CN115372482A - 肠道菌群谱和代谢标志物在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用 - Google Patents
肠道菌群谱和代谢标志物在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及临床医学领域，具体是肠道菌群谱和代谢标志物在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用，所述的多囊卵巢综合征为机体生物钟紊乱诱导的多囊卵巢综合征。本发明明确一组血清联合标志物用于PCOS的诊断和治疗，包括皮质醇、顺式‑9‑棕榈油酸和13‑甲基十四烷酸，同时该组联合标志物可以联合LH/FSH或睾酮或甘油三酯提高诊断特异性和敏感度，且该组联合标志物诊断呈阳性的PCOS人群可能对罗伊氏乳杆菌有较好的潜在治疗效果。本发明还明确了一组肠道菌群可用于临床PCOS的诊断。本发明提供了创伤小、再生速度快、成本相对较低、侵袭性小、灵敏度高、特异性好的生物标志物，对于多囊卵巢综合征的临床诊疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学领域，具体地说，是肠道菌群谱和代谢标志物在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
背景技术
多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌代谢性疾病，发病率约为7％-10％，是以稀发排卵或无排卵、多囊卵巢、伴发高雄激素或胰岛素抵抗等为特征的内分泌紊乱症候群，同时常伴有肥胖、不孕等表现，且冠心病、子宫内膜癌等远期并发症增加。
PCOS是妇科内分泌较为复杂的疾病之一，其发病机制至今尚不明确，一直是研究的重点且具有重要的临床意义。近年来大规模的全基因组关联研究 (Genome-WideAssociation Studies，GWAS)研究发现了多个在PCOS发生发展中可能发挥重要作用的遗传基因。但是并非所有携带遗传致病基因突变的患者都会出现PCOS的症状，因此外界环境在PCOS的发病中也发挥着重要作用。正常生物钟节律的存在与机体内环境稳态息息相关，使机体能够更好地应对环境变化。既往研究表明，生物钟紊乱和机体糖脂代谢异常密切相关，因此生物钟紊乱很可能参与PCOS的发生发展。而探索改善生物钟紊乱的方法，也有助于PCOS的临床诊断和治疗。
由于PCOS临床表现的复杂多样，大大增加了临床诊疗的难度。目前，临床上诊断多囊卵巢综合征普遍依据2003年鹿特丹标准：(1)高雄激素的临床表现和或高雄激素血症；(2)稀发排卵或无排卵；(3)卵巢多囊样改变(单侧或双侧卵巢2-9mm，卵泡数≥12个)或卵巢体积≥10mL(卵巢体积＝0.5×长×宽×厚)；三个条件中满足两个，并排除其他引起排卵障碍或高雄激素生化或临床表现的疾病。此后，我国结合中国女性的特点和临床医师的经验，于2011年制定了PCOS诊治的中国诊断标准，并提出了“疑似诊断”的概念。疑似PCOS：月经稀发或闭经或不规则子宫出血是诊断的必要条件，另外再符合以下两项中的一项：(1)高雄激素临床表现或高雄激素血症；(2)超声表现为卵巢多囊样改变；确诊PCOS：具备上述疑似PCOS诊断条件后，还必须逐一排除其他可能引起高雄激素的疾病和排卵异常的疾病后才能确定诊断，包括库欣综合征、非典型先天性肾上腺皮质增生、卵巢或肾上腺分泌雄激素的肿瘤、功能性下丘脑性闭经、甲状腺疾病、高泌乳素血症和早发性卵巢功能不全等。
近年来，越来越多研究提示肠道菌群可能与PCOS的胰岛素抵抗和高雄激素血症有关。PCOS患者的肠道菌群与对照女性相比明显发生改变。来曲唑诱导的类PCOS小鼠以及脱氢表雄酮诱导的类PCOS小鼠均出现肠道菌群紊乱、雄激素水平升高、糖脂代谢异常、动情周期异常和卵巢多囊样改变等。而用乳杆菌和健康小鼠的粪微生物移植治疗后，可以减少小鼠体内雄激素合成，缓解糖脂代谢紊乱，改善动情周期异常和卵巢形态。因此，益生菌如乳杆菌可能对 PCOS有治疗作用。目前细菌的16s rDNA测序技术和宏基因组测序技术在肠道微生态学研究中取得了突破性发展，通过分析PCOS相关的关键菌群结构，可能有助于了解其分子病理机制，为临床诊断及治疗提供新的角度和理论依据。
代谢物的筛选以及作为疾病标志物的应用在临床工作中发挥了重要作用，如糖尿病中的葡萄糖和胰岛素，肾功能诊断中的肌酐和尿素，肿瘤标志物中的癌胚抗原和甲胎蛋白等，对于相关疾病的诊断和治疗都极为关键。PCOS的发生发展过程涉及多种代谢通路和代谢物含量的改变，如脂质、氨基酸、糖、有机酸、胆汁酸等等，但是将代谢物作为PCOS诊断标志物的临床应用仍较为局限。液相色谱-质谱(Liquid chromatograph massspectrometer，LC-MS)技术是代谢组学研究的重要技术，也是发现生物标志物的强有力工具，为PCOS血清标志物的挖掘提供基础。
目前，PCOS的诊断过程需要结合问诊、超声和多个免疫生化试剂盒的联合应用，成本高、过程繁琐。虽然现在已有大量PCOS相关的基因研究，为 PCOS的诊断提供了新思路，但是基因和蛋白质的表达容易受到表观遗传和翻译后修饰等调控，具有存在形式的不均一和不确定性。与之相比，代谢物作为上游基因表达的最终产物，可以体现机体对遗传因素和外界环境因素变化做出的最终反应，与临床表现密切相关。因此开发新的方法，发现创伤小、灵敏度高、特异性好的生物标志物对于PCOS临床诊疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供联合诊断标志物在机体生物钟紊乱以及多囊卵巢综合征诊断中的应用，所述的联合诊断标志物包括肠道菌群、粪便代谢物和血清代谢物。
本发明的第一方面，提供检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
进一步的，所述的多囊卵巢综合征为机体生物钟紊乱诱导的多囊卵巢综合征。
进一步的，所述的诊断试剂盒为预测罗伊氏乳杆菌治疗效果的试剂盒；诊断呈阳性的多囊卵巢综合征人群采用罗伊氏乳杆菌有较好的治疗效果。
本发明通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)的曲线下面积(Area under the curve，AUC)大小判断单个代谢物的诊断效果，同时利用logistic回归分析计算得皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸三个联合代谢物的AUC-ROC为0.81，95％CI为0.75-0.87(图6F)。
本发明还提供一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸的试剂。
本发明的第二方面，提供检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和LH/FSH比值的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
促黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)与卵泡刺激素(Follicle-stimulatinghormone，FSH)比值(即LH/FSH)升高是PCOS诊断中较为重要的辅助指标，如果将三个代谢物联合LH/FSH比值共同用于PCOS诊断，可以将LH/FSH比值的AUC-ROC从0.84提高到0.91，95％CI升至0.87-0.95(图6G)。
进一步的，所述的多囊卵巢综合征诊断试剂盒为适用于BMI＜24人群的多囊卵巢综合征临床诊断试剂盒，AUC-ROC为0.94，95％CI为0.91-0.98(图 6H)。
本发明还提供一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和LH/FSH比值的试剂。
本发明的第三方面，提供检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和睾酮(Testosterone，T0)的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
T0水平升高是PCOS诊断条件之一，如果将三个代谢物联合T0共同用于PCOS诊断，可以将T0水平的AUC-ROC从0.92提高到0.96，95％CI升至 0.94-0.98(图6I)。因此，皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和T0联合标志物在临床PCOS诊疗中有很大的潜在价值。
本发明还提供一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和睾酮的试剂。
