JP6735338B2 - 腸内細菌のButyribacter intestiniおよびその使用 - Google Patents
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Description
(iii )哺乳動物の体重増加の抑制、
(iv)哺乳動物の体脂肪比(脂肪重量/体重の比)の低下、
(v )哺乳動物の血中脂質レベルの低下、
(vi)哺乳動物における高密度リポタンパク質(HDLC)のレベルの向上、
(vii )哺乳動物における低密度リポタンパク質(LDLC)のレベルの低下、
からなる群から選ばれる一または複数の用途に使用される。
本発明の第一の側面に記載の分離された菌および/または分離された菌の代謝産物を、食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、本発明の第二に記載の組成物を形成する工程
を有する製造方法を提供する。
(a)適切な培養条件下で本発明の第一の側面に記載の分離された菌を培養することによって、培養産物を得る工程、
(b)任意に、前記培養産物から菌体および/または菌体の代謝産物を分離する工程、ならびに
(c)任意に、前の工程で分離された菌体および/または菌体の代謝産物を食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、組成物を製造する工程、
を有する生産方法を提供する。
一つの好適な例において、前記菌株はButyribacter intestini TF01-11で、寄託番号はCGMCC 10984 で、ヒトの糞便から分離されたものである。Butyribacter intestiniの生理的特性は以下の通りである。Butyribacter intestiniはPYG プレートにおいて嫌気条件、37℃で48h培養した後、集落が灰白色で、不透明で、平滑で、周縁が不規則で、仮根状で、集落の直径が約2mmである。グラム染色、顕微観察によって、TF01-11 はグラム陽性菌で、長桿状で、芽胞がなく、鞭毛を有し、運動可能で、菌体の直径が約0.5 〜1.0 mmで、長さが約2.0 〜8.0 mmである。そして、本発明に記載のButyribacter intestiniはカタラーゼ陰性菌で、生長の温度範囲が30〜42℃で、最適生長温度が37℃で、pH値許容範囲が6.0 〜8.5 で、2%のNaClに耐えることができる。発酵可能な炭水化物は、キシロース、ガラクトース、ラフィノース、グルコース、マルトース、セロビオース、スクロース、デンプンおよびを含み、主に酢酸と酪酸が生成する。
また、本発明は組成物、好ましくは薬物組成物を提供する。前記組成物は有効量のButyribacter intestiniを含み、一つの好適な例において、前記組成物はさらに乳酸菌、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれるプロバイオティクス、ならびに/あるいははフラクトオリゴ糖(FOS) 、ガラクトオリゴ糖(GOS) 、キシロオリゴ糖(XOS) 、乳果オリゴ糖(LACT)、大豆オリゴ糖(SOS) 、イヌリン(Inulin)、またはこれらの組み合せからなる群から選ばれるプレバイオティクスを含む。
1×10〜1×1020cfu/mLのButyribacter intestiniおよび/またはButyribacter intestiniの代謝産物と、食品的にまたは薬学的に許容される担体、および/または賦形剤とである。
1×106 〜1×1011cfu/mLのButyribacter intestiniおよび/またはButyribacter intestiniの代謝産物と、食品的にまたは薬学的に許容される担体、および/または賦形剤とである。
通常、Butyribacter intestiniは通常の方法で製造することができる。
(a)適切な培養条件下で前記のButyribacter intestiniを培養することによって、培養産物を得る工程、
(b)任意に、前記培養産物から菌体および/または菌体の代謝産物を分離する工程、ならびに
(c)任意に、前の工程で分離された菌体および/または菌体の代謝産物を食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、組成物を製造する工程
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記方法は、本発明の薬物組成物、食品組成物、飲料組成物、またはこれらの組み合わせを摂取することを含む。前記実験対象はヒトである。
(a) 本発明のButyribacter intestiniは顕著に体重、血中脂質、体脂肪比を低下させることができる。
(b) 本発明のButyribacter intestiniは顕著に肥満およびその関連疾患(たとえば心血管疾患)に関連する指標(たとえばコレステロールやトリグリセリド)を低下させることができる。
(c) 本発明のButyribacter intestiniは顕著に総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質のレベルを低下させることができる。
(d) 本発明のButyribacter intestiniは顕著に高密度リポタンパク質のレベルを向上させることができる。
(e) 本発明のButyribacter intestiniはインスリン抵抗性を改善し、さらにアテローム性動脈硬化や心血管疾患の発生のリスクを低下させることができる。
(f) 本発明のButyribacter intestiniは顕著に単球走化性タンパク質-1(MCP-1 )のレベルを低下させることができる。
(g) 本発明のButyribacter intestiniは有効に肥満症に伴うレプチン抵抗性を改善し、生体内におけるレプチンに対する感受性を向上させることができる。
1.1 Butyribacter intestini(Butyribacter intestini TF01-11)の分離
