CN113558193A - 一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，包括以下步骤：1)高产β‑葡萄糖苷酶的重组乳酸菌的构建；2)大豆相关原料的预处理，接种重组乳酸菌进行发酵，灭菌和罐装。本发明利用基因工程技术对乳酸菌进行改造，避免传统技术的盲目性，减少大量筛选检测工作，获得高产β‑葡萄糖苷酶的重组乳酸菌，促使乳酸菌在发酵过程中大量产生β‑葡萄糖苷酶，极大促进糖苷型大豆异黄酮向苷元型大豆异黄酮的转化，为制作富含大豆异黄酮苷元的功能性饮料提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，涉及一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法。
背景技术
大豆异黄酮是豆科植物生长过程中形成的双酚次级代谢产物，其由于具有与哺乳动物雌激素内源性雌二醇相似的结构和功能，可以通过与雌激素受体相互作用，起到预防更年期妇女心血管疾病、骨质疏松等作用。除此之外大豆异黄酮还具有抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇等多种生理活性。然而大豆中97％～98％的异黄酮是以结合型糖苷的形式存在，糖苷型大豆异黄酮由于分子量高，亲水性强，因此不能通过小肠壁进入血液被人体有效吸收利用，而是需要经过去糖基化反应后，转化成苷元才能被吸收进入血液。
目前研究发现，乳酸菌在发酵过程中能够产生β-葡萄糖苷酶，促进糖苷型大豆异黄酮转变为苷元型大豆异黄酮。同时乳酸菌作为人体肠道益生菌，其发酵饮品随着人们饮食习惯向绿色健康饮食转变而越来越受到人们的喜爱。因此若能得到高产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌，并利用其对大豆相关产品进行发酵，从而获得富含大豆异黄酮苷元的功能性发酵饮料，该技术将具有广阔的应用前景和经济效益。
CN112574905A发明专利中从桂林腐乳传统生产工艺所用酸浆水中分离出一种德氏乳杆菌并用于发酵豆乳饮料，该菌可高效转化糖苷型大豆异黄酮。CN109402000A发明专利从传统发酵食品泡菜中筛选分离出一种植物乳杆菌并用于制备酸奶，该菌也可高产β-葡萄糖苷酶。但是上述技术都存在大量的筛选检测步骤，工作量大且繁琐。
因此，有必要研发一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法来获得高品质的富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料。
发明内容
本发明目的是提供一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，该方法包括：
(1)根据乳酸乳球菌β-葡萄糖苷酶的基因组DNA序列设计PCR引物；
(2)使用DNAiso从乳酸乳球菌中提取乳酸乳球菌基因组DNA；
(3)将所述乳酸乳球菌基因组DNA作为反应模板，用所述PCR引物通过PCR仪扩增，使高拷贝数的β-葡萄糖苷酶DNA片段与酶切成功的质粒相连，再转入大肠杆菌进行后续的扩增、鉴定，获得阳性质粒；
(4)将所述阳性质粒电转到乳酸菌株中，获得高产β-葡萄糖苷酶的重组乳酸菌；
(5)以大豆为原料的产物作为接种原料，接种所述重组乳酸菌，进行发酵，灭菌和灌装，即得富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料。
进一步的，步骤(1)中，所述PCR引物的正向为：GAAGATCTATGGATGAACTGGCGT；所述PCR引物的反向为：CCATCGATTTATTGCACCTTGG。
进一步的，所述PCR引物的正向酶切位点为BglII；所述PCR引物的反向酶切位点为ClaI。
进一步的，步骤(4)中，所述电转条件为：200V，200Ω，电容25μF，时间5ms。
进一步的，步骤(5)中，所述重组乳酸菌的接种量为2～6％(mg/ml)。
进一步的，所述重组乳酸菌的接种量为4％(mg/ml)。
进一步的，步骤(5)中，所述发酵的温度为30℃～40℃，时间为10h～18h。
进一步的，所述发酵的温度为37℃，时间为12h。
进一步的，所述以大豆为原料的产物作为接种原料具体为：以豆浆或者豆制品制作过程中形成的黄浆水为接种原料。
本发明提供了一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，将乳酸菌通过基因工程技术进行改造，避免了传统技术的盲目性，同时不需要繁琐的筛选检测工作。获得的重组乳酸菌用于制备大豆发酵饮料，极大程度上将难吸收的糖苷型大豆异黄酮转化为易吸收的苷元型大豆异黄酮，该类益生菌发酵功能性饮料为豆制品厂家开发相关产品提供了新思路，具有广阔的应用前景和经济意义。
附图说明
图1为本发明所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法在实施例1中重组乳酸乳球菌发酵黄浆水过程中pH随时间的变化趋势图；
图2为本发明所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法在实施例1中原始/重组乳酸乳球菌发酵黄浆水12h大豆异黄酮比较示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)查询乳酸乳球菌β-葡萄糖苷酶的基因组DNA(基因序列见GeneBank(Accession:M60178.1)公布的L.lactis MG1363Usp45)，根据该DNA序列设计PCR引物，引物为正向:GAAGATCTATGGATGAACTGGCGT(BglII)反向：CCATCGATTTATTGCACCTTGG(ClaI)，括号里面为酶切位点。
