CN111560331B - 一株副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一株具有降血糖以及保护口腔和抗抑郁作用的副干酪乳杆菌及其应用。本发明提供的副干酪乳杆菌nbk‑LC16具有较强的耐酸耐胆盐特性，在人工胃液和人工肠液中耐受性良好，能有效降低血糖和抑制变形链球菌。研究其对高血糖小鼠的影响，灌胃副干酪乳杆菌nbk‑LC16 8W后，与模型组小鼠相比较，高血糖小鼠体重显著增加，肝脏指数和脾脏指数显著下降，FBG和PBG显著下降，HbA1c和胰岛素水平显著下降，肝糖原含量上升。试验结果表明，副干酪乳杆菌nbk‑LC16可通过调节胰岛素水平和HbA1c，以及促进血糖转化为肝糖原，来调节血糖。研究其对变形链球菌的抑制作用，体外试验和口腔试验结果表明均能有效抑制变形链球菌，有助于保护口腔和牙齿健康；同时具有抗抑郁作用。
Description
技术领域:
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一株具有降血糖以及保护口腔和抗抑郁作用的副干酪乳杆菌及其应用。
背景技术:
糖尿病是一种体内胰岛素分泌量相对不足或绝对不足而导致机体出现代谢紊乱现象的慢性疾病，被公认为世界第三大慢性疾病。糖尿病患者常常伴随着多种并发症，如视网膜病变、肾动脉硬化以及心脑血管疾病等，严重威胁人们的身体健康，甚至会危及生命。随着人民生活水平的不断提高，糖尿病的发病率也迅速增加。据国际糖尿病联盟的调查结果显示，2007年的全球糖尿病患病人数为2.4亿，2011年患病人数增长为3.47亿。糖尿病国际联盟预测，2045年全球糖尿病患病人数将达到6.29亿。有研究报道，中国已经成为糖尿病人口大国，且患病率呈持续升高状态，糖尿病已经成为我国重大的公共卫生问题。而在糖尿病患者中，Ⅱ型糖尿病患者占到95％左右。糖尿病不仅给患者和家庭造成了巨大的痛苦，也带来沉重的社会负担。因此，针对糖尿病的研究至关重要。
目前国内外常用的降糖药物分为三大类：胰岛素促泌剂、胰岛素增敏剂和α葡萄糖苷酶抑制剂。临床上一般采用口服降糖药对糖尿病患者进行治疗。但是长期应用这种治疗方法易引起一些副作用，如腹泻、头晕、恶心、食欲不振、低血糖和肝功能损伤等，严重威胁人们的健康。因此，一种天然的、安全的新型降糖药物或辅助治疗药物的开发变得尤为重要。而将乳酸菌应用于糖尿病的防治研究，近年来已经成为该领域新的研究热点。乳酸菌作为一种安全有效降血糖的生物效应调节剂，几乎无毒副反应，且作用温和、性质稳定、效果明显而持久，对有效防治糖尿病具有十分重要的理论价值和现实意义。
王启宪等研究以副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei GKS6对高血糖小鼠的影响，结果表明喂食14d后GKS6菌株对于抑制血糖上升具有良好效果。中国专利CN201711493835.5提供了一种糖尿病的理疗保健食品，原料包括副干酪乳杆菌，低聚糖，苦瓜等。该糖尿病的理疗保健食品适用于II型糖尿病人群及长期偏好多糖饮食的人群，可达到维持健康的血糖、胆固醇及血压功能；维持健康肝脏功能；发酵后让养分容易被人体吸收功能；能在酸性的消化道生存，可直达小肠保持活性功能；使肠胃健康，提高免疫力等功能。中国专利CN201711350019.9公开了一种副干酪乳杆菌即食型益生菌粉的制备方法，制备得到的即食型益生菌粉，口感良好，服用后可降低血糖。
抑郁症又称抑郁障碍，是一种常见的以情感认知和精神发生变化的神经系统紊乱疾病，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，伴随有意志活动减退、思维迟缓、运动减少或激越、认知功能障碍、无价值感、有自杀自残的心理和行为等，严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。抑郁症的具体发病机制复杂，涉及氧化应激系统、免疫系统、神经系统及行为学改变等多种机体反应体系。目前抑郁症患者多通过服用抗抑郁药物缓解病情，这些抗抑郁药物多以增加单胺类物质水平为目的进行治疗，但是这些抗抑郁药物对至少四分之一的患者并无明显效果，且存在许多副作用，因此一种天然的、安全的新型抗抑郁或辅助治疗抑郁手段变得尤为重要。
龋病是口腔中的常见疾病，虽然病程发展较为缓慢，但是它发病率高、流行区域广泛，而且破坏的牙体组织不能自行修复，不仅影响口腔健康也可影响身体健康，与癌症、心血管疾病一起被联合国世界卫生组织(WHO)列为三大非传染性疾病。经过近50年的广泛研究，目前已有大量证据表明变形链球菌是啮齿动物、灵长目和人类的致龋来源。这种微生物致龋性的主要特征可归纳为其附着在牙面的能力以及通过发酵产生大量的乳酸。因此，如何抑制这种细菌的生长就成了一个比较棘手的问题。目前治疗的方式主要是使用抑制剂，包括氟化钠、氯己定、酪蛋白磷酸多肽以及植物性化合物等。但是这些抑制剂在抑制变形链球菌等致病菌的同时，也抑制其他有益菌如乳酸菌等，长期使用抑制剂疗法，口腔菌群平衡易失调，不利于口腔健康。目前益生菌抑制变形链球菌文献较多。益生菌主要通过抑制变形链球菌生长及其特殊的黏附性能和耐酸性能调控口腔微生态平衡，更安全，更健康。林小龙研究L.casei Shirota，L.plantarum ST-III，L.rhamnosus HN001等对变形链球菌的抑制作用，结果表明5种菌对变形链球菌有显著抑制作用。于亚男等研究唾液链球菌BD3900对口腔益生作用，研究表明该菌株能有效抑制变形链球菌菌膜的形成。
