CN107201324A - 一株产水解银杏黄酮苷的β‑葡萄糖苷酶产生菌及其筛选方法 - Google Patents

一株产水解银杏黄酮苷的β‑葡萄糖苷酶产生菌及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株产水解银杏黄酮苷的β‑葡萄糖苷酶产生菌，其特征在于：解淀粉芽孢杆菌QY2‑3。本发明直接从银杏树下土壤样品中筛选得到水解银杏黄酮苷的β‑葡萄糖苷酶的产生菌，为银杏黄酮苷元的工业化生产奠定基础，降低转化成本。

Description

一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌及其筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物及其筛选方法，特别是产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的解淀粉芽孢杆菌QY2-3及其筛选。
背景技术
我国研究的124种防治气管炎植物药中就有69种主要成分是黄酮类化合物，包括双氢黄酮、黄酮醇及其苷，大多是消炎、平喘、止咳的活性成分。银杏叶提取物中的酮类化合物作为天然药物有着越来越广泛的用途。
以干银杏叶为原料提取银杏黄酮类化合物制成的药物，对心血管、动脉硬化、脑血管、高血压等疾病，有其它天然药物不能达到的疗效。银杏叶提取物及其制剂适用于智力衰退、脑功能障碍、末梢血管血流障碍伴随的肢体血流不畅。槲皮素主要通过抑制促进肿瘤细胞生长的蛋白活性而抑制肿瘤的生长，在高温条件下槲皮素可显著抑制白血病细胞的生长，并诱导肿瘤细胞程序性死亡。潘苏华等报道提取的银杏叶中的异银杏双黄酮具有抗血小板黏附聚集作用，抑制血栓形成。章家胜等报道，银杏叶黄酮类化合物对心脑血管有保护作用，其作用与抑制膜脂质过氧化有关。
银杏叶提取物中的银杏黄酮虽然有这么多生物功能，不过银杏叶中的黄酮是以银杏黄酮苷形式存在的，欲使其在体内发挥有效作用需将其水解成银杏黄酮苷元形式。目前水解方法主要有化学法和酶法，但化学法选择性差，水解的同时破坏银杏叶提取物中的其它活性成分。而酶法由于选择性高反应条件温和而不破坏其它活性成分而受到学者的重视。
微生物的增殖比动、植物细胞更快，且初级代谢迅速、体内酶系相对较简单。基因转化表达、原生质体的融合和基因重组比动、植物细胞更容易获得成功，所以整个过程可实现连续化、自动化，其转化效率更高。随着科技的发展，微生物转化广泛应用于药物合成、食品添加剂、维生素、化妆品等方面。20世纪90年代以来，微生物转化技术成为手性药物不对称合成中重要的合成技术。在天然药物的分离提取及转化上，利用微生物转化能有效提高主要成分的提取及转化率，并能增加其生物利用度及生物活性。
涂绍勇等得出用微生物转化黄酮苷成为苷元是非常有效的手段，通过发酵条件的正交试验分析，黑曲霉A166转化沙棘黄酮苷生成苷元的最佳条件是：发酵时间96h、装液量为体积分数40％、温度30℃、转速180r/min，在此条件下，转化得到的异鼠李素为78mg/g，槲皮素为22mg/g，相对于发酵前的含量(异鼠李素0.36mg和槲皮素0.28mg)大大提高。伍毅等人采用固定商业β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷苷，取得了较好结果。但是，利用非商业β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷苷还未见报告或极少。由于商业β-葡萄糖苷酶价格昂贵，因此，本发明选择自己筛选产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的菌株，为银杏黄酮苷元的工业化生产奠定基础，降低转化成本。
发明内容
本发明旨在提供一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的解淀粉芽孢杆菌，以期将其用于水解银杏黄酮苷生成黄酮苷元。
本发明的又一目的在于提供上述水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选方法。
为达到上述目的，一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌，解淀粉芽孢杆菌QY2-3。该菌已于2017年03月20日包藏于中国典型培养物保藏中心，简称：CCTCC，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，保藏号：CCTCCM 2017134。
一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选方法，筛选方法包括以下步骤：
(1)从银杏树下土壤中采集菌株，经培养、分离纯化及革兰氏染色，挑选具有蓝色菌圈的菌株，斜面及甘油保藏备用；
(2)通过DNS法检测菌株β-葡萄糖苷酶酶活力，挑选酶活力较高菌株；
(3)用菌株发酵液转化银杏黄酮，通过高效液相色谱仪检测菌株对银杏黄酮的转化作用，具有转化作用的β-葡萄糖苷酶产生菌为目的菌株；进一步经生理生化和16SrRNA分子生物学鉴定此菌为解淀粉芽孢杆菌。
上述方法第(1)步中，所述采集菌株，经培养、分离纯化的做法是：采集样品，称取5g土壤样品，加入45ml灭菌备用的种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h；取上清液用0.85生理盐水稀释，分别取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度200ul于筛选培养基上涂布，分别于28℃和37℃下培养48h后，挑选蓝色菌圈较大颜色较深的单菌落进行纯化培养。经革兰氏染色镜检为单一菌种后，斜面保藏和甘油保藏备用。
上述方法第(2)步中，所述DNS法测定β-葡萄糖苷酶酶活的做法是：挑取一环斜面保藏的初筛菌株接入种子培养基中，30℃，180r/min培养24h，按照8％的接种量接入揺瓶发酵培养基中，30℃，180r/min培养48h，制备发酵液，发酵液经细胞破碎后，8000r/min，4℃离心10min，取上清液为粗酶液。取15ml具塞刻度试管加入底物(1％水杨苷)1.8mL，50℃预热3min，加入酶液0.2mL，50℃水浴30min，加入DNS试剂3mL，沸水浴10min，冷却定容至15mL。以灭活的酶液为空白对照，于540nm处测定吸光值。