(2)接着使用DNAiso从乳酸乳球菌中提取基因组DNA。
(3)将该基因组DNA作为反应模板，用设计好的引物通过PCR仪扩增，所得的高拷贝数的β-葡萄糖苷酶DNA片段与酶切成功的质粒相连，转入大肠杆菌进行后续的扩增、鉴定，获得阳性质粒。
(4)接着将该阳性质粒电转到乳酸菌株中，最终获得高产β-葡萄糖苷酶的重组乳酸菌。
(5)以豆浆或者豆制品制作过程中形成的黄浆水为原料，按2～6％(mg/ml)的接种量接种重组乳酸菌，在温度为30℃～40℃，时间为10h～18h的条件下进行发酵，灭菌和灌装，即得富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法：
(1)查阅乳酸乳球菌β-葡萄糖苷酶的基因组DNA(基因序列见GeneBank(Accession:M60178.1)公布的L.lactis MG1363Usp45)，并根据该DNA片段设计引物序列正向:GAAGATCTATGGATGAACTGGCGT(BglII)反向：CCATCGATTTATTGCACCTTGG(ClaI)。
(2)使用DNAiso提取乳酸乳球菌的基因组DNA，以全基因组DNA为模板，加入Takara公司的试剂，引物进行PCR扩增，反应体系为95℃5min，95℃30s 72℃2min 35个循环，72℃10min，16℃终止反应，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳S，用AxyGEN公司凝胶回收试剂盒进行纯化。
(3)用Takara公司的BglII、ClaI两种酶对表达载体Pet28a(+)酶切，将得到产物进行凝胶回收纯化，所得产物以3比1的比例和第(2)步中获得的扩增片段用DNA连接酶混匀，放入PCR仪中连接，反应体系为16℃连接3个小时。
(4)将步骤(3)所得PCR产物用热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在大肠杆菌LB培养板里均匀涂开，放入37℃培养箱中培养16-24h。挑取单克隆进行摇菌。
(5)摇出的菌进行质粒抽提，加入BglII、ClaI两种酶对所得质粒酶切4h，用琼脂糖凝胶电泳观察是否能切出DNA片段以及载体大小的条带，若能，送生工测序。测序正确即为阳性克隆，进行下一步实验。
(6)将所得阳性质粒电转至乳酸乳球菌中获得重组乳酸乳球菌，并通过七叶苷平板法检测葡萄糖苷酶活性。电转条件为：200V，200Ω，电容25μF，时间5ms。
(7)以4％的接菌量向黄浆水中接入重组乳酸菌，在37℃条件下发酵12h，所得发酵液进行灭菌和罐装，获得富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料。
图1为本发明所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法在实施例1中重组乳酸乳球菌发酵黄浆水过程中pH随时间的变化趋势图。
如图1所示，制备得到的重组乳酸菌能够在黄浆水中正常生长繁殖，对黄浆水进行发酵。图2为本发明所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法在实施例1中原始/重组乳酸乳球菌发酵黄浆水12h大豆异黄酮比较示意图，其中，四个异黄酮标准品包括：糖苷型大豆异黄酮大豆苷及染料木苷，苷元型大豆异黄酮大豆苷元及染料木素，原始乳酸乳球菌及重组乳酸乳球菌，从图2中可以看出与原始乳酸乳球菌相比，重组乳酸乳球菌发酵以后苷元型大豆异黄酮的含量明显增加，证明制备得到的重组乳酸菌能够高效转化糖苷型大豆异黄酮为苷元型大豆异黄酮。
实施例2
大豆除杂、清洗、浸泡、打浆、去渣后煮沸获得豆浆，利用重组乳酸菌对豆浆进行发酵，其余步骤与实施例1相同。
实施例3
富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法：
(1)查阅乳酸乳球菌β-葡萄糖苷酶的基因组DNA(基因序列见GeneBank(Accession:M60178.1)公布的L.lactis MG1363Usp45)，并根据该DNA片段设计引物序列正向:GAAGATCTATGGATGAACTGGCGT(BglII)反向：CCATCGATTTATTGCACCTTGG(ClaI)。
(2)使用DNAiso提取乳酸乳球菌的基因组DNA，以全基因组DNA为模板，加入Takara公司的试剂，引物进行PCR扩增，反应体系为95℃5min，95℃30s 72℃2min 35个循环，72℃10min，16℃终止反应，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，用AxyGEN公司凝胶回收试剂盒进行纯化。
(3)用Takara公司的BglII、ClaI两种酶对表达载体Pet28a(+)酶切，将得到产物进行凝胶回收纯化，所得产物以3比1的比例和第(2)步中获得的扩增片段用DNA连接酶混匀，放入PCR仪中连接，反应体系为16℃连接3个小时。
(4)将步骤(3)所得PCR产物用热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在大肠杆菌LB培养板里均匀涂开，放入37℃培养箱中培养16-24h。挑取单克隆进行摇菌。
(5)摇出的菌进行质粒抽提，加入BglII、ClaI两种酶对所得质粒酶切4h，用琼脂糖凝胶电泳观察是否能切出DNA片段以及载体大小的条带，若能，送生工测序。测序正确即为阳性克隆，进行下一步实验。
(6)将所得阳性质粒电转至乳酸乳球菌中获得重组乳酸乳球菌，并通过七叶苷平板法检测葡萄糖苷酶活性。电转条件为：200V，200Ω，电容25μF，时间5ms。