然而副干酪乳杆菌抑制变形链球菌的研究较少，具有降血糖作用同时能有效抑制变形链球菌且具有抗抑郁作用的的副干酪乳杆菌，目前还没有报道。
发明内容:
本发明目的在于提供一株具有降血糖以及保护口腔作用的副干酪乳杆菌及其应用，经过坚持服用一段时间，可以调节和控制血糖，达到降低血糖的作用，解决了大量服用降糖药的健康问题，同时能有效抑制变形链球菌，同时促进其他有益菌如乳酸菌的生长，保护口腔健康。
本发明解决问题所采用的技术方案之一，是提供一株具有降血糖和保护口腔作用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)nbk-LC16，该菌株已于2019年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.19015。
所述的副干酪乳杆菌nbk-LC16分离自传统酸马奶中，挑选革兰氏染色阳性、触媒实验阴性的菌株，经生理生化实验及分子生物学鉴定为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌nbk-LC16。
本发明解决问题所采用的技术方案之二，是提供一种副干酪乳杆菌菌粉，制备方法如下：
(1)将副干酪乳杆菌nbk-LC16进行发酵培养，当发酵液中的活菌数≥3×109cfu/mL时，停止发酵；
(2)从步骤(1)的发酵液中收集菌体，将菌体与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液，将乳化液冷冻干燥，粉碎，得到副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉；
进一步地，所述菌体与冻干保护剂的质量比优选为1:0.5～1.5，更优选为1:0.5～1.0；
进一步地，所述乳化包埋的温度优选为10～25℃，更优选为15～20℃；
进一步地，所述乳化包埋时间为15～50min；
进一步地，所述冻干保护剂包括5～20％海藻糖、5～10％脱脂乳粉、0～5％甘油和余量的水；
进一步地，在获得乳化液后，对乳化液进行预冷冻、真空冷冻干燥、粉碎，得到副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉；所述预冷冻的温度优选为-45～-35℃，更优选为-45～-40℃；所述预冷冻的时间优选为5～8h；所述真空冷冻干燥的温度优选为-40℃～-25℃，更优选为-30℃～-25℃；所述真空冷冻干燥的时间优选为12～50h，更优选为20～40h，最优选为28～38h；所述真空冷冻干燥的真空度优选为0.1～0.3mbar，更优选为0.2mbar；
进一步地，将副干酪乳杆菌nbk-LC16接种至种子培养基中，活化后，得到一级种子液；将一级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养，得到二级种子液；将二级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养得到三级种子液；将三级种子液接种至发酵培养基中进行发酵，离心发酵液，得到菌体；
进一步地，所述种子培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸粉、0.8～1.2％牛肉膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；
优选的，所述种子培养基组成如下：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸粉、0.8～1.2％牛肉膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.1～0.13％吐温80和余量的水；
进一步地，所述活化的时间优选为14～24h，更优选为18～24h；所述活化温度优选为28～42℃，更优选为32～37℃；所述活化时为厌氧培养；
进一步地，一级种子液接种至种子培养基中在厌氧条件下活化18～24h，得到二级种子液；所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(质量百分比)，更优选为3～5％(质量百分比)；一级种子液进行厌氧培养的温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃；
进一步地，二级种子液进行厌氧发酵培养的时间优选为14～18h，更优选为15～16h，发酵温度为30～42℃，接种量为1％～8％(质量百分数)。
进一步地，三级种子液接种至发酵培养基的具体培养方法为：厌氧发酵时间优选为8～12h，更优选为8～10h，发酵温度优选为为30～42℃，更优选为35～40℃，接种量为1％～8％，更优选为3～5％(质量百分比)，种子罐保压优选为0.03～0.05Mpa，搅拌转速优选为25～50r/min，发酵pH优选为5.0～6.0。
进一步地，所述发酵培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％大豆蛋白胨、0.5～3％酵母浸粉、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％海藻酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；
