CN117844714A

CN117844714A - 一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用

Info

Publication number: CN117844714A
Application number: CN202410239290.9A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 董瑶; 齐咏梅; 钱莉敏
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2024-03-04
Filing date: 2024-03-04
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2044-03-04
Also published as: CN117844714B

Abstract

本发明涉及一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用，所述调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂中的菌株包括长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株。本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，BL21菌株和LCr86菌株两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在调控脑源性神经营养因子和性激素、改善多囊卵巢综合症的功效上协同增效。

Description

一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用

技术领域

本发明属于益生菌技术领域，涉及一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用，具体涉及一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其在制备预防、改善或治疗多囊卵巢综合症的药物中的应用。

背景技术

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见的女性内分泌疾病，主要表现为高雄激素血症、高胰岛素血症和慢性无排卵。近年来，肠道微生物群的作用在多囊卵巢综合征的研究中受到越来越多的关注。多囊卵巢综合征患者的肠道菌群组成可能与健康个体存在显著差异，这种差异可能与多囊卵巢综合征的代谢异常和内分泌失调有关。特定的肠道菌株，如某些益生菌，可能通过调节宿主的代谢、改善内分泌环境、免疫反应和激素平衡来影响多囊卵巢综合征的发展。例如，一些益生菌被发现可以改善胰岛素敏感性、降低炎症水平，甚至直接影响卵巢功能。因此，调节肠道菌群，特别是通过益生菌干预，可能成为一种新的治疗多囊卵巢综合征的策略，这种方法可能更加针对疾病的根本原因，而不仅仅是缓解症状。益生菌干预还能减轻高雄激素诱导的内质网应激，并逆转卵巢颗粒细胞的凋亡。此外，益生菌干预能刺激神经递质和神经营养蛋白（如脑源性神经营养因子）的释放，这些因子在卵泡发育和卵母细胞成熟中发挥重要作用。益生菌干预通过增加多囊卵巢综合征中脑源性神经营养因子表达来调节卵泡功能障碍，为管理不孕症和卵巢病理患者提供新的诊断和治疗应用的可能性。

脑源性神经营养因子（BDNF）是一种关键的分子介质，与酪氨酸激酶受体B（TrkB）受体结合并通过激活下游信号通路发挥作用。在多囊卵巢综合征中，脑源性神经营养因子及其受体的作用尚不明确，但已知脑源性神经营养因子在非神经元组织（如卵巢）中的表达与卵母细胞成熟有关。因此，开发益生菌补充剂，通过改善肠道菌群结构、调节性激素、脑源性神经营养因子水平，从而改善多囊卵巢综合症，成为一种具有前景的健康治疗方案。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其应用，具体提供一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂及其在制备预防、改善或治疗多囊卵巢综合症的药物中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，所述调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCC No.19758的卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株。

本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，是将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株进行复配，发现两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在调控脑源性神经营养因子和性激素、改善多囊卵巢综合症的功效上协同增效，具体表现在：（1）显著改善卵巢功能障碍；（2）调控卵巢脑源性神经营养因子信号传导；（3）显著改善机体激素和代谢水平；（4）显著改善肠道菌群多样性。在使用菌量一致的情况下，与单一的BL21菌株或单一的LCr86菌株相比，两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此，该益生菌剂为预防、改善或治疗多囊卵巢综合症提供了新的策略。由于长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株均为益生菌，因此其在用于制备相关功效产品时，安全性高，且不易产生依赖性。

优选地，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株的活菌数之比为1:10-10:1，例如1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、71、8:1、9:1、10:1等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

基于BL21菌株与LCr86菌株的潜在相互作用关系，本发明还发现当两种菌株以上述特定的活菌数配比进行复合时，其在调控脑源性神经营养因子和性激素、改善多囊卵巢综合症的功效上更加显著。