本発明のButyribacter intestini TF01-11 は深▲セン▼市塩田区の一名の17歳の男性の糞便サンプルから分離されたのもので、嫌気条件において約0.2gの糞便サンプルを取り、無菌のPBS に入れた後、勾配希釈を行って塗布し、PYG 培地を使用したが、その主な成分はペプトン5g、カゼインの膵消化物5g、酵母粉10 g、牛肉エキス5g、ブドウ糖5g、K2HPO42g 、Tween 80 1ml、システイン-HCl・H2O 0.5g 、ヘム 5mg、ビタミンK1 1ul、無機塩溶液(1Lあたりの無機塩溶液は、CaCl2・2H2O 0.25g、MgSO4・7H2O 0.5g 、K2HPO41g 、KH2PO41g 、NaHCO310g、NaCl 2g を含む)40ml、レサズリン 1mg、蒸留水950 mlで、pH 6.8〜7.0 で、115 ℃で25 min滅菌された。48hのプレート培養後、単一集落を取って画線分離を行った。
1mlのTF01-11 培養の菌液を取り、ゲノムDNA を抽出し、プライマー対8f/1492rで16S rDNAをPCR によって増幅させた。
tgcagtcgaa cgaagctcct gcgacagatt ccttcgggat gaagatgctt gagacttagt 60
ggcggacggg tgagtaacgc gtgggtaacc tgccctgtac tgggggacaa cagttagaaa 120
tgactgctaa taccgcataa gcctacggag tcgcatgact cagcaggaaa aattccggtg 180
gtacaggatg ggcccgcgtc tgattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac 240
gatcagtagc cggcttgaga gagtgaacgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact 300
cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcaacgc 360
cgcgtgagtg aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag aaaatgacgg 420
tacctgacta agaagcaccg gctaaatacg tgccagcagc cgcggtaata cgtatggtgc 480
aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag ggagcgcagg cggtctggca agtctgatgt 540
gaaaatccgg ggctcaactc cggaactgca ttggaaactg tcagactaga gtgtcggaga 600
ggtaagtgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg 660
cgaagggcgg cttactggac gataactgac gctgaggctc gaaagcgtgg ggagcaaaca 720
ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat actaggtgtc ggggcacaaa 780
agtgcttcgg tgccgcagca aacgcattaa gtattccacc tggggagtac gttcgcaaga 840
atgaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900
aagcaacgcg aagaacctta ccagtccttg acatcccgat gaccgacctg taacgaggtc 960
ttctcttcgg agcatcggag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cctgtcctta gtagccagca gttcggctgg 1080
gcactctagg gagactgccg gggataaccc ggaggaaggt ggggacgacg tcaaatcatc 1140
atgcccctta tgggctgggc tacacacgtg ctacaatggt gctaacaaag tgaagcaagc 1200
tggtgacagt aagcaaatca caaaaatggc atctcagttc ggattgtagt ctgcaactcg 1260
actacatgaa gctggaatcg ctagtaatcg cagatcagaa tgctgcggtg aatacgttcc 1320
cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg aaatgcccga agtcagtgac 1380
ccaaccgcaa ggagggagca 1400
TF01-11 をラクノスピラ科(Lachnospiraceae )のモデル種の16S rDNA配列と多重配列アライメントした後、MEGA 5によって系統樹の作成を行い、最近隣法(Neighbour-joining )によって系統発生樹を構築した。
(1)形態学的特徴
Butyribacter intestini(Butyribacter intestini TF01-11)は、PYG プレートにおいて嫌気条件、37℃で48h培養した後、集落が灰白色で、不透明で、平滑で、周縁が不規則で、仮根状で、集落の直径が約2mmである(図1)。
グラム染色、顕微観察によって、TF01-11 はグラム陽性菌で、長桿状で、芽胞がなく、鞭毛を有し、運動可能で、菌体の直径が約0.5 〜1.0 mmで、長さが約2.0 〜8.0 mmである(図1)。
TF01-11 はカタラーゼ陰性で、生長の温度範囲が30〜42℃で、最適生長温度が37℃で、pH値許容範囲が6.0 〜8.5 で、2%のNaClに耐えることができる。TF01-11 と近縁の3株のモデル菌(Roseburia intestinalis DSM 14610T、Acetivibrio ethanolgignens ATCC 33324T、Lachnospira multipara DSM 3073T )との酵素反応(API ZYM) および基質の利用状況(API 20A、API 50CH) を比較したところ、表1では、TF01-11 が近縁の3株のモデル菌とAPI 反応において大きな違いが存在することが示された。
