CN116077536A - 一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用。所述微生态活菌制剂包括保藏编号为CGMCC NO.1.12733的罗伊氏乳杆菌Limosilactobacillus reuteri LR08菌株和小檗碱。本发明创造性地发现罗伊氏乳杆菌LR08菌株能够显著缓解肥胖相关代谢疾病，小檗碱能够提高罗伊氏乳杆菌LR08菌株在胃肠道的定植能力，增强其相关适应症功效，可以显著减轻高脂诱导肥胖小鼠的代谢综合征、显著降低肥胖小鼠炎症水平、改善代谢机体代谢水平、调节肠道菌群丰度和短链脂肪酸水平。因此，本发明在制备用于预防、缓解或治疗肥胖相关代谢疾病产品中具有很好的前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
人类正面临着代谢综合征(Metabolic Syndrome,MS)的大流行时代，其症状包括肥胖、高血糖、胰岛素抵抗、高脂血症和高血压。越来越多的证据表明，高脂肪/高热量饮食(HFD)诱导的肠道微生物群失调在肥胖、胰岛素抵抗和MS的其他特征的发展中起着关键作用。有益细菌的减少和促炎/致病菌的增加一直与人类和啮齿动物中肥胖、脂肪组织和全身炎症和代谢合并症的发展有关。肠道微生物群可通过与宿主之间的一系列分子相互作用影响代谢活动、调节肠道通透性、特异性消耗膳食底物、产生短链脂肪酸等功能性代谢产物、刺激脑肠轴等方式改善肥胖及其并发症。目前，调整饮食结构、补充益生菌是研究最为广泛的调节肠道菌群的方法，可以特异性地改变肠道菌群构成，然而现有的益生菌开发工艺存在技术难点，比如益生菌活菌数、生产稳定性以及菌株体内的定植能力以及益生菌应用到临床前动物试验和临床研究中的功效不显著等问题。
小檗碱，又称黄连素(berberine，BBR)，是一种属于原小檗碱类的苄基异喹啉季铵生物碱，也是一种安全的天然化合物，可通过多种机制调节肥胖相关基因的表达。近年来在心血管疾病、糖脂代谢影响方面的研究显示小檗碱在降脂方面具有优异的治疗前景，其作用机制可能与调节肠道菌群结构、影响胆汁酸的合成与代谢、激活内脏脂肪组织相关基因的表达、激活腺自酸活化蛋白激酶(AMPK)途径、改善胰岛素抵抗、抑制促炎细胞因子的产生达到抗炎作用等有关，具有广泛的药理活性，是治疗肥胖及其并发症的潜在药物。小檗碱对人体肠道菌的调节作用是近些年的研究热点，若能将小檗碱与功能益生菌联合利用，提高功能益生菌在胃肠道的定植能力，增强其相关适应症功效，或许可以成为微生态活菌制剂改善肥胖相关代谢疾病的一个新的作用靶点和非常健康的治疗方案，解决长期使用常规抗生素治疗及其他化学药物治疗所导致的潜在的不良反应等问题，具有广阔的市场应用前景。
因此，提供一种含小檗碱的微生态活菌制剂能够改善肥胖相关代谢疾病的产品，用以改善肥胖等代谢疾病是目前亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂包括保藏编号为CGMCC NO.1.12733的罗伊氏乳杆菌Limosilactobacillusreuteri LR08菌株和小檗碱。
所述罗伊氏乳杆菌是已被纳入《可用于食品的菌种名单》的一种益生菌，因此，罗伊氏乳杆菌LR08对人体而言，相对健康，且不易产生不良反应，现也称为罗伊氏黏乳杆菌。本发明创造性地发现所涉及的罗伊氏乳杆菌LR08菌株能够显著缓解肥胖相关代谢疾病，具体表现在：(1)显著减轻高脂诱导肥胖小鼠的代谢综合征；(2)显著降低改善肥胖小鼠炎症水平，调整血清LBP水平，减轻体内毒素负荷；(3)激活细胞能量代谢AMPK通路，改善代谢机体代谢水平；(4)调节肠道菌群丰度和短链脂肪酸水平。小檗碱是一种安全的天然化合物，可通过多种机制调节肥胖相关基因的表达。同时小檗碱对人体肠道菌具有一定的调节作用，小檗碱与罗伊氏乳杆菌LR08联合使用，可以提高罗伊氏乳杆菌LR08在胃肠道的定植能力，促进上述功效的发挥。
优选地，所述用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08菌株的活菌数不低于1×109CFU/mL，例如1×109CFU/mL、2×109CFU/mL、3×109CFU/mL、4×109CFU/mL、5×109CFU/mL、6×109CFU/mL、7×109CFU/mL、8×109CFU/mL、9×109CFU/mL、1×1010CFU/mL等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂中小檗碱的质量百分含量为0.1-1.8％，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
当小檗碱以上述特定的含量添加时，所述微生态活菌制剂在改善肥胖相关代谢疾病上的效果最佳。
优选地，所述用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂还包括益生元和/或黄芪。
本发明创造性地发现，黄芪的添加能够进一步提高微生态活菌制剂改善肥胖相关代谢疾病的效果，且黄芪和小檗碱在提高罗伊氏乳杆菌LR08在胃肠道的定植能力，提高上述效果上具有一定的协同作用。
优选地，所述用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂中黄芪的质量百分含量为0.05-1.5％；例如0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