优选地，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于2×10⁹ CFU/mL或2×10⁹ CFU/g，例如2×10⁹CFU/mL（CFU/g）、5×10⁹CFU/mL（CFU/g）、1×10¹⁰CFU/mL（CFU/g）、5×10¹⁰CFU/mL（CFU/g）、1×10¹¹CFU/mL（CFU/g）、1×10¹²CFU/mL（CFU/g）、1×10¹³CFU/mL（CFU/g）等；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。其中冻干粉剂示例性地可以采用如下方法制得：

将BL21菌株与LCr86菌株分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；菌体用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，即得，然后按比例将二者复配。

或者，将BL21菌株与LCr86菌株分别接种于培养基中进行培养，得到培养液；培养液离心，得到菌体；将两种菌体按照比例混合后用冻干保护剂重悬，得到重悬液；重悬液冻干，即得。

优选地，所述冻干采用真空冷冻法。

优选地，所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或辅助添加剂。

优选地，所述冻干保护剂包括脱脂乳、蔗糖、乳糖、海藻糖、右旋糖酐、明胶、糊精、阿拉伯胶、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供根据第一方面所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂在制备预防、改善或治疗多囊卵巢综合症的药物中的应用。

优选地，所述药物中还包括辅料。

优选地，所述辅料包括赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，是将长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株进行复配，发现两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在调控脑源性神经营养因子和性激素、改善多囊卵巢综合症的功效上协同增效，在使用菌量一致的情况下，与单一的BL21菌株或单一的LCr86菌株相比，两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此，该益生菌剂为预防、改善或治疗多囊卵巢综合症提供了新的策略。由于长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株均为益生菌，因此其在用于制备相关功效产品时，安全性高，且不易产生依赖性。

本发明所涉及的长双歧杆菌BL21菌株的分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2015年01月27日，保藏编号为CGMCC No.10452，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所涉及的卷曲乳杆菌LCr86菌株的分类命名为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2020年04月29日，保藏编号为CGMCC No.19758，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1(A)是CTL组小鼠的体重变化情况统计结果图；

图1(B)是PCOS组小鼠的体重变化情况统计结果图；

图1(C)是S1组小鼠的体重变化情况统计结果图；

图1(D)是S2组小鼠的体重变化情况统计结果图；

图1(E)是S3组小鼠的体重变化情况统计结果图；

图1(F)是S4组小鼠的体重变化情况统计结果图；

图1(G)是S5组小鼠的体重变化情况统计结果图；

图2是各组小鼠的卵巢样本病理切片图；

图3是各组小鼠的血糖值曲线下面积的统计结果图；

图4是各组小鼠的血清脑源性神经营养因子水平的统计结果图；

图5是各组小鼠的血清促黄体生成素（LH）水平的统计结果图；

图6是各组小鼠的血清促卵泡素（FSH）水平的统计结果图；

图7是各组小鼠的血清睾酮（T）水平的统计结果图；

图8是各组小鼠的血清雌二醇（E2）水平的统计结果图；

图9是各组小鼠的血清孕激素/孕酮（PROG）水平的统计结果图；

图10是各组小鼠肠道菌群分析的Chao1指数统计结果图；

图11是各组小鼠肠道菌群分析的ACE指数统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中涉及的培养基配方如下：

MRS培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

下述实施例所涉及的长双歧杆菌BL21菌株的分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏编号为CGMCC No.10452。

下述实施例所涉及的卷曲乳杆菌LCr86菌株的分类命名为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus，保藏编号为CGMCC No.19758。

下述涉及的菌悬液制备方法：将所需菌株接种于液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按5%（v/v）的接种量接种于液体培养基中，37℃下培养24 h，得到菌液；将菌液在4℃下5000rpm下离心10 min，过滤，得到菌体，使用PBS溶液重悬菌体，即得。

试验结果数据使用R语言的ggplot2进行统计分析，与对照组相比，###代表p<0.001；与模型组相比，***代表p<0.001，**代表p<0.01，*代表p<0.05，NS代表无显著差异。