优选的，所述发酵培养基组成如下：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％大豆蛋白胨、1～2％酵母浸粉、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％海藻酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.1～0.13％吐温80和余量的水。
本发明解决问题所采用的技术方案之三，是提供了副干酪乳杆菌nbk-LC16及其菌粉的应用，特别是在制备具有降血糖以及保护口腔作用的药品、保健品、食品或饲料中的应用。
有益效果：
本发明提供了一株降血糖作用的副干酪乳杆菌nbk-LC16，对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶具有较高的抑制率，能显著降低高血糖小鼠PBG，FBG水平，HbA1c，肝脏指数，脾脏指数以及胰岛素水平，增加肝糖原含量，有效改善高血糖小鼠体重，有效降低高血糖小鼠血糖水平；同时能有效抑制变形链球菌，保护口腔健康；且具有一定的抗抑郁作用。
附图说明:
图1副干酪乳杆菌nbk-LC16对高血糖小鼠体重的影响；
图2副干酪乳杆菌nbk-LC16对高血糖小鼠餐前血糖的影响；
图3副干酪乳杆菌nbk-LC16对高血糖小鼠餐后血糖的影响；
图4副干酪乳杆菌nbk-LC16对高血糖小鼠HbA1c和胰岛素水平的影响；
图1-4中，A空白对照组，B模型组，C高剂量组，D中剂量组组，E低剂量组；
图5副干酪乳杆菌nbk-LC16对抑郁大鼠旷场实验移动距离影响；
a与空白组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05；c与阳性对照组相比，P<0.05；
图6副干酪乳杆菌nbk-LC16对抑郁大鼠旷场实验移动速率影响；
a与空白组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05；c与阳性对照组相比，P<0.05；
图7副干酪乳杆菌nbk-LC16对抑郁大鼠糖水偏好程度影响；
a与空白组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05；
图8副干酪乳杆菌nbk-LC16对抑郁大鼠体重变化影响；
a与空白组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05；
图9副干酪乳杆菌nbk-LC16对抑郁大鼠5-HT、DA、NE的影响；
a与空白组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05；
图10副干酪乳杆菌nbk-LC16对抑郁大鼠CORT、CRH的影响
a与空白组相比，P<0.05；b与模型组相比，P<0.05。
具体实施方式:
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比；溶液的百分比“％(m/v)”指100mL溶液中含有溶质的克数。
本发明所提供的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)nbk-LC16，是一株具有降血糖和抑制变形链球菌作用的菌株，该菌株已于2019年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.19015。
所述的副干酪乳杆菌nbk-LC16分离自传统酸马奶中。将无菌采集到的传统酸马奶稀释合适梯度，用四区划线法划线于MRS琼脂平板上。
本发明提供了副干酪乳杆菌菌粉制备工艺，将副干酪乳杆菌nbk-LC16接种至种子培养基中，活化后，得到一级种子液；将一级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养，得到二级种子液；将二级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养得到三级种子液；将三级种子液接种至发酵培养基中进行发酵，离心发酵液，得到菌体；将菌体与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液，将乳化液真空冷冻干燥，粉碎，得到副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉。
所述种子培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸粉、0.8～1.2％牛肉膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0。在本发明中，所述活化的时间优选为14～24h，更优选为18～24h；所述活化温度优选为28～42℃，更优选为35～37℃；所述活化时为厌氧条件；
得到一级种子液后，本发明将一级种子液接种至种子培养基中在厌氧条件下活化18～24h，得到二级种子液，本发明采用的种子培养基与制备一级种子液时的相同。所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(质量百分比)，更优选为3～5％(质量百分比)；一级种子液进行厌氧培养的温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。
