CN109402000A - 一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其筛选方法和富含活性黄酮苷元酸奶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产β‑葡萄糖苷酶乳酸菌及其筛选方法和富含活性黄酮苷元酸奶的制备方法，特点是该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种PDD‑1株，于2018年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953，其味酸奶制备方法为将大豆的植物提取物大豆异黄酮粉和蔗糖按一定比例加入纯牛奶中，杀菌，接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂及能产生β‑葡萄糖苷酶的植物乳酸菌发酵剂，混匀，发酵培养，冷却，即可制成富含活性黄酮苷元这一功能因子的特色风味酸奶制品，优点是富含活性黄酮苷元功能因子，具有具有抗氧化、抗疲劳、增强机体免疫调节能力等作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌及其酸奶制备方法，尤其是涉及一种产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其筛选方法和功能酸奶的制备应用。
背景技术
β-葡萄糖苷酶主要来源是天然植物及微生物，而且不同来源的酶的性质也不同。即使在微生物体内，β-葡萄糖苷酶在细胞的水平上分布，但是不在特定的细胞器中，而是在各个细胞器中均有不同的分布，如细胞质、叶绿体、液泡等。此外，也可以通过微生物发酵提取法制备得到的发酵液中分离出β-葡萄糖苷酶。酵母、霉菌、细菌等均可以产此酶，其中曲霉、康氏木酶研究的较多，对来源于乳酸菌中的β-葡萄糖苷酶的研究相对来说较少。
黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的植物次级代谢产物，在植物界广泛存在。其在植物体内通常与糖类结合形成配基形式的苷类，少部分以游离态的苷元形式存在。黄酮类化合物不仅在植物的生长发育中起着重要作用，而且还具有抗癌、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎镇痛、抗心脑血管疾病、抗辐射、保肝和治疗骨质疏松等药理活性。因此，黄酮类化合物的研究一直是国内外生物类和医药类研究的热门课题。在自然界中，黄酮类物质多以糖苷类形式存在，少部分以游离性的苷元形式存在。但大部分的黄酮糖苷在人体内不能通过小肠壁进入血液，而是需要利用肠腔内益生菌（如乳酸菌和大肠杆菌）产生的水解酶，经过去糖基化反应后，转化成苷元才能被吸收进入血液。
黄酮苷元的膜渗透性强，容易透过肠黏膜细胞，相对于黄酮糖苷更易被人体吸收，因此，黄酮类化合通过技术手段将黄酮糖苷转化为相应的黄酮苷元，可大大提高其生物利用率。黄酮糖苷的转化方法有以下两类：化学法和生物转化法。生物转化是指利用生物体系作用于外源性底物，在适宜的培养条件下，使得生物体系对底物进行特异性结构修饰，从而产生结构改变。其中β-葡萄糖苷酶可以将黄酮糖苷类化合物转化为异黄酮苷元，由于大豆本身的β-葡萄糖苷酶的水解效率只有22%~29%，因此，通过酶法水解大豆异黄酮的研究具有重要意义。
酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质，经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品。在发酵过程中，鲜牛奶中的酪蛋白遇酸凝固，成为有弹性的凝块，颜色乳白、气味清香、酸甜可口。与牛乳相比，酸奶的营养成分更趋完善和更易消化吸收，内含的乳糖被部分分解成半乳糖和葡萄糖，后者进而转化为乳酸等有机酸，并且酸奶由于乳酸菌的发酵作用，在营养成分得到改善的同时，也产生了一些生理活性物质如有机酸、芳香物质、抗生物质、 SOD、细胞壁外多糖、活性酶、乳酸菌增殖因子及乳酸菌等，对机体功能有显著的调节作用，这些物质在维持肠道正常菌群平衡，调节肠道有益菌群达到正常水平、胆固醇含量降低、防衰老和延年益寿等方面都有重要的功能，因此酸奶是一种对人体十分有益的营养保健食品，对于酸奶的研究十分有意义，尤其是针对富含活性黄酮苷元酸奶的研究有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其筛选方法和富含活性黄酮苷元功能因子，具有抗癌、抗衰老、抗病毒和抗氧化自由基等功能的富含活性黄酮苷元酸奶的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）PDD-1株，于2018 年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953。
