CN104780943A - 通过DagA酶反应制备的、具有抗肥胖及抗糖尿病效果的、琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物 - Google Patents

通过DagA酶反应制备的、具有抗肥胖及抗糖尿病效果的、琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104780943A
CN104780943A CN201380059074.6A CN201380059074A CN104780943A CN 104780943 A CN104780943 A CN 104780943A CN 201380059074 A CN201380059074 A CN 201380059074A CN 104780943 A CN104780943 A CN 104780943A
Authority
CN
China
Prior art keywords
weight
diabetes
agar
prevention
oligosaccharide mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380059074.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104780943B (zh
Inventor
李济贤
洪淳光
洪善珠
李文姬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dyne Is Than Co Ltd Difficult To Understand
Dynebio Inc
Original Assignee
Dyne Is Than Co Ltd Difficult To Understand
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dyne Is Than Co Ltd Difficult To Understand filed Critical Dyne Is Than Co Ltd Difficult To Understand
Priority claimed from PCT/KR2013/010277 external-priority patent/WO2014077575A1/ko
Publication of CN104780943A publication Critical patent/CN104780943A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104780943B publication Critical patent/CN104780943B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/729—Agar; Agarose; Agaropectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种通过DagA酶反应制备的具备抗肥胖及抗糖尿病效果的琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物，更具体地说，涉及一种通过天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)DagA与琼脂或琼脂糖(agarose)的酶反应获得的产物作为有效成分含有的对肥胖或糖尿病显示预防、治疗、改善效果的组合物。根据本发明，天蓝链霉菌DagA和琼脂或琼脂糖的酶反应产物显示出优异的抗肥胖及抗糖尿病效果。因此，给予或摄取本发明的组合物可以有效地预防、治疗及改善肥胖及糖尿病。

Description

通过DagA酶反应制备的、具有抗肥胖及抗糖尿病效果的、琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物
技术领域
本发明涉及一种通过DagA酶反应制备的具备抗肥胖及抗糖尿病效果的琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物，更具体地说，涉及一种通过天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)DagA与琼脂或琼脂糖(agarose)的酶反应获得的产物作为有效成分含有的对肥胖或糖尿病显示预防、治疗、改善效果的组合物。
背景技术
琼脂(Agar)作为代表性的海藻类来源多糖类，长久以来在食品添加剂、医药品、化妆品、畜牧饲料及工业原料等方面被广泛使用。韩国每年的生产量约达3600吨，属于比较丰富的水产资源之一。但是在实际利用方面，只有全部生产量中的一部分通过简单加工处理后作为廉价原料而使用，而其余大部分则未能被利用，也就是说，相比于其丰富储量其实现的附加价值极低。因此，迫切需要对丰富的韩国琼脂新用途开发和提高附加价值方面的研究。
琼脂由琼脂糖(agarose)和琼脂胶(agaropectin)组成。其中，琼脂糖具有琼脂二糖(agarobiose)反复地，以α-1,3结合连接而成的直链结构，其中，上述琼脂二糖是由D-半乳糖(D-galactose)与3,6-脱水-L-半乳糖(3,6-anhydro-L-galactose)以β-1,4结构结合的单体。琼脂糖凝胶(gel)化力强，但与此相反，琼脂胶虽然由与琼脂糖相同的琼脂二糖单体构成，但是包含磺酸基等酸性基团，凝胶化力弱。
其中，琼脂糖通过作用于β-1,4结合的β-琼脂糖酶(β-agarase)，经过新琼脂四糖(neoagarotetraose)分解成新琼脂双糖(neoagarobiose)，继续通过作用于α-1,3结合的α-琼脂糖酶(α-agarase)最终分解成半乳糖(D-galactose)和3,6-脱水-L-半乳糖。