当黄芪以上述特定含量添加时，在改善肥胖相关代谢疾病上的效果最好。
优选地，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉或螺旋藻中任意一种或至少两种的组合，优选为低聚果糖。
本发明创造性地发现，低聚果糖对罗伊氏乳杆菌在预防或治疗肥胖相关代谢疾病功效上的发挥的促进优于其他益生元。
优选地，所述用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌与益生元的比例为(1×109)CFU:(1-10)mg，其中(1-10)中均可选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
当益生元与罗伊氏乳杆菌LR08以上述特定比例配合时，对罗伊氏乳杆菌LR08功效的促进达到最佳。
优选地，所述微生态活菌制剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
优选地，所述微生态活菌制剂还包括保护剂。
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、明胶、糊精、乳糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂的制备方法，所述制备方法包括：在含有小檗碱的培养基中培养罗伊氏乳杆菌LR08菌株，离心得到菌泥，将菌泥、小檗碱与保护剂混合，冻干，即得。
优选地，所述培养基中小檗碱的含量为1-10g/L，例如1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养基以质量浓度计包括：蛋白胨0-15g/L、牛肉膏0-15g/L、葡萄糖15-25g/L、小檗碱1-10g/L、酵母粉3-7g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、K2PO4·3H2O 2-3g/L、MgSO4·7H2O 0.05-0.2g/L、MnSO4 0.01-0.1g/L、吐温80 0.5-2mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.1-1g/L。
所述蛋白胨的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L等，所述牛肉膏的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L等，所述葡萄糖的含量可以选择15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L、25g/L等，所述小檗碱的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L，所述酵母粉的含量可以选择3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L，所述柠檬酸氢二铵的含量可以选择1g/L、2g/L、3g/L，所述K2PO4·3H2O的含量可以选择2g/L、2.5g/L、3g/L等，所述MgSO4·7H2O的含量可以选择0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L等，所述MnSO4的含量可以选择0.01g/L、0.02g/L、0.03g/L、0.04g/L、0.05g/L、0.06g/L、0.07g/L、0.08g/L、0.09g/L、0.1g/L，所述吐温80的含量可以选择0.5mL/L、1mL/L、1.5mL/L、2mL/L等，所述半胱氨酸氨酸盐的含量可以选择0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述冻干为真空冷冻。
第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂在制备用于预防、缓解或治疗肥胖相关代谢疾病产品中的应用。
优选地，所述肥胖相关代谢疾病包括糖尿病、高脂血症或高尿酸血症。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地发现所述含小檗碱的罗伊氏乳杆菌微生态活菌制剂能够显著改善肥胖相关代谢疾病以及降糖减脂，罗伊氏乳杆菌LR08菌株能够显著缓解肥胖相关代谢疾病，小檗碱能够提高罗伊氏乳杆菌LR08菌株在胃肠道的定植能力，增强其相关适应症功效，具体表现在：(1)显著减轻高脂诱导肥胖小鼠的代谢综合征；(2)显著降低改善肥胖小鼠炎症水平，调整血清LBP水平，减轻体内毒素负荷；(3)激活细胞能量代谢AMPK通路，改善代谢机体代谢水平；(4)调节肠道菌群丰度和短链脂肪酸水平。因此，将其用于制备用于预防和/或治疗肥胖相关代谢疾病的产品中具有很好的前景。
附图说明
图1是小鼠体重增长情况结果图，**表示与HFD组对比，结果有统计学差异，p<0.01。
图2是小鼠口服葡萄糖耐量结果图。
图3是小鼠空腹血糖、空腹胰岛素及HOMA-IR结果图，其中图3a是小鼠空腹血糖结果图，图3b是小鼠空腹胰岛素结果图，图3c是小鼠HOMA-IR结果图，**表示与HFD组对比，结果有统计学差异，p<0.01。
