CN116622587B - 合成生物学方法制备的益生菌及其组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种益生菌组合物及其制备方法和应用，属于微生物领域。本发明的益生菌组合物中包括鼠李糖乳杆菌WOP1719、长双歧杆菌XSL0718和表达IL‑27蛋白的工程化益生菌等成分，通过科学合理的将复合益生菌粉与植物活性成分进行配合使用，原料安全，且通便和减肥效果好。

Description

合成生物学方法制备的益生菌及其组合物和应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种含合成生物学方法制备的益生菌的组合物及其在通便减肥中的应用。
背景技术
肥胖是由于机体能量代谢紊乱导致能量摄入大于能量消耗，体内脂肪积累过多所产生的代谢性疾病。肥胖不但易导致机体功能过早老化，还会引起许多慢性疾病，例如糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、胆结石、脂肪肝、睡眠呼吸暂停综合征。然而，目前临床用于肥胖治疗的药物研究仍未取得明显进步，大多数药物因其严重的不良反应和毒副作用而被限制使用。
对于肥胖的干预和治疗，目前运动减肥与饮食干预相结合的方式比较有效也最推崇。但是运动减肥非常考验毅力，见效慢、周期长，难以长期坚持；节食减肥见效快，但是反弹也快；而药物治疗效率高、效果佳，但多数药物常伴有严重的不良反应副作用。因此，开发新型的天然成分的降脂药物用于预防和治疗肥胖症显得尤为重要。
既往研究认为，肥胖与能量摄取和消耗间的不平衡有关。但近期研究表明，肠道菌群在调控能量平衡和脂肪储存中发挥关键作用。肥胖人群的肠道菌群结构与健康人群相比有明显差异。一方面肠道菌群能够通过释放内毒素（如脂多糖）或活性代谢产物（如短链脂肪酸）来损伤或造福宿主健康，另一方面宿主的遗传通过先天免疫与营养的可获得性对肠道菌群施加选择性压力，而饮食或药物干预对肠道菌群结构与功能的塑造比宿主的遗传具有更大的潜力，进而影响宿主的健康。因此以肠道菌群为靶点的干预治疗可能是治疗肥胖的一种新途径。
益生菌是对宿主健康有益的一类活性微生物。通过与有害细菌竞争氧气、营养和定植位点，抑制有害细菌增殖，从而改善肠道微生态，调节肠道菌群平衡，促进营养吸收和保持肠道健康。益生菌主要包括乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、丁酸梭菌、放线菌等。同时，益生菌也可以通过影响食欲以及新陈代谢，达到控制体重和减肥的目的，对机体损害和负担较小，安全性好。此外，现有研究表明，肥胖其实是一种慢性炎症，益生菌还能通过多种抗炎作用从而减少脂肪生成。
虽然市面上已有益生菌、益生元的产品，但是大多产品耐酸耐胆碱性能较差，口服后难以抵抗消化道和胃的酸性环境，导致到达肠道的活菌数大大减少，缺乏脂肪细胞靶向性，肠道调节和减肥减脂效果大打折扣，并且没有炎症调节效果；同时，益生菌耐热性能较差，高温或日晒均可能导致益生菌发酵过度，变酸变质，甚至当温度高于60℃时，益生菌会进入衰亡期，影响治疗效果。此外，市面上大多数益生菌产品只是简单组合，缺乏有利于益生菌生长的益生元的科学配比，或者益生菌种类不够丰富，导致应用效果不佳，对肠道菌群的调节不明显，疗程漫长且易反弹，甚至限制了肠胃虚弱或伴有其他疾病的人群的使用。
专利CN113604493A公开了一种高效表达LDH的益生菌能够有效显著降低胃溃疡的溃疡指数和溃疡面积，同时改善胃粘膜的损伤程度，在消化系统疾病，和/或心脑血管疾病药物中有治疗效果。其构建工程菌的方法将表达LDH的基因导入载体pET-28a构建了表达LDH的重组质粒pET-28a-LDH，然后将其转化益生菌大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle1917获得了表达LDH的重组益生菌。但其对于肥胖的作用不明确。
专利CN114774338A公开了一种高效表达丁酸的益生菌具有改善溃疡性结肠炎、抑郁症、肥胖和脂肪肝症状的效果。其工程菌的构建方法是首先构建pRE112自杀质粒同源重组体系，即将待敲除基因上下游片段，或待插入基因及其待插入上下游片段克隆到pRE112质粒载体上，通过接合等使其进入宿主菌（大肠杆菌），敲除竞争途径相关基因，同时插入单拷贝或多拷贝丁酸合成相关基因atoB、phaA或thl，hbd或phaB，crt或phaJ，ter以及tesB、yciA或cat1，得到产丁酸的大肠杆菌。
综上所述，现有技术中普遍存在益生菌耐酸耐胆碱性能较差、缺乏脂肪细胞靶向消耗能力、缺乏炎症调节效果、高温稳定性差、配比单一导致适用人群较窄等技术问题。不断挖掘新菌株，并与现有益生菌或益生元通过合理配比研发新的减肥减脂产品是目前仍需发展的方向。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有通便减肥的益生菌组合物。
