CN116211900A - 一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂及其制备方法和应用。所述微生态活菌制剂包括保藏编号为CGMCC No.1.12733的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株和水飞蓟素。本发明创造性地发现罗伊氏乳杆菌LR08菌株能够显著缓解多囊卵巢综合征，可以显著调节多囊卵巢综合征大鼠代谢水平，改善慢性炎症、糖代谢和性激素水平，预防多囊卵巢综合征相关肥胖、糖尿病等代谢疾病。水飞蓟素具有一定的辅助降低血脂、血糖和脂肪细胞炎症因子水平的作用。因此，本发明在制备用于预防、缓解或治疗多囊卵巢综合征的产品中具有很好的前景。

Description

一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是较常见的引起育龄妇女内分泌紊乱的疾病。PCOS的特点是排卵功能障碍和雄激素过多，其临床表现主要为月经不调、多毛症、痤疮、脱发和不孕症等代谢功能障碍，对患者生活质量和社会心理健康产生严重的负面影响。PCOS的发病机制至今尚未完全明确，其中胰岛素抵抗及其代偿表现高胰岛素血症在PCOS的发生和发展中起着重要作用，此外慢性炎症、卵巢间质纤维化与该病也有密切关系。目前国外指南对PCOS的治疗主要包括改善生活方式、复方醋酸环丙孕酮治疗高雄激素血症、二甲双胍改善胰岛素抵抗等。水飞蓟素是水飞蓟的活性成分，是全球市场占有率最高的黄酮类提取物之一。临床中水飞蓟素是治疗肝脏纤维化的常用药物，因其具有抗炎、抗纤维化、抗脂质过氧化和免疫调节等作用，故推测其亦可能有抑制PCOS慢性炎症、卵巢纤维化等作用，但目前相关研究报道较少。
近年来，肠道微生物群和代谢疾病之间的联系成为研究人员关注的焦点，肠道菌群是我们身体不可或缺的“微生物器官”，在维持健康方面起着至关重要的作用，通常，炎症、代谢紊乱、肠道菌群三者相互作用，共同影响机体的内环境。肠道菌群失调可导致高雄激素血症。已有研究表示，他们发现了肠道健康和多囊卵巢综合征之间具有相关性，因此提出肠道微生物群中可能存在影响多囊卵巢综合征的某些机制，改善卵巢功能，改善机体代谢水平和胰岛素抵抗等问题，以期能为基于肠道菌群为靶点辅助治疗或治疗多囊卵巢综合征提供新的帮助。功能益生菌补充剂的使用已得到广大消费者的认可，其安全、无毒副、无不良反应作用，但其在相关适应症的有效性有待验证，若能将水飞蓟素与功能益生菌联合使用，从而提供一种具有改善PCOS适应症的微生态活菌制剂，作为改善PCOS一个新作用靶点，是一种非常健康的治疗方案，解决长期使用常规抗生素治疗及其他化学药物治疗所导致的潜在的不良反应等问题，具有广阔的市场应用前景。
因此，提供一种含水飞蓟素的微生态活菌制剂能够改善PCOS的产品，用以改善PCOS相关代谢疾病是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂包括保藏编号为CGMCC No.1.12733的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteriLR08菌株和水飞蓟素。
所述罗伊氏乳杆菌是已被纳入《可用于食品的菌种名单》的一种益生菌，因此，罗伊氏乳杆菌LR08对人体而言，相对健康，且不易产生不良反应，现也称为罗伊氏黏乳杆菌。本发明创造性地发现所涉及的罗伊氏乳杆菌LR08菌株能够显著缓解多囊卵巢综合征，具体表现在：(1)显著调节PCOS大鼠代谢水平；(2)显著改善PCOS大鼠慢性炎症，糖代谢和性激素水平；(3)显著改善PCOS大鼠胰岛素抵抗，预防甚至逆转卵巢纤维化，促使卵泡发育；(4)调节短链脂肪酸乙酸水平，预防PCOS相关肥胖、糖尿病等代谢疾病。水飞蓟素具有一定的辅助降低血脂、血糖和脂肪细胞炎症因子水平的作用。二者的联合使用，可以促进上述效果的发挥，治疗效果更为显著。
优选地，所述用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08菌株的活菌数不低于1×108CFU/mL，例如1×108CFU/mL、2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、4×108CFU/mL、5×108CFU/mL、6×108CFU/mL、7×108CFU/mL、8×108CFU/mL、9×108CFU/mL、1×109CFU/mL等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂中水飞蓟素的质量百分含量为0.02-0.29％，例如0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％、0.22％、0.24％、0.26％、0.29％等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
当水飞蓟素以上述特定的含量添加时，所述微生态活菌制剂在改善多囊卵巢综合征上的效果最佳。
优选地，所述用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂还包括益生元和/或鸡血藤。
本发明创造性地发现，鸡血藤的添加能够进一步提高微生态活菌制剂改善多囊卵巢综合征的效果，且鸡血藤和水飞蓟素在提高上述效果上具有一定的协同作用。
优选地，所述用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂中鸡血藤的质量百分含量为0.01-0.3％，例如0.01％、0.03％、0.05％、0.07％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％、0.24％、0.26％、0.28％、0.3％等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
当鸡血藤以上述特定含量添加时，在用于改善多囊卵巢综合征的效果最好。
优选地，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉或螺旋藻中任意一种或至少两种的组合，优选为低聚果糖。
