CN111838551B - 一种黄酮发酵物及其制备方法和在血糖调节中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种黄酮发酵物及其制备方法和在血糖调节中的应用，涉及医药技术领域。所述发酵方法包括：在灭菌豆皮中接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行一阶静态发酵，然后接种马克思克鲁维酵母通气搅拌进行二阶发酵。本发明的方法原料价格低廉易得，工艺步骤少，获得的发酵物与大豆蛋白、胶原肽和可溶性膳食纤维以特定比例制备成组合物后具有较好的降空腹血糖功效。

Description

一种黄酮发酵物及其制备方法和在血糖调节中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种黄酮发酵物及其制备方法和在血糖调节中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
豆皮(壳)口味不佳，不易消化，影响传统豆沙、豆腐、豆油等豆制品加工和产品质量，一般作为食品加工后的废弃物处理，污染环境。研究发现豆类含有大豆异黄酮类成分(以下简称“黄酮”)，其中豆皮部分含量最高。黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的植物次级代谢产物，在植物界广泛存在。黄酮类化合物的药理活性研究表明其具有抗氧化、防止心血管疾病、调节免疫、抗疲劳等生理功效。其在植物体内通常与糖类结合形成配基形式的黄酮糖苷，少部分以游离态的黄酮苷元形式存在。然而，研究发现利于人体吸收利用的是去糖基化后的黄酮苷元。虽然植物本身比如大豆含有β-葡萄糖苷酶，但是使用其自身的β-葡萄糖苷酶的水解得到黄酮苷元的效率只有20％左右，转化率较低。因此，要将黄酮糖苷转化为黄酮苷元，目前主要的方法主要包括化学法和生物转化法。化学转化法有酸水解、碱水解，会对环境造成污染，并且反应条件剧烈会使苷元结构和构型发生变化，导致产物不稳定或药效消失。生物转化法相对温和且对环境友好，但目前报道的菌株多为黑曲霉等非食用菌种，不适用于食品加工。另外还有报道用酶转化的，该法适用于直接与酶接触的黄酮提取物，并不适用于处理豆皮内的黄酮糖苷。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种黄酮发酵物及其制备方法和在血糖调节中的应用，本发明以成本低廉且易得的豆皮为原料，采用二次接种、二级发酵的方式对豆皮进行发酵，发酵方法简单易行且容易控制，该发酵过程能够将豆皮中含有的黄酮成分从糖苷形式充分转化为苷元形式，转化率高达90％以上，并且发酵过程中豆皮纤维继续被酸化和溶胀分散，将豆皮纤维由致密结构转化为软化、持水力高的不溶性膳食纤维。此外，本发明的豆皮发酵物能够有效地降低空腹血糖和餐后血糖，将本发明的豆皮发酵物与大豆蛋白、胶原肽和可溶性膳食纤维等成分混合使用时，结合生活习惯干预，能够控制血糖的平衡。
具体地，本发明的技术方案如下所示：
在本发明的第一方面，提供了一种黄酮的发酵物的发酵方法，所述方法包括：在灭菌的豆皮培养基中接种德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)进行一阶静态发酵，然后接种马克思克鲁维酵母通气搅拌进行二阶发酵。
在本发明的实施方式中，所述豆皮选自赤小豆、赤豆、绿豆、黑豆、花豆、青豆和黄豆中的一种或多种的带皮全豆或豆皮，优选为赤小豆。其中，所述豆皮优选经粉碎后使用，粉粹后可过100目筛。
所述豆皮培养基的组成为：7-20％豆皮、0.5-5％乳糖、0.05-0.5％柠檬酸钠、0.02-0.5％醋酸钠、0.5-9％脱脂奶粉和水，此处的％为重量百分比。
在本发明的实施方式中，所述豆皮培养基的杀菌条件为：在60-130℃温度下杀菌10-40min，优选60-70℃，30min；70-80℃，20min；80-90℃，15min；90-95℃，10min，最优选为80-90℃，15min。
在本发明的实施方式中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的接种量为2-5％，优选为2％。
其中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的质量比为1-9:3，该比例范围可以进一步为1-2：3、2-5：3、5-9：3等等，较为优选地，两菌的混合比例为1-2：3，优选为1:3。发明人在实践中发现，发酵初期pH中性，嗜热链球菌生长较好、产酸量增加，是此阶段酸度下降的主要贡献者。当pH降至4.2时，嗜热链球菌基本停止产酸，此时德氏乳杆菌保加利亚亚种快速生长、继续产酸，因此，德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌以1-2：3的比例混合尤其以1:3的比例混合时，更有利于加快发酵液酸化，减少染菌风险。