本发明通过合成生物学方法获取高表达IL-27的工程化益生菌，其具有脂肪细胞靶向性，IL-27信号通过影响脂肪细胞产热的方式介导能量消耗，并科学合理地将复合益生菌粉与植物活性成分进行配合使用，通便减肥效果显著，且适宜人群广泛。本发明的益生菌和组合物具有较好的耐酸耐胆盐能力，在口服经过胃肠道消化后仍能保持活性，稳定性好。
一方面，本发明提供了两种新的益生菌。
所述的益生菌为鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）WOP1719，其保藏编号为GDMCC No:63057，于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
所述的益生菌为长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）XSL0718，其保藏编号为GDMCC No:63098，于2022年12月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
又一方面，本发明提供了一种益生菌组合物。
所述的组合物中包括前述的鼠李糖乳杆菌WOP1719和/或长双歧杆菌XSL0718。
所述的组合物中还包括表达IL-27蛋白的工程化益生菌。
优选地，所述的表达IL-27蛋白的工程化益生菌通过使用表达IL-27的重组质粒转化获得。
所述重组质粒是将编码IL-27的基因接入表达载体获得。所述表达载体包括但不限于：pET-28a、pEZZ18、pTA1529、pINIII-ompA、pUB110、pE194、pUCX05-bgaB、pHT304、pMK3、pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P、PNZ8149-usp45。
优选地，所述的表达载体为pET-28a，所述重组质粒为pET-28a-IL-27。
优选地，所述的IL-27蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述的重组质粒pET-28a-IL-27的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的表达IL-27蛋白的工程化益生菌通过使用pET-28a-IL-27重组质粒转化获得，或将编码IL-27蛋白的基因整合到益生菌获得。
所述的益生菌包括但不限于大肠埃希菌(Escherichia coli) Nissle 1917。
优选地，所述的工程化益生菌为工程化表达IL-27大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917。
优选地，所述的组合物中还包括：生姜油微囊粉、米粕发酵粉、葡甘露聚糖、β伴大豆球蛋白、山葵浓缩粉、黑生姜提取物、玫瑰果籽提取物、葛花提取物或毗黎勒提取物。
具体地，所述的组合物中，按重量份数计，包括：0.01-0.1份工程化表达IL-27大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917、0.01-0.1份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.01-0.1份长双歧杆菌XSL0718、1.5-2.5份生姜油微囊粉、0.8-1.2份米粕发酵粉、2.5-3.5份葡甘露聚糖、1.8-2.2份β伴大豆球蛋白、0.3-0.5份山葵浓缩粉、0.5-0.8份黑生姜提取物、0.2-0.3份玫瑰果籽提取物、0.2-0.3份葛花提取物、0.2-0.3份毗黎勒提取物。
优选地，所述的组合物中，按重量份数计，包括：0.05份工程化表达IL-27大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917、0.05份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.05份长双歧杆菌XSL0718、2份生姜油微囊粉、1份米粕发酵粉、3份葡甘露聚糖、2份β伴大豆球蛋白、0.4份山葵浓缩粉、0.7份黑生姜提取物、0.25份玫瑰果籽提取物、0.25份葛花提取物、0.25份毗黎勒提取物。
又一方面，本发明提供了前述的鼠李糖乳杆菌WOP1719或长双歧杆菌XSL0718或组合物在制备治疗便秘或肥胖或胀气的药物中的应用。
又一方面，本发明提供了包括前述的鼠李糖乳杆菌WOP1719或长双歧杆菌XSL0718或组合物的药品。