图4是小鼠脂多糖结合蛋白及小鼠按体重校准后的血清脂联素浓度，其中图4a是小鼠脂多糖结合蛋白结果图，图4b是小鼠按体重校准后的血清脂联素浓度结果图，**表示与HFD组对比，结果有统计学差异，p<0.01。
图5是小鼠脂肪组织中TNF-α和AMPK-α1的表达水平，其中图5a是小鼠脂肪组织中TNF-α表达水平的结果图，图5b是小鼠脂肪组织中AMPK-α1的表达水平的结果图，**表示与HFD组对比，结果有统计学差异，p<0.01。
图6是小鼠肠道菌群丰富度及多样性的结果图，其中图6a是小鼠肠道菌群丰富度的结果图，图6b是小鼠肠道菌群多样性的结果图，**表示与HFD组对比，结果有统计学差异，p<0.01。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述内容中涉及的罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌LimosilactobacillusreuteriLR08菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.1.12733，保藏日期为2020年7月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述内容中涉及的改良MRS培养基以浓度计包括：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、小檗碱3g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
下述实施例涉及的产品中包含的功效成分来源方式如下(仅体现功效成分，其他市售原料中含有的必要辅料成分不再赘述)：
小檗碱来源于购自广州佳途科技股份有限公司的商品名为黄连素的产品；
黄芪来源于购自兰州沃特莱斯生物科技有限公司的商品名为黄芪粉的产品；
低聚果糖来源于购自量子高科集团有限公司的商品名为低聚果糖的产品；
低聚木糖来源于购自山东龙力生物科技股份有限公司的商品名为低聚木糖的产品。
实施例1
本实施例提供一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、小檗碱的质量百分含量为0.8％、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
其制备方法为：
将罗伊氏乳杆菌LR08菌株按照2％的接种量接种到改良MRS培养基中，于37℃下培养24h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体、含有低聚果糖的0.5％脱脂奶粉溶液和小檗碱混合，得到重悬液，所述含有低聚果糖的脱脂奶粉溶液与菌体的质量比为2:1；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，即得。
实施例2
本实施例提供一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、黄芪的质量百分含量为0.8％、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
实施例3
本实施例提供一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、小檗碱的质量百分含量为0.4％、黄芪的质量百分含量为0.4％、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
实施例4
本实施例提供一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、小檗碱的质量百分含量为0.4％、黄芪的质量百分含量为0.4％、低聚木糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
对比例1
本对比例提供一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08的活菌数为1×109CFU/mL、低聚果糖的质量百分含量为0.1％。
制备方法参考实施例1。
测试例1
罗伊氏乳杆菌LR08耐胃酸能力：
(1)制备人工胃液：以质量分数计，人工胃液中含有0.2％的NaCl以及0.3％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
(2)耐胃酸能力测试：分别取1.0mL罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L1组(浓度为1×109CFU/mL)、含0.8％小檗碱的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L2组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.8％黄芪的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L3组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.4％小檗碱和0.4％黄芪的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L4组(浓度为1×109CFU/mL)。采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度，分别与9.0mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始0h和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表1。