在本发明的实施方式中，所述一阶静态发酵的温度为38-44℃，优选40-42℃，发酵时间为5-24h，优选在40℃静置保温5h。
在本发明的实施方式中，待一阶发酵至pH降到4-5时，接种马克思克鲁维酵母；其中，马克思克鲁维酵母的接种量为1-3％，优选为1％。
其中，所述二阶发酵的温度为25-45℃，优选33-35℃，发酵时间为48-96h，优选在33℃条件下通气搅拌发酵48h。
在本发明的实施方式中，对豆皮进行二次接种发酵，其中，一阶发酵，先接种保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌，静态发酵，此次发酵能够转化部分黄酮糖苷和部分酸化豆皮纤维，此时的静态发酵对黄酮糖苷转化效率低，但是提供了由益生菌控制下的足够时间去浸润和消噬豆皮，有助于黄酮糖苷和豆皮纤维的充分释放。二阶发酵，待一阶发酵pH降到4-5左右，适合马克思克鲁维酵母生长时，接种马克思克鲁维酵母，启动搅拌对豆皮进行有氧发酵，增加马克思克鲁维酵母与经一阶发酵充分释放的疏松分散的黄酮糖苷和豆皮纤维的接触，充分发酵转化，高效地从水溶性好但难以被人体吸收利用的黄酮糖苷转化为易被人体吸收利用的黄酮苷元，发酵转化率在90％以上，同时豆皮纤维继续被酸化和溶胀分散，将豆皮纤维由致密结构转化为软化、持水力高的不溶性膳食纤维，有助肠道蠕动，改善肠道微生态，防治便秘等。
在本发明的第二方面，提供了根据上述第一方面中所述的发酵方法发酵豆皮得到的发酵物。
所述发酵物中含有益生菌菌体、培养基成分、豆皮发酵产物，其中所述豆皮发酵产物中富含黄酮苷元和分散疏松的不溶性膳食纤维，协同改善人体肠道微生态和健康水平。
如有需要，本领域的技术人员可分离获得黄酮苷元和膳食纤维成分以供进一步使用。
在本发明的第三方面，提供了一种组合物，其含上述第一方面中所述的发酵物。
在进一步地实施方式中，本发明所述组合物中还可以包括大豆蛋白、胶原肽和可溶性膳食纤维。
其中，发酵物、大豆蛋白、胶原肽和可溶性膳食纤维的混合比例：10-30重量份的发酵物、40-90重量份的大豆蛋白、1-8重量份的胶原肽以及0.5-15重量份的可溶性膳食纤维；其中，可溶性膳食纤维选自聚葡萄糖、抗性糊精、果胶、魔芋粉、低聚果糖、菊粉、低聚木糖中的一种或多种。所述发酵物可以是发酵液的干粉，比如由发酵液浓缩后喷雾干燥或冻干得到；所述发酵物(即发酵液)也可直接与大豆蛋白、胶原肽、可溶性膳食纤维粉混合，发酵液的添加量根据所需固形物用量来计算总液量，然后混匀、干燥和粉碎。其中，在较为优选地实施方式中，所述组合物黄酮苷元的含量为30-1000mg/g。
在本发明的第四方面，提供了上述第三方面所述的发酵物或上述第四方面所述的组合物在制备用于预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果包括：
本发明能高效利用废弃物豆皮，发酵生成富含黄酮苷元、持水力高的膳食纤维和复合益生菌；复配其他营养成分，能够降低空腹血糖至正常水平。且本发明的原料价格低廉易得，工艺步骤少，黄酮苷元的转化效率高，不可溶膳食纤维持水力提高。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明实施例中所用嗜热链球菌为菌种编号CICC 20681的嗜热链球菌Streptococcus thermophilus；所用保加利亚乳杆菌为菌种编号为CICC 20361的德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus；所用马克思克鲁维酵母为菌种编号为CICC 32015的马克思克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus；三株菌从中国工业微生物菌种保藏管理中心获得，网址为http://www.china-cicc.org/。
实施例1
称取绿豆豆皮粉100g，脱脂奶粉70g，乳糖20g，柠檬酸钠2g，醋酸钠0.5g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在121℃温度下灭菌15min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌1:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2％，搅拌均匀后于38℃静置保温5h；pH降至4-5时，接种1％的马克思克鲁维酵母，33℃下通气搅拌48h，得到发酵液。取500mL发酵液制成冻干粉。