上述产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选方法，包括以下步骤：
（1）乳酸菌的筛选
挑选传统发酵食品泡菜为样品稀释后，涂布于含有溴甲酚紫的MRS固体培养基平板，静置，于37-43℃培养36-48h，挑选出呈黄色的菌落，将筛选得到具有典型乳酸菌特征的单一菌落初步定为乳酸菌，将初步确定的乳酸菌菌落在MRS固体培养基平板上反复划线几次，直至出现单一的形态一致的菌落为纯化后的乳酸菌；
（2）目标菌株的筛选
将步骤（1）筛选的得到的纯化后的乳酸菌涂布于含有七叶苷和柠檬酸铁的MRS固体培养基平板上，静置，于37-43℃条件下培养20-28h，挑选周围出现黑色水解斑的菌落，继续分离纯化至单一菌落，进行革兰氏染色和生理生化特性鉴定，选取革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶实验为阴性的单一菌落，即为产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）PDD-1株，于2018 年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953。
所述的含有溴甲酚紫的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，溴甲酚紫0.04g，琼脂粉10-20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可；所述的含有七叶苷和柠檬酸铁的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，七叶苷3g，柠檬酸铁0.3g，琼脂粉10-20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可。
利用上述产β-葡萄糖苷酶乳酸菌制备富含活性黄酮苷元酸奶的方法，包括以下步骤：
（1）菌株的活化：在无菌操作条件下，将德氏乳杆菌保加利亚亚种（BNCC336436或BNCC186626或BNCC138500或BNCC187941）和嗜热链球菌（BNCC187932 或BNCC186629或BNCC175966或BNCC175937）、权利要求1所述的植物乳杆菌植物亚种分别接种于MRS液体培养基中，分别在35-38℃的培养箱中培养20-28小时；
（2）乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌按质量比1:1的比例混合后得到的混合菌种和植物乳杆菌植物亚种在无菌操作条件下，分别按体积比4-6%的接种量接种于经巴氏杀菌后冷却至37-40℃的纯牛奶中，在34-40℃保温箱中培养3-6h，制成第一发酵剂和第二发酵剂；
（3）大豆异黄酮牛奶液的制备：以pH5-8的纯牛奶体积为基准，按质量比添加大豆异黄酮粉 0.1-0.5%和蔗糖 4-8%，混合均匀，制成大豆异黄酮牛奶液；
（4）接种发酵剂发酵：将大豆异黄酮牛奶液进行杀菌处理后，按质量或体积比添加第一发酵剂5-8%和第二发酵剂3-7%，充分搅拌使其混合均匀后，置于发酵箱内，于温度为27-47℃，发酵处理4-8h得到发酵液；
（5）酸奶的成熟：将步骤（4）得到的发酵液移入4-8℃冰箱或冷藏室内，经6-12h发酵成熟后，制得富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品。
步骤（3）中纯牛奶pH为6。
步骤（4）中发酵温度为42℃，第二发酵剂接种量为5%。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌及其筛选方法和富含活性黄酮苷元酸奶的制备方法，将大豆的植物提取物大豆异黄酮粉和蔗糖按一定比例加入纯牛奶中，杀菌，接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵剂及能产生β-葡萄糖苷酶的植物乳酸菌发酵剂。在整体发酵过程中，嗜热链球菌能够分泌出乳糖酶，将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，除供给能源外，半乳糖可参与脑苷脂和神经物质的合成，有助于婴幼儿脑和神经系统的发育；植物乳杆菌分泌出β-葡萄糖苷酶，把黄酮苷类物质转化为易被肠道吸收的黄酮苷元，同时产生多糖等多功能因子，制得富含黄酮苷元、葡萄糖、半乳糖、各种维生素等功能因子的酸奶。本产品奶除了普通酸奶具有的维持肠道正常菌丛平衡、调节肠道有益菌群、降低胆固醇含量的作用外，由于富含活性黄酮苷元这一功能因子，本产品还具有抗癌、抗氧化自由基、抗病毒和抗衰老等保健功能，为特色风味的功能性酸奶开发提供一定的思路和启发，也为富含黄酮苷类的物质在食品中的运用探索了一条可行的道路。