本发明的第四方面，提供检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和甘油三酯的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
三个代谢物联合TG用于PCOS诊断，其AUC-ROC为0.91，95％CI为 0.86-0.96(图6J)。
进一步的，所述的多囊卵巢综合征诊断试剂盒为适用于BMI≥24人群的多囊卵巢综合征临床诊断试剂盒，AUC-ROC为0.95，95％CI为0.88-1.00(图 6K)。
本发明还提供一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和甘油三酯的试剂。
本发明的第五方面，提供检测粪便中肠道菌群丰度变化的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用，所述的肠道菌群包括金孢子菌属 (g__Chrysosporum)、梭杆菌属(g__Fusobacterium)、梭菌属(g__Podoviridae)、志贺氏杆菌(g__Shigellap)、丛毛单胞菌属(g__Comamonas菌属)、副拟杆菌属(g__Parabacteroides)、γ-噬菌体(g__Lambdalikevirus)、克雷伯氏菌属 (g__Klebsiella)、埃希氏菌属(g__Escherichia)、福赛斯坦纳菌属 (g__Tannerella)、长尾噬菌体(g__Siphoviridae)和巴恩斯氏菌 (g__Barnesiella)。
本发明还提供一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，所述的试剂盒中包含检测粪便中肠道菌群丰度变化的试剂，所述的肠道菌群包括金孢子菌属、梭杆菌属、梭菌属、志贺氏杆菌、丛毛单胞菌属、副拟杆菌属、γ-噬菌体、埃希氏菌属、长尾噬菌体、克雷伯氏菌属、福赛斯坦纳菌属和巴恩斯氏菌。
本发明研究发现，持续黑暗引起的生物钟紊乱会导致大鼠出现肝脏核心节律基因表达异常，包括BMAL1、CLOCK、PER1、PER2、NR1D1、NR1D2，同时出现高雄激素血症、血清LH/FSH比值升高、糖脂代谢异常、动情周期紊乱、卵巢多囊样改变等类PCOS的症状，因此生物钟紊乱与PCOS的发生发展密切相关。而罗伊氏乳杆菌处理后，黑暗大鼠肝脏节律基因PER2和NR1D1 的异常表达恢复趋近于正常对照，同时血清性激素结合求蛋白(Sex hormonebinding globulin，SHBG)水平、胰岛素抵抗、动情周期紊乱和卵巢多囊样改变得到改善，肝脏脂质聚积以及血清脂代谢紊乱情况明显缓解。
本发明明确，大鼠生物钟发生紊乱后，菌属棒状杆菌属-1 (g__Corynebacterium_1)、奇枝菌属(g__Atopostipes)、八叠球菌属 (g__Sporosarcina)、咸海鲜球菌属(g__Jeotgalicoccus)、中慢生根瘤菌属 (g__Mesorhizobium_sp)、不明的瘤胃菌_RFN54 (g__unidentified_rumen_bacterium_RFN54)、短状杆菌属 (g__Brachybacterium)、厌氧氨养菌属(g__Candidatus_Brocadia)、海洋芽孢杆菌属(g__Oceanobacillus)、费克蓝姆菌属(g__Facklamia)、嗜冷杆菌属 (g__Psychrobacter)、g__Family_XIII_AD3011_group菌属、瘤胃菌属-009 (g__Ruminococcaceae_UCG-009)、瘤胃菌属-010 (g__Ruminococcaceae_UCG-010)、杆菌属(g__Bacillus)、g__Faecalitalea菌属、普雷沃氏菌属-003(g__Prevotellaceae_UCG-003)、类香味菌属 (g__Myroides)、狭义梭菌属-1(g__Clostridium_sensu_stricto_1)、瘤胃菌属-014 (g__Ruminococcaceae_UCG-014)、乳酸杆菌属(g__Lactobacillus)、 g__Elusimicrobium菌属、巴氏杆菌属(g__Pasteurella)、普氏菌属-1(g__Prevotella_1)、漫游球菌属(g__Vagococcus)、埃希氏菌属-志贺氏菌属 (g__Escherichia-Shigella)、球链菌属(g__Globicatella)和丁酸弧菌 (g__Butyricimonas)的丰度发生明显变化。其中，乳酸杆菌属 (g__Lactobacillus)、瘤胃菌属-010(g__Ruminococcaceae_UCG-010)、狭义梭菌属-1(g__Clostridium_sensu_stricto_1)、瘤胃菌属-009 (g__Ruminococcaceae_UCG-009)和g__Family_XIII_AD3011_group菌属在罗伊氏乳杆菌改善生物钟紊乱，以及改善生物钟紊乱诱导类PCOS中发挥重要作用。
本发明明确，大鼠生物钟发生紊乱后，大量粪便代谢物的含量发生明显变化。其中，MG(18:0/0:0/0:0)、熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid)、9-羰基-反, 顺-共轭亚油酸(9-OxoODE)、甘氨酰(Glycyl-valine)、3-甲基腺嘌呤 (3-Methyladenine)、L-肉毒碱(L-Carnitine)、棕榈酸(Palmitic acid)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid)、壬二酸(Nonanedioic acid)、13-甲基十四烷酸 (13-Methylmyristic acid)、琥珀酸(Succinicacid)、N6,N6,N6-三甲基赖氨酸 (N6,N6,N6-Trimethyl-L-lysine)、十四烷酸(Myristicacid)、葫芦巴碱 (Trigonelline)、烟酸(Nicotinic acid)、顺式-二十碳烯酸(cis-Gondoic acid)、肌酐(Creatinine)、泛酸(Pantothenic acid)、鸟氨酸(Ornithine)、N-乙酰天冬氨酸(N-Acetylaspartate)、阿魏酸(Ferulic acid)、鼠胆酸(Murocholic acid)、油酸(Oleic acid)、16-羟基十六酸(16-Hydroxyhexadecanoic acid)、腺嘌呤 (Adenine)、马来酸(Maleic acid)、十五酸(Pentadecylic acid)、γ-氨基丁酸 (gamma-Aminobutyricacid)、3-甲基黄嘌呤(3-Methylxanthine)、cAMP、L- 谷氨酰胺(L-Glutamine)、3-吲哚乙酸(3-Indoleacetic acid)和N-乙酰-L-谷氨酸(N-Acetyl-L-glutamic acid)在罗伊氏乳杆菌改善生物钟紊乱，以及改善生物钟紊乱诱导的类PCOS中发挥重要作用。
本发明明确，大鼠生物钟发生紊乱后，大量血清代谢物的含量发生明显变化。其中，尿囊素(Allantoin)、13-甲基十四烷酸(13-Methylmyristic acid)、胸腺嘧啶(Thymine)、脱氢枞酸(Dehydroabietic acid)、γ-亚麻酸 (gamma-Linolenic acid)、十四烷酸(Myristic acid)、dUMP、皮质醇(Cortisol)、顺式-9-棕榈油酸(cis-9-Palmitoleicacid)、癸酸(Capric acid)和瓜氨酸 (Citrulline)在罗伊氏乳杆菌改善生物钟紊乱，以及改善生物钟紊乱诱导的类 PCOS中发挥重要作用。
通过多组学的生物信息学联合分析，本发明明确，乳酸杆菌属、瘤胃菌属 -010、狭义梭菌属-1和g__Family_XIII_AD3011_group菌属的改变，共同作用引起粪便代谢物13-甲基十四烷酸、烟酸、甘氨酰、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸、琥珀酸、L-谷氨酰胺、壬二酸、N-乙酰-L-谷氨酸、棕榈酸、顺式-二十碳烯酸、 MG(18:0/0:0/0:0)、16-羟基十六酸、3-甲基黄嘌呤、马来酸、γ-氨基丁酸和3- 甲基腺嘌呤的含量改变，以及血清代谢物皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸、 dUMP和13-甲基十四烷酸的含量变化，最终改善生物钟紊乱诱导的类PCOS大鼠血脂代谢紊乱，包括血清低密度脂蛋白、胆固醇和高密度脂蛋白的异常。