上述方法第(3)步中，所述菌株发酵液转化银杏提取物的做法是：取发酵液液9mL，加入1mL银杏黄酮苷溶液，50℃，180r/min摇床振荡转化4h，0.45μm膜过滤后检测槲皮素含量。液相检测的做法是：用1％甲酸(A)和甲醇(B)进行梯度洗脱：0～3.0min 29-33％B,3.0～10.0min 33-33％B，10.0～10.5min 33-40％B，10.5～14.0min 40-40％B,14.0～16.0min 40-50％B,16.0～18.0min50-65％B,18.0～20.0min 65-75％B,20.0～20.5min75-100％B,20.5～23.0min 100-100％B,23.0～28min 100-29％B；流速为0.5mL/min，进样量5μL，柱温30℃。
本发明的人解淀粉芽孢杆菌QY2-3的β-葡萄糖苷酶酶活为0.88U/mL，具有转化银杏黄酮苷的作用。
本发明的有益效果：直接从银杏树下土壤样品中筛选得到水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶的产生菌，丰富了β-葡萄糖苷酶产生菌菌种资源，同时，也为银杏黄酮苷元的工业化生产奠定基础，降低转化成本。
附图说明
图1是葡萄糖浓度标准曲线；
图2是菌株QY2-3平板菌落形态；
图3是菌株QY2-3显微镜(100x)观察照；
图4是菌株QY2-3系统发育树。
具体实施方式
实施例筛选产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌：
1.样品采集与菌株的分离纯化
从贵州黔灵山公园银杏树下采集土壤样品，称取5g土壤样品，加入45ml灭菌备用的种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h；取上清液用0.85生理盐水稀释，分别取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度200ul于筛选培养基上涂布，分别于28℃和37℃下培养48h后，挑选蓝色菌圈较大颜色较深的单菌落进行纯化培养。经革兰氏染色镜检为单一菌种后，斜面保藏和甘油保藏备用。
2.β-葡萄糖苷酶酶活力测定
挑取一环斜面保藏的初筛菌株接入种子培养基中，30℃，180r/min培养24h，按照8％的接种量接入揺瓶发酵培养基中，30℃，180r/min培养48h，制备发酵液，发酵液经细胞破碎后，8000r/min，4℃离心10min，取上清液为粗酶液。取15ml具塞刻度试管加入底物(1％水杨苷)1.8mL，50℃预热3min，加入酶液0.2mL，50℃水浴30min，加入DNS试剂3mL，沸水浴10min，冷却定容至15mL。以灭活的酶液为空白对照，于540nm处测定吸光值。
酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟水解水杨苷产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位。
2.1葡萄糖标准曲线绘制
吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL于具塞刻度试管中，补水至2mL，加DNS试剂3mL，混合后于沸水中煮10min,冷却后加水定容至15mL，于分光光度计540nm波长下测吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖量为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为y＝0.465x-0.004，R2＝0.999(如图1所示)
3.银杏黄酮苷生物转化
粗酶液制备：从斜面培养基上挑取2环菌种，接种于50/250mL种子培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h，按8％接种量接种于发酵产酶培养基中，
30℃，180r/min振荡培养48h，发酵液经细胞破碎后，8000r/min，4℃，离心10min，取上清液为粗酶液。
取粗酶液9mL，加入1mL银杏黄酮苷溶液，50℃，180r/min摇床振荡转化4h，0.45μm膜过滤后检测槲皮素含量。
银杏黄酮苷高效液相色谱检测条件：用1％甲酸(A)和甲醇(B)进行梯度洗脱：0～3.0min 29-33％B,3.0～10.0min 33-33％B，10.0～10.5min 33-40％B，10.5～14.0min40-40％B,14.0～16.0min 40-50％B,16.0～18.0min 50-65％B,18.0～20.0min 65-75％B,20.0～20.5min 75-100％B,20.5～23.0min 100-100％B,23.0～28min 100-29％B；流速为0.5mL/min，进样量5μL，柱温30℃。
液相色谱检测表明QY2-3菌株的β-葡萄糖苷酶水解了银杏黄酮苷生成了相应的苷元。
4.菌落形态鉴定、生理生化鉴定及16SrRNA分子生物学鉴定
4.1菌株于筛选培养基平板上培养48h，观察并记录菌落形态、颜色。
4.2革兰氏染色：挑取平板上的菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、媒染、
脱色、水
洗、番红复染、干燥、镜检。
观察菌株的菌落形态特征，结果如图2，该菌株菌落有明显蓝色菌圈，凸起有褶皱，革兰氏染色后，于光学显微镜油镜下观察细胞形态特征，结果如图3。
4.3生理生化特征
QY2-3的生理生化特征如表1和表2所示
表1菌株QY2-3生理生化特性——碳源利用
备注：+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性
表2QY2-3生理生化特性—酶活、产酸
备注：+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性
4.4分子生物学鉴定
对菌株QY2-3进行16SrRNA基因序列测定，测定结果在NCBI上比对鉴定结果为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，构建QY2-3的系统发育树如图4所示。

