CN117965403B - 一种改善生殖道衰老的益生菌剂及其应用 - Google Patents

一种改善生殖道衰老的益生菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种改善生殖道衰老的益生菌剂及其应用，所述改善生殖道衰老的益生菌剂包括干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis BI03菌株。上述两种菌株存在潜在的相互作用，能够相互配合，在改善生殖道衰老的功效上协同增效，具体体现在：显著降低阴道pH值，提高子宫重量指数和阴道重量指数；显著减轻机体的氧化应激，调节免疫反应和改善内分泌平衡。

Description

一种改善生殖道衰老的益生菌剂及其应用
技术领域
本发明属于益生菌剂技术领域，涉及一种改善生殖道衰老的益生菌剂及其应用。
背景技术
随着年龄的增长，生殖道组织会出现自然衰老的现象，表现为局部微环境的改变、微生物群落失衡等，这些变化不仅会降低生殖功能，还可能增加多种生殖道相关疾病的风险。目前，市场上针对生殖道衰老的治疗方法主要集中在荷尔蒙替代疗法等药物治疗上，这些方法虽然在一定程度上能够缓解症状，但长期使用可能会带来副作用，且不能从根本上调节生殖道微环境。
益生菌作为一种调节人体微生态平衡的生物制剂，因其安全性高、副作用小等优点，被应用于改善肠道健康、增强免疫力等领域。益生菌通过维持或恢复微生物群落的平衡，能够改善宿主的局部或全身健康状况。然而，在生殖道衰老领域，选择特定种类的益生菌并开发出既能有效改善生殖道衰老状况，又能保持安全性和稳定性的益生菌剂，是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善生殖道衰老的益生菌剂及其应用，具体提供改善生殖道衰老的益生菌剂及其在制备促进女性生殖健康的产品、在制备预防或缓解生殖道衰老的产品、在制备预防、缓解或治疗生殖道损伤的药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种改善生殖道衰老的益生菌剂，所述改善生殖道衰老的益生菌剂包括保藏编号为CGMCC No.24110的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和保藏编号为CGMCC No.24473的长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis BI03菌株。
本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，将干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC16菌株和长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis BI03菌株进行复配，发现两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在改善生殖道衰老的功效上协同增效，具体体现在：（1）显著降低阴道pH值，提高子宫重量指数和阴道重量指数；（2）显著减轻机体的氧化应激，调节免疫反应和改善内分泌平衡。在使用菌量一致的情况下，与单一的LC16菌株或单一的BI03菌株相比，两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此，该益生菌剂为改善生殖道衰老提供了新的策略。由于干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis BI03菌株均为益生菌，因此其在用于制备相关功效产品时，安全性高，且不易产生抗性。
优选地，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于1×1010 CFU/mL或1×1010 CFU/g，例如1×1010 CFU/mL（CFU/g）、5×1010 CFU/mL（CFU/g）、1×1011 CFU/mL（CFU/g）、1×1012 CFU/mL（CFU/g）、1×1013 CFU/mL（CFU/g）等；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述LC16菌株与BI03菌株的活菌数之比为1:10-10:1，例如1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
基于LC16菌株与BI03菌株的潜在相互作用关系，本发明还发现当两种菌株以上述特定的活菌数配比进行复合时，其在降低阴道pH值，提高子宫重量指数和阴道重量指数，减轻机体的氧化应激，调节免疫反应和改善内分泌平衡的功效上更加显著。
优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
本发明所涉及的益生菌剂的剂型不受限制，包括最常用的冻干粉剂，或进一步制得的胶囊剂、片剂或颗粒剂。
优选地，所述益生菌剂的剂型为冻干粉剂，其由如下的制备方法制得：
将LC16菌株和BI03菌株分别接种于培养基中依次进行活化和发酵培养，得到发酵液；发酵液分别离心，与冻干保护剂混合后进行冷冻干燥，得到LC16菌粉和BI03菌粉；将LC16菌粉和BI03菌粉按照活菌数配比进行混合，得到所述改善生殖道衰老的益生菌剂。
优选地，所述冻干保护剂选自脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述将LC16菌粉和BI03菌粉按照活菌数配比进行混合后还与功能助剂混合。
所述功能助剂选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供根据第一方面所述的改善生殖道衰老的益生菌剂在制备促进女性生殖健康的产品中的应用。
第三方面，本发明提供根据第一方面所述的改善生殖道衰老的益生菌剂在制备预防或缓解生殖道衰老的产品中的应用。