另一方面，已知作为放线菌的天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)产生用于分解琼脂的细胞外(分泌到细胞外)琼脂糖酶(Stanier et al.,1942,J.Bacteriol.:Hodgson and chater,1981,J.Gen.Microbiol.)，上述琼脂糖酶由DagA基因编码。DagA基因是放线菌中唯一已知的β-琼脂糖酶(β-agarase)基因，其在放线菌的琼脂糖酶生产研究中具有重要的地位。特别是，天蓝链霉菌是放线菌的分子生物学研究中最为广泛使用的菌株。在2002年,其染色体DNA由英国桑格研究院(Sanger centre)分析并公开(Bentley et al.,2002,Nature)。
本发明人致力于能够对作为丰富水产资源的琼脂进行更加有效地运用的方法，并且，注意到由于琼脂为多糖类，所以适当地利用糖分解酶可在琼脂的分解过程中产生出多种具有生理活性效果的、糖来源化合物的可能性。另外，放线菌是生产抗生素等有用的生物活性物质的微生物，且其生物活性物质中包含多种与糖相关的化合物，因此，预料放线菌中应当有包括使琼脂分解或变形而转化为有用的糖化合物的酶的菌株。因此，尝试从这些放线菌探索有用的酶，并将其用于琼脂的酶反应，从而生产有用的生物活性物质。
如琼脂的高分子多糖类可以通过酶反应产生相对小的低聚糖。这些低聚糖中存在分子形态上与生物代谢中使用的低聚糖类似但不能被相关酶分解而最终阻碍糖分解酶活性的低聚糖。本发明人注意到上述特点，并试图通过验证对琼脂的酶反应产物的糖分解酶活性的抑制活性，开发对肥胖或糖尿病有效的物质。
其结果，证明通过作为放线菌的天蓝链霉菌的DagA和琼脂或琼脂糖的酶反应而获得的反应产物对肥胖或糖尿病的预防、治疗及改善具有良好的效果，从而完成了本发明。
本专利申请基于，通过2013～2014年度农村振兴厅的资助，获得次世代生物绿色21产业(课题编号：PJ009536，研究课题名称：通过鉴定琼脂低聚糖的抗肥胖效果开发高附加值食物医药材料)的资源而执行的研究成果。
发明内容
本发明要解决的技术问题
因此，本发明的主要目的在于，提供一种有用的生物活性物质，尤其是提供通过调节脂肪细胞分化及糖代谢而在对肥胖或糖尿病显示出优异效果的生物活性物质，其中，该生物活性物质是通过将琼脂作为底物的酶反应而生产出的。
技术方案
根据本发明的一方面，本发明提供一种肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，该药物组合物包含通过天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)DagA和琼脂或琼脂糖(agarose)的酶反应获得的反应产物作为有效成分。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种包含上述反应产物作为有效成分的肥胖或糖尿病的预防及改善用功能食品。
根据本发明的又一方面，本发明提供一种包含上述反应产物作为有效成分的肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料。
本发明中，上述酶反应优选在35℃至45℃的温度及6至8的pH条件下进行。
本发明中，上述酶反应优选是通过在0.5至5％(w/v)的琼脂或琼脂糖(agarose)溶液中，以20至100unit/ml的浓度添加DagA而实现。此时，1unit是指，和以0.2％(w/v)溶解了琼脂糖的50mM磷酸溶液(pH7)，在40℃下反应5分钟(反应液4ml)后，加入与反应液相等量的DNS试剂(二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid)6.5g，2M NaOH 325ml，甘油45ml/1L蒸馏水)后，煮10分钟并冷却后，测定吸光度()时，产生吸光度()0.001的量。
本发明中，以反应产物总重量计，上述反应产物包含45至85重量％的新琼脂寡糖(neoagarooligosaccharide)混合物。优选地，以新琼脂寡糖混合物的总重量计，上述新琼脂寡糖混合物中包含10重量％以下的新琼脂双糖(neoagarobiose)、50至70重量％的新琼脂四糖(neoagarotetraose)及30至50重量％的新琼六糖(neoagarohexaose)。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含新琼脂寡糖混合物作为有效成分，其中，上述新琼脂寡糖混合物含有新琼脂双糖(neoagarobiose)、新琼脂四糖(neoagarotetraose)或者新琼六糖(neoagarohexaose)。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种肥胖或糖尿病的预防及改善用功能性食品，其特征在于，该功能性食品包含新琼脂寡糖混合物作为有效成分，其中，上述新琼脂寡糖混合物含有新琼脂双糖(neoagarobiose)、新琼脂四糖(neoagarotetraose)或者新琼六糖(neoagarohexaose)。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料，其特征在于，该饲料包含新琼脂寡糖混合物作为有效成分，其中，上述新琼脂寡糖混合物含有新琼脂双糖(neoagarobiose)、新琼脂四糖(neoagarotetraose)或者新琼六糖(neoagarohexaose)。
本发明中优选地，以新琼脂寡糖混合物的总重量计，上述新琼脂寡糖混合物包含10重量％以下的新琼脂双糖(neoagarobiose)、50至70重量％的新琼脂四糖(neoagarotetraose)及30至50重量％的新琼六糖(neoagarohexaose)。
本发明中，天蓝链霉菌DagA指，具有SEQ ID NO.2的31～309位之间的氨基酸序列的蛋白质，包括由天蓝链霉菌产生或异种菌株产生的蛋白质。并且，包括未完全变化为其它功能或未失去琼脂糖活性的范围内通过通常的基因重组方法，即为了有利于纯化添加标记氨基酸或为了异种表达改变氨基酸序列等方法重组的蛋白质。