实施例

本实施例探究菌株对多囊卵巢综合症小鼠的改善能力：

（1）试验动物：7周龄的ICR品种雌性小鼠，与雄性小鼠合笼繁殖。将小鼠饲养于笼内，环境清洁安静，温度23-25℃，湿度50-70%。通过检查雌性小鼠的阴道交配栓来确认怀孕的第一天，此时胚胎处于0.5天。

（2）动物分组：孕鼠随机分配为7组：正常对照组（CTL）、多囊卵巢综合征模型组（PCOS组）、长双歧杆菌BL21组（BL21组，记为S1组）、卷曲乳杆菌LCr86组（LCr86组，记为S2组）、市售长双歧杆菌组（BNCC371780组，记为S3组）、复合菌组1（BL21+LCr86组，活菌数比为2:1，记为S4组）、复合菌组2（BNCC371780+LCr86组，活菌数比为2:1，记为S5组）。

（3）动物建模及干预方法：

在孕期的第16、17和18天，模型组和益生菌干预组（S1，S2，S3，S4和S5）的母鼠（F1代）通过皮下注射250微克/100微升的DHT，随后，对这些组别出生后的雌性后代（F2代，每组8只，患有多囊卵巢综合征）进行相关指标的测定。在整个试验期间，对照组和模型组的孕鼠及其雌性后代正常饲喂纯化水。各干预组每日分别给菌悬液（各组均为1×10⁹ CFU/只）并正常饮用纯化水。试验共持续8周（将孕期第15天记为试验第1天），定期测量F2代小鼠体重和采集F2代小鼠粪便样本，粪便样本收集后迅速转移至-80℃冰箱保存。实验结束时，F2代小鼠先以2%的异氟烷进行麻醉，随后通过CO₂窒息实施安乐死。通过眼眶采血，4000g离心10min后收集F2代小鼠的血清样本，并在-80℃保存以待后续分析。同时收集F2代小鼠的卵巢样本，固定在4%甲醛溶液中，以备后续组织学分析。

（4）指标分析：

（4.1）体重变化统计：

各组小鼠的体重统计结果如图1(A)-图1(G)所示，与对照组相比，模型组小鼠的体重异常升高，多囊卵巢综合征通常伴随着体重增加，可能发生肥胖，但是益生菌干预后体重增长趋势得到改善，即BL21菌株和LCr86菌株有助于减缓或改善多囊卵巢综合征小鼠的体重增长，且两菌联合的效果更优。

（4.2）卵泡发育情况：

收集各组小鼠的卵巢样本，固定在4%甲醛溶液中，进行组织切片和HE染色，病理切片图如图2所示，与对照组相比，模型组的小鼠卵巢出现非典型卵泡，卵泡没有正常发育和成熟，同时，几乎没有黄体的存在，这表明黄体的形成和功能可能受到影响，这些情况是多囊卵巢综合征的特征之一，通常伴随着卵巢功能的紊乱。在益生菌干预后，多个未成熟卵泡明显减少，而黄体数量明显增加，即BL21菌株和LCr86菌株能够改善卵泡的正常发育和成熟并且有助于促进黄体的形成和功能，且两菌联合的效果更优。

（4.3）葡萄糖耐量测试：

在实验结束前两天对所有小鼠进行了空腹血糖水平和腹膜内葡萄糖耐量测试。具体操作为，小鼠首先禁食12 h以获得基线血糖值（0 min），随后进行灌胃以2 g/kg的剂量给予葡萄糖溶液。在注射后的30、60、90和120 min，通过尾部采血并使用血糖仪测量血糖水平并使用测定的血糖值绘制曲线，计算曲线下面积（AUC）。

各组小鼠的血糖值曲线下面积的统计结果如图3所示，与对照组相比，模型组小鼠血糖值的曲线下面积呈现变大趋势，血糖水平上升，机体对血糖的调控能力受到了影响，但是益生菌干预后，血糖值曲线下面积呈现下降趋势，趋于正常水平，且S4组效果最显著，更优于其他干预组。

（4.4）血清BDNF和性激素水平测定：

采用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒来测量血清中的脑源性神经营养因子（BDNF）和性激素水平，评估实验动物的内分泌功能。具体地，性激素的测定包括促黄体生成素（LH）、促卵泡素（FSH）、睾酮（T）、雌二醇（E2）和孕激素/孕酮（PROG）。所有测量均严格遵循制造商提供的操作指南进行，以确保数据的准确性和可靠性。

结果分别如图4-图9所示，与对照组相比，模型组小鼠的脑源性神经营养因子（BDNF）水平，促卵泡素（FSH），雌二醇（E2）以及孕激素/孕酮（PROG）的水平显著下降，促黄体生成素（LH）水平上升且睾酮（T）水平显著升高。益生菌干预后，脑源性神经营养因子（BDNF）水平，促卵泡素（FSH），雌二醇（E2）以及孕激素/孕酮（PROG）的水平呈现逆转趋势，显著升高，且促黄体生成素（LH）有下降趋势，睾酮（T）水平显著下降。且S4组效果最显著，更优于其他干预组。

模型组的脑源性神经营养因子（BDNF）水平显著低于对照组，这可能反映了多囊卵巢综合征小鼠除了卵巢的功能障碍外，还出现神经系统功能受损的情况。在益生菌干预后，脑源性神经营养因子（BDNF）显著提高，表明神经营养支持和相关神经功能可能得到了恢复或改善。促卵泡素（FSH）水平在模型组中显著下降，这可能与排卵障碍有关。益生菌的介入使促卵泡素（FSH）水平显著升高，这可能有助于恢复正常的卵巢功能和周期性排卵。E2（雌二醇）和孕激素/孕酮（PROG）这两种性激素在模型组中也出现了显著下降，这可能影响到了生殖系统的正常功能。益生菌干预后，这两种激素的水平呈现显著升高，可能指示着对生殖激素平衡的正面影响。模型组的促黄体生成素（LH）水平上升，益生菌干预后促黄体生成素（LH）水平有下降趋势，这可能有助于纠正多囊卵巢综合征患者常见的促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH）比例失衡。模型组中睾酮水平显著升高，符合多囊卵巢综合征的高雄激素血症特征。益生菌干预显著降低了睾酮水平，这可能有助于减轻多囊卵巢综合征症状。

（4.5）肠道菌群分析：采用16S rRNA基因测序及其随后的生物信息学分析来评估粪便样本中的肠道微生物群落。首先，从粪便样本中提取微生物DNA，然后使用特异性引物通过聚合酶链式反应（PCR）扩增16S rRNA基因的V3-V4区域。PCR反应如下：95℃变性3 min，94℃变性0.5 min，58℃退火0.5 min，72℃变性0.5 min，共21个循环，72℃最终延伸5 min。将不同样本的产物进行索引，并根据生产商的说明，以等比例混合，使用Illumina Miseq平台（2×300 bp）进行测序。

结果如图10和图11所示，与对照组相比，模型组的微生物群落的α多样性（Chao1指数和ACE指数）显著下降，干预组的微生物群落的α多样性（Chao1指数和ACE指数）显著上升，即BL21菌株和LCr86菌株能够提高多囊卵巢综合征小鼠肠道菌群的丰度，尤其BL21菌株和LCr86菌株合用干预后效果最为显著。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，其特征在于，所述调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.10452的长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株和保藏编号为CGMCC No.19758的卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株。

2.根据权利要求1所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，其特征在于，所述长双歧杆菌Bifidobacterium longum BL21菌株与卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株的活菌数之比为1:10-10:1。

3.根据权利要求1所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于2×10⁹ CFU/mL或2×10⁹ CFU/g。

4.根据权利要求1所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。

5.根据权利要求1所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括冻干保护剂和/或辅助添加剂。

6.根据权利要求5所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括脱脂乳、蔗糖、乳糖、海藻糖、右旋糖酐、明胶、糊精、阿拉伯胶、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求5所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂，其特征在于，所述辅助添加剂包括菊粉、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的调控脑源性神经营养因子和性激素的益生菌剂在制备预防、改善或治疗多囊卵巢综合症的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括辅料。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述辅料包括赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。