所述的食品或保健品中还可以包括其他本领域常用的添加剂或辅料。
所述的保健品中还可能包括以下添加剂中的一种或多种：调味剂、调色剂、填充剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂、粘合剂、pH调节剂。
所述的食品中还可能包括以下添加剂中的一种或多种：调味剂、调色剂、填充剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂、粘合剂、pH调节剂。
所述的药品中还可以包括其他药学上可接受的载体或赋形剂，包括但不限于：缓冲液、赋形剂、稳定剂、防腐剂。
优选地，所述的药物为内服药物，剂型可以是粉剂、颗粒剂、片剂、糖浆剂、口服液等等。
本发明中，大肠埃希菌(Escherichia coli) Nissle 1917具有脂肪细胞靶向性，IL-27信号通过影响脂肪细胞产热的方式介导能量消耗，通便减肥效果显著。
本发明中，鼠李糖乳杆菌WOP1719为从牛奶中分离出的1株乳杆菌。鼠李糖乳杆菌是人类研究最广泛的益生菌之一，具有调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素及提高机体免疫力等功效。
本发明中，长双歧杆菌XSL0718能够促进肠道pH值降低，改善肠道菌群平衡，维持肠道健康。
本发明中，生姜油微囊粉是一种强效的化脂素，其中的姜辣素具有加速堆积脂肪分解，促进脂肪酸氧化供能，激活棕色脂肪产热，同时具有提高能量消耗，间接刺激燃脂，最终将体内脂肪转化为水、二氧化碳、能量ATP和热量，从而实现高效化脂。
本发明中，米粕发酵粉可以使脂肪酸合成酶活性降低，抑制脂肪酸的合成，使脂肪细胞肥大化被抑制。
本发明中，葡甘露聚糖能增加平均每日粪湿重和粪便含水量，能缩短肠道转运时间和平均一次排便时间；同时可增殖肠道内益生菌，改善肠道健康。
本发明中，β伴大豆球蛋白可以增加饱腹感，减少内脏脂肪，并促进肌肉生长。
本发明中，山葵浓缩粉能够抑制α-葡萄糖苷酶、降低脂肪蓄积量、增加脂肪燃烧相关基因的表达，促进脂肪燃烧，对白色脂肪细胞肥大化有抑制作用。
本发明中，黑生姜提取物可通过活化AMPK来改善肌肉的质量，促进脂质代谢和能量的产生，进而达到减肥的功效。
本发明中，玫瑰果籽提取物有效成分为银锻苷，可促进体内脂肪燃烧，有助于平衡食欲、改善餐后血糖及脂肪堆积。
本发明中，葛花提取物富含葛花黄酮，可抑制糖的吸收，对餐后血糖上升有抑制作用。
本发明中，毗黎勒提取物富含没食子酸，可以抑制α-葡萄糖苷酶把二糖转化成单糖，从而防止糖分被吸收，抑制脂肪被吸收，降低餐后上升的中性脂肪和血糖值。
本发明的有益效果：
(1)本发明选择的具有合成生物学改造后高表达IL-27的益生菌组合物，具有通便减肥功效，科学合理的将复合益生菌粉与植物活性成分进行配合使用，最大程度上在实现安全性的前提下，能够有效减少体内脂肪的生成，调节体内炎症，增加益生菌种类和数量，抑制有害菌生长，从而达到对肠道菌群微生态的合理作用，提高益生菌组合物的益生性和减肥效果，并且适宜广泛人群使用。
(2)本发明提供的具有通便减肥功效的复合益生菌组合物制剂不添加任何化学添加剂，并且还能保护益生菌活性，耐酸耐胆碱性能较好，同时色味俱佳、食用体验良好；
(3)本发明提供的具有减肥降脂功效的复合益生菌组合物制剂的制备方法有效降低了制备过程中益生菌和植物提取成分的活性损失，操作简单，条件可控，利于实现大规模工业化生产。
保藏说明
菌种名称：鼠李糖乳杆菌WOP1719；
分类命名：Lacticaseibacillus rhamnosus；
保藏编号：GDMCC No:63057；
保藏时间：2022年12月28日；
保藏中心：广东省微生物菌种保藏中心；
保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
菌种名称：长双歧杆菌XSL0718；
分类命名：Bifidobacterium longum；
保藏编号：GDMCC No:63098；
保藏时间：2022年12月28日；
保藏中心：广东省微生物菌种保藏中心；
保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为免疫印迹试验检测工程化益生菌IL-27蛋白表达，M：Marker；1：表达前全菌液；2：全菌液；3：培养基上清菌体；4：菌体裂解物。
图2为细胞活力检测结果。
图3为给药4周后小鼠体重。
图4为给药4周后小鼠血液中TC含量。
图5为给药4周后小鼠血液中TG含量。
图6为给药4周后小鼠血液中LDL-CH含量。
图7为给药4周后小鼠血液中HDL-CH含量。
图8为给药4周后小鼠血液中LPS含量。
图9为给药4周后小鼠血液中TNF-α表达变化量。
图10为给药4周后小鼠血液中IL-6表达变化量。
