CN114621896A - 一株具有降糖降脂功能的植物乳杆菌84-3及其应用 - Google Patents
一株具有降糖降脂功能的植物乳杆菌84-3及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株具有降糖降脂功能的植物乳杆菌84‑3及其应用。Lactobacillusplantarum84‑3于2021年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCCNo：61965。植物乳杆菌84‑3显著的功能特性使其应用在多种形式的益生食品或者药品组合物中，如在益生菌菌粉、益生菌压片糖果、益生菌固体饮料和益生菌医药组合物中具有广泛的应用价值。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种具有降糖降脂功能的植物乳杆菌84-3及其应用。
背景技术：
2型糖尿病主要表现为高血糖、低度炎症和β细胞衰竭，影响糖、脂、蛋白的代谢。根据国际糖尿病联合会的数据，全球有3.8亿人患有糖尿病，2035年会增加到5.92亿，其中2型糖尿病的人数超过90％。目前已经合成了许多治疗糖尿病的药物，如磺酰脲类、噻唑烷二酮类和双胍类药物，但给药后患者出现肠胃胀气、不适，有时出现腹泻等副作用。近年来，天然物质如植物、蔬菜、传统药物和益生菌已被广泛研究，具有潜在的抗糖尿病功效，且副作用相对较低，成本较低。
近年来，益生菌被广泛应用于预防2型糖尿病及其并发症的发生。前期研究表明鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus，LGG)处理后胰岛素敏感性增强，改善了糖耐量和血清胰岛素。口服干酪乳杆菌和两歧双歧杆菌对血脂异常和抗氧化活性均有积极作用。研究还发现，鼠李糖乳杆菌可改善氧化应激、肠道功能和炎症。干酪乳杆菌CCFM419可降低肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平。
虽然目前已经证实了益生菌的降血糖活性，相对于其他功能研究与开发，有关益生菌对2型糖尿病患者血糖血脂的调节作用还没有形成系统性的研究，而且其具体机制仍有待阐明。因此，开展具有缓解糖尿病患者血糖血脂作用的乳酸菌的功能挖掘和评价研究，开发原创性的具有缓解糖尿病血糖血脂的乳酸菌菌种还有待筛选和研究，目前，我国具有突出缓解血糖血脂作用的乳酸菌菌种还不多，因此功能性乳酸菌尤其是具有降糖降脂功能的乳酸菌还有待进一步开发。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株具有降糖降脂功能的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)84-3，该菌具有显著的降低糖尿病大鼠空腹血糖和血脂，以及改善炎症因子的能力，因而对降低血糖和血脂具有显著的效果，该菌于2021年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：61965。
在本发明中，以鼠里糖乳杆菌LGG作为益生菌阳性对照组，植物乳杆菌84-3作为实验组，对造模成功的2型糖尿病Wistar大鼠进行为期13周的干预实验，探究植物乳杆菌84-3在糖脂代谢调节方面的差异以及降糖降脂的机制机理，结果发现该菌具有显著的降低糖尿病大鼠空腹血糖和血脂，以及改善炎症因子的能力，因而对降低血糖和血脂具有显著的效果。
因此，本发明的第二个目的是提供植物乳杆菌84-3在制备具有降糖降脂功能的食品、保健品或者药物中的应用。通过将植物乳杆菌84-3作为食品组合物或者医药组合物，能够对糖尿病人的血糖血脂起到良好的预防和治疗效果。
优选，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌菌粉的应用。
优选，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌压片果糖的应用。
优选，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌固体饮料的应用。
优选，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌医药组合物的应用。