利用PCOS患者和对照正常女性的血清样本，本发明进一步明确两组人群血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸和13-甲基十四烷酸的含量明显不同，且这些代谢物与身体质量指数(Body mass index，BMI)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、总胆固醇(Cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、抗穆勒管激素(Anti-Mullerian Hormone， AMH)、促黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)、LH与卵泡刺激素 (Follicle-stimulating hormone，FSH)比值(LH/FSH)、睾酮(Testosterone，T0)、泌乳素(Prolactin，PRL)、促甲状腺激素(Thyroid stimulating hormone， TSH)和优胚率呈明显相关。此外，本发明提供了一种用于PCOS的代谢标志物的筛选方法，基于LC-MS技术定量检测血清中代谢标志物的含量和logistic 模型的ROC计算，将皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸作为一组诊断标志物，作为辅助诊断PCOS的联合标志物。同时该组标志物还可以联合使用LH/FSH比值、血清睾酮、血清甘油三酯，提高诊断灵敏度和特异性，用于PCOS的临床诊断工作。
利用PCOS患者和对照正常女性的粪便样本，本发明通过宏基因组测序技术，分析明确两组人群的肠道微生物之间存在金孢子菌属(g__Chrysosporum)、梭杆菌属(g__Fusobacterium)、梭菌属(g__Podoviridae)、志贺氏杆菌 (g__Shigellap)、丛毛单胞菌属(g__Comamonas菌属)、副拟杆菌属 (g__Parabacteroides)、γ-噬菌体(g__Lambdalikevirus)、克雷伯氏菌属 (g__Klebsiella)、埃希氏菌属(g__Escherichia)、福赛斯坦纳菌属 (g__Tannerella)、长尾噬菌体(g__Siphoviridae)和巴恩斯氏菌(g__Barnesiella) 的丰度变化。此外，这些基因集(Metagenomic species，MGS)与T0、AMH、 LH、TSH、空腹血糖、BMI呈显著相关，提示肠道微生物在PCOS的发生发展过程中可能存在一定作用，为PCOS的诊断和治疗提供新的角度。
本发明优点在于：
1、本发明利用临床PCOS患者及对照正常女性的血清样本，针对上述动物模型互作网络中的关键血清代谢物，通过血清LC-MS定量检测其含量，根据logistic模型的ROC计算，明确一组血清联合标志物用于辅助诊断PCOS，包括皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸，同时该组联合标志物可以联合LH/FSH或睾酮或甘油三酯提高诊断特异性和敏感度。
2、本发明利用临床PCOS患者及对照正常女性的粪便样本，通过宏基因组测序分析明确PCOS肠道优势菌群，且肠道菌聚合得到的多个MGS与临床指标呈明显相关，为PCOS诊断提供一组肠道菌群标志物，包括金孢子菌属、梭杆菌属、梭菌属、志贺氏杆菌、丛毛单胞菌属、副拟杆菌属、γ-噬菌体、埃希氏菌属、长尾噬菌体、克雷伯氏菌属、福赛斯坦纳菌属和巴恩斯氏菌。
3、由于外周血和粪便取材方便创伤小、再生速度快、成本相对较低、侵袭性小等优点，是生物标志物研究的理想来源之一，对于多囊卵巢综合征的临床诊疗具有重要意义。
附图说明
图1：罗伊氏乳酸杆菌改善生物钟紊乱诱导的类PCOS表型。
A.造模方法。我们将24只SPF级SD大鼠(6周龄，约160克)随机分为3组，每组8只。对照组：正常光照处理8周，黑暗组：持续黑暗处理8周，黑暗+乳杆菌组：持续黑暗8周处理的同时给予罗伊氏乳杆菌灌胃。B.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠在造模8周中每周的体重情况。C.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠肝脏的油红染色。D.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠肝脏的透射电镜。E.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠肝脏中的脂质检测。F.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠血清中的脂质检测。G.对照组、黑暗组、黑暗+恢复光照1周组、黑暗+恢复光照2周组、黑暗+低聚木糖组、黑暗+乳杆菌组、黑暗+褪黑素组大鼠的口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test，OGTT)结果。左图各组血糖水平，右图是各组曲线下面积(Area Under Curve,AUC)。H.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠的卵巢HE染色。 I.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠的动情周期。J.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠血清中LH/FSH水平比值、睾酮水平和SHBG水平。
我们研究发现，持续黑暗引起的生物钟紊乱会导致大鼠出现肝脏核心节律基因表达异常，同时出现雄激素升高、糖脂代谢异常、动情周期紊乱、卵巢多囊样改变等类PCOS的症状。而我们给大鼠持续黑暗8周处理的同时给予罗伊氏乳杆菌灌胃(图1A)，发现各组大鼠虽然体重没有变化(图1B)，但是罗伊氏乳杆菌可以明显改善黑暗大鼠肝脏脂质聚积(图1C，D)，降低黑暗大鼠肝脏内较高的甘油三酯和低密度脂蛋白水平、升高肝脏内较低的胆固醇和高密度脂蛋白水平(图1E)；罗伊氏乳杆菌还明显升高黑暗大鼠血清中较低的胆固醇和高密度脂蛋白水平(图1F)。同时，罗伊氏乳杆菌改善了黑暗大鼠葡萄糖耐量水平(图1G)。另外，黑暗大鼠卵巢中不规则的囊性卵泡增多，黄体数目减少，而黑暗+乳杆菌处理的大鼠卵巢中不规则的囊性卵泡减少，黄体数目增多(图1H)，说明罗伊氏乳杆菌改善了持续黑暗诱导的类PCOS大鼠卵巢的囊性改变。同样，在动情周期方面，罗伊氏乳杆菌也能一定程度地改善黑暗大鼠紊乱的动情周期(图1I)。此外，罗伊氏乳杆菌显著缓解了黑暗大鼠血清中较高的SHBG水平，但是对血清LH/FSH比值及睾酮水平仅有改善趋势(图1J)。
图2：粪便代谢物和血清代谢物的总体主成分差异分析。A.正离子模式的粪便代谢物PCA(Principal Component Analysis)、PLS-DA(Partial Least Squares DiscriminantAnalysis)和OPLS-DA(Orthogonal PLS-DA)。B.负离子模式的粪便代谢物PCA、PLS-DA和OPLS-DA。C.正离子模式的血清代谢物PCA、PLS-DA和OPLS-DA。D.负离子模式的血清代谢物PCA、PLS-DA 和OPLS-DA。
8周造模结束后，我们收集对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠的粪便和空腹血清，分别做UHPLC-TOF-LC-MS测序。通过PCA、PLS-DA和OPLS-DA 分析，我们可以看到对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠的粪便代谢物和血清代谢物有明显差异(图2)。
图3：在罗伊氏乳杆菌改善类PCOS表型中发挥重要作用的肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物。
A.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组之间的差异肠道菌群(属)。B.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组之间的差异血清代谢物。C.对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组之间的差异粪便代谢物。同时满足3个筛选条件：①黑暗组vs. 对照组P＜0.05，②黑暗+乳杆菌组vs.黑暗组P＜0.05，③黑暗+乳杆菌组vs. 对照组P≥0.05。
我们利用对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠的粪便进行16s-rDNA测序，同时利用大鼠粪便和血清的UHPLC-TOF-LC-MS测序结果，筛选可能在罗伊氏乳杆菌改善类PCOS表型中发挥重要作用的肠道菌群、粪便代谢物和血清代谢物。筛选时同时满足以为3个条件：①黑暗组vs.对照组P＜0.05，②黑暗+乳杆菌组vs.黑暗组P＜0.05，③黑暗+乳杆菌组vs.对照组P≥0.05。