原来DagA为天蓝链霉菌产生的β-琼脂糖酶，从基因开始被翻译时以具备SEQID NO.2的309个氨基酸、且分子量约为35kDa的状态产生，其以N-末端的30个氨基酸信号肽切除后完成的、细胞外型蛋白质(约32kDa)的状态分泌。
此DagA由天蓝链霉菌的dagA基因编码，dagA基因可以表示为SEQ ID NO.1的碱基序列。SEQ ID NO.1是天蓝链霉菌A3(2)的基因组中存在的基因序列，在NCBI(美国国立生物信息中心)数据库中被命名为“SCO3471”。据体外(In vitro)实验证实，dagA基因的转录是被4种或5种不同的启动子(promoter)调节，这些启动子可被RNA聚合酶的至少3种不同的全酶(holoenzyme)识别。通过dagA基因的转录阶段的分析，显示转录从编码序列的上游第32、77、125及220个碱基开始。
可以通过作为DagA的生产菌株的天蓝链霉菌的培养来产生本发明的DagA，但是为提高产生效率，优选地利用作为异种菌株的变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)表达系统。可以采用将上述dagA基因插入到放线菌用载体制作重组载体后，将此重组载体转化至变铅青链霉菌，再对此转化体进行培养的方法。此时，重组载体优选地，构成为dagA基因可通过由放线菌来源启动子来调节转录。
放线菌来源启动子有sgtR启动子(sgtRp)、ermE启动子(ermEp)、tipA启动子(tipAp)等多种启动子，因此在制作重组载体时可以进行选择使用。已经开发出了构成为可通过这些启动子来调节转录的多种载体，所以可通过将SCO3471克隆至上述载体，制备出具有能够由放线菌来源启动子调节转录的结构的重组载体。
转化体可以通过将重组载体转化至宿主菌株而制备。根据宿主菌株的不同存在多种转化方法，因此可以选择适当的方法使用。例如，将变铅青链霉菌作为宿主菌株时，可以选择使用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)介导的转化方法。
将如转化体等的DagA生产菌株培养于液体培养基，从而可以生产DagA。获得的培养液利用超滤等通常的蛋白质纯化方法可生产出高纯度的DagA。此时，液体培养基中添加琼脂(agar)或琼脂糖(agarose)可以更有效地产生DagA。
根据本发明，显示通过琼脂或琼脂糖与DagA的酶反应可以产生新琼六糖、新琼脂四糖、新琼脂双糖。因此，本发明的酶反应产物可以为上述各个化合物，或也可以为其混合的状态。但是，本发明中证实也可能产生上述三种反应产物以外的其它反应产物，因此并不仅限定于上述三种反应产物。
通过本发明证实不仅是通过琼脂或琼脂糖与DagA的酶反应后，进行超滤而获得的反应产物(包含新琼六糖、新琼脂四糖及新琼脂双糖全部的状态，并且可能包含上述以外的反应产物)，各个新琼六糖、新琼脂四糖、新琼脂双糖也均具有优异的肥胖及糖尿病的预防及治疗效果。
本发明的组合物可以用于医药品及食品等用途。
可以根据食品药品安全厅(MFDS)的通常的药剂学制剂的剂型化标准或健康辅助食品的剂型标准进行剂型化。也可以按照通常的方法，根据给药方法、给药形态及治疗目的，而将有效成分与药剂学上可接受的载体混合稀释，或者封入容器形态的载体。
当上述载体用作稀释剂时，可以制备成选择使用盐水、缓冲剂、水、注射液及乙醇组成的组中的一种以上的载体的经口给药，以及作为非经口给药用的如粉末、颗粒、注射液、糖浆、溶液剂、片剂等剂型。此时，非经口给药指经口以外的、通过静脉、腹膜、肌肉、动脉、经皮、吸入等方式，进行有效成分的给药。
上述剂型中可以额外包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂、防腐剂等而进行剂型化，使得给药至哺乳动物后活性成分可以获得迅速、持续或延迟释放等效果。另外，对于本发明的给药量可以根据患者的状态、给药途径及给药形态而进行适当调节，因此并不会特别限定。显然地，本发明所属技术领域的技术人员可以根据症状而在多种范围内使用。但是在本发明中，作为实验性有效量，可以按照每1kg体重10至200mg每天的量进行给药，且这种给药可以是连续性或间歇性给药。
以上述有效量为准，本发明提供琼脂或琼脂糖与DagA的酶反应的产物本身或混合有食品学的可接受的载体的组合物的食品。可以将其包含于食用肉加工制品、鱼肉制品、豆腐、凉粉、粥、方便面、面条等面类，酱油、大酱、辣椒酱、混合酱等调味食品，调味汁、饼干、发酵油、奶酪等乳制品，泡菜、酱菜等腌制食品，水果、蔬菜、豆乳、发酵饮料等饮料食品而使用。各种食品的烹调方法和生产方法对于本领域技术人员而言是显而易见的，因此将省略对其的具体记载。并且食品学上可接受的载体亦可以使用上述药剂学上可接受的载体。
以上述有效量计，本发明提供琼脂或琼脂糖与DagA的酶反应产物本身或混合有可用于饲料的载体的组合物的饲料。本发明的组合物可以加入到饲养对象的基本食物材料而使用。特别是，作为担心由于运动不足而发生肥胖的狗、猫等宠物或赛马的饲料时，效果尤为显著。
有益效果
根据本发明，天蓝链霉菌DagA和琼脂或琼脂糖的酶反应产物显示出优异的抗肥胖及抗糖尿病效果。因此，给予或摄取本发明的组合物可以有效地预防、治疗及改善肥胖及糖尿病。
附图说明
图1表示pUWL201pw的载体图谱。
图2表示根据本发明一实施例的重组载体的图谱。
图3表示对本发明的酶反应产物进行高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC-ELSD)分析的结果图。
图4表示本发明的酶反应产物(以下简称“NAO”)或将其纯化获得的新琼六糖(以下简称“DP6”)、新琼脂四糖(以下简称“DP4”)、新琼脂双糖(以下简称“DP2”)的α-淀粉酶抑制活性结果。
图5表示NAO或DP6、DP4、DP2的α-葡萄糖苷酶抑制活性结果。