本发明的第三个目的是提供一种具有降糖降脂功能的食品、保健品或者药物，其含有植物乳杆菌84-3的发酵液、或其发酵液或发酵液的提取物作为活性成分。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过对分离自新疆奶疙瘩中的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)84-3进行了体内2型糖尿病大鼠动物实验，得出植物乳杆菌84-3具有调控大鼠体重，降糖降脂及改善炎症因子的功能特性；在此基础上，充分分析了植物乳杆菌84-3可能是通过降低半胱氨酸、异亮氨酸、支链氨基酸和Fischer比值，增加酪氨酸和芳香族氨基酸水平来达到降糖降脂的目的；最后通过测定大鼠结肠粪便中短链脂肪酸的含量，得出植物乳杆菌84-3可能是通过增加糖尿病大鼠结肠粪便中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的产生来达到改善2型尿病的目的。植物乳杆菌84-3显著的功能特性使其应用在多种形式的益生食品或者药品组合物中，如在益生菌菌粉、益生菌压片糖果、益生菌固体饮料和益生菌医药组合物中具有广泛的应用价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
Lactobacillus plantarum 84-3于2021年9月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：61965。
附图说明
图1是本发明所述的植物乳杆菌84-3益生特性的测定(耐酸性实验、耐胆盐实验、对模拟胃肠道耐受性实验)。
图2为本发明所述的各组大鼠初始体重及最终体重；
图3为本发明所述的各组大鼠造模后10天空腹血糖，造模成功后空腹血糖的变化及结束时空腹血糖；
图4为本发明所述的各组大鼠葡萄糖耐量OGTT、曲线下面积AUC、血清胰岛素、糖化血红蛋白和胰高血糖素水平；
图5为本发明所述的各组大鼠血糖相关指标(GLP-1含量、DPP-IV和α葡萄糖苷酶酶活)；
图6为本发明所述的各组大鼠血脂四项水平(TC、TG、HDL-C和LDL-C)；
图7为本发明所述的各组大鼠脂肪细胞因子水平(瘦素和脂联素)；
图8为本发明所述的各组大鼠炎症因子水平(IL-6，IL-10，TNF-α，CRP和内毒素)；
图9为本发明所述的各组大鼠肝脏和胰腺组织病理切片观察；
图10为本发明所述的各组大鼠血清氨基酸组成(芳香族氨基酸、支链氨基酸和Fisher比值)；
图11为本发明所述的各组大鼠结肠粪便中短链脂肪酸的含量(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和总酸)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1植物乳杆菌84-3益生特性的测定
参考王芬等的方法进行植物乳杆菌84-3耐酸性、耐胆盐和模拟胃肠液耐受性实验。将植物乳杆菌84-3以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体分别重悬于pH值为3.0的MRS肉汤培养基、含2％胆盐(pH8.0)的无菌去离子水、人工模拟的胃液(pH2.0)、人工模拟的肠液(pH8.0)中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。然后于37℃分别孵育3h，24h，3h，24h，收集菌液，进行活菌计数。耐受性的计算公式如下：
存活率(％)＝logN1/logN0*100
注：N1:经pH＝3.0处理以后的活菌数；N0经pH＝6.4(正常)MRS肉汤培养基中的活菌数
如图1所示，植物乳杆菌84-3在pH3.0的酸性条件下，在含2％胆盐的无菌去离子水中、在人工模拟的胃液(pH2.0)中、在人工模拟的肠液(pH 8.0)中，培养3h，24h，3h，24h后，均表现出了很高的存活率，分别为91.4％、73.5％、61.6％和82.1％。
实施例22型糖尿病模型大鼠的建立及分组设计
(1)菌液的制备。将活化3次后的细菌悬液(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)在4℃6000r/min离心10min，用灭菌磷酸盐缓冲液(pH 6.8)清洗3次菌体，然后将细菌的浓度调整至1*109CFU/mL用于后续实验。
(2)2型糖尿病模型大鼠的建立。实验动物：4-5周龄的雄性SPF级Wistar大鼠(108-116g)，饲养于广东省科学院微生物研究所动物房(伦理审查编号：GT-IACUC202006014)，采用12h/12h的明暗交替环境，且温度和湿度适宜，自由摄食和饮水。适应性饲养1周后进行正式实验，根据大鼠体重，利用随机数表法进行分组。其中，2型糖尿病造模方法：高糖高脂结合低剂量链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导。所用高糖高脂饲料：购自北京华阜康生物科技股份有限公司，编号：KK鼠料1042。