(7)以2％的接菌量向黄浆水中接入重组乳酸菌，在30℃条件下发酵10h，所得发酵液进行灭菌和罐装，获得富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料。
实施例4
富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法：
(1)查阅乳酸乳球菌β-葡萄糖苷酶的基因组DNA(基因序列见GeneBank(Accession:M60178.1)公布的L.lactis MG1363Usp45)，并根据该DNA片段设计引物序列正向:GAAGATCTATGGATGAACTGGCGT(BglII)反向：CCATCGATTTATTGCACCTTGG(ClaI)。
(2)使用DNAiso提取乳酸乳球菌的基因组DNA，以全基因组DNA为模板，加入Takara公司的试剂，引物进行PCR扩增，反应体系为95℃5min，95℃30s 72℃2min 35个循环，72℃10min，16℃终止反应，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，用AxyGEN公司凝胶回收试剂盒进行纯化。
(3)用Takara公司的BglII、ClaI两种酶对表达载体Pet28a(+)酶切，将得到产物进行凝胶回收纯化，所得产物以3比1的比例和第(2)步中获得的扩增片段用DNA连接酶混匀，放入PCR仪中连接，反应体系为16℃连接3个小时。
(4)将步骤(3)所得PCR产物用热激法转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，在大肠杆菌LB培养板里均匀涂开，放入37℃培养箱中培养16-24h。挑取单克隆进行摇菌。
(5)摇出的菌进行质粒抽提，加入BglII、ClaI两种酶对所得质粒酶切4h，用琼脂糖凝胶电泳观察是否能切出DNA片段以及载体大小的条带，若能，送生工测序。测序正确即为阳性克隆，进行下一步实验。
(6)将所得阳性质粒电转至乳酸乳球菌中获得重组乳酸乳球菌，并通过七叶苷平板法检测葡萄糖苷酶活性。电转条件为：200V，200Ω，电容25μF，时间5ms。
(7)以6％的接菌量向黄浆水中接入重组乳酸菌，在40℃条件下发酵18h，所得发酵液进行灭菌和罐装，获得富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料。
综上所述，本发明所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，本发明利用基因工程技术对乳酸菌进行改造，避免传统技术的盲目性，减少大量筛选检测工作，获得高产β-葡萄糖苷酶的重组乳酸菌，促使乳酸菌在发酵过程中大量产生β-葡萄糖苷酶，极大促进糖苷型大豆异黄酮向苷元型大豆异黄酮的转化，为制作富含大豆异黄酮苷元的功能性饮料提供新思路。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (9)
1.一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)根据乳酸乳球菌β-葡萄糖苷酶的基因组DNA序列设计PCR引物；
(2)使用DNAiso从乳酸乳球菌中提取乳酸乳球菌基因组DNA；
(3)将所述乳酸乳球菌基因组DNA作为反应模板，用所述PCR引物通过PCR仪扩增，使高拷贝数的β-葡萄糖苷酶DNA片段与酶切成功的质粒相连，再转入大肠杆菌进行后续的扩增、鉴定，获得阳性质粒；
(4)将所述阳性质粒电转到乳酸菌株中，获得高产β-葡萄糖苷酶的重组乳酸菌；
(5)以大豆为原料的产物作为接种原料，接种所述重组乳酸菌，进行发酵，灭菌和灌装，即得富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料。
2.根据权利要求1所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述PCR引物的正向为：GAAGATCTATGGATGAACTGGCGT；所述PCR引物的反向为：CCATCGATTTATTGCACCTTGG。
3.根据权利要求2所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述PCR引物的正向酶切位点为BglII；所述PCR引物的反向酶切位点为ClaI。
4.根据权利要求1所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述电转条件为：200V，200Ω，电容25μF，时间5ms。
5.根据权利要求1所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述重组乳酸菌的接种量为2～6％(mg/ml)。
6.根据权利要求5所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述重组乳酸菌的接种量为4％(mg/ml)。
7.根据权利要求1所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述发酵的温度为30℃～40℃，时间为10h～18h。
8.根据权利要求7所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：所述发酵的温度为37℃，时间为12h。
9.根据权利要求1所述的一种富含大豆异黄酮苷元的发酵饮料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述以大豆为原料的产物作为接种原料具体为：以豆浆或者豆制品制作过程中形成的黄浆水为接种原料。
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