得到二级种子液后，本发明将二级种子液接种至种子培养基的具体方法为：厌氧发酵时间优选为14～18h，更优选为15～16h，发酵温度优选为为30～42℃，更优选为35～40℃，接种量为1％～8％，更优选为3～5％(质量百分比)。
得到三级种子液后，本发明将三级种子液接种至发酵培养基的具体方法为：厌氧发酵时间优选为8～12h，更优选为8～10h，发酵温度优选为为30～42℃，更优选为35～40℃，接种量为1％～8％，更优选为3～5％(质量百分比)，发酵罐保压优选为0.03～0.05Mpa，搅拌转速优选为25～50r/min，发酵pH优选为5.0～6.0。
所述发酵培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％大豆蛋白胨、0.5～3％酵母浸粉、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％海藻酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；
优选的，所述发酵培养基组成如下：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％大豆蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％海藻酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.1～0.13％吐温80和余量的水。
按质量百分比计，所述冻干保护剂包括包括5～20％海藻糖、5～10％脱脂乳粉、0～5％甘油和余量的水；所述乳化包埋时间为15～50min，所述乳化包埋的温度优选为10～25℃，更优选为15～20℃；
本发明具体实施过程中，所述发酵液中的活菌数≥3×109cfu/mL时，即可停止发酵；所述发酵液中活菌数的测定方法优选的依据GB4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》绘制生长曲线，根据生长曲线进行判定；所述测定的频率优选为发酵开始后每小时测定一次。
本发明中所述制剂中，将得到的菌体与冻干保护剂混合，进行乳化包埋，得到乳化液；所述菌体与冻干保护剂的质量比优选为1:0.5～1.5，更优选为1:0.5～1.0。
本发明中，将菌体进行乳化包埋的目的在于保护副干酪乳杆菌的活性，降低后续的冷冻干燥步骤对副干酪乳杆菌活菌数和活性的影响。
本发明在获得乳化液后，对乳化液进行预冷冻、真空冷冻干燥、粉碎，得到副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉；所述预冷冻的温度优选为-45～-35℃，更优选为-45℃～-40℃；所述预冷冻的时间优选为5～8h；所述真空冷冻干燥的温度优选为-40℃～25℃，更优选为-30℃～-25℃；所述真空冷冻干燥的时间优选为12～50h，更优选为20～40h，最优选为28～38h；所述真空冷冻干燥的真空度优选为0.1～0.3mbar，更优选为0.2mbar。
本发明还提供了副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉在制备具有降血糖功效的药品、保健品、食品或饲料中的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉的制备方法
本实施例所使用的培养基及冻干保护剂如下：
按质量百分比计，种子培养基组成为：3％葡萄糖、2％蛋白胨、1.5％酵母浸粉、1％牛肉膏、0.5％无水乙酸钠、0.05％硫酸镁、0.06％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.8；
按质量百分比计，发酵培养基组成为：2.3％葡萄糖、2.5％大豆蛋白胨、2％酵母浸粉、0.6％无水乙酸钠、0.06％海藻酸钠、0.05％硫酸镁、0.03％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水。
按质量百分比计，所述冻干保护剂包括包括：10％海藻糖、8％脱脂乳粉、0.5％甘油和余量的水。
1)将副干酪乳杆菌nbk-LC16接种至装有种子培养基的试管中进行活化，37℃恒温培养箱中厌氧培养20h，即得一级种子液。
2)将一级种子液接种至装有种子培养基的三角瓶中，接种量为3％(质量百分比)，37℃恒温培养箱中厌氧培养18h，即得二级种子液。
3)将二级种子液接种至装有种子培养基的三角瓶中，接种量为5％(质量百分比)，37℃恒温培养箱中厌氧培养16h，即得三级种子液。
4)将三级种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中，接种量为5％(质量百分比)，罐保压优选为0.04Mpa，搅拌转速优选为50r/min，发酵pH为6.0，37℃厌氧培养8h。
5)待发酵液活菌数≥5×109cfu/mL时，停止发酵，离心(8000r/min，15min)收集菌体。
6)将菌体与冻干保护剂按照质量比1:0.6进行乳化包埋，乳化温度为20℃，乳化时间为20min；
7)将乳化液-40℃进行预冻6h，-30℃真空冷冻干燥30h，真空度为0.2mbar，粉碎即得副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉，活菌数为5.0×1011cfu/g。
实施例2副干酪乳杆菌nbk-LC16耐酸耐胆盐特性研究