(3)动物实验分组。1)正常组(Normal Control，NC组)：普通基础维持饲料饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重生理盐水4周，第五周腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液(0.1mmol/L，pH 4.4)，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重生理盐水直至实验结束。2)模型组(DiabeticControl，DC组)：高脂高糖饲料饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重生理盐水4周，第五周腹腔注射35mg/kg STZ，第5-13周灌胃每天1mL/100g体重生理盐水直至实验结束。3)阿卡波糖组(Acarbose，Acar组)：高脂高糖饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重50mg/kg的阿卡波糖4周，第五周腹腔注射35mg/kg STZ(链脲佐菌素)，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重50mg/kg的阿卡波糖直至实验结束。4)鼠里糖乳杆菌(LGG组)：高脂高糖饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重1*109CFU/mL 4周，第五周腹腔注射35mg/kg体重STZ，第5-13周每天灌胃1mL/100g体重1*109CFU/mL鼠里糖乳杆菌菌液，直至实验结束。5)植物乳杆菌(84-3组)：高脂高糖饲喂4周，每天灌胃1mL/100g体重1*109CFU/mL 4周，第五周腹腔注射35mg/kg体重STZ，第5-13周灌胃每天1mL/100g体重1*109CFU/mL植物乳杆菌84-3菌液，直至实验结束。
实施例3大鼠结肠粪便、组织样本的收集
在实验的最后一天，大鼠禁食12h(正常饮水)，将舒泰50以100uL/100g体重的剂量肌肉注射麻醉下心脏取血，静置2小时后，离心取上清得到血清(3500r/min，15min)，带回实验室放置在-80℃冰箱用于后续生理生化、炎症因子指标和氨基酸组成的检测。实验大鼠取血后，收集肝脏、胰腺和小肠，将各组织分装，一部分组织切块放在提前准备好的甲醛试剂中固定，用于组织病理切片观察，其余的组织液氮速冻，干冰运输至实验室，-80℃冰箱保藏用于后续生理生化指标分析。收集结肠内容物，用于短链脂肪酸的测定。
实施例4大鼠体重、血糖、血脂及炎症因子检测分析
(1)大鼠体重变化的测定，记录初始体重，最终体重。从图2(A)可看出，各组的初始体重组间无差异(P>0.05)。实验结束时正常组(NC)大鼠的最终体重和体重变化显著高于模型组(DC)，且模型组(DC)与正常组(NC)相比，显著降低了14％。经植物乳杆菌84-3处理后，可以改善糖尿病大鼠体重下降的趋势，然而，见图2(B)，植物乳杆菌84-3干预后大鼠最终体重与模型组(DC)之间相比无显著性差异(P>0.05)，我们推测是由于植物乳杆菌84-3的干预时间还不够长。
(2)大鼠空腹血糖的测定。造模成功后每周测定一次空腹血糖，通过尾尖取血。从图3(A)可看出，大鼠腹腔注射STZ 10天后，除正常组(NC)外，其余各组的空腹血糖平均水平均高于7.0mmol/L，研究表明空腹血糖>7.0mmol/L，就代表2型糖尿病造模成功，因此，本研究2型糖尿病大鼠模型造模成功，可用于后续进一步的研究。同时，结果显示，模型组(DC)的空腹血糖水平显著高于其他各组(P<0.05)，且植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG组均可显著抑制大鼠的空腹血糖升高(P<0.05)，且植物乳杆菌84-3降低空腹血糖的能力更强，其降血糖潜力有待进一步研究。同时，我们可以发现，糖尿病组的空腹血糖水平在STZ注射后7-12周期间均显著高于正常组(NC)(P<0.05)图3(B)。第9周开始，植物乳杆菌84-3、鼠里糖乳杆菌LGG和阿卡波糖ACAR组的空腹血糖呈现下降的趋势，说明随着乳酸菌干预时间的延长，2型糖尿病大鼠的空腹血糖可以得到不同程度的改善。在第11周时，植物乳杆菌84-3的空腹血糖水平降到最低，其中，植物乳杆菌84-3显著低于鼠里糖乳杆菌LGG(P<0.05)，与阿卡波糖组无显著性差异(P>0.05)，如图3(C)，直到实验结束时都维持在比鼠里糖乳杆菌血糖低的水平。