检测发酵前豆皮粉以及发酵后发酵液冻干粉中的黄酮糖苷或黄酮苷元：分别准确称取0.200g发酵前的豆皮粉、发酵液冻干粉于25mL容量瓶中，加入80％乙醇溶液10.00mL，震荡均匀，50℃超声提取30min，3000r/min离心15min，取上清液1.00mL，80％甲醇稀释5倍，0.45μm滤膜过滤后进样。高效液相色谱条件：色谱柱：SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；紫外检测器波长：260nm；流动相：0.2％冰乙酸+甲醇；梯度洗脱程序：0-5min，甲醇由20％至25％；5-25min，甲醇由25％至80％；25-30min，甲醇由80％降为20％，洗脱结束。
测定结果：
黄酮糖苷：黄豆苷(daidzin,D)、染料木苷(genistin,G)；
黄酮苷元：黄豆苷元(daidzein,De)、染料木黄酮(genistein,Ge)。
发酵前豆皮粉中：D为1538.0μg/g(干基，下同)，G为1764.2μg/g，De为20.3μg/g，Ge为15.4μg/g，总计3337.9μg/g。可见发酵前豆皮粉中黄酮糖苷含量为3302.2μg/g；发酵前黄酮苷元的含量为35.7μg/g。
发酵后发酵液冻干粉中：D为28.3μg/g，G为22.9μg/g，De为1482.1μg/g，Ge为1644.0μg/g，总计3177.2μg/g。可见发酵后发酵液冻干粉中黄酮糖苷含量为51.2μg/g；发酵前黄酮苷元的含量为3126μg/g。黄酮苷元转化率＝(发酵后黄酮苷元含量-发酵前黄酮苷元含量)*100％/(发酵后黄酮糖苷含量-发酵前黄酮糖苷含量)＝95.06％
固形物持水力检测：分别取1.0000g(m1)样品(豆皮粉或豆皮发酵液冻干粉)，置于离心管中，加入40mL蒸馏水，置冰箱中过夜，然后在3500r/min条件下离心30min，倾去上清液，称得质量为m2。持水力(g/g)＝(m2-m1)/m1
结果：豆皮粉中固定物的持水力为1.42g/g，豆皮发酵后发酵液冻干粉中的固形物持水力为2.86g/g。
发酵后发酵液冻干粉中活菌数检测：
乳酸菌活菌数测定：用MRS培养基倾注培养，于42℃厌氧条件下培养3d后计数。
马克思克鲁维酵母菌活菌数测定：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基涂布培养，于28℃培养3d后计数。
结果：乳酸菌活菌数：9.2×107cfu/g；马克思克鲁维酵母菌活菌数8.5×106cfu/g。
实施例2
称取赤小豆豆皮粉110g，脱脂奶粉5g，乳糖7g，柠檬酸钠3g，醋酸钠3g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在75℃温度下灭菌38min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌1:2的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2％，搅拌均匀后于40℃静置保温22h；pH降至4.0时，接种1％的马克思克鲁维酵母，25℃下通气搅拌96h。
将10g发酵液喷雾干燥粉、40g大豆蛋白、7g胶原肽、0.5g可溶性膳食混合和富含羟基酪醇的橄榄提取物，即得。其中，可溶性膳食纤维为聚葡萄糖。
实施例3
称取赤豆豆皮粉80g，脱脂奶粉10g，乳糖15g，柠檬酸钠1.5g，醋酸钠1.5g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在85℃温度下灭菌15min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌4:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为3％，搅拌均匀后于39℃静置保温20h；pH降至4.2时，接种2％的马克思克鲁维酵母，30℃下通气搅拌80h。
将20g发酵液冻干粉、50g大豆蛋白、3g胶原肽、8g可溶性膳食混合，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：聚葡萄糖、魔芋粉、低聚果糖、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为1：1：0.3：0.5：0.1。
实施例4