表1
| 组别 | 人工胃液pH2.0 | 人工胃液pH2.5 | 人工胃液pH3.0 |
| L1组 | 80.2％ | 90.4％ | 95.0％ |
| L2组 | 82.3％ | 91.0％ | 95.2％ |
| L3组 | 82.9％ | 91.0％ | 95.5％ |
| L4组 | 84.8％ | 95.3％ | 97.7％ |
罗伊氏乳杆菌LR08耐胆盐能力：
(1)制备10％牛胆盐：称取10.0g牛胆盐(沃凯，国药集团化学试剂有限公司，中国上海)至100mL无菌水中，0.22μm滤膜过滤除菌。
含0.1％胆盐MRS培养基：按说明书配制MRS培养基(北京索莱宝科技有限公司)，高压蒸汽灭菌(121℃，15min)后，加入适量10％牛胆盐溶液至终浓度为0.1％。
(2)耐胆盐能力测试：分别取1.0mL罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L1组(浓度为1×109CFU/mL)、含0.8％小檗碱的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L2组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.8％黄芪的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L3组(浓度为1×109CFU/mL)，含0.4％小檗碱和0.4％黄芪的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液L4组(浓度为1×109CFU/mL)。采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度，与9.0mL含0.1％牛胆盐MRS培养基混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率(％)＝N1/N0×100％，其中，N1：胆盐处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表2。
表2
| 组别 | 存活率 |
| L1组 | 58.4％ |
| L2组 | 62.7％ |
| L3组 | 63.1％ |
| L4组 | 85.2％ |
由表1和表2可以看出，对比常规培养的L1组，LR08在发酵培养过程中以及在冻干保护过程中添加了小檗碱这一组分后，其耐胃酸和胆盐能力有了明显的提升，即小檗碱的使用，可以在发酵培养和冻干保护过程中促进菌株的增殖生长，提高菌株耐受性，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达82.3％；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达91％；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达95.2％。黄芪和小檗碱的使用提高菌株耐受性上具有一定的协同作用。良好的胃酸和胆盐耐受能力为其在胃肠道定植，维持胃肠道黏膜屏障稳态以及制备预防、改善或治疗肥胖相关代谢疾病的产品创造了条件。
测试例2
测试含小檗碱的罗伊氏乳杆菌LR08对肥胖小鼠体重、代谢水平、细胞因子表达、AMPK作用通路以及肠道菌群丰度的影响：
(1)动物分组和建立肥胖小鼠模型：
雄性SPF级C57BL/6J小鼠56只，10周龄，体重22-25g，由上海实验动物中心提供。将小鼠饲养于笼内，环境清洁安静，温度23-25℃，湿度60％。所有涉及小鼠的程序均符合上海市实验动物护理与动物实验中心提供的指导原则(许可证号2022122006)。经过2周的适应期，56只小鼠随机分成7组，每组8只。小鼠饲料均购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
对照组(CTL组)：正常饲料；模型组(HFD组)：高脂饲料；干预组(L1组)：高脂饲料+对比例1所述微生态活菌制剂(每只小鼠每天灌胃1×108CFU)；干预组(L2组)：高脂饲料+实施例1所述微生态活菌制剂(每只小鼠每天灌胃1×108CFU)；干预组(L3组)：高脂饲料+实施例2所述微生态活菌制剂(每只小鼠每天灌胃1×108CFU)；干预组(L4组)：高脂饲料+实施例3所述微生态活菌制剂(每只小鼠每天灌胃1×108CFU)；干预组(L5组)：高脂饲料+实施例4所述微生态活菌制剂(每只小鼠每天灌胃1×108CFU)。