图6表示摄入正常饮食(以下简称“ND”)、高脂饮食(以下简称“HFD”)、包含0.25％(w/w)本发明的酶反应产物的高脂饮食(以下简称“HFD-NAO0.25％”)或包含0.5％(w/w)本发明的酶反应产物的高脂饮食(以下简称“HFD-NAO0.5％”)的实验动物的每日体重增加量的附图。
图7表示对摄入ND、HFD、HFD-NAO0.25或NFD-NAO0.5的实验动物的肝组织进行H&E染色后显微镜下拍摄的照片。其中，A为ND，B为HFD，C为HFD-NAO0.25％，D为HFD-NAO0.5％实验组的组织。
图8显示摄入ND、HFD、HFD-NAO0.25或NFD-NAO0.5的实验动物的肝脂肪变性程度的附图。
图9显示摄入ND、HFD、HFD-NAO0.25或NFD-NAO0.5的实验动物的附睾脂肪组织细胞的大小的图。
图10表示对摄入ND、HFD、HFD-NAO0.25或NFD-NAO0.5的实验动物的附睾脂肪组织进行H&E染色后显微镜下拍摄的照片(A～D)和口服糖耐量试验结果的附图(E)。其中，A为ND，B为HFD，C为HFD-NAO0.25％，D为HFD-NAO0.5％实验组的组织。
具体实施方式
以下，将参考实施例，对本发明进行详细说明。这些实施例仅是为了举例说明本发明，而不能理解为本发明的范围仅限于以下实施例。
实施例1.DagA生产
以天蓝链霉菌A3(2)染色体DNA为模板，通过利用Asm-F及Asm-R引物的PCR扩增了dagA基因片段(编码有A的信号肽及完整肽的947bp片段，SEQ IDNO.1中包含引物的一部分序列的状态)，并利用片段的限制酶位点(NdeI/BamHI)将DagA的基因克隆至pUWL201pw载体(参考图1)中，从而以可通过ermE启动子调节DagA基因转录的方式制备重组载体(参考图2)。
Asm-F引物：5′-GACATATGGTGGTCAACCGACGTGATC-3′(NdeI)(SEQID NO.3)
Asm-R引物：5′-GGTGGATCCCTACACGGCCTGATACG-3′(BamHI)(SEQID NO.4)
将此重组载体转化至铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24，并将获得的转化菌株用于DagA的生产。
将此菌株接种于包含0.3％(w/v)琼脂(agar)的R2YE液体培养基，在28℃条件下，以120rpm振荡培养48小时至72小时。经过预培养后实施正式培养，各培养时间为2.5天。
将通过正式培养获得的培养液进行离心去除菌体后，用超滤膜(5kDa截留膜(5kDa cut-off membrane))过滤上清液，从而分离及纯化未通过滤膜的蛋白质。对获得的浓缩液(酶液)进行冷冻干燥，并保存使用。
实施例2.DagA的琼脂糖酶活性测定
采用还原糖含量测定法(DNS method)测定了对于上述实施例1的DagA的琼脂糖酶活性。向实施例1中获得的酶液100ml中，加入0.2％(w/v)的溶解有琼脂糖的50mM磷酸溶液(pH7)3.9ml，在40℃下反应5分钟后，放入DNS试剂(二硝基水杨酸(dinitrosalicylic acid)6.5g，2M NaOH 325ml，甘油(glycerol)45ml/1L蒸馏水)4ml，煮10分钟并冷却后，测定吸光度()。酶1U被定义为反应5分钟后生成吸光度()0.001的活性。
实施例3.DagA酶反应产物
3-1.利用DagA的琼脂或琼脂糖的分解
制备0.5％至5％(w/v)的溶解有琼脂或琼脂糖的20mM Tris-HCl溶液1L，在100℃下加热约10分钟而充分融化后，降温至40℃，用DagA酶2000U至50000U进行酶反应24小时。
3-2.DagA酶反应产物的预处理
为去除酶反应产物中未分解的琼脂糖，进行离心分离并回收上清液后，用薄层色谱(thin layer chromatography，TLC)验证了酶反应产物。利用5kDa截留膜(5kDacut-off membrane)对回收的上清液，通过超滤法进行部分纯化。
实施例4.通过HPLC-ELSD分析验证DagA酶反应产物的组成
通过HPLC-ELSD验证了上述实施例4中获得的酶反应产物的组成。其中，使用了NH2P-504E multimode column(250x 4.6mm)，将乙腈(acetonitrile)和水的混合溶液(乙腈:水＝65:35)作为流动相而使用。
其结果，如图3所示，显示出了反应产物中由新琼脂双糖(neoagarobiose，以下简称“DP2”)、新琼脂四糖(neoagarotetraose，以下简称“DP4”)及新琼六糖(neoagarohexaose，以下简称“DP6”)共同组成的新琼脂寡糖(neoagarooligosaccharides)的总量占65±20％(重量)，且以此新琼脂寡糖的总量计DP2，DP4，DP6分别占10％、50～70％、30～50％(重量)。
实施例5.采用凝胶过滤层析的DagA酶反应产物的纯化
通过利用BioGel P-2凝胶(美国伯乐(Biorad)，商品目录号.:150-4115)的凝胶过滤层析(gel permeation chromatography，GPC)对DP6、DP4、DP2进行纯化，且对纯化的产物通过TLC和HPLC验证了纯度。
实施例6.DagA酶反应产物的抗肥胖及抗糖尿病功能验证试验
6-1.α-淀粉酶(α-amylase)抑制活性
将上述实施例5中通过纯化获得的DP2、DP4、DP6及实施例3中获得的酶反应产物(以下简称“NAO”)作为试样。
已知的广泛应用于第Ⅱ型糖尿病治疗的药物阿卡波糖(acarbose)，其是通过抑制α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶而延迟糖吸收的机制表现出抗糖尿病效果。因此，为验证新琼脂寡糖的糖尿病相关性，研究了其是否有与阿卡波糖类似的酶活性抑制效果。
将α-淀粉酶溶液和各试样混合，并将蓝淀粉试剂(starch azure solution)作为底物()加入后，反应10分钟，之后通过吸光度()测定分解产生的蓝色的浓度，从而分析了酶活性。