称取黑豆豆皮粉130g，脱脂奶粉20g，乳糖35g，柠檬酸钠2.5g，醋酸钠2.5g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在95℃温度下灭菌20min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌2:1的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为4.5％，搅拌均匀后于42℃静置保温18h；pH降至4.4时，接种3％的马克思克鲁维酵母，33℃下通气搅拌50h。
将25g发酵液冻干粉、60g大豆蛋白、4g胶原肽、6g可溶性膳食混合，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：抗性糊精、魔芋粉、低聚果糖、菊粉，质量混合比例为1：0.1：0.5：0.1。
实施例5
称取花豆豆皮粉150g，脱脂奶粉30g，乳糖45g，柠檬酸钠3.5g，醋酸钠3.5g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在110℃温度下灭菌10min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌8:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为3.5％，搅拌均匀后于44℃静置保温16h；pH降至4.6时，接种2.5％的马克思克鲁维酵母，40℃下通气搅拌52h。
将30g发酵液冻干粉、70g大豆蛋白、6g胶原肽、11g可溶性膳食混合，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：果胶、魔芋粉、低聚果糖、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为0.3：0.1：0.3：0.2：0.1。
实施例6
称取青豆豆皮粉190g，脱脂奶粉40g，乳糖30g，柠檬酸钠4.5g，醋酸钠4.5g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在60℃温度下灭菌40min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌3：1的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2.5％，搅拌均匀后于41℃静置保温14h；pH降至4.8时，接种1.5％的马克思克鲁维酵母，45℃下通气搅拌48h。
将25g发酵液冻干粉、80g大豆蛋白、8g胶原肽、13g可溶性膳食混合，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：抗性糊精、魔芋粉、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为1：0.1：0.5：0.1。
实施例7
称取黄豆豆皮粉70g，脱脂奶粉50g，乳糖5g，柠檬酸钠0.5g，醋酸钠0.2g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在70℃温度下灭菌30min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌1:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2％，搅拌均匀后于40℃静置保温12h；pH降至5时，接种1％的马克思克鲁维酵母，25℃下通气搅拌96h。
取100g发酵液(发酵液固形物含量13％)，加入40g大豆蛋白、1g胶原肽、1g可溶性膳食，加入的过程中不断搅拌使其混合均匀，直至含水量至25％，加热干燥至含水量5％，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：聚葡萄糖、抗性糊精、果胶、魔芋粉、低聚果糖，质量混合比例为1：1：0.1：0.1：0.2。
实施例8
称取豆皮粉90g，脱脂奶粉60g，乳糖10g，柠檬酸钠1g，醋酸钠1g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在80℃温度下灭菌15min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌2:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为3％，搅拌均匀后于38℃静置保温24h；pH降至4-5时，接种2％的马克思克鲁维酵母，30℃下通气搅拌80h。