图11为给药4周后小鼠血液中IL-1β表达变化量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中：
生姜油微囊粉购买自西安诺众康健生物有限公司，型号为P30；
米粕发酵粉购买自贝塔莱福（天津）生物科技有限公司，型号为P80；
葡甘露聚糖购买自西安诺众康健生物有限公司，型号为P99；
β伴大豆球蛋白购买自贝塔莱福（天津）生物科技有限公司，型号为P80；
山葵浓缩粉购买自贝塔莱福（天津）生物科技有限公司，型号为P50；
黑生姜提取物购买自贝塔莱福（天津）生物科技有限公司，型号为P10；
玫瑰果籽提取物购买自上海诚一食品原料有限公司，型号为P25；
葛花提取物购买自上海统元食品原料有限公司，型号为Phase2；
毗黎勒提取物购买自上海楷达生物有限公司，型号为P10；
大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；
大肠杆菌菌种大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917购自德国(商标名为Mutaflor)；
重组质粒pET-28a-EGFP购自淼灵质粒平台；
无水乙醇购自天津大茂化学试剂公司；
细菌质粒DNA提取试剂盒购自AXYGEN公司。
鼠李糖乳杆菌WOP1719是从牛奶中自然提取和分离出来，保藏编号为GDMCC No:63057，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间2022年12月28日。长双歧杆菌XSL0718从母乳中自然提取和分离出来，保藏编号为GDMCC No:63098，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间2022年12月28日。
基础实验例构建高表达IL-27蛋白的工程化益生菌
益生菌组合物中包含高表达IL-27蛋白的工程化益生菌，通过转基因的方式使益生菌高表达白细胞介素27（IL-27），有研究报道，IL-27可以直接靶向作用于脂肪细胞，能够促进脂肪细胞产热。本发明所制备的益生菌组合物包含高表达IL-27的益生菌，该益生菌组合物将有助于靶向脂肪细胞，促进脂肪细胞的产热分解，有助于提高减肥效果。
构建高表达IL-27蛋白的工程化益生菌使用的LB液体培养基配方为：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl；
LB固体培养基配方为：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl、1.5%琼脂。
（1）重组质粒的构建
pET-28a-IL-27质粒由淼灵生物科技有限公司合成。重组质粒pET-28a- IL-27的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
（2）用重组质粒转化DH5α
从-80℃冰箱中取出DH5α感受态细胞，在冰盒上放置10-20分钟，使其融化；取50 μL感受态细胞加入2 μL质粒，用手指轻轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置30 min；42℃热激45 s后，迅速放回冰上静置2 min；加500 μL室温的LB液体培养基(不含抗生素)，37℃、200 rpm振摇培养1 h活化；取120 μL上述菌液涂布于含有15μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养16 h。
（3）转化成功菌落扩增培养
挑取单克隆，在5 mL含有15μg/mL的卡那霉素的液体培养基中扩增培养6h，再将成功转入重组质粒的菌株转接至250 mL 含有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中过夜放大培养。上述培养条件为：转速200rpm，温度为37℃。
（4）提取重组质粒DNA
用AXYGEN公司的质粒小提试剂盒提取质粒。
（5）将重组质粒转入大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917菌株
从-80℃冰箱中取出大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917化学感受态细胞，在冰盒上放置10-20分钟，使其融化。从中取出50 μL感受态细胞加入5 μL质粒，用手指轻轻拨打几次混匀，将混合物在冰上放置30 min；在42℃热激45s后，迅速放回冰上静置2min；加0.5 mL室温的LB液体培养基(不含抗生素)，37℃，200 rpm振摇培养1h；取120μL上述菌液涂布于含有15μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，在37℃条件下培养16 h。