(3)大鼠口服葡萄糖耐量实验的测定。第12周，2g/kg葡萄糖溶液给大鼠灌胃，在灌胃前(0min)和灌胃后(30min，60min，90min，120min)测定血糖，利用GraphPadPrism软件计算曲线下面积(Area under curve，AUC)，评估大鼠的口服葡萄糖耐量(oral glucosetolerance test，OGTT)。从图4(A)可看出，正常组(NC)的血糖值变化不大，糖耐受性依然保持平稳。与正常组(NC)相比，糖尿病组各时间点血糖浓度显著高于正常组，且模型组(DC)的血糖浓度在2个小时内基本不变，稳定在最高水平，说明模型组(DC)大鼠的糖耐受性严重受损。结果也显示，乳酸菌组和阿卡波糖组在30min时血糖浓度最高，之后持续降低。与模型组(DC)相比，乳酸菌组和阿卡波糖组降低了血糖值(P<0.05)，尤其是植物乳杆菌84-3的血糖值和耐受性与阿卡波糖ACAR无显著性差异(P>0.05)，接近于正常组(NC)。同样，我们从图4(B)，模型组(DC)AUC葡萄糖值明显高于其他各组，与模型组(DC)相比，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3，鼠里糖乳杆菌LGG)大鼠对葡萄糖的反应和对高糖水平的调节能力均增强，显著降低了糖尿病的AUC葡萄糖值(P<0.05)，说明植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG对2型糖尿病大鼠的糖耐量具有显著改善作用，防止高血糖的发生。
(4)大鼠血清HbA1c、胰岛素和GC的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清胰岛素、胰高血糖素(Glucagon，GC)和HbA1c含量，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠血清中胰岛素和胰高血糖素的含量如图4(C)(D)所示，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)的胰岛素的含量比模型组(DC)含量均有显著升高(P<0.05)，且乳酸菌各组之间无显著性差异(P>0.05)，这可能是由于胰岛素敏感性的提高。另外，各乳酸菌组和药物组的胰高血糖素水平均呈不同程度的下降趋势，其中，植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG组的胰高血糖素的含量比模型组(DC)含量均显著降低(P<0.05)，特别是植物乳杆菌84-3，其胰高血糖素的含量与正常组(NC)相比无显著性差异(P>0.05)，说明植物乳杆菌84-3改善了胰高血糖素症。另外，实验结束时各组大鼠血清中HbA1c的含量如图4(E)所示，模型组(DC)的HbA1c与正常组(NC)相比，显著升高(P<0.05)。与模型组(DC)相比，乳酸菌组和药物组的HbA1c的含量显著降低(P<0.05)。值得注意的是，植物乳杆菌84-3的HbA1c含量显著低于鼠里糖乳杆菌LGG和阿卡波糖ACAR组(P<0.05)。
(5)大鼠血清GLP-1含量、肝脏DPP-IV和小肠中α葡萄糖苷酶酶活的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清GLP-1含量和肝脏中二肽激肽酶(Dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)和小肠中α葡萄糖苷酶酶活，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠肝脏中DPP-IV活性如图5(A)所示，模型组(DC)的DPP-IV活性比正常组(NC)显著升高(P<0.05)。阿卡波糖ACAR组与模型组(DC)相比无显著性差异(P>0.05)。植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG的DPP-IV活性与正常组(NC)相比无显著差异(P>0.05)，说明大鼠肝脏DPP-IV的活性已恢复至正常水平，且植物乳杆菌84-3的DPP-IV的活性最低。由以上结果可知，模型组(DC)的DPP-IV活性有所增加，喂食植物乳杆菌84-3后可以有效降低DPP-IV活性，说明植物乳杆菌84-3可能是通过降低糖尿病大鼠的DPP-IV活性来达到有效调节血糖的作用。同时，我们发现，实验结束时各组大鼠小肠中α葡萄糖苷酶活性如图5(B)所示，模型组(DC)的α-葡萄糖苷酶活性比正常组(NC)显著升高(P<0.05)。鼠里糖乳杆菌LGG与模型组(DC)相比无显著性差异(P>0.05)。植物乳杆菌84-3和阿卡波糖ACAR组的α-葡萄糖苷酶活性与正常组(NC)相比无显著差异(P>0.05)，说明大鼠小肠α-葡萄糖苷酶的活性已恢复至正常水平，植物乳杆菌84-3对糖尿病大鼠的α-葡萄糖苷酶有较好的调节作用。另外，我们从5(C)实验结束时各组大鼠血清中的GLP-1含量。模型组(DC)的GLP-1含量较正常组(NC)显著降低(P<0.05)，其余各组与模型组(DC)相比，其GLP-1含量都有所增加(P<0.05)，但鼠里糖乳杆菌84-3和阿卡波糖ACAR组之间无显著性差异(P>0.05)；植物乳杆菌84-3的GLP-1含量与其它组相比显著增加(P<0.05)。这些结果表明，植物乳杆菌84-3可能是通过改变GLP-1的合成速率来刺激糖尿病大鼠胰岛素分泌和降低血糖，其具体机制有待于我们进一步探索。