结果发现，在罗伊氏乳杆菌改善生物钟紊乱，以及改善生物钟紊乱诱导的类PCOS表型中可能发挥重要作用的肠道菌群(属)，包括乳酸杆菌属、瘤胃菌属-009、瘤胃菌属-010、狭义梭菌属-1和g__Family_XIII_AD3011_group菌属(图3A)。此外，重要的差异粪便代谢物包括MG(18:0/0:0/0:0)、熊去氧胆酸、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸、甘氨酰、3-甲基腺嘌呤、L-肉毒碱、棕榈酸、鹅去氧胆酸、壬二酸、13-甲基十四烷酸、琥珀酸、N6,N6,N6-三甲基赖氨酸、十四烷酸、葫芦巴碱、烟酸、顺式-二十碳烯酸、肌酐、泛酸、鸟氨酸、N-乙酰天冬氨酸、阿魏酸、鼠胆酸、油酸、16-羟基十六酸、腺嘌呤、马来酸、十五酸、γ-氨基丁酸、3-甲基黄嘌呤、cAMP、L-谷氨酰胺、3-吲哚乙酸和N-乙酰-L-谷氨酸(图3B)。而在这其中可能发挥作用的血清代谢物，包括尿囊素、 13-甲基十四烷酸、胸腺嘧啶、脱氢枞酸、γ-亚麻酸、十四烷酸、dUMP、皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸和瓜氨酸(图3C)。
图4：差异肠道菌群、粪便代谢物和血清代谢物的表达量热图。A.差异肠道菌群(属)的相对丰度热图。B.差异粪便代谢物的表达量热图。C.差异血清代谢物的表达量热图。
我们根据对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组大鼠的16s-rDNA测序结果，粪便和血清的UHPLC-TOF-LC-MS测序结果及相关全谱鉴定分析，绘制差异肠道菌群(属)的相对丰度热图(4A)，差异粪便代谢物的表达量热图(4B)，以及差异血清代谢物的表达量热图(4C)，并通过聚类，更直观地观察到差异菌群及差异代谢物在对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组各个样本中的情况。
图5：多组学联合分析发现在罗伊氏乳杆菌改善类PCOS血清脂质代谢紊乱中发挥作用的肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物。A.利用全部肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物之间的相关性，分别针对对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组做各组的Circos-plot分析。Spearman相关性的筛选条件： r＞0.8，P＜0.05。红线代表正相关，蓝线代表负相关。B.利用对照组、黑暗组和黑暗+乳杆菌组的全部肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物，分别做肠道菌群(属)与粪便代谢物之间(左)、粪便代谢物与血清代谢物之间(中)、肠道菌群(属)与血清代谢物之间(右)的普鲁克分析(Procrustes Analysis)。 C.差异粪便代谢物与血清指标之间Spearman相关性的热图。D.差异血清代谢物与血清指标之间Spearman相关性的热图。E.差异肠道菌群(属)与差异血清代谢物之间Spearman相关性的热图。F.差异肠道菌群(属)与差异粪便代谢物之间Spearman相关性的热图。G.差异粪便代谢物与差异血清代谢物之间Spearman相关性的热图。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。H.在罗伊氏乳杆菌改善类PCOS血清脂质代谢紊乱中发挥作用的肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物之间的网络互作图。P＜0.05。I.靶向肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物之间Spearman相关性示意图。P＜0.05。红线代表正相关，蓝线代表负相关。
利用16s-rDNA测序、粪便和血清的UHPLC-TOF-LC-MS测序结果，我们将所有肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物做Spearman相关性分析，发现对照组大鼠中正相关为948个，负相关为1266个；黑暗组大鼠中正相关为 988个，负相关为1079个；和黑暗+乳杆菌组中正相关为851个，负相关为1102 个(图5A)，说明不同处理组大鼠菌群、粪便代谢物和血清代谢物之间的差异。此外，普鲁克分析也提示各样本的菌群物种丰度组成和粪便代谢物丰度组成之间，以及粪便代谢物丰度组成和血清代谢物丰度组成之间，均存在很强的关联 (图5B)。为了探究可能在罗伊氏乳杆菌改善类PCOS血清脂质代谢紊乱中发挥作用的肠道菌群(属)、粪便代谢物和血清代谢物，因此，我们将上述差异粪便代谢物和差异血清代谢物与血清指标包括甘油三酯、低密度脂蛋白、胆固醇、高密度脂蛋白、游离脂肪酸、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、C反应蛋白(图 5C，D)，同时，我们还将上述差异肠道菌群(属)、差异粪便代谢物和差异血清代谢物相互做相关性分析(图5E-G)。我们发现，乳酸杆菌属、瘤胃菌属-010、狭义梭菌属-1和g__Family_XIII_AD3011_group菌属的改变，共同作用引起粪便代谢物13-甲基十四烷酸、烟酸、甘氨酰、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸、琥珀酸、L-谷氨酰胺、壬二酸、N-乙酰-L-谷氨酸、棕榈酸、顺式-二十碳烯酸、 MG(18:0/0:0/0:0)、16-羟基十六酸、3-甲基黄嘌呤、马来酸、γ-氨基丁酸和3- 甲基腺嘌呤的含量改变，以及血清代谢物皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸、 dUMP和13-甲基十四烷酸的含量变化，最终改善生物钟紊乱诱导的类PCOS大鼠血脂代谢紊乱，包括血清低密度脂蛋白、胆固醇和高密度脂蛋白的异常(图 5H，I)。
图6：PCOS女性血清中靶向血清代谢物的含量变化及诊断意义。A.PCOS 女性及对照组女性血清中13-甲基十四烷酸的含量。B.PCOS女性及对照组女性血清中顺式-9-棕榈油酸的含量。C.PCOS女性及对照组女性血清中皮质醇的含量。D.PCOS女性及对照组女性血清中癸酸的含量。E.13-甲基十四烷酸、顺式-9-棕榈油酸、皮质醇、癸酸与临床指标的相关性。*P＜0.05，**P＜0.01， ***P＜0.001。F.单个血清代谢物(皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸)的ROC曲线，以及联合三个代谢物(皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13- 甲基十四烷酸)的ROC曲线。G.LH/FSH比值的ROC曲线，三个代谢物联合 LH/FSH比值的ROC曲线。H.BMI<24人群中联合三个代谢物(皮质醇、顺式 -9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸)的ROC曲线，BMI<24人群中三个代谢物联合LH/FSH比值的ROC曲线。I.T0水平的ROC曲线，三个代谢物联合T0水平的ROC曲线。J.TG的ROC曲线，三个代谢物联合TG的ROC曲线。K. BMI≥24人群中三个代谢物联合TG比值的ROC曲线。
根据上述动物实验结果，我们收集99名PCOS患者和101名对照正常女性的血清样本，利用LC-MS技术定量检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸和13-甲基十四烷酸的含量。我们发现，相较于对照女性，PCOS患者血清中13-甲基十四烷酸和顺式-9-棕榈油酸浓度明显下降(图6A-B)，皮质醇含量明显升高(图6C)，癸酸水平明显下降(图6D)。进一步将代谢物含量与临床指标做Spearman分析，结果提示皮质醇和TG、CHOL、AMH、LH及T0呈明显正相关；13-甲基十四烷酸和TG、LH、LH/FSH及T0呈明显负相关，和优胚率呈明显正相关；癸酸和BMI、TG、AMH、LH/FSH及T0呈明显负相关，和HDL-C呈明显正相关；顺式-9-棕榈油酸和TG、LH/FSH、T0、PRL、 TSH呈明显负相关(图6E)。由于癸酸在PCOS血清中的变化趋势与前期生物钟紊乱诱导的类PCOS动物模型中的变化趋势相反，因此我们考虑将皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸作为PCOS及生物钟紊乱受试者特异性临床诊断的标志物。