本发明创造性地发现，低聚果糖对罗伊氏乳杆菌LR08在用于改善多囊卵巢综合征的功效上的发挥的促进优于其他益生元。
优选地，所述用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌与益生元的比例为(1×108)CFU:(1-2)g，其中(1-2)中具体点值均可选择1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
当益生元与罗伊氏乳杆菌LR08以上述特定比例配合时，对罗伊氏乳杆菌LR08功效的促进达到最佳。
优选地，所述微生态活菌制剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
优选地，所述微生态活菌制剂还包括保护剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、明胶、糊精、乳糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂的制备方法，所述制备方法包括：在含有水飞蓟素的培养基中培养罗伊氏乳杆菌LR08菌株，离心得到菌泥，将菌泥、水飞蓟素与保护剂混合，冻干，即得。
优选地，所述培养基中水飞蓟素的含量为1-10g/L；例如1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养基以质量浓度计包括：蛋白胨0-15g/L、牛肉膏0-15g/L、葡萄糖15-25g/L、水飞蓟素1-10g/L、酵母粉3-7g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、K2PO4·3H2O 2-3g/L、MgSO4·7H2O 0.05-0.2g/L、MnSO4 0.01-0.1g/L、吐温80 0.5-2mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.1-1g/L。
所述蛋白胨的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L等，所述牛肉膏的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L等，所述葡萄糖的含量可以选择15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L等，所述水飞蓟素的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L，所述酵母粉的含量可以选择3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L，所述柠檬酸氢二铵的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L，所述K2PO4·3H2O的含量可以选择2g/L、2.5g/L、3g/L等，所述MgSO4·7H2O的含量可以选择0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L等，所述MnSO4的含量可以选择0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L，所述吐温80的含量可以选择0.5mL/L、1mL/L、1.5mL/L、2mL/L等，所述半胱氨酸氨酸盐的含量可以选择0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述冻干为真空冷冻。
第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂在制备用于预防、缓解或治疗多囊卵巢综合征产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地发现所涉及的罗伊氏乳杆菌LR08菌株能够显著缓解多囊卵巢综合征，水飞蓟素具有一定的辅助降低血脂、血糖和脂肪细胞炎症因子水平的作用。具体表现在：(1)显著调节PCOS大鼠代谢水平；(2)显著改善PCOS大鼠慢性炎症，糖代谢和性激素水平；(3)显著改善PCOS大鼠胰岛素抵抗，预防甚至逆转卵巢纤维化，促使卵泡发育；(4)调节短链脂肪酸乙酸水平，预防PCOS相关肥胖、糖尿病等代谢疾病。因此，将其用于制备用于预防、缓解或治疗多囊卵巢综合征的产品中具有很好的前景。
附图说明
图1是大鼠血糖相关指标检测结果图，其中图1a是大鼠空腹胰岛素水平结果图，图1b是大鼠空腹血糖水平结果图，图1c是大鼠胰岛素抵抗指数结果图，图1d是大鼠餐后2h胰岛素水平结果图，图1e是大鼠餐后2h血糖水平结果图，***表示与模型组对比p<0.001，**表示与模型组对比p<0.01，*表示与模型组对比p<0.05，NS.表示p>0.05。
图2是大鼠血清性激素水平结果图，其中图2a是大鼠黄体生成素水平结果图，图2b是大鼠卵泡刺激素水平结果图，图2c是大鼠性激素结合蛋白水平结果图，图2d是大鼠睾酮水平结果图，***表示与模型组对比p<0.001，**表示与模型组对比p<0.01，*表示与模型组对比p<0.05。
图3是大鼠炎性因子水平结果图，其中图3a是大鼠白细胞介素-6水平结果图，图3b是大鼠结缔组织生长因子结果图，***表示与模型组对比p<0.001，**表示与模型组对比p<0.01，*表示与模型组对比p<0.05。
图4是大鼠盲肠内容物乙酸含量结果图，***表示与模型组对比p<0.001，*表示与模型组对比p<0.05。
图5是大鼠肝功能水平变化结果图，其中图5a是大鼠谷丙转氨酶含量结果图，图5b是大鼠谷草转氨酶含量结果图，其中NS.表示p>0.05。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述内容中涉及的罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.1.12733，保藏日期为2020年7月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述内容中涉及的改良MRS培养基以浓度计包括：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、水飞蓟素3g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述实施例涉及的产品中包含的功效成分来源方式如下(仅体现功效成分，其他市售原料中含有的必要辅料成分不再赘述)：