(6)大鼠血清脂质四项指标的测定。利用全自动生化分析仪测定血清中TC，TG，HDL-C和LDL-C的含量。实验结束时各组大鼠血清中的血脂含量见图6。糖尿病模型组(DC)大鼠显著升高了TC、TG和LDL-C的浓度(P<0.05)，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)和阳性对照药物组阿卡波糖ACAR组的TC，TG和LDL-C含量均下降至正常水平且略高于正常组，特别是，植物乳杆菌84-3显著降低了TC和LDL-C(P<0.05)。然而，除鼠里糖乳杆菌LGG组外，模型组(DC)组大鼠的HDL-C水平高于植物乳杆菌84-3，但无显著性差异(P>0.05)，鼠里糖乳杆菌LGG组的HDL-C水平高于植物乳杆菌84-3(P<0.05)。本研究结果表明，乳酸菌具有保护大鼠血脂发生异常的功能，特别是植物乳杆菌84-3可显著降低血脂水平并恢复至正常水平。
(7)大鼠血清中瘦素和脂联素的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清中瘦素和脂联素含量，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠血清中的瘦素水平如图7(A)所示，模型组(DC)的瘦素水平比正常组(NC)显著增加(P<0.05)。乳酸菌组与模型组(DC)相比显著降低(P<0.05)，乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)之间无显著性差异(P>0.05)，说明喂食乳酸菌后可以降低瘦素水平。另外，实验结束时各组大鼠血清中的脂联素水平如图7(B)所示，模型组(DC)脂联素水平比正常组(NC)显著降低(P<0.05)，而乳酸菌组和药物组与模型组(DC)相比，显著升高，说明大鼠体内脂联素水平已恢复，接近正常水平。其中，植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG的脂联素水平显著高于药物组阿卡波糖ACAR组(P<0.05)，且植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG之间无显著性差异(P>0.05)，以上结果表明，植物乳杆菌84-3对糖尿病大鼠的脂肪因子有较好的调节作用。
(8)大鼠血清中炎症因子的测定。利用ELISA试剂盒(Dogesce)测定血清中炎症因子(C反应蛋白、内毒素、TNF-α、IL-6和IL-10)含量，具体操作按照说明书进行。实验结束时各组大鼠血清中的炎症因子水平如图8所示，模型组(DC)的CRP、内毒素、TNF-α和IL-6水平比正常组(NC)显著升高，IL-10显著降低(P<0.05)。乳酸菌组(植物乳杆菌84-3和鼠里糖乳杆菌LGG)与模型组(DC)相比CRP、内毒素、TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.05)，IL-10水平升高，说明大鼠体内促炎因子的含量已恢复至正常水平，且增加抗炎因子水平。特别是植物乳杆菌84-3降低C反应蛋白、内毒素、TNF-α和IL-6的水平最多，也显著增加IL-10的水平。由以上结果可知，模型组(DC)的促炎因子都有所增加，喂食乳酸菌后可以有效降低促炎因子水平，尤其是植物乳杆菌84-3对糖尿病大鼠的炎症因子有很好的改善作用。我们推测因乳酸菌的喂食导致肠道中有益菌群的增加，使得体内的内毒素水平有所降低，从而缓解了2型糖尿病大鼠的症状。