为明确皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸该组联合标志物的敏感性和特异性，我们进一步通过AUC大小判断代谢物的诊断效果。单个血清代谢物13-甲基十四烷酸的AUC-ROC为0.69，95％CI为0.62-0.76；皮质醇的 AUC-ROC为0.68，95％CI为0.61-0.76；顺式-9-棕榈油酸的AUC-ROC为0.65， 95％CI为0.57-0.72；利用logistic回归分析计算得联合以上三个血清代谢物的 AUC-ROC为0.81，95％CI为0.75-0.87(图6F)。LH/FSH比值在本队列中的 AUC-ROC为0.84，95％CI为0.79-0.90，而将三个代谢物联合LH/FSH比值共同用于PCOS诊断，其AUC-ROC高达0.91，95％CI为0.87-0.95(图6G)。值得注意的是，对于BMI小于24的人群来说，皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和 13-甲基十四烷酸联合代谢物的AUC-ROC为0.84，95％CI为0.77-0.91，而三个代谢物联合LH/FSH比值的AUC-ROC为0.94，95％CI为0.91-0.98(图6H)。 T0水平在本队列中的AUC-ROC为0.92，95％CI为0.89-0.96，而将三个代谢物联合T0共同用于PCOS诊断，其AUC-ROC高达0.96，95％CI为0.94-0.98 (图6I)。除了LH/FSH和T0，3个代谢物联合TG用于PCOS诊断的AUC-ROC 也高达0.91(95％CI:0.86-0.96)(图6J)，且该联合应用更适合BMI≥24的女性(AUC-ROC:0.95，95％CI:0.88-1.00)(图6K)。
图7：PCOS患者肠道微生物LDA分析。PCOS患者与对照组患者肠道微生物LEfSe分析。以LDA(Linear discriminant analysis)>2定义为具有统计学差异。在PCOS患者中存在金孢子菌属(g__Chrysosporum)、梭杆菌属 (g__Fusobacterium)、梭菌属(g__Podoviridae)、志贺氏杆菌(g__Shigella)、丛毛单胞菌属(g__Comamonas菌属)、副拟杆菌属(g__Parabacteroides)、γ- 噬菌体(g__Lambdalikevirus)、埃希氏菌属(g__Escherichia)和长尾噬菌体 (g__Siphoviridae)多个肠道菌属富集，而克雷伯氏菌属(g__Klebsiella)、福赛斯坦纳菌属(g__Tannerella)、和巴恩斯氏菌(g__Barnesiella)肠道菌丰度下降。(图7)。
图8：MGS与PCOS临床指标相关性分析。宏基因组分析筛选到的肠道菌聚合为多个MGS，与临床指标进行相关性分析，发现PCOS富集的MGS与 T0、AMH、LH、BMI呈正相关联系，对照组富集的MGS与T0、AMH、TSH 呈负相关联系，而与空腹血糖呈正相关联系(图8)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例：
1、实验材料
1.1实验用大鼠
采用SPF级Sprague Dawley(SD)雌性6周龄大鼠进行实验。
1.2主要试剂和溶液
罗伊氏乳杆菌(中国台湾亚芯公司)；组织固定液、油红染液、苏木素染液、分化液、返蓝液、甘油明胶封片剂、电镜固定液、伊红染液(Servicebio公司)；无水乙醇、丙酮、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；812包埋剂(SPI)；锇酸(Ted Pella Inc)；TriglycerideAssay试剂盒、Free Fatty Acid Assay试剂盒、Cholesterol Assay试剂盒(Abcam公司)；Rat HDL-C ELISA kit、Rat LDL-C ELISA kit(CUSABIO公司)；Triton-X 100(上海生工)；10×PBS(上海雅酶生物技术有限公司)；乙腈、甲醇(Merck公司)；甲酸(上海安普实验科技股份有限公司)；超纯水(Mili-Q)；2-氯苯丙氨酸(上海吉尔生化有限公司)；胆固醇标准品(Sigma-Aldrich公司)；DNA提取试剂盒E.Z.N.A.@stool DNA kit (Omega Biotek公司)；凝胶回收试剂盒(Axygen公司)；NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina、TruseqPEClusterKitv3-cBot-HS、 TruseqSBSKitv3-HS(上海锐翌生物科技有限公司)。
1.3主要实验仪器设备
高速低温离心机(Centrifuge 5810R)、高速低温离心机(Centrifuge 5415R)、金属加热仪、电热鼓风干燥箱、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃低温冰箱、酶标仪、 IBM电脑(分析软件)、电子天平(1/1000)、倒置显微镜、荧光显微镜、微型混合器、座式自动电热压力蒸汽灭菌器、Illumina MiSeq System、血糖仪、冰冻切片机、载玻片、超薄切片机、钻石切片刀、透射电子显微镜、150目方华膜铜网、BioruptarPico、高分辨质谱仪AB Sciex Qtrap 5500+、高分辨质谱仪 AB SCIEX Triple TOF 6600+、高效液相色谱仪Nexera UHPLC LC-30A、冷冻浓缩离心干燥器LNG-798、色谱柱Waters UPLC HSS C8柱、色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3柱。
2、实验方法
2.1油红染色
(1)新鲜肝脏组织的冰冻切片固定：将冰冻切片复温干燥，固定液中固定15分钟，自来水洗，晾干。
(2)油红染色：切片入油红染液浸染8-10分钟(加盖避光)，蒸馏水洗；
(3)背景分化：75％酒精稍分化，蒸馏水洗。
(4)苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5分钟，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
(5)封片：甘油明胶封片剂封片。
(6)显微镜镜检，图像采集分析。
2.2透射电镜
(1)取材固定：新鲜肝脏组织确定取材部位，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，1-3分钟内取样，取样组织1mm3大小。取材前可提前准备装有电镜固定液的培养皿，将小组织块离体取下后立即投入培养皿内，用手术刀在培养皿的固定液中进行切割成1mm3的小组织块。再将切割好的小组织块转移至装有新的电镜固定液的EP管内继续固定，4℃固定保存及运输。0.1M 磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次，每次15分钟。
(2)后固定：0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)配制的1％锇酸避光室温固定2小时。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次，每次15分钟。
(3)室温脱水：组织依次入30％-50％-70％-80％-95％-100％-100％酒精上行脱水每次20分钟，100％丙酮两次，每次15分钟。
(4)渗透包埋：丙酮:812包埋剂＝1:1，37℃，2-4小时,丙酮:812包埋剂＝1:2，37℃渗透过夜，纯812包埋剂37℃，5-8小时。将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37℃烤箱过夜。
(5)聚合：包埋板放于60℃烤箱聚合48小时，取出树脂块备用。
(6)超薄切片：树脂块于超薄切片机60-80nm超薄切片，150目方华膜铜网捞片。
(7)染色：铜网于2％醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8分钟；70％酒精清洗3次；超纯水清洗3次；2.6％枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8分钟；超纯水清洗3次，滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。
(8)透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
2.3大鼠肝脏和血清甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇定量检测