（6）转化成功菌落扩增培养
挑取单克隆，在含有15μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中扩增培养，之后离心收集全菌液、培养基上清菌体、菌体裂解物，进行免疫印迹试验（Western Blot），如图1所示，验证正确得到重组菌株。
由图1可知，通过免疫印迹试验检测IL-27蛋白，工程化益生菌及其分泌的上清中高表达该蛋白。
实施例1-5益生菌组合物
组合物中包括以下重量份的组分：
益生菌组合物的制备方法如下：
在45℃-85℃的条件下，将生姜油微囊粉、米粕发酵粉、葡甘露聚糖、β伴大豆球蛋白、山葵浓缩粉、黑生姜提取物、玫瑰果籽提取物、葛花提取物、毗黎勒提取物干燥至质量含水率低于5%；
将干燥后的上述各组份分别过20-60目筛；
将过筛后的上述各组份与所述益生菌复合菌粉按比例混合，得到组合物。
混合粉末可以使用全自动灌装机按10g/包的规格进行分装。
工程化表达IL-27大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917规格是600亿CFU/g；
鼠李糖乳杆菌WOP1719规格是600亿CFU/g；
长双歧杆菌XSL0718规格是600亿CFU/g。
对比例1
与实施例1相比，将工程化表达IL-27大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle1917替换为未工程化处理过的大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917。
对比例2
与实施例1相比，不添加鼠李糖乳杆菌WOP1719。
对比例3
与实施例1相比，不添加长双歧杆菌XSL0718。
对比例4
与实施例1相比，不添加生姜油微囊粉。
对比例5
与实施例1相比，不添加米粕发酵粉。
对比例6
与实施例1相比，不添加葡甘露聚糖。
对比例7
与实施例1相比，不添加β伴大豆球蛋白。
对比例8
与实施例1相比，不添加山葵浓缩粉。
对比例9
与实施例1相比，不添加黑生姜提取物。
对比例10
与实施例1相比，不添加玫瑰果籽提取物。
对比例11
与实施例1相比，不添加葛花提取物。
对比例12
与实施例1相比，不添加毗黎勒提取物。
对比例13
与实施例1相比，不添加鼠李糖乳杆菌WOP1719和长双歧杆菌XSL0718。
对比例14
包括以下重量份的原料：生姜油微囊粉2份，米粕发酵粉1份，葡甘露聚糖3份，β伴大豆球蛋白2份，山葵浓缩粉0.4份，黑生姜提取物0.8份，玫瑰果籽提取物0.3份，葛花提取物0.25份，毗黎勒提取物0.25份。
实验例1肥胖患者的治疗效果试验
根据中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会在2013年发布的成人体重判定标准，以体重指数（BMI）为依据对成人体重分类。BMI（kg/m2）=个体的体重(公斤)/身高(米)的平方(kg/m2)。BMI<18.5定义为体重过低，18.5≤BMI<24.0定义为正常体质量，24.0≤BMI≤28.0定义为超重，BMI>28.0定义为肥胖。
选取190个符合肥胖症状（BMI指数=体重（公斤）÷身高²（米），BMI指数大于28）的患者，随机分为19组，每组10个人，各组分别服用实施例1-5益生菌组合物和对比例1-14益生菌组合物1个月，服用剂量为10克/人/天。然后通过感官评价的方法，统计各组患者的排便次数和大便硬度，通过胃肠症状评分表，分别记录食用前、后并量，患者的胃肠道症状，及食用前后症状总评分；大便性状评分；食用后有效率；症状总评分为各项评分之和。
统计结果如表1：
注：排便痛、胀气率=排便痛、胀气次数/排便次数；排便异常率=排便异常次数/排便次数。症状评分分数越高表示症状越严重，0分表示无症状。
由表1可看出，对比例1-14中，腹痛人数较多，排便痛，胀气率较高，大便硬度较高，排便频率较低，其中对比例1和对比例14则最为严重。而实施例1-5和对比例1与对比例14相比，实施例1-5所使用的工程化表达IL-27大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917能够靶向脂肪细胞，促进脂肪细胞产热，消耗脂肪细胞，提高新陈代谢能力，普遍增加了患者的排便次数，大便硬度降低，排便异常率明显降低，这证明了富含IL-27的益生菌组合物能够有效促进通便，所述高表达IL-27的工程化益生菌组合物对肥胖症患者的通便效果较好，能够通过增加提高通便次数增强代谢，达到减肥作用。对比例14和实施例1及对比例1-13相比，其排便更为困难，说明益生菌组合物更为有利于排便。