(9)大鼠肝脏和胰腺组织病理切片。肝脏、胰腺和小肠H&E染色送广东省科学院微生物研究所分析检测中心进行分析。显微镜下观察，如图9(A)，为大鼠肝脏组织形态结构比较结果。正常组(NC)大鼠肝细胞以中央静脉为中心呈单行放射状排列；而2型糖尿病模型组(DC)大鼠的肝细胞排列无规则，脂肪变性，形成脂肪空泡；而药物阿卡波糖ACAR，乳酸菌(鼠里糖乳杆菌LGG和植物乳杆菌84-3)预防组大鼠肝脏形态结构得到不同程度的改善，我们可以看出干预组各组肝细胞排列较整齐，以中央静脉为中心呈现放射状排列，通过减少脂肪泡的大小和数量显著抑制肝脏脂肪变性的形成。胰腺组织结构如图9(B)所示，正常组(NC)大鼠胰岛细胞组织结构完整，排列有序，且胰岛与外分泌腺之间边界清晰。而糖尿病模型组(DC)胰岛细胞受到明显的损伤，且胰岛边缘与外部组织不清晰，胰岛萎缩，形态结构极不完整，胰岛细胞数量减少。与模型组(DC)相比，阿卡波糖ACAR和乳酸菌干预组胰腺组织结构均有明显恢复，可明显逆转胰腺异常组织病理改变，且植物乳杆菌84-3的胰腺组织结构恢复更佳。总的来说，益生乳酸菌可明显改善肝脏、胰腺组织学的变化。
实施例5大鼠血清氨基酸组成分析
血清样本前处理：从-80℃冰箱取出血清样本并在4℃冰箱中解冻，然后取出在12000r/min，15min离心，取上清加入等体积的8％的5-磺基水杨酸静置30min，12000r/min，15min离心，取上清，放置于进样瓶中，待上机检测，上机条件和检测条件见表1和2。上机条件：
表1上机条件
检测条件：
表2检测条件
Fisher比值＝支链氨基酸(缬氨酸+亮氨酸+异亮氨酸)/芳香族氨基酸(苯丙氨酸+酪氨酸+色氨酸)*100％
其中，Fisher比值正常范围在2.69～3.85之间
实验结束时各组大鼠血清中氨基酸的含量如图10，从我们的结果可以看出，与正常组(NC)相比，糖尿病模型组(DC)大鼠支链氨基酸水平和Fischer比值显著增加(P<0.05)，而芳香族氨基酸水平显著降低(P<0.05)，而经植物乳杆菌84-3干预后可显著降低支链氨基酸水平，显著降低了Fischer比值。以上结果表明，经喂食乳酸菌后，部分氨基酸可恢复至正常水平，对于乳酸菌对氨基酸的改善机制还有待于我们进一步研究，特别是涉及氨基酸的代谢通路的研究，因此，后期有必要利用组学技术阐明乳酸菌是如何通过改善氨基酸的表达来达到降糖降脂功效的。
实施例6大鼠结肠粪便中短链脂肪酸谱的测定
样本预处理：结肠粪便样本(50mg)加入500μL 0.001％硫酸，均质，室温放置5min，13000r/min在4℃下离心25min，收集上清，上清液经0.22μm滤膜过滤；气相色谱条件：气相色谱仪：Agilent 7693A，色谱柱：TG-624SiIMS(30m×0.25mm×0.25μm)。压力：7.2452psi，总气体流量：20mL/min，吹扫气体流量：3mL/min，火焰电离检测器温度：250℃，氮气用作载气。用挥发性脂肪酸混合标准品(Supelco，Bellefonte，PA，USA)获得校正曲线。
实验结束时各组大鼠结肠粪便中短链脂肪酸的含量如图11，我们可以发现，与正常组(NC)相比，2型糖尿病模型组(DC)大鼠结肠粪便中短链脂肪酸的含量明显减少(P<0.05)。我们还发现，不同乳酸菌对短链脂肪酸表现出不同程度的增加。与模型组(DC)相比，乳酸菌组增加了乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的产生，对照菌株鼠里糖乳杆菌LGG显著增加了戊酸的水平(P<0.05)，而植物乳杆菌84-3干预后同时显著增加了糖尿病大鼠结肠粪便中丙酸、丁酸、异丁酸和异戊酸的含量(P<0.05)。因此，我们推测喂食植物乳杆菌84-3对于2型糖尿病葡萄糖代谢调节方面发挥的作用可能是通过产生短链脂肪酸来实现的。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (7)
1.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)84-3，保藏编号为GDMCC No：61965。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌84-3在制备具有降糖降脂功能的食品、保健品或者药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌菌粉的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌压片果糖的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌固体饮料的应用。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是植物乳杆菌84-3在制备降糖降脂的益生菌医药组合物的应用。
7.一种具有降糖降脂功能的食品、保健品或者药物，其特征在于，含有植物乳杆菌84-3、或其发酵液或发酵液的提取物作为活性成分。
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