Claims (5)

1.一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌，其特征在于：所述的菌为解淀粉芽孢杆菌QY2-3。
2.如权利要求1所述的一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选方法，其特征在于：筛选方法包括以下步骤：
(1)从银杏树下土壤中采集菌株，经培养、分离纯化及革兰氏染色，挑选具有蓝色菌圈的菌株，斜面及甘油保藏备用；
(2)通过DNS法检测菌株β-葡萄糖苷酶酶活力，挑选酶活力较高菌株；
(3)用菌株发酵液转化银杏黄酮，通过高效液相色谱仪检测菌株对银杏黄酮的转化作用，具有转化作用的β-葡萄糖苷酶产生菌为目的菌株；进一步经生理生化和16SrRNA分子生物学鉴定此菌为解淀粉芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选方法，其特征在于：上述方法第(1)步中，所述采集菌株，经培养、分离纯化的做法是：采集样品，称取土壤样品，加入灭菌备用的种子培养基中，震荡培养；取上清液用生理盐水稀释，分别取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度100ul～200ul于筛选培养基上涂布，分别于25℃-30℃和35℃-40℃下培养36-72h后，挑选蓝色菌圈较大颜色较深的单菌落进行纯化培养；经革兰氏染色镜检为单一菌种后，斜面保藏和甘油保藏备用。
4.根据权利要求2所述的一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选方法，其特征在于：上述方法第(2)步中，所述DNS法测定β-葡萄糖苷酶酶活的做法是：挑取一环斜面保藏的初筛菌株接入种子培养基中，培养，按照1％-10％的接种量接入揺瓶发酵培养基中，培养，制备发酵液，发酵液经细胞破碎后，离心，取上清液为粗酶液；取具塞刻度试管加入底物，预热，加入酶液，50℃水浴，加入DNS试剂，沸水浴，冷却定容至；以灭活的酶液为空白对照，于540nm处测定吸光值。
5.根据权利要求2所述的一株产水解银杏黄酮苷的β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选方法，其特征在于：上述方法第(3)步中，所述菌株发酵液转化银杏提取物的做法：取发酵液，加入银杏黄酮苷溶液，摇床振荡转化，膜过滤后检测槲皮素含量；液相检测的做法：用1％甲酸(A)和甲醇(B)进行梯度洗脱，流速为0.1mL/min-1mL/min，进样量5μL-20μL，柱温25℃-35℃。
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