CN1189472C - 一种低聚寡糖的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有下式的低聚寡糖结构，来自于红藻琼胶的降解产物，其中为n为1至10，可以进一步开发成为作为治疗与预防II型糖尿病的新型药物及保健食品上应用。

Description

一种低聚寡糖的应用

技术领域

本发明涉及一种低聚寡糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用技术领域。

背景技术

α-葡萄糖苷酶是一种能使不被吸收的复合碳水化合物分解成小肠可吸收的单糖的酶，而葡萄糖苷酶抑制剂则通过抑制该酶作用而延迟或减少餐后血糖升高，参见Vichayanrat A，Ploybutr S，Tunlakit M，Watanakejorn P.2002.Efficacy and safety ofvoglibose in comparison with acarbose in type 2 diabetic patients.Diabetes Res Clin Pract 55(2)：99-103。主要代表药物有阿卡波糖(Acarbose)和伏格列波糖(Voglibose)。前者是通过竞争性和可逆性抑制小肠粘膜刷状缘葡萄糖苷酶，阻断淀粉及蔗糖的裂解，从而延长葡萄糖和果糖在消化道的吸收速度，降低餐后血糖水平，副作用主要为胃胀、腹胀。后者为选择性双糖水解酶抑制剂，适当延缓糖的吸收，改善餐后血糖，对肠道的麦芽糖酶、蔗糖酶抑制作用比葡萄糖苷酶抑制剂作用强，胃肠道反应低，参见Mooradian AD，Thurman JE.1999.Drug therapy of postprandial hyperglycaemia.Drugs57(1)：19-29。因此，寻找α-葡萄糖苷酶安全有效的抑制剂，对于治疗、预防非胰岛素依赖性糖尿病、肥胖症、高脂血症、高脂蛋白血症具有重要的临床应用价值。专利号为99801464.8的中国发明专利报道了从豆豉中分离得到了α-葡萄糖苷酶抑制剂。其缺陷是具体的物质还不太知道，仅仅是一种方法定义的提取物，所以造成其工业开发还不太成熟，质量比较难以明确地控制，更不用提其反应机理，另外其抑制剂的抑制活性没有明确地报道，可能有待提高，由于其具体的物质还不明确，所以无法在真正意义上作为药物使用，只能作为保健食品的添加剂使用，在工业开发和实际药物应用上面有待进一步研发和完善。

另外海藻含有许多不被人体吸收的多糖化合物，其单糖结构单元也不被人体吸收，因此，在降血糖研究中发现了多种生物活性。例如，Lamela等(1989)发现，从海藻中得到的多糖粗提取物经过静脉给药后8小时，能够显著降低血糖浓度，参见Lamela，M.，Anca，J.，Villar，R.，Otero，J.，1989.Hypoglycemic activity of several seaweedextracts.J.Ethnopharmacol.，27(1-2)：3543。褐藻中提取的多糖褐藻酸，也可以降低小肠对葡萄糖的吸收，参见Vaugelade，P.，Hoebler，C.，Bernard，F.，Guillon，F.，2000.Non-starch polysaccharides extracted from seaweed can modulate intestinal absorption of glucoseand insulin response in the pig.Reproduction Nutrition Development，40(1)：33-47。但是多糖类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性效价不高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术提供一种低聚寡糖的应用，其物质明确、来源广泛、抑制活性好、便于工业开发生产和药物应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种具有以下结构通式的低聚寡糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备治疗或预防II型糖尿病药物与保健食品上应用，

其中n＝1-10。

上述的低聚寡糖是来自于红藻琼胶的降解寡聚糖，以5个琼二糖或新琼二糖的聚合单位以下的寡糖为主，即1≤n≤5。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1、该α-葡萄糖苷酶抑制剂是明确的单体化合物寡聚体，其作用机理比较明确，在工业生产中比较容易严格地控制质量，保障人体使用的安全性；2、可以采用生化工程来生产，工艺方法比较成熟简单；3、产品安全无毒、并且抑制活性好和明显，物质明确，适合作为药物使用，可信性和科学性强：4、可以通过添加各种附剂制作成为治疗II型糖尿病的口服药物，或者作为主要的活性成分添加到各种食品、饮料中，作为预防II型糖尿病、防治肥胖的保健食品。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例一：