分别按照Triglyceride Quantification Assay kit(Abcam公司，货号ab65336)、Free Fatty Acid Quantification Assay kit(Abcam公司，货号ab65341)、HDL and LDL/VLDL Cholesterol-assay(Abcam公司，货号ab65390)说明书规范操作。
2.4大鼠肝脏和血清高密度脂蛋白、低密度脂蛋白定量检测
分别按照Rat HDL-C ELISA kit(CUSABIO公司，货号CSB-E14399r)、 Rat HDL-CELISA kit(CUSABIO公司，货号CSB-E16561r)说明书规范操作。
2.5H&E染色
(1)固定：将新鲜取出的大鼠脏器组织用PBS冲洗后迅速置于4％的多聚甲醛中，4℃固定过夜；
(2)流水冲洗6小时；
(3)标本脱水：首先将标本置于75％的乙醇中浸泡过夜，然后置于85％的乙醇中浸泡2小时，然后分别置于95％的乙醇中两次，各浸泡一个小时，取出后置于100％的乙醇中两次，每次1小时，至此标本脱水结束；
(4)二甲苯透明：将脱水后的标本置于二甲苯中30分钟，然后置于另一个二甲苯中15-20分钟(根据组织的透明程度决定)；
(5)石蜡包埋：脏器组织置于液体石蜡中浸泡1小时，然后置于另一个液体石蜡中浸泡1小时，然后进行石蜡包埋并作出标记；
(6)石蜡切片：将石蜡块修正成长方体或立方体，置于石蜡切片机连续切片，厚度为5μm，将切好的片子置于42℃的水中展开，待展平后将石蜡切片贴至载玻片上，然后放置在42℃的烘片机上过夜。然后将石蜡切片常温保存以备后续H&E染色及免疫组化检测；
(7)脱蜡：H&E染色时首先进行脱蜡处理，切片置于二甲苯中30分钟，然后换另一个二甲苯浸泡10分钟，将石蜡完全脱尽；
(8)复水：将石蜡切片分别置于100％、95％、80％、70％和50％的乙醇中各5分钟使组织复水；
(9)H&E染色：将复水处理后的组织切片置于苏木素溶液中染色15分钟，流水冲洗30分钟，然后蒸馏水冲洗，盐酸酒精处理6-8秒，然后将组织切片置于伊红溶液中染色5分钟；
(10)脱水：将染色结束的片子进行分别置于50％、70％、80％、95％、 100％的乙醇中浸泡5分钟，然后置于两个二甲苯中分别浸泡10分钟，最后应用中性树胶封片；
(11)显微镜下观察并拍照。
2.6大鼠粪便16s rDNA测序
2.6.1粪便标本DNA提取
采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取粪便DNA，按照说明书规范操作。利用1％琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。
2.6.2粪便16S rDNAV3-4区PCR扩增
肠道菌群DNA的目的片段为16S rDNA的V3-V4区。
(1)16S rDNA V3-V4区引物为：
(2)PCR扩增体系：
(3)PCR扩增程序：
a.1×(3minutes at 95℃)
b.29×(30seconds at 95℃；30seconds at 54℃；45seconds at 72℃)
c.10minutes at 72℃，10℃ until halted by user
2.6.3测序文库的定量和illumina MiSeq测序
扩增后的产物使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2％琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。最终使用 illumina MiSeq PE300进行双端测序。
2.6.4数据处理及分析
(1)首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，同时对reads的之类和拼接的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的 barcode和引物序列区分样本得到有效序列。采用UCHIME算法进行去除嵌合体序列，得到的有效序列用于下游分析。数据处理方法和参数：过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的read；根据PEreads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10bp；拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为 0，最大引物错配数为2。
(2)OUT聚类及注释：其包括5个步骤，分别为聚类OTU、挑选OTU 代表序列、OTU代表序列注释、形成OTU table、OTU代表序列构建树发育进化树。其中OTU聚类，是通过经过质控得到的有效序列按照97％相似度进行自身聚类；挑选OTU代表序列，将得到的OTU簇中reads数目最多的序列作为代表序列；OTU代表序列注释，是将代表序列与SILVA数据库进行比对注释，得到各层次的注释文件；OTU代表序列构建树发育进化树，将代表序列进行对比构建形成进化树，用于下游的基于进化树的分析；形成OTU table，利用qiime软件转化成OTU的丰度注释表。
(3)α分析：该步骤利用得到的OTU table进行抽平后，进行样本组内的比较，包含多样性指数计算、绘制稀疏度曲线、香浓曲线、rank曲线。
(4)β分析：该步骤利用得到的OTU table进行抽平后，进行样本组间的比较，包含PCA分析、PCoA分析、NMDS分析。
(5)Metastats分析：通过mothur的metastats命令来进行分析，通过两组之间比较检测客观宏基因组样本的差异丰度特征。P<0.05则认为存在显著性差异。
2.7大鼠粪便/血清非靶向代谢物UHPLC-TOF-LC-MS检测
2.7.1样本预处理
(1)粪便/血清置于室温解冻，用移液枪吸取100μL样本于1.5mL EP管；
(2)加入300μL甲醇，涡旋混匀30秒；
(3)-40℃静置1小时；
(4)涡旋混匀30秒，4℃静置0.5小时；
(5)置于4℃离心机中，12000rpm离心15分钟；
(6)取出全部上清液于离心管中，-40℃静置1小时；
(7)置于4℃离心机中，12000rpm离心15分钟；
(8)吸取200μL上清，并加入5μL内标(140μg/mL，2-氯苯丙氨酸)，转入进样小瓶中待检测。
2.7.2LC-MS分析
(1)仪器分析平台：LC-MS(AB SCIEX Triple TOF 6600+，Nexera UHPLC LC-30A)
(2)色谱柱：(ACQUITY UPLC HSS T3，2.1mm*100mm*1.8μm)
(3)色谱分离条件为：柱温为40℃；流速0.3mL/分钟；
流动相组成A：水+0.1％甲酸，B：乙腈+0.1％甲酸；
进样量为4μL，自动进样器温度4℃。
(4)流动相梯度洗脱程序见表1。
表1.流动相洗脱程序
(5)质谱检测参数：
正模式：
离子源(Ion source)：ESI+离子源
气帘气(Curtain Gas)：40arb
离子喷雾电压(IonSpray voltage)：5500V
离子源温度(Temperature)：550℃
离子源气体(IonSource Gas1)：60arb
离子源气体(IonSource Gas2)：60arb
DP(去簇电压)：80V CE(碰撞能量)：35V
负模式：
离子源(Ion source)：ESI-离子源
气帘气(Curtain Gas)：40arb
离子喷雾电压(IonSpray voltage)：-4500V
离子源温度(Temperature)：550℃
离子源气体(IonSource Gas1)：60arb
离子源气体(IonSource Gas2)：60arb
DP(去簇电压)：-80V CE(碰撞能量)：-35V
2.7.3数据分析
原始数据首先利用AbfConverter.4.0.0软件转化为ABF格式文件，然后在MS-DIAL中进行峰提取、峰比对和峰过滤，补充缺失峰，物质鉴定等，数据最终标准化为Excel格式的二维数据矩阵，包含保留时间、质荷比、观察量(样本)、鉴定物质和峰强等信息。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P 14.0 (Umetrics AB，Umea，Sweden)软件进行多元统计分析。
2.8人血清靶向代谢物UHPLC-MS/MS检测
2.8.1样本预处理
(1)取80μL样品，加入600μL甲醇:丙酮:水＝65:25:10(v/v/v)，涡旋 30秒，冰水浴超声提取10分钟，
(2)离心10分钟(10000rpm，4℃)，取500μL上清液挥干，
(3)加入150μL甲醇-水＝4:6(v/v)，涡旋30秒，冰水浴超声3分钟复溶；
(4)离心10分钟(10000rpm，4℃)，取150μL上清，装入LC-MS进样小瓶中；