48h培養したTF01-11 の発酵液1mlを取り、12000r/minで5min遠心し、上清液を吸い取り、所定濃度のギ酸水溶液で10倍希釈し(ギ酸の最終濃度9%)、使用に備えた。外標準法によって測定し、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸で標準曲線の作成を行い、ここで、酢酸、酪酸、吉草酸の濃度はそれぞれ517 μL/L 、497 μL/L 、401 μL/L 、467 μL/L であった。島津GC-2014Cガスクロマトグラフ、HP-INNOWax(Cross-Linked PEG)、30 m×0.25mm×0.25umの毛細柱によって分析し、検出器は水素炎イオン化検出器で、GCパラメーターの設定はカラム温度:180 〜200 ℃、気化室温度:240 ℃、検出温度:210 ℃、仕込み量:2μL、キャリアガス流量:N2,50mL/min、水素ガス流量:50mL/min、空気流量:600 〜700 mL/minであった。
実験材料:
マウス:C57BL/6J雄マウス(広東省医学実験動物センターから購入)を購入し、正常飼育のマウスで、6週齢で、計30匹であった。マウスの生長過程は同じ環境で、かつ同様の食物を投与した。
菌株:実施例1に記載の分離されたButyribacter intestini TF01-11菌株
高脂肪飼料(HF):78.8%基礎飼料、1%コレステロール、10%卵黄粉、10%豚脂および0.2 %コール酸塩を含み、南通特洛菲飼料科技有限公司から購入された。
普通維持飼料:広東省医学実験動物センターから購入された。
正常飼育のC57BL/6J成年雄マウスを選び、ランダムに三つの実験群(それぞれ対照群、肥満モデル群およびTF01群)に分かれ、各群に10匹ずつで、SPF(Specific pathogen Free) 環境において自由に餌と水を摂らせた。肥満モデル(Model )群およびTF01群では高脂肪飼料を、対照群では普通維持飼料を投与した。4週間飼育した後、TF01群ではButyribacter intestini(Butyribacter intestini TF01-11)の菌液の胃内投与を開始し、肥満モデル群および対照群では等量の培地を胃内投与し、9週間胃内投与した。
(1)Butyribacter intestini(Butyribacter intestini TF01-11)のマウスの体重増加に対する影響
原料の配合は表7に示す。
原料の配合は表8に示す。
本発明の菌株であるButyribacter intestini(Butyribacter intestini TF01-11)(寄託名称と同様)は、既に2015年6月16日に中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター(CGMCC)に寄託され、住所は中国北京市朝▲陽▼区北辰西路1号院3号で、寄託番号はそれぞれCGMCC 10984である。
Claims (9)
- 配列番号1に記載されている16s rDNAの配列を有しているButyribacter intestiniであることを特徴とする分離された菌。
- Butyribacter intestiniは、寄託番号がCGMCC 10984 のButyribacter intestini TF01-11であることを特徴とする請求項1に記載の分離された菌。
- (a)安全有効量の請求項1に記載の分離された菌および/または分離された菌の代謝産物と、
(b)食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と
を含むことを特徴とする組成物。 - 前記組成物の全体積または全重量に対し、1×10〜1×1020cfu/mLまたはcfu/g のButyribacter intestini TF01-11を、好ましくは1×104 〜1×1015cfu/mLまたはcfu/g のButyribacter intestini TF01-11を含有することを特徴とする請求項3に記載の組成物。
- ほかのプロバイオティクスおよび/またはプレバイオティクスをさらに含有することを特徴とする請求項3に記載の組成物。
- 請求項1に記載の分離された菌、または請求項3に記載の組成物の使用であって、
(a)肥満の予防および/もしくは治療、(b)血中脂質の低下、(c)心血管疾患の予防もしくは治療、ならびに/または(d)糖尿病の予防および/もしくは治療からなる群から選ばれる一または複数の用途に使用される薬物の製造のためであることを特徴とする使用。 - 請求項1に記載の分離された菌、または請求項3に記載の組成物の使用であって、
(i)哺乳動物における単球走化性タンパク質-1(MCP-1 )のレベルの低下、ならびに/または(ii)レプチン抵抗性の改善および/もしくは生体内におけるレプチンに対する感受性の向上に使用される薬物または製剤の製造のためであることを特徴とする使用。 - 請求項3に記載の組成物の製造方法であって、
請求項1に記載の分離された菌および/または分離された菌の代謝産物を、食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、請求項3に記載の組成物を形成する工程
を有することを特徴とする製造方法。 - (a)適切な培養条件下で請求項1に記載の分離された菌を培養することによって、培養産物を得る工程、
(b)任意に、前記培養産物から菌体および/または菌体の代謝産物を分離する工程、ならびに
(c)任意に、前の工程で分離された菌体および/または菌体の代謝産物を食品的に許容される担体または薬学的に許容される担体と混合することによって、組成物を製造する工程
を有することを特徴とする生産方法。
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