取100g发酵液(发酵液固形物含量17％)，加入50g大豆蛋白、2g胶原肽、2g可溶性膳食，加入的过程中不断搅拌使其混合均匀，直至含水量至22％，加热干燥至含水量4.5％，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：聚葡萄糖、魔芋粉、低聚果糖、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为1：0.2：0.3：0.5：0.1。
实施例9
称取豆皮粉140g，脱脂奶粉70g，乳糖20g，柠檬酸钠2g，醋酸钠2g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在90℃温度下灭菌25min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌5:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为4％，搅拌均匀后于42℃静置保温8h；pH降至4-5时，接种3％的马克思克鲁维酵母，33℃下通气搅拌90h。
取100g发酵液(发酵液固形物含量26％)，加入60g大豆蛋白、4g胶原肽、4g可溶性膳食，加入的过程中不断搅拌使其混合均匀，直至含水量至20％，加热干燥至含水量4％，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：抗性糊精、魔芋粉、低聚果糖、菊粉，质量混合比例为1：0.1：0.5：0.1。
实施例10
称取豆皮粉160g，脱脂奶粉80g，乳糖40g，柠檬酸钠4g，醋酸钠4g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在100℃温度下灭菌10min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌7:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为5％，搅拌均匀后于44℃静置保温23h；pH降至4-5时，接种2％的马克思克鲁维酵母，34℃下通气搅拌70h。
取100g发酵液(发酵液固形物含量29％)，加入70g大豆蛋白、6g胶原肽、10g可溶性膳食，加入的过程中不断搅拌使其混合均匀，直至含水量至18％，加热干燥至含水量3.5％，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：果胶、魔芋粉、低聚果糖、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为0.4：0.1：0.3：0.2：0.1。
实施例11
称取豆皮粉200g，脱脂奶粉90g，乳糖50g，柠檬酸钠5g，醋酸钠5g，补水至1L搅拌制备豆皮培养基。将配制好的豆皮培养基在130℃温度下灭菌10min。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌1:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2％，搅拌均匀后于42℃静置保温10h；pH降至4-5时，接种1％的马克思克鲁维酵母，35℃下通气搅拌60h。
取50g发酵液(发酵液固形物含量36％)，加入90g大豆蛋白、8g胶原肽、15g可溶性膳食，加入的过程中不断搅拌使其混合均匀，直至含水量至15％，加热干燥至含水量3％，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：抗性糊精、魔芋粉、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为1：0.1：0.3：0.1。
试验例1
按照实施例1的方法配制豆皮培养基，原料均取自同一批次。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌1:1的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2％，搅拌均匀后于38℃静置保温5h；然后接种1％的马克思克鲁维酵母，33℃下通气搅拌48h。
按照实施例1所述的方法检测黄酮糖苷和黄酮苷元的含量、固形物的持水力和发酵后发酵液冻干粉中活菌数检测，结果分别为：
发酵后发酵液冻干粉中：D为304.2μg/g，G为367.5μg/g，De为1107.6μg/g，Ge为1347.8μg/g，总计3127.1μg/g。可见发酵后发酵液冻干粉中黄酮糖苷含量为671.7μg/g；发酵前黄酮苷元的含量为2455.4μg/g。
固形物持水力检测：豆皮发酵后发酵液冻干粉中的固形物持水力为2.74g/g。