实验例2益生菌组合物对脂肪细胞增殖的影响
采用CCK-8实验，研究实施例和对比例1-14对3T3-L1细胞（前脂肪细胞系）增殖的影响。3T3-L1细胞以每孔2000个的密度接种于96孔板，待细胞密度达到30%，吸取培养基，分别加入对照溶剂（等体积PBS）、实施例1-5和对比例1-14的培养基溶液（基础培养基DMEM培养基+10% FBS+1% P/S，加上益生菌组合物的溶液，益生菌组合物的工作浓度是2 μg/mL），分别培养24h、48h，弃去培养基，每孔加入10 μL CCK8试液和90 μL无血清培养基，37℃避光孵育2h后于酶标仪450 nm处检测吸光度值。细胞活力检测结果如图2所示。
细胞活力（%）=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100；
A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值；
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值；
A（空白）：没有细胞的孔的OD值；
细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力。
从图2可以看出，相比于溶剂对照组，对比例1-13的组合物比对比例14更能有效抑制脂肪细胞的增殖。相比于对比例1，实施例中添加了高表达IL-27的工程化益生菌，其能够有效抑制3T3-L1细胞的增殖，说明高表达IL-27的工程化益生菌能够有效针对脂肪细胞，抑制脂肪细胞的生长。此外，实施例1-5与对比例2-13相比，也具有显著性抑制脂肪细胞增殖的作用，这进一步说明高表达IL-27的工程化益生菌组合物的各组分能够协同抑制脂肪细胞的增殖，从而能够有效减少脂肪组织的生成。
实验例3益生菌组合物对肥胖小鼠的减肥作用
通过使用高脂饮食构建肥胖小鼠模型（食物诱导的动物肥胖模型与人类肥胖相似，常用来研究饮食、基因等因素与肥胖疾病之间的关系。通过高热量饮食喂养构建的小鼠肥胖模型，可作为肥胖及相关并发症临床前药效研究的合适动物模型。造模方法：动物的种属、品系：C57BL/6，小鼠动物年龄：6周龄动物，体重：18±2g，制备周期：4-12周，适应性饲养3 d后随机分成空白对照组，造模对照组、造模给药组, 空白对照组喂常规饲料，造模组饲喂高脂饲料(D12492)，自由饮水，肥胖小鼠成模标准：体质量高于空白对照组平均体质量五分之一），将造模成功后的肥胖小鼠随机分成实施例1-5和对比例1-14，每组3只，各组每日给予等体积的益生菌组合物（将益生菌组合物溶于生理盐水，按照25 mg/kg的剂量进行灌胃处理，每日一次，持续四周）。给药4周后，对实验小鼠进行称量体重，心头取血检测血清血脂成分含量。实验结果如图3-图7所示。
从图3可以看出，实验结束时，相比于造模对照组，对比例1-13的组合物比对比例14更能有效降低体重水平。与对比例1相比，实施例1-5有效降低了体重，说明了高表达IL-27的工程化益生菌组合物由于富含表达IL-27的工程化益生菌，能够有效靶向脂肪细胞产热，消耗脂肪细胞，实现肥胖小鼠的减重作用。此外，实施例1-5与对比例2-13组相比，有显著性差异，这说明了实施例1-5的各组分之间配伍合理，具有协同作用，实现更加有效的减重效果。
研究表明，肥胖对于机体血脂各项生化指标水平有显著影响，总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）能够反映机体血脂代谢水平，低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-CH）是运输胆固醇到肝外组织的主要运载工具，高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-CH）能够将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢。提取小鼠血液中的血清，对血清中的血脂成分进行测定。从图4-图7看到，相比于造模对照组，对比例1-13的组合物比对比例14的组合物更能有效改善血脂水平。相比于对比例1，实施例1-5能够有效降低血液中TC、TG和LDL-CH的水平，提升HDL-CH的水平，这说明高表达IL-27的工程化益生菌能够有效消耗脂肪细胞，改善小鼠体内血脂水平，有益于减肥。此外，与对比例2-13相比，实施例1-5也更加有效地调节血脂水平，这说明实施例中的各组分之间的搭配能够有效协同调节血脂水平。
实验例4益生菌组合物对肥胖小鼠的抗炎作用