小鼠粪便和血液样品、组织收集：干预持续12周，每周测量每只小鼠的体重，并计算12周小鼠体重增长情况(结果如图1)。在基线和试验结束时，收集小鼠粪便样本，并立即保存在-80℃下，用于后续肠道菌群分析。第12周结束时，禁食5h后，从小鼠眼眶采集血液，于4℃下3000rpm离心15min分离血清，-80℃保存，以备后续生化检测。所有动物均颈椎脱位处死，并立即切除每只小鼠的肝脏和空肠。对于肝脏，取最大肺叶自由端，保存在特殊样品储存液RNALater(Ambion,Austin,USA)中，固定端在多聚甲醛中取样。空肠切除距离幽门菌1.5cm处2cm的肠组织，保存在RNALater中。收集盲肠内容物，在液氮中快速冷冻，然后在-80℃保存，直到分析。
根据图1结果，经过12周的干预，对比CTL组小鼠，HFD组小鼠的体重增长较为显著，在常规培养的罗伊氏乳杆菌LR08干预下，肥胖小鼠的体重增长情况有所减缓，而在含小檗碱的益生菌LR08微生态活菌制剂的干预下，肥胖小鼠体重增长情况进一步减缓，即小檗碱的使用提高了益生菌LR08减重的功效，小檗碱和黄芪在提高罗伊氏乳杆菌LR08减重的功效上具有一定的协同作用，低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(2)口服葡萄糖耐量试验：
试验结束时，在禁食6h后，以1.5g/kg体重的剂量口服葡萄糖(购于Sigma公司)。在口服葡萄糖前和口服葡萄糖后第15min、30min、60min、120min分别取尾巴血样，用血糖仪(购于Accu-Check，罗氏诊断公司)进行测定。口服葡萄糖前的血糖水平代表空腹血糖水平。
结果如图2所示，对比CTL组，HFD组小鼠口服葡萄糖耐量水平明显提高且清除能力较差，无法在正常时间内恢复正常水平，而益生菌L1组能够提高肥胖小鼠葡萄糖清除能力，而L2干预组能够进一步提高肥胖小鼠葡萄糖清除能力，小檗碱的添加提高了益生菌LR08在肥胖小鼠机体糖代谢能力。黄芪的添加能够进一步提高使肥胖小鼠的机体糖代谢能力，且小檗碱和黄芪在上述功效上具有一定的协同作用，低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(3)胰岛素抵抗，空腹血糖和胰岛素水平测定：
小鼠空腹血糖的测定：小鼠尾部椎体采血，采用Accu-Check Performa试纸(购于Roche公司)测定血糖含量。空腹12h后，测量一次空腹血糖。
血清胰岛素水平的测定：采用酶联免疫吸附试验(所用试剂购于武汉纯度生物)。样本为糖耐量实验中腹腔注射葡萄糖15min时的各组小鼠血清。具体的实验步骤按照试剂盒说明书进行。
胰岛素抵抗指数也称为HOMA-IR指数，可以用空腹血糖和空腹胰岛素数值评估机体胰岛素抵抗的数学模型，HOMA-IR＝空腹血糖×空腹胰岛素/22.5，其中空腹血糖单位是mmol/L，空腹胰岛素的单位是μU/mL，系数22.5是矫正因子。(参考文献：Kanauchi M.A newindex of insulin sensitivity obtained from the oral glucose tolerance testapplicable to advanced type 2diabetes.Diabetes Care.2002Oct；25(10):1891-2.)
结果如图3所示，与CTL组小鼠相比，HFD小鼠出现代谢综合征的标志性特征，包括空腹血糖和空腹胰岛素升高，胰岛素抵抗HOMA-IR水平增加。罗伊氏乳杆菌LR08干预后能显著降低高脂饮食引起的空腹血糖和胰岛素水平升高，从而影响HOMA-IR水平。使用含有小檗碱的罗伊氏乳杆菌LR08的微生态活菌制剂干预后，肥胖小鼠的代谢异常情况能够得到更为有效的改善，黄芪的添加能够进一步降低肥胖小鼠的空腹血糖和空腹胰岛素，且小檗碱和黄芪在上述功效上具有一定的协同作用，增强糖代谢和胰岛素稳态。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(4)肥胖小鼠全身炎症指标(内毒素负荷、脂联素)的测定：
采用酶联免疫吸附试剂盒检测脂多糖结合蛋白(LBP)和脂联素(试剂盒购于武汉纯度生物)，具体的实验步骤按照试剂盒说明书进行。
结果如图4所示，通过检测内毒素负荷的标志物LBP和抗炎因子脂联素指标，可以借此反应肥胖小鼠全身炎症的情况。与CTL组相比，HFD的诱导显著增加了肥胖小鼠血清LBP水平，并显著降低了肥胖小鼠血清脂联素浓度(按体重校准后)。罗伊氏乳杆菌LR08干预后，肥胖小鼠的全身炎症情况有所改变，说明罗伊氏乳杆菌LR08对于肥胖小鼠的炎症情况有一定的改善作用，而使用添加小檗碱的罗伊氏乳杆菌LR08干预的小鼠的内毒素负荷的标志物降低，黄芪的添加能够进一步改善肥胖小鼠的炎症情况，且小檗碱和黄芪在上述功效上具有一定的协同作用。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(5)肥胖小鼠TNF-α和AMPK-α1的表达水平检测：
试验结束处死小鼠时，迅速剥离皮下腹股沟脂肪，将白色脂肪组织于-80℃保存备用。使用免疫学测定方法Westernblot法进行测定。以β-actin为内参，采用Quantity One4.6.2软件进行蛋白灰度值分析，各蛋白表达量是与内参的比值。(参考文献：Chen H,SunY,Dong R,Yang S,Pan C,Xiang D,Miao M,Jiao B.Mir-34a is upregulated duringliver regeneration in rats and is associated with the suppression ofhepatocyte proliferation.PLoS One.2011；6(5):e20238.)