水飞蓟素来源于购自探索平台阿达玛斯生命科学品牌商品名为水飞蓟素的产品；
鸡血藤来源于购自西安优硕生物科技有限公司商品名为鸡血藤提取物的产品；
低聚果糖来源于购自量子高科集团有限公司的商品名为低聚果糖的产品；
脱脂奶粉来源于购自山东谷硕生物科技有限公司的商品名为脱脂奶粉的产品；
低聚木糖来源于购自山东省龙力生物科技公司的商品名为低聚木糖的产品。
实施例1
本实施例提供一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、水飞蓟素的质量百分含量为0.16％、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
其制备方法为：
将罗伊氏乳杆菌LR08菌株按照2％的接种量接种到改良MRS培养基中，于37℃下培养24h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体、含有低聚果糖的1.5％脱脂奶粉溶液和水飞蓟素混合，得到重悬液，所述含有低聚果糖的脱脂奶粉溶液与菌体的质量比为2:1；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，即得。
实施例2
本实施例提供一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、鸡血藤的质量百分含量为0.16％、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
实施例3
本实施例提供一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、水飞蓟素的质量百分含量为0.08％、鸡血藤的质量百分含量为0.08％、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
实施例4
本实施例提供一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、水飞蓟素的质量百分含量为0.08％、鸡血藤的质量百分含量为0.08％、低聚木糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
对比例1
本对比例提供一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
测试例1
罗伊氏乳杆菌LR08耐胃酸能力：
(1)制备人工胃液：以质量分数计，人工胃液中含有0.2％的NaCl以及0.3％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
(2)耐胃酸能力测试：分别取1.0mL罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L1组(浓度为1×109CFU/mL)、含0.16％水飞蓟素的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L2组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.16％鸡血藤的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L3组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.08％水飞蓟素和0.08％鸡血藤的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L4组(浓度为1×109CFU/mL)。采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度，分别与9.0mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始0h和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表1。
表1
组别 人工胃液pH2.0 人工胃液pH2.5 人工胃液pH3.0
L1组 58.4％ 63.0％ 71.3％
L2组 73.5％ 80.7％ 86.2％
L3组 78.3％ 84.6％ 90.2％
L4组 84.0％ 92.5％ 96.5％
罗伊氏乳杆菌LR08耐胆盐能力：
(1)制备10％牛胆盐：称取10.0g牛胆盐(沃凯，国药集团化学试剂有限公司，中国上海)至100mL无菌水中，0.22μm滤膜过滤除菌。
含0.1％胆盐MRS培养基：按说明书配制MRS培养基(北京索莱宝科技有限公司)，高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后，加入适量10％牛胆盐溶液至终浓度为0.1％。
(2)耐胆盐能力测试：分别取1.0mL罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L1组(浓度为1×109CFU/mL)、含0.16％水飞蓟素的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L2组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.16％鸡血藤的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L3组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.08％水飞蓟素和0.08％鸡血藤的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L4组(浓度为1×109CFU/mL)。采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度，与9.0mL含0.1％牛胆盐MRS培养基混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，其中，N1：胆盐处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表2。