其结果，如图4所示，各试样均具有α-淀粉酶抑制活性，但相比阿卡波糖(阳性对照组)的抑制活性低。
6-2.α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)抑制活性
将DP2、DP4、DP6及NAO作为试样。
将α-葡萄糖苷酶溶液分别和各试样混合，将对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，p-NPG)作为底物加入后，反应10分钟，之后通过吸光度()测定分解产生的对硝基苯酚(p-nitrophenol)的浓度，从而分析酶活性。
其结果，如图5所示，虽然抑制活性比第Ⅱ型糖尿病的治疗药物的阿卡波糖(阳性对照组)较低，但是证明了DP2、DP4、DP6及NAO均具有α-淀粉酶抑制活性。
6-3.对诱导肥胖鼠的抗肥胖及抗糖尿病效果的验证
给实验动物(小鼠)给予高脂肪饲料将发生内脏脂肪增加过度、高血糖、血脂异常症、高胰岛素血症及肝组织脂肪变性，从而能够构建很好地反应肥胖症患者显示的特征的肥胖动物模型。
将结束驯化的4周龄C57bl/6小鼠根据体重通过随机分组设计分成4组，即正常组(Normal diet，ND)、高脂肪对照组(High fat diet，HFD)、高脂肪-0.25％NAO混合组(HFD-NAO 0.25％)、高脂肪-0.5％NAO混合组(HFD-NAO 0.5％)，之后将对于各自的试样与高脂肪饮食一同供给9周，并且通过检查实验动物的血液生化检测、组织学检测、葡萄糖耐性检测验证了NAO的抗肥胖及抗糖尿病效果。
给予9周的实验饮食的实验动物的体重增加量和食物摄取量如图6及表1所示。体重在给予高脂肪饮食1周之后开始显现统计学上的显著性差异，在第9周实验结束时，作为对照组的高脂饮食组(HFD)相比正常饮食组(ND)增加29.5％，从而观察到由高脂饮食能够诱导小鼠肥胖。以0.5％添加了NAO的饮食组的体重显著低于高脂饮食组，在体重增加量上也显示出了比正常组低。相反，以0.25％添加了NAO的饮食组中未显示出与高脂饮食组的显著性差异。
表1
1)饲料效率：体重增加量/食物摄入量
结果数值：根据平均±标准差、T-检验(n＝6～10)，在p＜0.05时具有显著性差异。
对于正常饮食组的p<0.05，*对于高脂肪饮食组的p<0.05
从给予9周的实验饮食的实验动物提取肝组织及附睾脂肪组织，在显微镜下进行观察，肝组织的H&E染色(staining)结果，如图7所示。
对于肝组织，依照Kleiner DE et.al.(2005)的肝脂肪变性(steatosis)程度比较法区分了脂肪变性程度，其结果如图8所示。结果显示摄入高脂肪饮食的肝组织内脂肪堆积显著高于正常饮食组，呈小水泡性脂肪变性(micro-vescularsteotosis)和大水泡性脂肪变性(macro-vescularsteotosis)的形态(grade 1.75±0.41)。与此相反地，添加了NAO的饮食组中，0.25％组(grade 0.75±0.16)和0.5％(grade 0.37±0.18)组都显示出了脂肪空泡的数量和大小减小至正常水平，验证了通过NAO而抑制了肝组织内脂肪沉积。
附睾周围脂肪组织的H&E染色结果，如图9及10所示，HFD(10.74±1.44)相比于ND(4.65±0.54)，在附睾脂肪组织中的脂肪细胞显著增大。但在添加了NAO的饮食组中，0.25％组(6.74±0.38)和0.5％(6.95±0.82)组的脂肪细胞的大小均相比于高脂饮食组减小。因此，推测NAO能够抑制肝及脂肪组织内的脂肪堆积。
为验证高脂饮食及NAO对于脂质代谢的影响，研究了血清内脂质含量，并表示于表2。血清总胆固醇含量在ND组为140.1±5.2mg/dL，与此相比，HFD组中增加至182.0±8.2mg/dL。与此相反地，添加了NAO的饮食组中，在0.25％组中以173.0±4.3mg/dL，表现出了减小的趋势，在0.5％组中显著性的减小至159.6±5.6mg/dL。对于血清中性脂肪而言，在ND组为48.7±3.2mg/dL，相反在HFD组中增加至64.8±4.0mg/dL。添加了NAO的饮食组中，在0.25％组中以56.7±4.4mg/dL，表现出了减小的趋势，而在0.5％组中显著性的减小至47.3±2.9mg/dL。并且，对于血中游离脂肪酸(Free fatty acid，FFA)而言，高脂饮食组显示出了比正常数值高，而在添加了NAO的饮食组中显示出了接近于正常水平的数值。已知，血中FFA浓度和TG的浓度与肝组织的脂肪沉积和胰岛素抗性密切相关。因此，推测NAO具有通过调节FFA和TG，从而改善第Ⅱ型糖尿病的主要原因之一的胰岛素抗性的效果。
表2
结果数值：根据平均±标准差、T-检验(n＝8)，在p＜0.05时具有显著性差异。
对于正常饮食组的p<0.05，*对于高脂肪饮食组的p<0.05
为验证NAO的糖尿病改善效果及胰岛素抗性改善效果，进行了口服葡萄耐糖量试验(Oral GTT)和胰岛素抗性相关的生化分析，其结果如图10(E)和表3。给予NAO 9周后，经口给药葡萄糖(glucose)，测定血糖的结果，高脂肪组在血糖给药后30分和60分时显示出比正常组高的血糖值，可以确认诱导了胰岛素抗性。相反，添加NAO的饮食组在30分和60分时显示出相比于高脂肪饮食组，显著性的低的血糖数值，计算比较曲线下面积(Area under curve，AUC)的结果，也显示添加NAO饮食组显著低于高脂肪饮食组。这提示由高脂肪饮食诱导的胰岛素抗性，通过同时摄入NAO而恢复至与正常接近的水平。并且，如表3所示，血中胰岛素和血糖测定结果，显示添加NAO饮食组的数值比HFD低，而血中脂联素(adiponectin)在添加NAO饮食组中的数值比HFD高。已知，脂联素数值与胰岛素抗性密切相关，在具有胰岛素抗性的人体中脂联素数值低下，而当其胰岛素抗性改善时脂联素数值则将升高。如表3所示，HFD组的脂联素浓度与正常组未见大的差异，推测HFD组中由肥胖引起的胰岛素抗性及糖尿病未得到充分发展。但是，在添加NAO的饮食组中脂联素数值显示相比正常组增加，提示NAO可在改善胰岛素抗性中起到重要的作用。虽然，在本实施例中HFD未发展至糖尿病，但在各糖尿病相关指标上显示出了恶化的倾向，并验证了其可通过摄入NAO而在很大程度上恢复至正常水平。并且，通过口服葡萄耐糖量试验(OGTT)检测结果显示出在NAO摄入饮食组中确实表现出了糖尿病改善效果，从而证明了NAO可作为糖尿病功能性材料的可能性。