结果如图5所示，与CTL组相比，肥胖小鼠脂肪组织中TNF-α的表达水平升高，AMPK-α1表达水平显著降低。与HFD组小鼠相比，针对肥胖小鼠脂肪组织中TNF-α的表达水平，L1和L2组干预组均显著降低，而在AMPK-α1的表达水平上，含小檗碱的益生菌LR08微生态活菌制剂L2组干预能够有效激活肥胖小鼠脂肪组织AMPK活性，起到抗炎效果。即小檗碱的添加可能激活了肠道微生物LR08参与机体能量代谢的能力，AMPK活性提高，可能因此可以更好地改善代谢水平，缓解肥胖相关代谢疾病。黄芪的添加能够进一步降低肥胖小鼠脂肪组织中TNF-α的表达水平，提高AMPK-α1的表达水平，且小檗碱和黄芪在上述功效上具有一定的协同作用。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
(6)肥胖小鼠肠道菌群分析：
肥胖小鼠肠道菌群分析采用341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)引物PCR扩增16SrRNA基因V3-V4区。PCR反应如下：95℃变性3min，94℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，共21个循环，72℃最终延伸5min。将不同样本的产物进行索引，并根据生产商的说明，以等比例混合，使用IlluminaMiseq平台(2×300bp)进行测序。
结果如图6所示，与CTL组相比，HFD组微生物群落的α多样性显著下降，包括微生物丰富度下降(以Chao1指数表示)，以及微生物多样性下降(以Shannon指数表示)。由L1和L2组与HFD组对比可知，L1和L2干预后增加了微生物群落的α多样性，黄芪的添加能够进一步提高微生物群落的多样性，且小檗碱和黄芪在上述功效上具有一定的协同作用。低聚果糖在促进罗伊氏乳杆菌LR08效果的发挥上优于其他的益生元。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂包括保藏编号为CGMCC No.1.12733的罗伊氏乳杆菌Limosilactobacillus reuteriLR08菌株和小檗碱。
2.根据权利要求1所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌LR08菌株的活菌数不低于1×109CFU/mL。
3.根据权利要求1或2所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂中小檗碱的质量百分含量为0.1-1.8％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂还包括益生元和/或黄芪；
优选地，所述用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂中黄芪的质量百分含量为0.05-1.5％；
优选地，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉或螺旋藻中任意一种或至少两种的组合，优选为低聚果糖；
优选地，所述用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂中罗伊氏乳杆菌与益生元的比例为(1×109)CFU:(1-10)mg。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂，其特征在于，所述微生态活菌制剂还包括保护剂；
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉、蔗糖、明胶、糊精、乳糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：在含有小檗碱的培养基中培养罗伊氏乳杆菌LR08菌株，离心得到菌泥，将菌泥、小檗碱与保护剂混合，冻干，即得。
8.根据权利要求7所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂的制备方法，其特征在于，所述培养基中小檗碱的含量为1-10g/L；
优选地，所述冻干为真空冷冻。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的用于改善肥胖相关代谢疾病的微生态活菌制剂在制备用于预防、缓解或治疗肥胖相关代谢疾病产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肥胖相关代谢疾病包括糖尿病、高脂血症或高尿酸血症。
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