(1)将实施例1得到的副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉分别以1％(w/v)的接种量接于pH为6.0和pH为3.0的MRS培养基中37℃培养3h后采用平板计数法进行活菌计数，结果见表1。
表1副干酪乳杆菌nbk-LC16耐酸性能研究
可以看出，在pH 3.0的条件下，副干酪乳杆菌nbk-LC16在3h后仍有足够数量的活菌可以通过胃部环境。
(2)将实施例1得到的副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉分别以1％(w/v)的接种量接于胆盐浓度为0％(w/v)和胆盐浓度为0.3％的MRS培养基中37℃培养3h后采用平板计数法进行活菌计数，结果见表2。
表2副干酪乳杆菌nbk-LC16耐胆盐性能研究
可以看出，在0.4％的胆盐浓度下，副干酪乳杆菌nbk-LC16有较好的胆盐耐受性。
(3)将一定量的胃蛋白溶解于pH 3.0的PBS缓冲溶液中，调节其终浓度为3g/L，从而获得人工胃液。将一定量的胰蛋白酶溶解于pH 8.0的PBS缓冲溶液中，调节其终浓度为1g/L，从而获得人工肠液。人工胃液和人工肠液均须在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤。
将实施例1得到的副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉分别以1％(w/v)的接种量接于MRS培养基中和人工胃液中37℃培养3h，然后将人工胃液中发酵液以10％接种量接种至人工肠液中37℃培养3h，再采用平板计数法进行活菌计数，结果见表3。
表3副干酪乳杆菌nbk-LC16在人工胃液和人工肠液中耐受情况
可以看出，先经过人工胃液再经过人工肠液，副干酪乳杆菌nbk-LC16有较好耐受性，可以顺利到达肠道定植，发挥功效。
实施例3副干酪乳杆菌nbk-LC16体外降血糖研究
将副干酪乳杆菌nbk-LC16三级种子液在转速为4 000r/min(4℃)的条件下进行离心10min，倒掉上清液取沉淀，用PBS溶液(浓度0.1mol/L，pH＝6.8)清洗2～3次后进行重悬，统一调整菌悬液密度在1×109CFU/mL，制取菌悬液。测定方法如下：
α葡萄糖苷酶抑制率测定方法：在总体积205μL的体系中，其中添加50μL的PBS溶液(浓度0.1mol/L，pH＝6.8)，再加入50μL浓度为20mmol/L的对硝基苯酚-α-D-吡喃葡葡糖苷(PNPG)溶液及25μL待测样，将混合物于37℃孵化10min，加入30μL α葡萄糖苷酶溶液20U/mL继续反应20min，加入50μL浓度为1mol/L Na2CO3作为反应终止液，将反应液于405nm处测其吸光值，吸光值与对硝基苯酚PNP的游离量成正比，反应体系中采用pH值为6.8浓度为0.1mol/L的PBS溶液作为α葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照。进行反应后计算乳酸菌对仪一葡萄糖苷酶抑制性，其抑制率计算公式为
α-葡萄糖苷酶抑制率＝[1-(A-B)/(C-D)]×100％；
式中：A为样品组-含有样品溶液以及α葡萄糖苷酶溶液；B为样品空白组-含有样品溶液不含α葡萄糖苷酶溶液；C为对照组-不含有样品溶液含α葡萄糖苷酶溶液；D为空白组-不含有样品溶液以及α葡萄糖苷酶溶液。
α淀粉酶抑制率测定方法：取质量浓度为2mg/mL用pH值为7.0的磷酸缓冲液配制的α淀粉酶溶液2mL，加2mL样液(即乳酸菌菌悬液)，37℃下反应30min后加2mL质量分数为1％的可溶性淀粉，37℃下反应15min，加碘液显色，在660nm测OD值。抑制率计算公式为
α淀粉酶抑制率＝[1-(A-B/C-D)]×100％；
式中：A为样品空白组含有样品溶液不含α淀粉酶溶液；B为样品组含有样品溶液以及α淀粉酶溶液；C为空白组不含有样品溶液以及α淀粉酶溶液；D为对照组不含有样品溶液含α淀粉酶溶液。
结果如下表4：
表4副干酪乳杆菌nbk-LC16对α葡萄糖苷酶和α淀粉酶的抑制情况研究
| 项目 | α葡萄糖苷酶抑制率(％) | α淀粉酶抑制率(％) |
| 抑制率 | 32.35±1.32 | 28.65±0.86 |
副干酪乳杆菌nbk-LC16定植于人体肠道内，其对小肠α葡萄糖苷酶和α淀粉酶活力的抑制，可延缓碳水化合物的消化和吸收，从而降低餐后高血糖。
实施例4副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉在降低小鼠血糖中的应用
1、试验材料
实验动物：60只雄性C57BL/6J小鼠，3周龄，13～15g。
试验对象：以实施例1所得副干酪乳杆菌nbk-LC16冻干粉为样品。
2、动物分组、造模及给药方法
将小鼠随机分为5组，基础饲料适应性喂养一周。从第2周开始，模型组、高剂量组、中剂量组和低剂量组喂养高脂高糖饲料，空白组喂养正常小鼠饲料。3周后，模型组、高剂量组、中剂量组和低剂量组以100mg/kg的剂量腹腔注射STZ，构建糖尿病模型，同时空白对照组注射同等剂量的柠檬酸缓冲液。造模一周后，测定小鼠随机血糖，血糖值高于11mmol/L的为造模成功小鼠。造模成功后按照以下方案进行灌胃：
A空白对照组：每天灌胃生理盐水0.1ml/10g.bw，连续8W。
B模型组：每天灌胃生理盐水0.1ml/10g.bw，连续8W。