一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)PDD-1株，于2018年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一、实验测定方法
1. 目标菌株产酶能力的测定
（1）七叶灵显色反应：称取4g琼脂置于100m1，pH值5.0，0.2 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，在121℃下湿热灭菌20 min。冷却至55-60℃左右。新鲜配制含0.2wt%七叶灵、0.6wt%FeC13水溶液100 ml，并水浴加热到50℃。将以上两种溶液混合并立即到入培养皿中，制备平板。冷却，打孔（孔径为0.3-0.6 cm左右，相互间的两孔距离要适宜）。分别将100uL液样品加入到小孔中，封好培养皿，置于37℃培养箱中保温一段时间后，将培养皿置于冰浴中。观察显色反应。根据黑色圈的直径大小初步判断产酶活的能力。
（2）pNP光密度标准曲线的绘制：
将对硝基苯酚（pNP）标准溶液稀释成4mmol/L的标品溶液，再配制不同浓度的对硝基苯酚溶液，定容至10mL（浓度分别为0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.03mmol/L、0.04mmol/L、0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.1mmol/L），分别量取不同浓度的pNP溶液2mL，加入2mL的1mol/L的Na2CO3溶液充分混匀，室温放置5min，在波长400nm条件下测定吸光度，以pNP浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，蒸馏水作对照。作线性回归，得方程：y=9.3757x+0.0046，相关系数R2=0.999。
（3）产酶活力的测定方法：
p-NPG法是以对硝基苯酚-β-葡萄糖苷为反应物，β-葡萄糖酶可以使其在酸性条件下水解成葡萄糖和对硝基苯酚，其中水解产物对硝基苯酚是有色物质，用比色法来测定乳酸菌产β-葡萄糖苷酶的活性。准确吸取100uL粗酶液，稀释适当的倍数，加入900uL的pH=6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，放在37℃水浴锅中预热10min，然后加入5mmol/L的p-NPG溶液（已经预热10min），混匀，在50℃恒温水浴锅中精确反应10min，最后加入1mL的1mol/L 的碳酸钠溶液终止反应，室温放置5min，在波长400nm的 条件下测定吸光值，其中用加热失去活性的酶液作为空白对照，做同样处理。
（4）粗酶液的制备及其定位：
将筛得的目标乳酸菌在MRS液体培养基中培养，37℃条件下培养到稳定期（OD600值估计），,取培养好的菌液2ml在8000r/min，4℃条件下离心，取上清为S1，用空白MRS作为对照。然后将第一次离心后的沉淀用配制好的缓冲液重悬2次后，置超声波破碎仪上进行破壁，离心取上清为S2，用缓冲液作为空白对照，同样在波长为400条件下测吸光值。测得的吸光度分别是AS1=0.358、AS2=0.0014，其中S2的吸光度值太小可忽略不计，即未测到。确定筛得的植物乳杆菌植物亚种产的β-葡萄糖苷酶是胞外酶。带入线性回归方程得到浓度分别为S1是0.0377mmol/L。酶活力计算公式如下：U=C×N/10×0.1，其中U:酶活力（IU/mL）；N:原酶液稀释倍数； 10：反应时间（min）；0.1：添加酶液体积（mL）。将上述测得的吸光度带入标准曲线得到的粗酶液的浓度，通过酶活力计算公式得到酶活力，即U=0.377 IU/mL。
2、酸奶中游离黄酮甘元含量的测定
黄酮苷元含量的测定方法采用高效液相色法，将大豆苷（daidzin）、染料木苷（genistin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）四种标准品分别配制成0.001mg/mL、0.005mg/mL、0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL浓度梯度的混合标准品溶液，经过0.45um的微孔滤膜后选择适用的液相色谱条件进行测定，以标准品浓度x（单位mg/mL）为横坐标，高效液相色谱法出峰面积y为纵坐标，计算线性回归方程结果如下表1所示：
表1 标准品线性回归方程结果
。