表2
组别 存活率
L1组 59.6％
L2组 63.4％
L3组 68.7％
L4组 89.5％
由表1，2可以看出，对比常规培养的L1组，LR08在发酵培养过程中以及在冻干保护过程中添加了水飞蓟素这一组分后，其耐胃酸和胆盐能力有了明显的提升，即水飞蓟素的使用，可以在发酵培养和冻干保护过程中促进菌株的增殖生长，提高菌株耐受性，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达73.5％；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达80.7％；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达86.2％。水飞蓟素对益生菌LR08的发酵培养和增殖生长无抑制作用，另外良好的胃酸和胆盐耐受能力为其在胃肠道定植，维持胃肠道黏膜屏障稳态以及制备预防、改善或治疗多囊卵巢综合征的产品创造了条件。水飞蓟素和鸡血藤的使用提高菌株耐受性上具有一定的协同作用。
测试例2
测试含水飞蓟素的罗伊氏乳杆菌LR08对肥胖大鼠体重、性激素水平、炎症细胞因子表达和短链脂肪酸含量的影响：
(1)动物分组和建立多囊卵巢综合征大鼠模型：
由上海实验动物中心提供的清洁级3周龄雌性SD大鼠56只，体重约45g，将大鼠饲养于笼内，环境清洁安静，温度23-25℃，湿度60％，12/12h光照/黑暗周期，常规饲料喂养，自由摄食饮水。所有涉及大鼠的程序均符合上海市实验动物护理与动物实验中心提供的指导原则(许可证号2022122006)。所有SD大鼠常规适应性喂养3d后，随机分为7组，每组8只，除对照组外，其余组大鼠均于颈背部皮下注射脱氢表雄酮(6mg/100g)+注射用油剂(0.2mL)，连续20d。20d后，在光学显微镜下观察大鼠的阴道图片，连续4d(即大鼠一个动情周期)。观察到大鼠阴道上皮持续角化，失去动情周期则提示造模成功，否则为造模失败，予以剔除；同时每组随机处死1只大鼠，留取卵巢组织，送检病理，以进一步证实造模结果(见异常发育的卵泡细胞明显增多及囊状样改变)。造模第21天，干预组(L1组)：对比例1所述微生态活菌制剂(每只大鼠每天灌胃5×108CFU)；干预组(L2组)：实施例1所述微生态活菌制剂(每只大鼠每天灌胃5×108CFU)；干预组(L3组)：实施例2所述微生态活菌制剂(每只大鼠每天灌胃5×108CFU)；干预组(L4组)：实施例3所述微生态活菌制剂(每只大鼠每天灌胃5×108CFU)；干预组(L5组)：实施例4所述微生态活菌制剂(每只大鼠每天灌胃5×108CFU)；CTL组和PCOS组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续28d(约7个大鼠动情周期)。灌胃过程中，除对照组外，其余组均皮下注射脱氢表雄酮以防止其自身恢复排卵。
(2)血糖相关指标检测：末次灌胃后禁食8h，行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)：水合氯醛麻醉大鼠后，于眶静脉取血1mL，检测空腹血糖FPG及空腹胰岛素FINS水平；腹腔注射50％葡萄糖注射液2g/kg，120min后另一侧眶静脉取血1mL，检测餐后2h血糖(2hPG)和餐后2h胰岛素(2hINS)，并计算稳态模型下胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。
HOMA-IR＝空腹血糖×空腹胰岛素/22.5，其中空腹血糖单位是mmol/L，空腹胰岛素的单位是μU/mL，系数22.5是矫正因子(参考文献：Kanauchi M.A new index of insulinsensitivity obtained from the oral glucose tolerance test applicable toadvanced type 2diabetes.Diabetes Care.2002Oct；25(10):1891-2.)。末次灌胃48h后，再次腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉取血4mL，3000r/min离心10min，留取上清，保存于-80℃冰箱。
对比CTL组大鼠，PCOS组大鼠的FINS、FPG、HOMA-IR、2hINS和2hPG水平均明显升高，在含水飞蓟素的罗伊氏乳杆菌LR08微生态活菌制剂的干预下，PCOS大鼠各项血糖指标增长情况进一步减缓，即水飞蓟素的使用提高了罗伊氏乳杆菌LR08对机体血糖指标调控的功效。水飞蓟素和鸡血藤在减缓血糖指标增长的功效上具有一定的协同作用。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(3)血清性激素及炎性因子水平：酶联免疫吸附试验(试剂盒购于武汉纯度生物)检测血清中睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、性激素结合蛋白(SHBG)、白细胞介素-6(IL-6)、结缔组织生长因子(CTGF)水平。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，计算样品浓度。
睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和性激素结合蛋白(SHBG)的结果如图2所示，表示各组大鼠血清性激素水平的比较。对比CTL组，PCOS组大鼠血清中LH、FSH以及T水平均出现显著的升高，SHBG水平出现显著的降低(SHBG是一种性激素运输载体，其水平的降低意味着机体可能存在PCOS相关的糖尿病症状)。结合血清代谢指标变化情况，PCOS大鼠存在明显的胰岛素抵抗，该模型大鼠符合女性的PCOS代谢特点。罗伊氏乳杆菌LR08能有效调整PCOS大鼠的LH、FSH、SHBG以及T水平，水飞蓟素的加入，干预效果更好。水飞蓟素和鸡血藤在上述效果上具有一定的协同作用。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