1.琼胶的提取制备：取20g晒干的石花菜放在3000ml大烧杯中，自来水冲洗2-3次，蒸馏水洗1次，加入600-800ml蒸馏水，放在加压锅中，在0.5kg压力下加热提取1h，取出用纱布过滤，残渣再用300ml蒸馏水在同样条件下提取1次，将两次粗滤液合并，用铺有脱脂棉的布氏漏斗过滤，滤液放冷凝固、切条，将凝胶条放在搪瓷盘上在-10℃冻结，然后将凝胶取出、粉碎，加入1.5倍体积的95％乙醇，进一步脱水，挤去溶液，再用85％乙醇400ml浸洗1次，过滤，干燥，粉碎，得到琼胶粉。

2.琼胶寡糖的降解制备：将琼胶样品配置成1.5％溶液，在50℃恒温水浴中加入盐酸至终浓度0.37mol/L，搅拌条件下反应4h，反应结束后以NaOH中和，加入4倍体积的乙醇，静置过夜，减压过滤，滤液减压浓缩至近干。降解产物经Sephadex G-10柱脱盐，脱盐后的产物冷冻干燥，得率为35％。

琼胶寡糖的薄层色谱分析：样品溶解于50％乙醇中，在硅胶板上点样，展开剂采用正丁醇/乙醇/水(3∶1∶1)，显色剂采用百里酚-硫酸，喷雾后100℃显色5min，出现粉红色斑点，标准寡糖样品包括半乳糖、3，6-内醚半乳糖、新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖。斑点主要集中在新琼二糖、新琼四糖、新琼六糖以及更高分子量的寡糖斑点。

3.α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：取120μl 0.5mol/L磷酸缓冲液(pH＝6.8)，120μl样品水溶液(空白对照为蒸馏水)，282μl蒸馏水，200μl 6mmol/L对硝基苯酚-α-葡萄糖苷溶液(底物)，在37℃恒温水浴预热5min，然后加入200μl 0.1u/mlα-葡萄糖苷酶溶液(Sigma公司，III型)，摇匀，反应开始，在37℃恒温水浴反应30min，然后加入0.4mol/L甘氨酸终止剂1.2ml终止反应，采用分光光度计测定410nm吸光度，抑制率按照下式求出α-葡萄糖苷酶抑制活性，测定3次，以平均值作为测定值。然后根据不同浓度的抑制活性作图得到IC50。

α-葡萄糖苷酶抑制活性(％)＝[(A₀-A)/A₀]×100％

其中，A为样品组的吸光度；A₀为空白对照组的吸光度。

琼胶寡糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50为0.9mg/ml。

实施例二：

1.从食品级琼胶降解制备琼胶寡糖：采用食品级市售琼胶配置成1％溶液，加入2216E固体培养基，经过琼胶降解微生物降解2d，过滤后，在降解产物中加入3倍乙醇，离心后将溶液旋转浓缩，冷冻干燥。

2.琼胶寡糖的分离制备：将上述降解产物120mg，加入0.02％叠氮化钠抗菌剂，上Sephadex G-25凝胶柱(900×26mm)，室温下用恒流泵以40ml/h流速含有0.02％叠氮化钠的水溶液洗脱，以部分收集器收集流分，每次收集6ml，用硫酸苯酚法检测各试管中的糖浓度，结合薄层色谱检测，得到二糖寡聚度为1-5的组分，合并洗脱液，旋转浓缩后冷冻干燥。

3.α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：采用与实施例1相同的α-葡萄糖苷酶抑制活性检测方法同样测定，琼胶寡糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性IC50为0.6mg/ml。

作为本实施例的变更：

1.琼胶的来源可以是石花菜、江蓠、紫菜等红藻。按照藻类资源的不同，在提取琼胶的工艺上有所不同。

2.琼胶寡糖的制备可以采用酸水解法，也可以采用酶水解法。精制琼胶寡糖的方法可以采用Sephadex G-25凝胶色谱，也可以采用乙醇沉淀除去多糖后再脱盐制备，或者采用分子截留值为3000的膜超滤方法制备。

3.α-葡萄糖苷酶活性测定时所采用的酶可以采用市售的酶制剂(如从Sigma公司购买，或者从大鼠的小肠制备)，所采用底物可以是蔗糖或者对硝基苯酚-α-葡萄糖苷。

Claims (2)

1、一种具有以下结构通式的低聚寡糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备治疗或预防II型糖尿病药物与保健食品上应用，

其中n＝1-10。

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的低聚寡糖是来自于红藻琼胶的降解寡聚糖，以5个琼二糖或新琼二糖的聚合单位以下的寡糖为主，即1≤n≤5。