按照上述步骤发酵的酸奶，搅拌均匀取1ml发酵好的酸奶样品，吸取3ml乙酸乙酯与其混合，涡旋30s后，超声10-15min，在转速为6000r，4℃的条件下离心5min，取乙酸乙酯层（即上层液封）放入超声洗净的玻璃试管中，将试管放在80℃的水浴锅中水浴至乙酸乙酯（乙酸乙酯的沸点是77℃）挥发完全。取500μL甲醇复溶，过滤膜，选择上述标准曲线同样的色谱条件过高效液相色谱仪。设置不同发酵条件，分别测酸奶中的黄酮苷元的含量。以不产β-葡萄糖苷酶的实验室现有嗜酸乳杆菌（CICC6074）发酵的酸奶作为阴性对照。
二、具体实施例
实施例1
一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）PDD-1株，于2018 年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953。
实施例2
上述实施例1中产β-葡萄糖苷酶乳酸菌其筛选方法，包括以下步骤：
（1）乳酸菌的初步筛选
挑选传统发酵食品泡菜为样品稀释后，涂布于含有溴甲酚紫的MRS固体培养基平板，静置，于37-43℃培养36-48h，挑选出呈黄色的菌落，将筛选得到具有典型乳酸菌特征的单一菌落初步定为乳酸菌，将初步确定的乳酸菌菌落在MRS固体培养基平板上反复划线几次，直至出现单一的形态一致的菌落为纯化后的乳酸菌；其中含有溴甲酚紫的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，溴甲酚紫0.04g，琼脂粉10~20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可；含有七叶苷和柠檬酸铁的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，七叶苷3g，柠檬酸铁0.3g，琼脂粉10~20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可；
（2）目标菌株的筛选
将步骤（1）初步得到的纯化后的乳酸菌涂布于含有七叶苷和柠檬酸铁的MRS固体培养基平板上，静置，于37-43℃条件下培养20-28h，挑选周围出现黑色水解斑的菌落，继续分离纯化至单一菌落，进行革兰氏染色和生理生化特性鉴定，选取革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶实验为阴性的单一菌落，即为产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，进行-80℃冷冻保藏。该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）PDD-1株，于2018 年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953。
实施例3
一种利用实施例1或实施例2筛选得到的产β-葡萄糖苷酶乳酸菌制备富含活性黄酮苷元的特色风味酸奶的方法，包括以下步骤：
（1）菌株的活化：在无菌操作条件下，将德氏乳杆菌保加利亚亚种（BNCC336436或BNCC186626或BNCC138500或BNCC187941）和嗜热链球菌（BNCC187932 或BNCC186629或BNCC175966或BNCC175937）、权利要求1所述的植物乳杆菌植物亚种分别接种于MRS液体培养基中，分别在36℃的培养箱中培养26小时；
（2）乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌按质量比1:1的比例混合后得到的混合菌种和植物乳杆菌植物亚种在无菌操作条件下，分别按体积比5%的接种量接种在经巴氏杀菌后冷却至39℃的纯牛奶中，在37℃保温箱中培养4h，制成第一发酵剂和第二发酵剂；
（3）大豆异黄酮牛奶液的制备：以pH5-8的纯牛奶体积为基准，按质量比添加大豆异黄酮粉0.3%和蔗糖 6%，混合均匀，制成大豆异黄酮牛奶液；纯牛奶的pH值优选为6；
（4）接种发酵剂发酵：将大豆异黄酮牛奶液进行杀菌处理后，按质量或体积比添加第一发酵剂7%和第二发酵剂5%，充分搅拌使其混合均匀后，置于发酵箱内，于温度为35℃，发酵处理6h得到发酵液；
（5）酸奶的成熟：将步骤（4）得到的发酵液移入6℃冰箱或冷藏室内，经9h发酵成熟后，制得富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品。
对照组制备方法同上，其区别在于以不产β-葡萄糖苷酶的实验室现有嗜酸乳杆菌（CICC6074）代替保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌植物亚种，制备得到的酸奶为对照组，酸奶中的黄酮苷元含量：对照组为0.051mg/ml，实验组为0.19mg/ml。
实施例4
同上述实施例3，其区别在于：
步骤（1）中将德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌和植物乳杆菌植物亚种分别接种于MRS液体培养基中，分别在35℃的培养箱中培养28小时；