乳酸菌活菌数：1.2×107cfu/g；马克思克鲁维酵母菌活菌数1.5×106cfu/g。
试验例2
按照实施例1的方法配制豆皮培养基，原料均取自同一批次。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌1:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2％，搅拌均匀后于38℃静置保温5h；然后接种1％的马克思克鲁维酵母，搅拌均匀后于33℃静置保温48h。
按照实施例1所述的方法检测黄酮糖苷和黄酮苷元的含量、固形物的持水力和发酵后发酵液冻干粉中活菌数检测，结果分别为：
发酵后发酵液冻干粉中：D为457.1μg/g，G为507.2μg/g，De为1088.8μg/g，Ge为1167.5μg/g，总计3220.6μg/g。可见发酵后发酵液冻干粉中黄酮糖苷含量为964.3μg/g；发酵前黄酮苷元的含量为2256.3μg/g。
固形物持水力检测：豆皮发酵后发酵液冻干粉中的固形物持水力为2.12g/g。
乳酸菌活菌数：5.2×106cfu/g；马克思克鲁维酵母菌活菌数2.1×105cfu/g。
试验例3
按照实施例1的方法配制豆皮培养基，原料均取自同一批次。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌1:3的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为2％，搅拌均匀后于38℃静置保温5h。
按照实施例1所述的方法检测黄酮糖苷和黄酮苷元的含量、固形物的持水力和发酵后发酵液冻干粉中活菌数检测，结果分别为：
发酵后发酵液冻干粉中：D为751.8μg/g，G为889.4μg/g，De为766.0μg/g，Ge为849.5μg/g，总计3256.7μg/g。可见发酵后发酵液冻干粉中黄酮糖苷含量为1641.2μg/g；发酵前黄酮苷元的含量为1615.5μg/g。
固形物持水力检测：豆皮发酵后发酵液冻干粉中的固形物持水力为1.83g/g。
乳酸菌活菌数：4.6×105cfu/g。
试验例4
按照实施例1的方法配制豆皮培养基，原料均取自同一批次。
将菌粉按照德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌和马克思克鲁维酵母为1:3:2的重量比混合后接种于豆皮培养基中，接种量为3％，搅拌均匀后于38℃静置保温5h。
按照实施例1所述的方法检测黄酮糖苷和黄酮苷元的含量、固形物的持水力和发酵后发酵液冻干粉中活菌数检测，结果分别为：
发酵后发酵液冻干粉中：D为608.3μg/g，G为699.1μg/g，De为894.7μg/g，Ge为947μg/g，总计3149.1μg/g。可见发酵后发酵液冻干粉中黄酮糖苷含量为1307.4μg/g；发酵前黄酮苷元的含量为1841.7μg/g。
固形物持水力检测：豆皮发酵后发酵液冻干粉中的固形物持水力为1.90g/g。
乳酸菌活菌数：4.8×105cfu/g；马克思克鲁维酵母菌活菌数8.1×102cfu/g。
试验例5
按照实施例1的方法配制豆皮培养基，原料均取自同一批次。
将马克思克鲁维酵母接种于豆皮培养基中，接种量为1％，33℃下通气搅拌48h。
按照实施例1所述的方法检测黄酮糖苷和黄酮苷元的含量、固形物的持水力和发酵后发酵液冻干粉中活菌数检测，结果分别为：
发酵后发酵液冻干粉中：D为836.2μg/g，G为968.8μg/g，De为666.1μg/g，Ge为707.4μg/g，总计3178.5μg/g。可见发酵后发酵液冻干粉中黄酮糖苷含量为1805.0μg/g；发酵前黄酮苷元的含量为1373.5μg/g。
固形物持水力检测：豆皮发酵后发酵液冻干粉中的固形物持水力为2.14g/g。
马克思克鲁维酵母菌活菌数5.2×104cfu/g。
与实施例1相比可见，由试验例1-5制备的发酵液冻干粉中总黄酮苷元出现不同程度降低，固形物持水力略微降低，以德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌为代表的乳酸菌或马克思克鲁维酵母活菌数明显降低。
实施例12
取50g发酵液(实施例1，发酵液固形物含量19.6％)，加入60g大豆蛋白、5g胶原肽、5g可溶性膳食，加入的过程中不断搅拌使其混合均匀，直至含水量至25％，加热干燥至含水量<5％，即得。其中，可溶性膳食纤维为抗性糊精、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为1：1：0.2。其中黄酮苷元的含量为381mg/g。
实施例13