肥胖患者常常伴随全身慢性低度炎症，有研究表明高脂饮食会改变肠道菌群的丰度和多样性，引发内毒素如脂多糖的水平升高。脂多糖是革兰氏阴性菌的细胞壁成分。本发明所制备的益生菌组合物含有益生菌，能够促进肠道有益菌的生长，竞争性抑制有害菌的增殖，调节肠道的紊乱，重建肠道微生态平衡，减低血液中脂多糖含量，改善炎症水平。此外，增加了高表达IL-27的工程化益生菌，IL-27具有免疫调节作用，能够针对性地去调节炎症反应。通过检测空白对照组、造模对照组、实验例和对比例中各组小鼠血液中的脂多糖水平以及提取血液RNA进行qPCR检测炎症因子来检测益生菌组合物的抗炎功效。结果如图8-图11所示。
通过检测血液中的脂多糖（LPS）的水平，从图8可以发现，相比于对比例14，对比例1-13的组合物更能有效降低脂多糖水平。相比较于没有添加高表达IL-27的工程化益生菌组合物，即对比例1，实施例1-5能够有效降低肥胖小鼠体内的脂多糖的水平，这主要是由于实施例1中包含了高表达IL-27的工程化益生菌，说明IL-27能够有效改善肠道微生态以及降低全身炎症。此外与对比例2-13相比，实施例1-5也能更加显著下调小鼠机体中的脂多糖水平，说明实施例中各组分之间的协同作用具有更加显著的抗炎效果。
进一步检测整体的炎症因子水平来评价益生菌组合物的减肥消炎的效果。通过血液的qPCR，从图9-图11可以发现，相比于对比例14，对比例1-13的组合物更能有效降低炎症因子水平。相比于对比例1-13，实施例1-5能够有效降低血液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，起到消炎的作用。这进一步证明高表达IL-27的工程化益生菌组合物本身由于富含IL-27以及各组分之间的搭配从而具有更显著的炎症调节能力，实现减肥的效果。
综上所述，本发明的组合物中通过构建工程化益生菌，增加益生菌中IL-27蛋白的含量，并添加新菌株鼠李糖乳杆菌WOP1719和长双歧杆菌XSL0718，能够有效改善患者的排便代谢，从细胞实验上证明了其能够有效抑制脂肪细胞的增殖，血脂水平得到改善，并且全身水平的炎症程度减低，这充分展示了高表达IL-27的工程化益生菌组合物能够有效促进排便减肥。

Claims (6)

1.包括鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）WOP1719和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）XSL0718的组合物，其特征在于，鼠李糖乳杆菌WOP1719保藏编号为GDMCC No:63057；长双歧杆菌XSL0718的保藏编号为GDMCC No:63098；
所述的组合物中还包括表达IL-27蛋白的工程化益生菌；所述的工程化益生菌通过使用表达IL-27的重组质粒转化获得；所述的重组质粒为pET-28a-IL-27；所述的工程化益生菌为工程化表达IL-27大肠埃希菌(Escherichia coli)Nissle 1917；
所述的组合物中按重量份数计，包括：0.01-0.1份工程化表达IL-27大肠埃希菌Nissle1917、0.01-0.1份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.01-0.1份长双歧杆菌XSL0718、1.5-2.5份生姜油微囊粉、0.8-1.2份米粕发酵粉、2.5-3.5份葡甘露聚糖、1.8-2.2份β伴大豆球蛋白、0.3-0.5份山葵浓缩粉、0.5-0.8份黑生姜提取物、0.2-0.3份玫瑰果籽提取物、0.2-0.3份葛花提取物、0.2-0.3份毗黎勒提取物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，按重量份数计，包括：0.05份工程化表达IL-27大肠埃希菌Nissle 1917、0.05份鼠李糖乳杆菌WOP1719、0.05份长双歧杆菌XSL0718、2份生姜油微囊粉、1份米粕发酵粉、3份葡甘露聚糖、2份β伴大豆球蛋白、0.4份山葵浓缩粉、0.7份黑生姜提取物、0.25份玫瑰果籽提取物、0.25份葛花提取物、0.25份毗黎勒提取物。
3.权利要求1-2任一项所述的组合物在制备治疗便秘或肥胖或胀气的药品中的应用。
4.包括权利要求1-2任一项所述的组合物的药品。
5.权利要求1-2任一项所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括：原料干燥，干燥后原料过20-60目筛，过筛后按比例混合。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的原料干燥条件为45℃-85℃的条件下干燥至质量含水率低于5%。
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