白细胞介素-6(IL-6)和结缔组织生长因子(CTGF)的结果如图3所示，对比CTL组，PCOS组大鼠促炎因子IL-6水平和PCOS相关生长因子CTGF水平显著提高，即出现了PCOS相关症状：慢性炎症和卵巢组织纤维化。研究表示CTGF是目前为止，所发现的与PCOS有关的较为重要的生长因子之一，其可使细胞增殖引起卵泡基底膜增厚，进而影响到卵泡基底膜的通透性及颗粒细胞的分裂，致使卵泡发育减慢，卵泡堆积，最终引起多囊样改变。
罗伊氏乳杆菌LR08能够降低机体的炎症指标IL-6水平以及CTGF水平，水飞蓟素的添加能够进一步降低IL-6水平以及CTGF水平。罗伊氏乳杆菌LR08和水飞蓟素能够非常明显地抑制炎症因子IL-6的释放、CTGF水平降低，有效减轻组织纤维化，这些可能是大鼠卵巢功能改善的关键因素，该现象提示罗伊氏乳杆菌LR08和水飞蓟素的干预治疗，可有效降低PCOS大鼠机体细胞因子水平，从而改善胰岛素抵抗，预防甚至逆转卵巢纤维化，促使卵泡发育。水飞蓟素和鸡血藤在上述效果上具有一定的协同作用。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(4)肠道菌群短链脂肪酸(SCFAs)测定：检测益生菌对发酵盲肠终产物的影响。测定了盲肠短链脂肪酸乙酸、丁酸的浓度。在0.01M磷酸盐缓冲液中重组每只动物的盲肠内容物，然后在4℃条件下以9000g离心5min，制备上清液2mL。上清液用1/10体积的50％ H2SO4酸化，用乙醚提取。采用Agilent 6890N气相色谱仪，配备极性HP-FFAP毛细管柱和火焰电离检测器测定有机相中SCFAs的浓度。
结果如图4所示，短链脂肪酸乙酸又被称为醋酸，已被证明可以通过多种机制抑制肥胖或糖尿病啮齿动物的身体脂肪积累和炎症。对比CTL组，PCOS疾病大鼠的盲肠内容物中的乙酸浓度显著降低，罗伊氏乳杆菌LR08能够显著提高PCOS疾病小鼠机体中的乙酸浓度，水飞蓟素的添加能够进一步提高PCOS疾病小鼠机体中的乙酸浓度，在干预PCOS诊疗的同时可以改善机体的代谢水平，调整内分泌。鸡血藤和水飞蓟素在上述功效上具有一定的协同作用。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(5)肝功能水平变化的测定：肝功能谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST的测定采用酶比色法，由上海斯莱克实验动物中心协助检测。
结果如图5所示，各组间ALT、AST水平均无明显的统计学差异，即表示微生态活菌制剂的使用尚未增加肝脏排泄的负担。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂包括保藏编号为CGMCC No.1.12733的罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株和水飞蓟素。
2.根据权利要求1所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08菌株的活菌数不低于1×108CFU/mL。
3.根据权利要求1或2所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂中水飞蓟素的质量百分含量为0.02-0.29％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂还包括益生元和/或鸡血藤；
优选地，所述用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂中鸡血藤的质量百分含量为0.01-0.3％；
优选地，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉或螺旋藻中任意一种或至少两种的组合，优选为低聚果糖；
优选地，所述用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌与益生元的比例为(1×108)CFU:(1-2)g。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂还包括保护剂；
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、明胶、糊精、乳糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：在含有水飞蓟素的培养基中培养罗伊氏乳杆菌LR08菌株，离心得到菌泥，将菌泥、水飞蓟素与保护剂混合，冻干，即得。
8.根据权利要求7所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂的制备方法，其特征在于，所述培养基中水飞蓟素的含量为1-10g/L。
9.根据权利要求7或8所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂的制备方法，其特征在于，所述冻干为真空冷冻。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的用于改善多囊卵巢综合征的微生态活菌制剂在制备用于预防、缓解或治疗多囊卵巢综合征产品中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116077536A (zh) * 2023-03-17 2023-05-09 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用
CN117844714A (zh) * 2024-03-04 2024-04-09 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用