(5)质控样本(QC)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个 QC体积与样本相同。备注：样品在上机之前存放于-20℃。(整个过程保证低温)。
2.8.2色谱质谱方法
1、色谱条件
进样量：5μL。流动相：A(0.05％甲酸-水溶液)，B(乙腈：异丙醇9:1)。
梯度洗脱方法(Gradient Elution Procedures)：0min A/B(45:55，V/V)， 0.5minA/B(45:55，V/V)，2.5min A/B(0:100，V/V)，4min A/B(0:100，V/V)， 4.1min A/B(45:55，V/V)，5min A/B(45:55，V/V)。
2、质谱条件
气帘气：35。碰撞诱导电离(Collision-activated dissociation，CAD)参数：medium。正离子喷雾电压：5500V；负离子喷雾电压：-4500V；温度：550℃；离子源：Gas1:55；Gas2:55。
2.8.3数据分析
利用SCIEX OS-MQ软件(美国Sciex公司)中采用默认参数对各MRM transition进行自动识别和积分，并辅助人工检查。通过对不同质控标本质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，并根据数据采集结果进行RSD值计算(RSD≤20)，可以判断代谢物检测的重复性，技术重复的效果。
根据代谢物的保留时间和峰型的信息，对每种代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行手动校正，以确保定性定量的准确，每个色谱峰的峰面积代表对应代谢物的相对含量，最终得到所有样本的定量分析积分结果。将代谢物的积分峰面积带入标准曲线线性方程进行计算，进一步代入计算公式计算后，最终得到实际样本中各代谢物的绝对含量数据。
样品代谢物含量(ng/mL)＝N*(C*V1)/V2
公式中各字母含义：
C：样本中代谢物峰面积带入标准曲线计算得到的浓度值(ng/mL)；
V1：定容体积(0.15mL)；
V2：取样体积(0.08mL)
N：稀释倍数(注：未稀释时，稀释倍数为1)。
2.9人粪便宏基因组测序
2.9.1实验流程
1、DNA抽提：采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取粪便DNA。
2、DNA质检：1％的琼脂糖凝胶电泳；Qubit检测基因组DNA浓度。
3、DNA片段化：将DNA打断成约500bp的片段。
4、文库构建
(1)DNA片段末端修复和连接A碱基；(2)在DNA片段两端连接接头； (3)琼脂糖凝胶电泳进行片段筛选；(4)PCR扩增和纯化；(5)Agilent2100 检测文库大小，qPCR检测文库摩尔浓度；(6)氢氧化钠变性，产生单链DNA 片段。
5、Cluster簇生成
(1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片flowcell上；(2)另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成"桥(bridge)"；(3)PCR 扩增，产生DNA簇；(4)DNA簇线性化成为单链。
6、IlluminaHiSeq测序
(1)在flowcell加入DNA聚合酶和4种荧光标记的dNTP，每次循环只掺入单种碱基；
(2)激光扫描芯片flowcell表面，捕捉荧光信号，读取每条模板序列聚合上的核苷酸种类；(3)将"荧光基团"和"终止基团"化学切割，恢复3'端粘性，继续掺入第二轮单种碱基；(4)依次统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。
2.9.2生物信息分析流程
原始序列进行质控后，一方面通过比对物种数据库，分析样品中的物种组成；另一方面通过组装、基因预测，并在此基础上进行功能注释。
2.9.3数据质控
1、原始数据统计分析方法
每个样品并不是单独测序，而是将多个样品混合在一起，进行平行测序。为了能区分不同样品，每个样品中的序列均引入一段Index标签序列(标示其样本来源信息)。通过Illumina平台(Hiseq)进行Paired-end测序，然后根据Index 序列将各个样品的下机数据区分开，提取出的数据以fastq格式进行保存。
2、数据统计分析方法
原始序列3’端带有adaptor接头序列以及一些少量低质量数据和杂质序列，另外，某些样品宿主污染严重，为了提高后续分析质量和可靠性，需要对原始序列进行去接头、质量剪切和去除宿主DNA污染，去除其他污染等。具体分析方法为：去除含有Adaptor接头序列污染的reads，去除包含N碱基数目≥3 的reads，对序列3’端进行截切，去掉质量值<20的碱基，并过滤截切后长度 <60％原长的reads；如果样品来源于宿主，则尽可能找到宿主的基因组或与宿主亲缘关系较近物种的基因组，通过SOAPaligner比对宿主基因组，将宿主污染的reads剔除。
2.9.4物种注释与差异物种分析
(1)物种注释统计分析方法
通过SOAPaligner(version2.21)将CleanReads与NCBI数据库中已知的细菌、真菌、病毒和古细菌序列构建的参考数据库进行序列比对，比对参数为-m4-r2-m100-x1000[2]，然后利用比对上的reads进行界、门、纲、目、科、属、种的分类和丰度统计，从而构建相应分类学水平上的taxonomy profile。
(2)物种LEfSe差异分析方法
线性判别分析(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件。首先，使用non-parametric factorialKruskal-Wallis(KW)sum-ranktest(非参数因子克鲁斯卡尔-沃利斯秩和检验)检测具有显著丰度差异特征，并找到与丰度有显著性差异的类群，然后采用线性判别分析来估算每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小，从而找出对样品划分产生显著性差异影响的群落或物种。
2.9.5基因集构建分析方法
利用CD-HIT(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)将所有预测出来的基因聚类(identity>95％，coverage>90％)，选择每一类中最长的基因序列后去除其余冗余基因，从而构建有关样品的非冗余基因集。
2.10构建L.reuteri处理的持续黑暗大鼠干预模型
24只6周龄的雌性SD大鼠随机分为3组饲养于无特定病原体(Specific pathogenfree，SPF)级动物实验环境：对照组、黑暗组、黑暗+L.reuteri组。对照组大鼠按照正常昼夜节律的12小时:12小时光照/黑暗处理(上午7:30亮灯，下午7:30熄灯)，每天给予灌胃生理盐水。黑暗组大鼠置于24小时恒定黑暗环境中饲养8周，每天给予灌胃生理盐水。黑暗+L.reuteri组持续黑暗8 周饲养，每日给予灌胃L.reuteri(1010CFU/mL，1mL/d)。造模最后2周通过阴道涂片记录动情周期。
3、实验结果
(1)罗伊氏乳酸杆菌改善生物钟紊乱诱导的类PCOS表型。
我们研究发现，持续黑暗引起的生物钟紊乱会导致大鼠出现肝脏核心节律基因表达异常，同时出现雄激素升高、糖脂代谢异常、动情周期紊乱、卵巢多囊样改变等类PCOS的症状。而我们给大鼠持续黑暗8周处理的同时给予罗伊氏乳杆菌灌胃(图1A)，发现罗伊氏乳杆菌可以改善黑暗大鼠肝脏脂质聚积(图 1C-E)、血清脂代谢紊乱(图1F)、糖代谢紊乱(图1G)、卵巢多囊样改变(图 1H)和动情周期紊乱(图1I)。此外，罗伊氏乳杆菌显著缓解了黑暗大鼠血清中较高的SHBG水平，但是对血清LH/FSH比值及睾酮水平仅有改善趋势(图1J)。
(2)多组学分析发现在罗伊氏乳杆菌改善类PCOS表型中发挥作用的肠道菌群、粪便代谢物和血清代谢物。
我们利用持续黑暗大鼠的类PCOS模型，以及罗伊氏乳杆菌处理黑暗大鼠的治疗模型，收集粪便和外周血清进行粪便16s-rDNA测序、粪便 UHPLC-TOF-LC-MS、血清UHPLC-TOF-LC-MS测序。对粪便代谢物和血清代谢物进行PCA(Principal Component Analysis)、PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)及OPLS-DA(Orthogonal PLS-DA)，结果显示，不同处理之间大鼠的粪便代谢物和血清代谢物有明显差异(图2)。