步骤（2）乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的混合菌种和植物乳杆菌植物亚种在无菌操作条件下，分别按体积比6%的接种量接种于37℃的纯牛奶中，在34℃保温箱中培养6h，制成第一发酵剂和第二发酵剂；
步骤（3）中纯牛奶按质量比添加大豆异黄酮粉 0.1%和蔗糖 4%，混合均匀，制成大豆异黄酮牛奶液；
步骤（4）中将大豆异黄酮牛奶液进行杀菌处理后，按质量或体积比添加第一发酵剂5%和第二发酵剂3%，充分搅拌使其混合均匀后，置于发酵箱内，于温度为32℃，发酵处理8h得到发酵液；
步骤（5）中将发酵液移入4℃冰箱或冷藏室内，经12h发酵成熟后，制得富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品。
对照组制备方法同上，其区别在于以不产β-葡萄糖苷酶的实验室现有嗜酸乳杆菌（CICC6074）代替保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌植物亚种，制备得到的酸奶为对照组，酸奶中的黄酮苷元含量：对照组为0.0484mg/ml，实验组为0.114mg/ml。
实施例5
同上述实施例3，其区别在于：
步骤（1）中将德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌和植物乳杆菌植物亚种分别接种于MRS液体培养基中，分别在38℃的培养箱中培养20小时；
步骤（2）乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌组成的混合菌种和植物乳杆菌植物亚种在无菌操作条件下，分别按体积比4%的接种量接种于40℃的纯牛奶中，在40℃保温箱中培养3h，制成第一发酵剂和第二发酵剂；
步骤（3）中纯牛奶按质量比添加大豆异黄酮粉 0.5%和蔗糖 8%，混合均匀，制成大豆异黄酮牛奶液；
步骤（4）中将大豆异黄酮牛奶液进行杀菌处理后，按质量或体积比添加第一发酵剂8%和第二发酵剂7%，充分搅拌使其混合均匀后，置于发酵箱内，于温度为39℃，发酵处理4h得到发酵液；
步骤（5）中将发酵液移入8℃冰箱或冷藏室内，经6h发酵成熟后，制得富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品。
对照组制备方法同上，其区别在于以不产β-葡萄糖苷酶的实验室现有嗜酸乳杆菌（CICC6074）代替保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌植物亚种，制备得到的酸奶为对照组，酸奶中的黄酮苷元含量：对照组为0.05mg/ml，实验组0.142mg/ml。
三、对比试验
1、纯牛奶pH优化试验
富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品的制备方法同上述实施例3，其区别在于：步骤（3）中调节纯牛奶pH为4、5、6、7、8；pH=4时因酸度过高，牛奶无法正常发酵，根据由实验组和对照组差值这一指标以及HPLC结果得到pH=6时，菌株转化的游离型的黄酮苷元的含量最高，根据色谱图中的峰面积代入标准曲线中得到黄酮苷元的浓度（单位是mg/mL）如下表2所示：
表2 对照组和实验组得到黄酮苷元（单位:mg/mL）含量
对照组制备方法同上述实施例3，其区别在于以不产β-葡萄糖苷酶的实验室现有嗜酸乳杆菌（CICC6074）代替保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌植物亚种。
2、酸奶发酵温度优化
富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品的制备方法同上述实施例3，其区别在于：步骤（4）中发酵温度为27℃、32℃、37℃、42℃、47℃，根据由实验组和对照组差值这一指标以及HPLC结果得到42℃时菌株发酵的酸奶中游离型的黄酮苷元的转化含量最高，根据色谱图中的峰面积代入标准曲线中得到黄酮苷元的浓度（单位是mg/mL）如下表3所示：
表3 对照组和实验组得到黄酮苷元（单位:mg/mL）含量
对照组制备方法同上述实施例3，其区别在于以不产β-葡萄糖苷酶的实验室现有嗜酸乳杆菌（CICC6074）代替保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌植物亚种。
3、产酶乳酸菌接种量优化
富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品的制备方法同上述实施例3，其区别在于：步骤（4）中第二发酵剂接种量为1%、3%、5%、7%、9%，根据由实验组和对照组差值这一指标以及HPLC色谱图结果可得到最佳接种量为5%，且发酵的酸奶中游离型黄酮苷元的含量最高。根据色谱图中的峰面积代入标准曲线中得到黄酮苷元的浓度（单位是mg/mL）如下表4所示：