表3
结果数值：根据平均±标准差、T-检验(n＝8)，在p＜0.05时具有显著性差异。
对于正常饮食组的p<0.05，*对于高脂肪饮食组的p<0.05
工业实用性
根据本发明，由于天蓝链霉菌DagA和琼脂或琼脂糖的酶反应产物显示优异的抗肥胖及抗糖尿病效果，因此通过给药或摄入本发明的组合物可以有效地预防、治疗及改善肥胖及糖尿病。由此，本发明的组合物可以用于预防、治疗及改善肥胖及糖尿病的医药品、食品、饲料等用途。

Claims (18)

1.一种肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，其中，
该药物组合物包含通过天蓝链霉菌DagA和琼脂或琼脂糖的酶反应获得的反应产物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，其特征在于，
所述酶反应是在35℃至45℃的温度及6至8的pH条件下进行的。
3.根据权利要求1所述的肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，其特征在于，
所述酶反应是通过在0.5w/v％至5w/v％的琼脂或琼脂糖溶液中，以20unit/ml至100unit/ml浓度添加DagA而实现。
4.根据权利要求1所述的肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，其特征在于，
以反应产物总重量计，所述反应产物包含45重量％至85重量％的新琼脂寡糖混合物，
并且，以所述新琼脂寡糖混合物的总重量计，所述新琼脂寡糖混合物中包含10重量％以下的新琼脂双糖、50重量％至70重量％的新琼脂四糖、以及30重量％至50重量％的新琼六糖。
5.一种肥胖或糖尿病的预防及改善用功能性食品，其中，
该功能性食品包含通过天蓝链霉菌DagA和琼脂或琼脂糖的酶反应获得的反应产物作为有效成分。
6.根据权利要求5所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用功能性食品，其特征在于，
所述酶反应是在35℃至45℃的温度及6至8的pH条件下进行的。
7.根据权利要求5所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用功能性食品，其特征在于，
所述酶反应是通过在0.5w/v％至5w/v％的琼脂或琼脂糖溶液中，以20unit/ml至100unit/ml浓度添加DagA而实现。
8.根据权利要求5所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用功能性食品，其特征在于，
以反应产物总重量计，所述反应产物包含45重量％至85重量％的新琼脂寡糖混合物，
并且，以所述新琼脂寡糖混合物的总重量计，所述新琼脂寡糖混合物中包含10重量％以下的新琼脂双糖、50重量％至70重量％的新琼脂四糖、以及30重量％至50重量％的新琼六糖。
9.一种肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料，其中，
该饲料包含通过天蓝链霉菌DagA和琼脂或琼脂糖的酶反应获得的反应产物作为有效成分。
10.根据权利要求9所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料，其特征在于，
所述酶反应是在35℃至45℃的温度及6至8的pH条件下进行的。
11.根据权利要求9所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料，其特征在于，
所述酶反应是通过在0.5w/v％至5w/v％的琼脂或琼脂糖溶液中，以20unit/ml至100unit/ml浓度添加DagA而实现。
12.根据权利要求9所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料，其特征在于，
以反应产物总重量计，所述反应产物包含45重量％至85重量％的新琼脂寡糖混合物，
并且，以所述新琼脂寡糖混合物的总重量计，所述新琼脂寡糖混合物中包含10重量％以下的新琼脂双糖、50重量％至70重量％的新琼脂四糖、以及30重量％至50重量％的新琼六糖。
13.一种肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，其特征在于，
该药物组合物包含新琼脂寡糖混合物作为有效成分，
其中，所述新琼脂寡糖混合物含有新琼脂双糖、新琼脂四糖或者新琼六糖。
14.根据权利要求13所述的肥胖或糖尿病的预防及治疗用药物组合物，其特征在于，
以新琼脂寡糖混合物的总重量计，所述新琼脂寡糖混合物包含10重量％以下的新琼脂双糖、50重量％至70重量％的新琼脂四糖、以及30重量％至50重量％的新琼六糖。
15.一种肥胖或糖尿病的预防及改善用功能性食品，其特征在于，
该功能性食品包含新琼脂寡糖混合物作为有效成分，
其中，所述新琼脂寡糖混合物含有新琼脂双糖、新琼脂四糖或者新琼六糖。
16.根据权利要求15所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用功能性食品，其特征在于，
以新琼脂寡糖混合物的总重量计，所述新琼脂寡糖混合物包含10重量％以下的新琼脂双糖、50重量％至70重量％的新琼脂四糖、以及30重量％至50重量％的新琼六糖。
17.一种肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料，其特征在于，
该饲料包含新琼脂寡糖混合物作为有效成分，
其中，所述新琼脂寡糖混合物含有新琼脂双糖、新琼脂四糖或者新琼六糖。