C高剂量组：称取1g副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉于500ml无菌生理盐水中，即得副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉灌胃液，灌胃剂量为0.1ml/10g.bw，连续8W。
D中剂量组组：称取0.1g副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉于500ml无菌生理盐水中，即得nbk-LC16菌粉灌胃液，灌胃剂量为0.1ml/10g.bw，连续8W。
E低剂量组：称取0.01g副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉于500ml无菌生理盐水中，即得nbk-LC16菌粉灌胃液，灌胃剂量为0.1ml/10g.bw，连续8W。
实验期间记录小鼠体重及精神面貌，每周测定小鼠血糖值并记录。小鼠隔夜禁食不禁水后，取尾部血液，测定其FBG值。小鼠喂食饲料2h后，测定其PBG值。实验结束时，五组小鼠均隔夜禁食12h后，称重，眼球取血。测定脏器指数，HbA1c，胰岛素含量及肝糖原含量。
如图1，造模成功后模型组，高剂量组，中剂量组和低剂量组小鼠体重持续下降，灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉3W(第7W)小鼠体重开始增加，且增加趋势都大于模型组，其中高剂量组增加趋势最明显，表明灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉后对小鼠高血糖导致的体重降低有一定的改善作用。
如图2图3，造模成功后，模型组、高剂量组、中剂量组和低剂量组小鼠的FBG和PBG水平迅速增加且远高于正常水平。灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉4W(第8W)前，小鼠血糖保持不变，之后FBG和PBG下降，且均低于模型组，其中高剂量组降血糖效果最显著(P<0.05)。试验结果表明灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉后对高血糖小鼠血糖降低有一定作用，且需要连续灌胃一段时间。
如表5，脾脏作为体内的主要免疫器官之一，其脏器指数对于巨噬细胞的吞噬活性、细胞免疫及体液免疫等功能具有重要影响。肝脏是糖代谢发生的主要器官，在机体血糖的调节中发挥很重要的作用。造模成功后，模型组小鼠脾脏指数，肝脏指数和肾脏指数明显增加，出现肿大现象，灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉8W后，均有不同程度降低，其中脾脏指数和肝脏指数，高剂量组和中剂量组显著降低(p<0.05)，肾脏指数降低不显著(P>0.05)，说明副干酪乳杆菌nbk-LC16对高血糖小鼠脏器有一定的保护作用。
表5副干酪乳杆菌nbk-LC16对脏器指数的影响
注：*表示与模型组相比较差异显著(p<0.05)
如表6，肝糖原对维持血糖水平的相对稳定有重要作用。造模成功后模型组小鼠肝糖原含量明显降低，灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉8W后，高剂量组和中剂量组肝糖原含量显著增加(p<0.05),低剂量组增加不显著(P>0.05)。试验结果表明副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉能促进血液中多余的糖转化为肝糖原，从而维持血糖的相对稳定。
表6副干酪乳杆菌nbk-LC16对肝糖原含量的影响
注：*表示与模型组相比较差异显著(p<0.05)
如图4，糖化血红蛋白(HbA1c)可反映取血前2～3月血糖的平均水平，在糖尿病治疗中，糖化血红蛋白水平对评价血糖总体控制、发现治疗中存在的问题以及指导治疗方案均有重要的临床意义。胰岛素是由胰岛B细胞分泌而来，主要作用在肝脏、肌肉和脂肪中，控制着体内糖类、蛋白质、脂肪的合成与代谢。灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉8W后与模型组相比较，高剂量组和中剂量组显著降低(p<0.05)，低剂量组降低不显著(P>0.05)，表明副干酪乳杆菌nbk-LC16具有降低HbA1c的作用。造模后模型组小鼠胰岛素水平上升，灌胃后胰岛素水平有明显降低，其中高剂量组和中剂量组有显著性差异(p<0.05)，低剂量组无显著性差异(P>0.05)。试验结果表明灌胃副干酪乳杆菌nbk-LC16对胰岛素水平降低有一定作用，缓解高胰岛素血症。
实施例5副干酪乳杆菌nbk-LC16体外抑制变形链球菌的应用
试验对象：实施例1中副干酪乳杆菌nbk-LC16三级种子液，变形链球菌UA159来自华西口腔医院。
将变形链球菌UA159在BHI培养基中培养24h，将副干酪乳杆菌nbk-LC16三级种子液分别用0.85％NaCl溶液洗涤两次并调整至1×108CFU/mL,同时收集副干酪乳杆菌nbk-LC16发酵上清液，过0.22μm滤膜。分别将0.25mL副干酪乳杆菌nbk-LC16菌悬液+0.25mL变形链球菌UA159菌悬液以及0.25mL副干酪乳杆菌nbk-LC16发酵上清液+0.25mL变形链球菌UA159菌悬液添加于1.5mLBHI培养基中37℃培养，于0h，12h，24h平板计数法进行变形链球菌活菌计数，结果见表7。
表7副干酪乳杆菌nbk-LC16抑制变形链球菌
可以看出，副干酪乳杆菌nbk-LC16活菌以及发酵上清液对变形链球菌UA159均有显著性抑制作用(p<0.05)。