CN117844714B (zh) * 2024-03-04 2024-05-17 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103690922A (zh) * 2013-12-30 2014-04-02 王雪雁 一种治疗多囊卵巢综合征的中药组合物及应用
CN112316122A (zh) * 2020-11-02 2021-02-05 山东省大健康精准医疗产业技术研究院 一种治疗多囊卵巢综合征的组合物及其制备方法与应用
WO2021074409A1 (en) * 2019-10-18 2021-04-22 Basf Se Composition for the treatment of (pre)obesity and/or associated morbidities thereto
EP4000626A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-25 concrete flowers GmbH Pharmaceutical preparation
CN114806980A (zh) * 2022-06-29 2022-07-29 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种用于培养活体生物药的培养基及其应用
CN115364126A (zh) * 2021-05-17 2022-11-22 上海交通大学医学院附属仁济医院 罗伊氏乳酸杆菌在制备多囊卵巢综合征治疗药物中的应用
CN115372482A (zh) * 2021-05-17 2022-11-22 上海交通大学医学院附属仁济医院 肠道菌群谱和代谢标志物在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103690922A (zh) * 2013-12-30 2014-04-02 王雪雁 一种治疗多囊卵巢综合征的中药组合物及应用
WO2021074409A1 (en) * 2019-10-18 2021-04-22 Basf Se Composition for the treatment of (pre)obesity and/or associated morbidities thereto
CN112316122A (zh) * 2020-11-02 2021-02-05 山东省大健康精准医疗产业技术研究院 一种治疗多囊卵巢综合征的组合物及其制备方法与应用
EP4000626A1 (en) * 2020-11-16 2022-05-25 concrete flowers GmbH Pharmaceutical preparation
CN115364126A (zh) * 2021-05-17 2022-11-22 上海交通大学医学院附属仁济医院 罗伊氏乳酸杆菌在制备多囊卵巢综合征治疗药物中的应用
CN115372482A (zh) * 2021-05-17 2022-11-22 上海交通大学医学院附属仁济医院 肠道菌群谱和代谢标志物在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用
CN114806980A (zh) * 2022-06-29 2022-07-29 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种用于培养活体生物药的培养基及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
D.F. HAMADE 等: "Second-Generation Probiotic Lactobacillus Reuteri Producing IL-22 (LR-IL-22) Protects the Intestine to Facilitate Whole Abdomen Irradiation (WAI) in Ovarian Cancer", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY*BIOLOGY*PHYSICS》, vol. 111, no. 3, XP086838202, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2021.07.1685 *
ZHANG CHI 等: "Identification of soybean peptides and their effect on the growth and metabolism of Limosilactobacillus reuteri LR08", 《FOOD CHEMISTRY》, vol. 369, pages 355 - 8 *
高江涛 等: "五种不同益生元对七种肠道有益菌及有害菌的体外作用", 《食品工业》, vol. 43, no. 10, pages 160 - 165 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116077536A (zh) * 2023-03-17 2023-05-09 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用
CN116077536B (zh) * 2023-03-17 2023-11-28 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用
CN117844714A (zh) * 2024-03-04 2024-04-09 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用
CN117844714B (zh) * 2024-03-04 2024-05-17 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用

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