表4 对照组和实验组得到黄酮苷元（单位:mg/mL）含量
对照组制备方法同上述实施例3，其区别在于以不产β-葡萄糖苷酶的实验室现有嗜酸乳杆菌（CICC6074）代替保藏编号为CGMCC No.15953的植物乳杆菌植物亚种。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一株产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，其特征在于：该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）PDD-1株，于2018 年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953。
2.一种权利要求1所述的产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）乳酸菌的筛选
挑选传统发酵食品泡菜为样品稀释后，涂布于含有溴甲酚紫的MRS固体培养基平板，静置，于37-43℃培养36-48h，挑选出呈黄色的菌落，将筛选得到具有典型乳酸菌特征的单一菌落初步定为乳酸菌，将初步确定的乳酸菌菌落在MRS固体培养基平板上反复划线几次，直至出现单一的形态一致的菌落为纯化后的乳酸菌；
（2）目标菌株的筛选
将步骤（1）筛选的得到的纯化后的乳酸菌涂布于含有七叶苷和柠檬酸铁的MRS固体培养基平板上，静置，于37-43℃条件下培养20-28h，挑选周围出现黑色水解斑的菌落，继续分离纯化至单一菌落，进行革兰氏染色和生理生化特性鉴定，选取革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶实验为阴性的单一菌落，即为产β-葡萄糖苷酶乳酸菌，该乳酸菌分类命名为植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）PDD-1株，于2018 年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15953。
3.根据权利要求1所述的一种产β-葡萄糖苷酶乳酸菌的筛选方法，其特征在于所述的含有溴甲酚紫的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，溴甲酚紫0.04g，琼脂粉10-20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可；所述的含有七叶苷和柠檬酸铁的MRS固体培养基的配制方法如下：将MRS肉汤52.24g，七叶苷3g，柠檬酸铁0.3g，琼脂粉10-20g，溶于1L蒸馏水中，于121℃灭菌20min即可。
4.一种利用权利要求1所述的产β-葡萄糖苷酶乳酸菌制备富含活性黄酮苷元酸奶的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）菌株的活化：在无菌操作条件下，将德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌、权利要求1所述的植物乳杆菌植物亚种分别接种于MRS液体培养基中，分别在35-38℃的培养箱中培养20-28小时；
（2）乳酸菌发酵剂的制备：将活化后的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌按质量比1:1的比例混合后得到的混合菌种和植物乳杆菌植物亚种在无菌操作条件下，分别按体积比4-6%的接种量接种于经巴氏杀菌后冷却至37-40℃的纯牛奶中，在34-40℃保温箱中培养3-6h，制成第一发酵剂和第二发酵剂；
（3）大豆异黄酮牛奶液的制备：以pH5-8的纯牛奶体积为基准，按质量比添加大豆异黄酮粉 0.1-0.5%和蔗糖 4-8%，混合均匀，制成大豆异黄酮牛奶液；
（4）接种发酵剂发酵：将大豆异黄酮牛奶液进行杀菌处理后，按质量或体积比添加第一发酵剂5-8%和第二发酵剂3-7%，充分搅拌使其混合均匀后，置于发酵箱内，于温度为27-47℃，发酵处理4-8h得到发酵液；
（5）酸奶的成熟：将步骤（4）得到的发酵液移入4-8℃冰箱或冷藏室内，经6-12h发酵成熟后，制得富含活性黄酮苷元功能因子的风味酸奶制品。
5.根据权利要求4所述的富含活性黄酮苷元酸奶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中纯牛奶pH为6。
6.根据权利要求4所述的富含活性黄酮苷元酸奶的制备方法，其特征在于：步骤（4）中发酵温度为42℃，第二发酵剂接种量为5%。
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