18.根据权利要求17所述的肥胖或糖尿病的预防及改善用饲料，其特征在于，
以新琼脂寡糖混合物的总重量计，所述新琼脂寡糖混合物包含10重量％以下的新琼脂双糖、50重量％至70重量％的新琼脂四糖、以及30重量％至50重量％的新琼六糖。
CN201380059074.6A 2012-11-13 2013-11-13 通过DagA酶反应制备的、具有抗肥胖及抗糖尿病效果的、琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物 Active CN104780943B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0128087 2012-11-13
KR20120128087 2012-11-13
KR10-2013-0137079 2013-11-12
KR1020130137079A KR101632262B1 (ko) 2012-11-13 2013-11-12 DagA 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물
PCT/KR2013/010277 WO2014077575A1 (ko) 2012-11-13 2013-11-13 덱에이 효소반응으로 조제한 항비만 및 항당뇨 효능을 갖는 한천 유래 네오아가로올리고당 복합 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104780943A true CN104780943A (zh) 2015-07-15
CN104780943B CN104780943B (zh) 2017-06-23

Family

ID=50890329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380059074.6A Active CN104780943B (zh) 2012-11-13 2013-11-13 通过DagA酶反应制备的、具有抗肥胖及抗糖尿病效果的、琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP6088657B2 (zh)
KR (1) KR101632262B1 (zh)
CN (1) CN104780943B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109890395A (zh) * 2016-10-27 2019-06-14 达因比奥有限公司 用于预防、缓解或治疗关节炎或骨质疏松症的含有新琼寡糖的组合物
CN111629733A (zh) * 2017-11-16 2020-09-04 高丽大学校产学协力团 用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101675359B1 (ko) * 2014-12-30 2016-11-14 건국대학교 글로컬산학협력단 네오아가로올리고당을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물
KR102214973B1 (ko) * 2019-06-04 2021-02-10 다인바이오 주식회사 네오아가로올리고당 혼합물 원료용 한천의 제조방법 및 이의 용도

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1344162A (zh) * 1999-01-20 2002-04-10 宝酒造株式会社 医药组合物
CN1360470A (zh) * 1999-05-14 2002-07-24 宝酒造株式会社 含琼脂二糖的组成
US20080096249A1 (en) * 2001-02-27 2008-04-24 Takara Bio Inc. Agarase and gene thereof
KR20110093120A (ko) * 2010-02-11 2011-08-18 명지대학교 산학협력단 베타―아가레즈의 생산을 위한 재조합 발현 벡터
KR20110133462A (ko) * 2011-11-29 2011-12-12 명지대학교 산학협력단 베타-아가레즈 재조합 발현 벡터, 형질전환 균주 및 베타-아가레즈 생산 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62210965A (ja) * 1986-03-13 1987-09-17 Shokuhin Sangyo Baioriakutaa Syst Gijutsu Kenkyu Kumiai 低カロリ−飲食品およびその製造方法
CN1189472C (zh) * 2002-06-06 2005-02-16 严小军 一种低聚寡糖的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1344162A (zh) * 1999-01-20 2002-04-10 宝酒造株式会社 医药组合物
CN1360470A (zh) * 1999-05-14 2002-07-24 宝酒造株式会社 含琼脂二糖的组成
US20080096249A1 (en) * 2001-02-27 2008-04-24 Takara Bio Inc. Agarase and gene thereof
KR20110093120A (ko) * 2010-02-11 2011-08-18 명지대학교 산학협력단 베타―아가레즈의 생산을 위한 재조합 발현 벡터
KR20110133462A (ko) * 2011-11-29 2011-12-12 명지대학교 산학협력단 베타-아가레즈 재조합 발현 벡터, 형질전환 균주 및 베타-아가레즈 생산 방법

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