第四方面，本发明提供根据第一方面所述的改善生殖道衰老的益生菌剂在制备预防、缓解或治疗生殖道损伤的药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明开发了一种全新的益生菌复配方式，将干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC16菌株和长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis BI03菌株进行复配，发现两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在改善生殖道衰老的功效上协同增效，具体体现在：（1）显著降低阴道pH值，提高子宫重量指数和阴道重量指数；（2）显著减轻机体的氧化应激，调节免疫反应和改善内分泌平衡。在使用菌量一致的情况下，与单一的LC16菌株或单一的BI03菌株相比，两种菌的复配在上述功效的发挥显著提高。因此，该益生菌剂为改善生殖道衰老提供了新的策略。由于干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis BI03菌株均为益生菌，因此其在用于制备相关功效产品时，安全性高，且不易产生抗性。
本发明所涉及的LC16菌株的分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2021年12月15日，保藏编号为CGMCC No.24110，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明所涉及的BI03菌株的分类命名为长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年03月07日，保藏编号为CGMCC No.24473，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1是各组大鼠阴道pH值的统计结果图；
图2是各组大鼠阴道灌洗液中的免疫球蛋白A（IgA）水平的统计结果图；
图3是各组大鼠血清中卵泡生成素水平的统计结果图；
图4是各组大鼠血清中雌二醇水平的统计结果图；
图5是各组大鼠血清中黄体生成素水平的统计结果图；
图6是各组大鼠血清中丙二醛水平的统计结果图；
图7是各组大鼠血清中活性氧簇水平的统计结果图；
图8是各组大鼠子宫重量指数的统计结果图；
图9是各组大鼠阴道重量指数的统计结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中涉及的培养基配方如下：
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。
下述实施例所涉及的LC16菌株的分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏编号为CGMCC No.24110。
下述实施例所涉及的BI03菌株的分类命名为长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis，保藏编号为CGMCC No.24473。
下述涉及的菌悬液制备方法：将所需菌株接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按4%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养30 h，得到菌液；将菌液在4℃下5000rpm下离心10 min，过滤，得到菌体，使用PBS溶液重悬菌体，即得。
试验结果数据使用R语言的ggplot2进行统计分析，与CTL组相比，###代表p<0.001，##代表p<0.01，#代表p<0.05；与MC组相比，***代表p<0.001，**代表p<0.01，*代表p<0.05，NS代表无显著差异。
实施例
本实施例探究益生菌剂对生殖道衰老大鼠的症状改善能力：
（1）试验动物：10月龄的SD雌性大鼠共70只（购于上海实验动物中心），体质量203-280g。
（2）动物分组：大鼠适应性喂养1周后，将70只小鼠随机分为7组（每组10只）：对照组（CTL组）、模型组（MC组）、经LC16菌株干预的小鼠组（LC16组，记为S1组）、经BI03菌株干预的小鼠组（BI03组，记为S2组）、经市售干酪乳杆菌菌株ATCC393干预的小鼠组（ATCC393组，记为S3组）、经LC16菌株和BI03菌株联合干预的小鼠组（LC16+BI03组，两株菌的活菌数比例1:1，记为S4组）、经市售菌株ATCC393和BI03菌株联合干预的小鼠组（ATCC393+BI03组，两株菌的活菌数比例1:1，记为S5组）。
（3）动物建模及干预方法：对照组进行卵巢暴露但不切除卵巢的假手术，模型组、各益生菌干预组通过切除卵巢及子宫角的手术建立生殖道衰老模型。
所有大鼠以2%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉；仰卧位固定后，在最下肋骨稍后方位中心剪毛，并用碘酒消毒。从腰椎沿背部正中线向下切开1-2.5cm的切口。用圆头剪插入肌肉和皮肤之间，扩张并剥离，找到卵巢及其相连的子宫角。结扎子宫角上下部输卵管及周围血管，用眼科剪切断子宫角并摘除卵巢。缝合腹膜及肌肉层切口，检查有无出血后缝合皮肤。
术后处理：手术后5天开始进行阴道涂片检查，每天1次，连续5天；以未出现动情反应为标准判断动物模型建立成功。术后所有大鼠均注射2万单位青霉素，连续3天。所有大鼠术后自然喂养20天，以达到生殖道衰老状态，接受统一的饲养条件，包括固定的光照时间（早上7时至晚上6时）、室温控制在22°C。在整个实验过程中，对照组、模型组大鼠自实验开始至结束均用普通饲料+无菌水喂养，各益生菌干预组使用普通饲料+含有菌悬液的纯化水喂养（干预量为1×109/天/只）。
（4）指标分析：
（4.1）大鼠阴道pH值检测：