实施例6副干酪乳杆菌nbk-LC16口腔抑制变形链球菌的应用
1、试验材料
实验人群：25-30岁50人(其中男23人，女27人)考虑邀请的对象必须少于两颗牙齿有龋齿，没有牙周病，不吸烟，每天使用含氟牙膏刷牙。排除标准为(1)食用益生菌或益生元；(2)在6周内全身服用抗生素药物；(3)有全身性或严重的慢性疾病；(4)正在接受牙齿矫正治疗。
试验对象：以实施例1所得副干酪乳杆菌nbk-LC16冻干粉为样品。
2、试验方法
将自愿人群随机分为两组，连续8W服用：
对照组：每天食用2克脱脂奶粉；
实验组：每天食用2克脱脂奶粉+0.1克实施例1所得副干酪乳杆菌nbk-LC16冻干粉。
采用10mL 0.85％NaCl溶液冲洗口腔收集0W、4W以及8W自愿者唾液，分别用选择性培养基法测定唾液变形链球菌和乳酸菌的典型菌落数量，计数结果取对数值，结果如下表8。
表8副干酪乳杆菌nbk-LC16对口腔中变形链球菌的抑制作用
摄入副干酪乳杆菌nbk-LC16冻干粉4W及8W后口腔中变形链球菌数量显著降低，而乳酸菌数量显著增加，表明副干酪乳杆菌nbk-LC16对变形链球菌有很好的抑制作用，一方面能补充口腔益生菌，一方面能改善口腔环境，促进口腔内其他乳酸菌增殖，有助于缓解牙菌斑及龋齿形成，有助于保护口腔和牙齿健康。
实施例7副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉制备固体饮料中的应用
将实施例1中得到的副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉1％、麦芽糊精35％、乳糖醇24％、低聚果糖20％以及低聚半乳糖20％混合，即可得到具有降血糖、保护口腔牙齿功能的固体饮料。实施例8副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉在发酵饮料中的应用
将0.7kg水、0.15kg浓缩苹果汁、0.15kg浓缩菠萝汁混匀，接种副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉0.2g，30℃发酵48h，发酵终点pH为3.48，即得具有降血糖功能的发酵果蔬汁饮料。
实施例9副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉在发酵乳中的应用
将0.15kg脱脂奶粉、0.05kg低聚果糖、0.8kg水混合均匀，保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌：副干酪乳杆菌nbk-LC16按1:2:3活菌数比例接种(总接种量为1×107CFU/g)，42℃发酵7h，发酵终点pH为4.5，即得具有降血糖功能的发酵乳。
实施例10副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉在干预抑郁大鼠中的应用
1、试验材料
实验动物：48只SPF级成年雄性SD大鼠，体重(183.65±10.49)g。
试验对象：以实施例1所得副干酪乳杆菌nbk-LC16冻干粉为样品。
2、动物分组、造模及干预方式
将大鼠随机分笼，每笼6只，室温下自然昼夜节律光照、自由饮食饮水的条件下适应环境一周(记为第0周)，同时进行旷场实验、糖水消耗实验及24h食物消耗实验以获得各行为学实验的基线值。适应性喂养结束后称重，按体重随机分为4组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组和副干酪乳杆菌nbk-LC16干预组，每组12只。
除空白对照组外，其他各组动物接受CUMS模型建立抑郁大鼠模型，将昼夜颠倒24h、倾斜24h、4℃冰水游泳5min、40℃热应激5min、禁水24h、禁食24h及垫料潮湿24h共7种刺激随机分配，每天采用1种刺激，同种刺激不连续出现，连续造模3周(记为第1-3周)。
连续造模3周后开始为期4周(记为第4-7周)的干预期，干预期内除空白对照组外，其他各组动物仍然接受CUMS刺激。干预期每天在刺激前1h按照体重灌胃：副干酪乳杆菌组给予副干酪乳杆菌nbk-LC16 8×108CFU/kg/d，阳性对照组给予帕罗西汀1.8mg/kg/d，空白对照组和模型对照组均给予生理盐水1.8mg/kg/d。
分别于适应期结束(第0周)、造模结束(第3周)及干预结束(第7周)进行旷场实验(即在光线较暗且安静的屋内放置长宽高为45cm×45cm×45cm的敞箱，敞箱底部及四周均为黑色。将大鼠放入敞箱中央，记录大鼠在安静环境中5min内的活动情况。)和糖水消耗实验(即实验大鼠禁食禁水24h后给予两个已分别称重的水瓶，一瓶为纯水，另一瓶为1％的蔗糖水，6h后调换两个水瓶的位置，12h后取下水瓶称重，由称重前后的差值计算糖水偏爱百分比，即糖水偏爱百分比＝糖水消耗/总液体消耗×100％。)；同时记录实验大鼠间隔24h食物消耗和体重变化(即实验大鼠禁食禁水24h后给予足量准确称量的普通饲料，24h后称量剩余饲料重量，同时称动物体重。24h摄食量＝(食物总量－食物余量)/体重×100％，体重变化率＝(本周体重－第0周体重)/本周体重。)；干预实验结束后处死大鼠，测定脑匀浆5-HT、NE、DA；血浆CORT、CRH水平。