将20g发酵液冻干粉(实施例1)、60g大豆蛋白、5g胶原肽、5g可溶性膳食混合，即得。其中，可溶性膳食纤维包括：聚葡萄糖、抗性糊精、果胶、魔芋粉、低聚果糖、菊粉、低聚木糖，质量混合比例为1：1：0.1：0.1：0.3：0.5：0.1。其中黄酮苷元的含量为663mg/g。
实施例14血糖控制实验
取50只实验小鼠，禁食16h，按照190mg/kg剂量腹腔注射四氧嘧啶生理盐水溶液，72h后，尾静脉采血测空腹血糖(禁食5h)，取血糖值在10-28mmol/L的造模成功小鼠24只，按血糖值、体重随机分成4组，分别为模型组(普通饲料)、组合物组(实施例13)，发酵液冻干粉组(实施例1)，其他成分组(与实施例13相比不含发酵液冻干粉)；正常小鼠作为对照组(普通饲料)，每组6只。小鼠分笼饲养，每只每天提供饲料10g，自由饮水，每周称体重1次。实验开始前给全部小鼠喂食普通饲料，实验开始后分组给小鼠提供不同饲料，直至实验结束。实验周期6周，在实验2、4、6周末尾静脉采血，测空腹血糖。血糖采用强生OneTouch UltraTM血糖仪测定。
其中，各组饲料情况如下：
模型组：普通饲料，玉米40g、豆饼29g、麸皮25g、食盐1g、鱼粉2g、猪多维0.125g，料水比1:1，挤出成型后，烘干。
组合物组：60g实施例13的混粉、麸皮25g、食盐1g、鱼粉2g、猪多维0.125g，料水比1:1，挤出成型后，烘干。
发酵液冻干粉组：60g实施例1中的发酵液冻干粉、麸皮25g、食盐1g、鱼粉2g、猪多维0.125g，料水比1:1，挤出成型后，烘干。
其他成分组：与组合物组相比，饲料组成中不再含有发酵液冻干粉，料水比1:1，挤出成型后，烘干。
对照组：同模型组。
结果：造模后小鼠“三多一少”即多饮多食多尿、体重减轻症状明显，组合物组和发酵物冻干粉组随着实验进程上述症状得到缓解。实验中，模型组有2只小鼠因糖尿病死亡。各组小鼠不同阶段的空腹血糖值如下表所示。
表1饲料对糖尿病小鼠空腹血糖值的影响
与饲料干预前相比，△p＜0.05，△△p＜0.01；与模型组比较，**p＜0.01。
结果表明，在给药6周末，组合物组能够稳定糖尿病小鼠的空腹血糖，降低糖尿病小鼠空腹血糖值，基本能恢复对照组正常小鼠的血糖水平。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种黄酮的发酵物的发酵方法，所述方法包括：在灭菌的豆皮培养基中接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行一阶静态发酵，然后接种马克思克鲁维酵母通气搅拌进行二阶发酵；
所述保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例为1-9:3；
所述灭菌豆皮的条件为：在60-130℃温度下灭菌10-40min；
所述豆皮选自赤小豆、赤豆、绿豆、黑豆、花豆、青豆和黄豆中的一种或多种；
所述豆皮培养基的组成为：7-20％豆皮、0.5-5％乳糖、0.05-0.5％柠檬酸钠、0.02-0.5％醋酸钠、0.5-9％脱脂奶粉和水；
所述保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的接种量为2-5％；
所述一阶静态发酵的温度为38-44℃，发酵时间为5-24h；
待一阶发酵至pH降到4-5时，接种马克思克鲁维酵母；
所述马克思克鲁维酵母的接种量为1-3％；
所述二阶发酵的温度为25-45℃，发酵时间为48-96h。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述二阶发酵的温度为33-35℃。
3.权利要求1或2所述的发酵方法发酵得到的发酵物。
4.一种组合物，其含有权利要求3所述的发酵物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，还包括大豆蛋白、胶原肽和可溶性膳食纤维。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述发酵物、大豆蛋白、胶原肽和可溶性膳食纤维的混合比例：10-30重量份的发酵物、40-90重量份的大豆蛋白、1-8重量份的胶原肽以及0.5-15重量份的可溶性膳食纤维。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述可溶性膳食纤维选自聚葡萄糖、抗性糊精、果胶、魔芋粉、低聚果糖、菊粉、低聚木糖中的一种或多种。
8.权利要求3所述的发酵物或权利要求4-7任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。
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