使用pH试纸检测大鼠阴道pH值，结果如图1所示，由图可知，与对照组相比，模型组大鼠阴道pH值显著升高，阴道pH值的升高可能是由于微生物群落失衡导致的阴道环境改变，这反映了生殖道衰老或受损的生理状态。而各组益生菌干预后，尤其是S4组，大鼠阴道pH值显著降低，这表明益生菌的干预对于恢复生殖道的健康状态具有积极作用，阴道pH值的降低反映了益生菌通过调节阴道微生物群落，恢复了阴道自然的酸性环境，有助于维持阴道健康并预防感染。
（4.2）大鼠阴道灌洗液中的免疫球蛋白A（IgA）水平的检测：
在测定阴道pH值后，所有大鼠经过一夜的禁食和禁水。次日，使用100μL生理盐水对每只大鼠的阴道进行三次清洗，并收集阴道灌洗液，随后将其保存在-80°C的条件下以备后续分析。参考试剂盒说明书（武汉纯度生物技术有限公司）方法，使用双抗体夹心法结合酶标仪来检测免疫球蛋白A水平。
结果如图2所示，由图可知，与对照组相比，模型组大鼠的免疫球蛋白A水平异常降低，免疫球蛋白A水平的降低指示免疫功能的减弱，影响了机体对病原体的防御能力，是生殖道衰老或受损的典型生理标志。各组益生菌干预后，尤其是S4组，大鼠阴道灌洗液中的免疫球蛋白A水平显著升高，这表明益生菌干预能有效提高免疫功能，从而对抗生殖道的衰老过程。
（4.3）大鼠血清卵泡生成素、雌二醇、黄体生成素、丙二醛、活性氧簇水平的检测：
通过麻醉并剖开腹腔的方式，从大鼠动脉中抽取5mL血液，血液静置30min后以3000r/min的速度离心10min，以分离血清，并将其保存在-20°C下待后续分析。血清中的卵泡生成素、雌二醇、黄体生成素水平通过放射免疫分析法进行检测，试剂盒由江苏酶免提供，丙二醛通过化学发光法检测，试剂盒由武汉纯度生物有限公司提供。活性氧簇水平则通过酶联免疫吸附法检测，试剂盒由武汉纯度生物有限公司提供。
结果如图3-图7所示，由图可知，与对照组相比，模型组大鼠血清卵泡生成素、黄体生成素、丙二醛和活性氧簇水平异常升高，雌二醇水平异常降低，这些变化指示了生殖内分泌功能紊乱、氧化应激增加，这些都是生殖道衰老或受损的典型生理标志。卵泡生成素和黄体生成素是调节生殖功能的关键激素，它们的异常升高可能反映了生殖轴的反馈机制失衡，导致生殖功能下降。丙二醛和活性氧簇水平的升高则反映了体内氧化应激状态的增加，氧化应激被认为是加速细胞衰老和组织损伤的重要因素。各组益生菌干预后，尤其是S4组，大鼠血清卵泡生成素、黄体生成素、丙二醛和活性氧簇水平显著降低趋于正常，雌二醇水平显著升高趋于正常。这些结果表明益生菌干预能有效调节生殖内分泌激素水平，减轻氧化应激，为维护生殖健康提供了一种潜在的干预手段。
（4.4）大鼠子宫重量指数及阴道重量指数检测：
通过剥离并精确称重大鼠的子宫及阴道，计算子宫及阴道的重量指数，即器官重量(mg)除以体质量(mg)，以评估生殖道的质量变化。
结果如图8-图9所示，由图可知，与对照组相比，模型组大鼠子宫重量指数和阴道重量指数显著降低，子宫与阴道重量指数的降低指示了组织萎缩或功能减退的现象，这些变化反映了生殖道衰老或受损的生理状态。各组益生菌干预后，尤其是S4组，大鼠子宫重量指数和阴道重量指数显著增加，子宫与阴道重量指数的增加表明益生菌干预促进了生殖道组织的恢复或生长，改善了其结构和功能，这表明益生菌的应用对于恢复生殖道的健康状态具有积极作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (8)

1.一种改善生殖道衰老的益生菌剂，其特征在于，所述改善生殖道衰老的益生菌剂包括保藏编号为CGMCC No.24110的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和保藏编号为CGMCC No.24473的长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp. infantis BI03菌株。
2.根据权利要求1所述的改善生殖道衰老的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，活菌总数不低于1×1010 CFU/mL或1×1010 CFU/g。
3.根据权利要求1所述的改善生殖道衰老的益生菌剂，其特征在于，所述LC16菌株与BI03菌株的活菌数之比为1:10-10:1。
4.根据权利要求1所述的改善生殖道衰老的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
5.根据权利要求4所述的改善生殖道衰老的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型为冻干粉剂，其由如下的制备方法制得：
将LC16菌株和BI03菌株分别接种于培养基中依次进行活化和发酵培养，得到发酵液；发酵液分别离心，与冻干保护剂混合后进行冷冻干燥，得到LC16菌粉和BI03菌粉；将LC16菌粉和BI03菌粉按照活菌数配比进行混合，得到所述改善生殖道衰老的益生菌剂。
6.根据权利要求5所述的改善生殖道衰老的益生菌剂，其特征在于，所述冻干保护剂选自脱脂乳、明胶、糊精、阿拉伯胶、右旋糖酐、藻胶钠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、乳糖、海藻糖、山梨醇或木糖醇中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求5所述的改善生殖道衰老的益生菌剂，其特征在于，所述将LC16菌粉和BI03菌粉按照活菌数配比进行混合后还与功能助剂混合；
所述功能助剂选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳清蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的改善生殖道衰老的益生菌剂在制备预防或缓解生殖道衰老的产品中的应用。
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