如图5、6结果显示，旷场实验中造模前各组大鼠移动速率和距离无显著差异；造模后，与空白对照组相比，其他模型组大鼠的移动距离和移动速率均显著减少(P<0.05)，表明造模成功；干预结束后，与模型对照组相比，阳性对照组及副干酪乳杆菌干预组的移动距离和移动速率均显著增加(P<0.05)，且副干酪乳杆菌nbk-LC16干预组显著高于帕罗西汀阳性对照组(P<0.05)。说明副干酪乳杆菌nbk-LC16可以促进提升抑郁大鼠对新环境的好奇程度和在新环境中的探索能力，与帕罗西汀阳性对照组比较，副干酪乳杆菌nbk-LC16效果更显著。
如图7结果显示，糖水消耗实验中造模前各组大鼠糖水偏好程度之间无显著性差异；在刺激源作用下，与空白对照组相比，其余各组大鼠对糖水的偏爱程度均显著下降(P<0.05)，表明造模成功；干预后结果显示，与模型对照组相比，阳性对照组及副干酪乳杆菌干预组的糖水偏好程度均显著增加(P<0.05)。糖水消耗实验能够反映实验动物的欣快感变化，结果表明副干酪乳杆菌nbk-LC16可以显著提升抑郁大鼠的欣快感。与帕罗西汀阳性对照组比较，副干酪乳杆菌nbk-LC16与阳性药物效果相当。
如图8结果显示，干预实验开始，模型对照组的体重增长速率显著慢于空白对照组(P<0.05)，而副干酪乳杆菌nbk-LC16干预组大鼠的体重增长速率在第4周至第6周显著高于模型对照组(P<0.05)，结果表明副干酪乳杆菌nbk-LC16对抑郁大鼠的体重增长有一定效果。
图9结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠5-HT、DA、NE均显著下降(P<0.05)，表明造模成功。与模型对照组相比，阳性对照组及副干酪乳杆菌nbk-LC16干预组大鼠5-HT、DA、NE均显著升高(P<0.05)，表明副干酪乳杆菌nbk-LC16具有升高抑郁大鼠脑组织单胺类神经递质5-HT、DA、NE的作用。与帕罗西汀阳性对照组比较，副干酪乳杆菌nbk-LC16与阳性药物效果相当。
图10结果显示，与空白对照组相比，模型对照组大鼠CORT、CRH均显著上升(P<0.05)，表明造模成功。与模型对照组相比，阳性对照组及副干酪乳杆菌nbk-LC16组大鼠CORT、CRH均显著下降(P<0.05)，HPA轴的变化与情绪障碍的发展有关，持续应激状态下会造成抑郁大鼠HPA轴功能紊乱，皮质醇持续升高，结果表明副干酪乳杆菌nbk-LC16具有降低抑郁大鼠CORT、CRH的作用。与帕罗西汀阳性对照组比较，副干酪乳杆菌nbk-LC16与阳性药物效果相当。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌具体为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)nbk-LC16，保藏编号为CGMCC NO.19015。
2.包含权利要求1所述副干酪乳杆菌nbk-LC16的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，是将副干酪乳杆菌nbk-LC16菌体与冻干保护剂混合后进行乳化包埋并冷冻干燥，粉碎获得的。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，制备方法如下：
(1)将副干酪乳杆菌nbk-LC16进行发酵培养，当发酵液中的活菌数≥3×109cfu/mL时，停止发酵；
(2)从步骤(1)的发酵液中收集菌体，将菌体与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液，将乳化液冷冻干燥，粉碎，得到副干酪乳杆菌nbk-LC16菌粉。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括5～20％海藻糖、5～10％脱脂乳粉、0～5％甘油和余量的水；所述菌体与冻干保护剂的质量比为1:0.5～1.5；乳化包埋的温度为10～25℃，时间为15～50min。
6.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，是通过发酵培养获得，具体如下：将副干酪乳杆菌nbk-LC16接种至种子培养基中活化后，得到一级种子液；将一级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养，得到二级种子液；将二级种子液接种至种子培养基中，厌氧培养得到三级种子液；将三级种子液接种至发酵培养基中进行发酵，离心发酵液，得到菌体；
所述种子培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸粉、0.8～1.2％牛肉膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；
所述发酵培养基包括以下质量百分比含量的原料：1～3％葡萄糖、1～3％大豆蛋白胨、0.5～3％酵母浸粉、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％海藻酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0。
7.权利要求1所述副干酪乳杆菌或权利要求2所述包含副干酪乳杆菌nbk-LC16的菌剂的应用，其特征在于，具体是在制备具有降血糖和/或保护口腔作用和/或抗抑郁的药品、保健品、食品或饲料中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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