我们发现，肠道菌群，包括乳酸杆菌属、瘤胃菌属-009、瘤胃菌属-010、狭义梭菌属-1和g__Family_XIII_AD3011_group菌属(图3A，4A)；粪便代谢物，包括MG(18:0/0:0/0:0)、熊去氧胆酸、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸、甘氨酰、 3-甲基腺嘌呤、L-肉毒碱、棕榈酸、鹅去氧胆酸、壬二酸、13-甲基十四烷酸、琥珀酸、N6,N6,N6-三甲基赖氨酸、十四烷酸、葫芦巴碱、烟酸、顺式-二十碳烯酸、肌酐、泛酸、鸟氨酸、N-乙酰天冬氨酸、阿魏酸、鼠胆酸、油酸、16- 羟基十六酸、腺嘌呤、马来酸、十五酸、γ-氨基丁酸、3-甲基黄嘌呤、cAMP、 L-谷氨酰胺、3-吲哚乙酸和N-乙酰-L-谷氨酸(图3B，4B)；以及血清代谢物，包括尿囊素、13-甲基十四烷酸、胸腺嘧啶、脱氢枞酸、γ-亚麻酸、十四烷酸、 dUMP、皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸和瓜氨酸(图3C，4C)，在罗伊氏乳杆菌改善生物钟紊乱，以及改善生物钟紊乱诱导的类PCOS表型中发挥重要作用。
(3)多组学联合分析在罗伊氏乳杆菌改善类PCOS脂质代谢紊乱中发挥作用的肠道菌群、粪便代谢物和血清代谢物。
通过多组学联合分析，我们发现，乳酸杆菌属、瘤胃菌属-010、狭义梭菌属-1和g__Family_XIII_AD3011_group菌属的改变，共同作用引起粪便代谢物 13-甲基十四烷酸、烟酸、甘氨酰、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸、琥珀酸、L-谷氨酰胺、壬二酸、N-乙酰-L-谷氨酸、棕榈酸、顺式-二十碳烯酸、 MG(18:0/0:0/0:0)、16-羟基十六酸、3-甲基黄嘌呤、马来酸、γ-氨基丁酸和3- 甲基腺嘌呤的含量改变，以及血清代谢物皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸、dUMP和13-甲基十四烷酸的含量变化，最终改善生物钟紊乱诱导的类PCOS 大鼠血脂代谢紊乱，包括血清低密度脂蛋白、胆固醇和高密度脂蛋白的异常(图 5)。
(4)PCOS女性血清中靶向血清代谢物的含量变化及诊断意义。
根据以上动物实验结果，我们收集99名PCOS患者和101名对照正常女性的血清样本，利用LC-MS技术定量检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、癸酸和13-甲基十四烷酸的含量。我们发现，相较于对照女性，PCOS患者血清中13-甲基十四烷酸和顺式-9-棕榈油酸浓度明显下降(图6A-B)，皮质醇含量明显升高(图6C)，癸酸水平明显下降(图6D)。进一步将代谢物含量与临床指标做Spearman分析，提示该组差异代谢物与BMI、TG、CHOL、HDL-C、 AMH、LH、LH/FSH、T0、PRL、TSH和优胚率呈明显相关性(图6E)。
我们进一步通过ROC曲线下面积(Area under the curve，AUC)大小判断单个代谢物的诊断效果，同时利用logistic回归分析计算得皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸三个联合代谢物的AUC-ROC为0.81，95％CI为 0.75-0.87(图6F)。LH/FSH比值升高是PCOS诊断中较为重要的辅助指标，如果将三个代谢物联合LH/FSH比值共同用于PCOS诊断，可以将LH/FSH比值的AUC-ROC从0.84(95％CI:0.79-0.90)提升至0.91(95％CI:0.87-0.95)(图6G)。值得注意的是，3个代谢物联合LH/FSH的应用更适合BMI<24的人群(AUC-ROC:0.94，95％CI:0.91-0.98)(图6H)。T0水平升高是PCOS诊断条件之一。将3个代谢物联合T0应用，可以将T0在本队列的AUC-ROC从 0.92(95％CI:0.89-0.96)提升至0.96(95％CI:0.94-0.98)(图6I)。除了LH/FSH 和T0，3个代谢物联合TG用于PCOS诊断的AUC-ROC也高达0.91(95％CI:0.86-0.96)(图6J)，且该联合应用更适合BMI≥24的女性(AUC-ROC:0.95， 95％CI:0.88-1.00)(图6K)。因此，血清代谢物包括13-甲基十四烷酸、皮质醇和顺式-9-棕榈油酸的联合应用，对PCOS具有较高的诊断价值，且该类PCOS 的发病可能与生物钟紊乱相关，并对罗伊氏乳杆菌有较好的潜在治疗效果。
(5)宏基因组分析提示PCOS患者中存在多种差异肠道菌及其与临床指标的相关性。
我们收集了14名PCOS患者和10名对照正常女性的肠道粪便，通过宏基因组测序分析，物种LEfSe差异分析显示，两组人群存在明显的肠道菌差异(图 7)。我们发现，在PCOS患者中存在金孢子菌属(g__Chrysosporum)、梭杆菌属(g__Fusobacterium)、梭菌属(g__Podoviridae)、志贺氏杆菌(g__Shigella)、丛毛单胞菌属(g__Comamonas菌属)、副拟杆菌属(g__Parabacteroides)、γ- 噬菌体(g__Lambdalikevirus)、埃希氏菌属(g__Escherichia)和长尾噬菌体 (g__Siphoviridae)多个肠道菌属富集，而克雷伯氏菌属(g__Klebsiella)、福赛斯坦纳菌属(g__Tannerella)、和巴恩斯氏菌(g__Barnesiella)肠道菌丰度下降。除此之外，PCOS患者中富集的埃希氏菌属(g__Escherichia)和志贺氏杆菌(g__Shigella)与前述动物造模结果相符。
同时，我们将宏基因组分析筛选到的肠道菌聚合为多个基因集 (Metagenomicspecies，MGS)，并与临床指标进行相关性分析，发现存在显著相关性。我们发现，PCOS富集的MGS与T0、AMH、LH、BMI呈正相关联系，对照组富集的MGS与T0、AMH、TSH呈负相关联系，而与空腹血糖呈正相关联系(图8)。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (14)
1.检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多囊卵巢综合征为机体生物钟紊乱诱导的多囊卵巢综合征。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断试剂盒为预测罗伊氏乳杆菌治疗效果的试剂盒；诊断呈阳性的多囊卵巢综合征人群采用罗伊氏乳杆菌有较好的治疗效果。
4.一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸和13-甲基十四烷酸的试剂。
5.检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和LH/FSH比值的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的多囊卵巢综合征诊断试剂盒为适用于BMI＜24人群的多囊卵巢综合征临床诊断试剂盒。
7.一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和LH/FSH比值的试剂。
8.检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和睾酮的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
9.一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和睾酮的试剂。
10.检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和甘油三酯的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的多囊卵巢综合征诊断试剂盒为适用于BMI≥24人群的多囊卵巢综合征临床诊断试剂盒。
12.一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测血清中皮质醇、顺式-9-棕榈油酸、13-甲基十四烷酸和甘油三酯的试剂。
13.检测粪便中肠道菌群丰度变化的试剂在制备多囊卵巢综合征诊断试剂盒中的应用，所述的肠道菌群包括金孢子菌属、梭杆菌属、梭菌属、志贺氏杆菌、丛毛单胞菌属、副拟杆菌属、γ-噬菌体、埃希氏菌属、长尾噬菌体、克雷伯氏菌属、福赛斯坦纳菌属和巴恩斯氏菌。
14.一种多囊卵巢综合征诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含检测粪便中肠道菌群丰度变化的试剂，所述的肠道菌群包括金孢子菌属、梭杆菌属、梭菌属、志贺氏杆菌、丛毛单胞菌属、副拟杆菌属、γ-噬菌体、埃希氏菌属、长尾噬菌体、克雷伯氏菌属、福赛斯坦纳菌属和巴恩斯氏菌。
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