UYANGAA TEMUUJIN ET AL.: "Overexpression and biochemical characterization of DagA from Streptomyces coelicolor A3(2): an endo-type β-agarase producing neoagarotetraose and neoagarohexaose", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
吴立根，王岸娜，毛文君: "几种低聚琼脂糖的制备和对小鼠血糖的影响研究", 《河南工业大学学报(自然科学版)》 *
王广慧，张明: "琼脂糖酶的研究进展", 《海洋通报》 *
胡斌: "新琼寡糖的益生元效应研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士) 医药卫生科技辑》 *
陈海敏，严小军: "琼脂寡糖对糖尿病小鼠血糖和氧化-抗氧化态的效应", 《营养学报》 *
龙梦娴: "琼脂降解相关酶类及酶法制备新琼寡糖的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109890395A (zh) * 2016-10-27 2019-06-14 达因比奥有限公司 用于预防、缓解或治疗关节炎或骨质疏松症的含有新琼寡糖的组合物
CN111629733A (zh) * 2017-11-16 2020-09-04 高丽大学校产学协力团 用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途
US11872253B2 (en) 2017-11-16 2024-01-16 Korea University Research And Business Foundation Method for producing marine algae-derived agarotriose, and use thereof as prebiotic

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140061272A (ko) 2014-05-21
KR101632262B9 (ko) 2022-08-16
CN104780943B (zh) 2017-06-23
KR101632262B1 (ko) 2016-06-21
JP6088657B2 (ja) 2017-03-01
JP2016505521A (ja) 2016-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kumar et al. Sharpea and Kandleria are lactic acid producing rumen bacteria that do not change their fermentation products when co-cultured with a methanogen
JP6815525B2 (ja) ネオアガロオリゴ糖を含む関節炎または骨粗しょう症の予防、改善または治療用組成物
CN104780943A (zh) 通过DagA酶反应制备的、具有抗肥胖及抗糖尿病效果的、琼脂来源的新琼脂寡糖复合组合物
CN109718255A (zh) 一种消除宿醉酶粉末的制备方法和含有该成分的消除宿醉用组合物
CN104082740A (zh) 一种具有干预或改善糖尿病的组合物及其制备方法
CN101756091B (zh) 花粉纳豆片
CN107206018A (zh) 包含新琼寡糖作为有效成分的败血症或败血症性休克的预防或治疗用药学组合物
CN104522750A (zh) 一种藻类保健食品
CN104367987A (zh) 兽用黄芪制剂及其制备方法
CN100496263C (zh) 降血糖的酸奶
US20210393501A1 (en) Preparation method and application of recombinant mutant collagenase
CN114989258B (zh) 植物提取组合物在制备治疗便秘、减肥产品上的应用
US9498516B2 (en) Composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising angiopoietin-4 protein
CN111838551B (zh) 一种黄酮发酵物及其制备方法和在血糖调节中的应用
KR101213069B1 (ko) 발효두유의 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 또는 당뇨병성 질환의 예방 및 혈당강하용 건강보조식품
CN110527680A (zh) 一种透明质酸裂解酶及其基因与应用
CN105106075B (zh) 一种具有营养和保湿功效的组合物及其制备方法与应用
JP2006136240A (ja) ビフィズス菌増殖促進性組成物
CN105154459A (zh) 一种新型芽孢杆菌阿拉伯糖异构酶基因的克隆表达及应用
CN109758494A (zh) 绿豆壳发酵产物及其应用
CN114569707B (zh) 腺苷脱氨酶或其修饰物在制备糖尿病治疗药物中的应用
CN104884066A (zh) 含有壳寡糖的淀粉酶活性抑制用组合物
CN103613657B (zh) 缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用
CN107699501A (zh) 一种猴头菌的培养基、生物转化菌丝体、生物转化菌丝体的提取物及其用途
KR101137697B1 (ko) 상황버섯-울금 발효액을 함유하는 숙취해소용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant