KR100985702B1 - 페디오코커스 펜토사세우스에서 분리된 신규한 플라스미드및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8)에서 분리된 신규한 플라스미드 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pJW79 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 플라스미드 pJW79은 벡터로써 활용하여 다양한 방법으로 목적 단백질을 발현하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특히 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 헬리코박터피로리(Helicobacter pylori)등의 균에 강한 항균활성이 있는 페디오신을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

페디오코커스 펜토사세우스, 페디오신, 플라스미드

Description

페디오코커스 펜토사세우스에서 분리된 신규한 플라스미드 및 그의 용도{Novel plasmid isolated from Pediococcus pentosaceus and use thereof}

본 발명은 페디오코커스 펜토사세우스에서 분리된 신규한 플라스미드 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pJW79 및 그의 용도에 관한 것이다.

김치발효과정에 관여하는 유산균은 항균작용(Physicochemical Characteristics of Yogurt Prepared with Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi. Korean J. Food Culture. 20(3):337-340(2005)), 면역기능 강화, 혈중 콜레스테롤 저하, 간 기능 항진작용, 항암작용, 항산화작용 등의 다양한 건강 증진 기능이 보고되고 있다.

최근에는 유산균 특징 중에 생균 활성제라는 기능적인 측면에 관심이 모아지고 있어 항균 활성이 있는 유산균에 대한 연구가 활발한 실정이다. 특히 김치에 함유된 유산균 중 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주는 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 헬리코박터피로리(Helicobacter pylori)등의 균에 강한 항균 활성이 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 연구가 다양한 방 법으로 진행되고 있다.

상기 김치 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스가 분비하는 항균 펩타이드를 페디오신(pediocin)이라 하는데, 페디오코커스 펜토사세우스를 이용하여 상기 페디오신을 생산하는 방법에 대해서는 한국 특허공개공보(10-2006-0069984)에 기재된 바 있다. 그러나 페디오코커스 펜토사세우스에 함유된 어떠한 플라스미드가 상기와 항균활성을 나타내는지에 대해서는 구체적으로 알려진 바가 전혀 없다.

현재까지 페디오코커스 펜토사세우스 중 전체 게놈 서열이 알려진 것은 페디오코커스 펜토사세우스 ATCC 27745(GenBank accession number: NC_008525)이며, 상기 균주에 포함된 플라스미드 중 전체 염기서열이 밝혀진 경우는 pMD136(GenBank accession number: NC_001277)이 유일하다. 하지만 상기 플라스미드의 경우 페디오신 오페론을 포함하고 있지 않은 문제점이 있었다.

특히 페디오코커스 펜토사세우스에 함유된 구체적인 항균활성이 있는 플라스미드를 알아냄으로써 이를 벡터로 활용하면 다양한 방법으로 항균활성 물질 또는 다양한 목적 단백질을 대량 생산할 수 있기 때문에 산업적으로 활용가치가 높아 이에 관한 연구가 절실히 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 페디오코커스 펜토사세우스에 함유된 플라스미드 중에 항균활성 물질인 페디오신 오페론이 함유된 플라스미드를 분리하고 이의 서열번호 를 결정함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pJW79를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 플라스미드 pJW79에 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별 마커가 삽입된 클로닝 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 플라스미드 pJW79, 대장균의 복제 원점, 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 플라스미드 또는 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 플라스미드 pJW79를 이용하여 페디오신(pediocin)을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pJW79를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 플라스미드 pJW79에 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별 마커가 삽입된 클로닝 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 플라스미드 pJW79, 대장균의 복제 원점, 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡 터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 플라스미드 또는 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 플라스미드 pJW79를 이용하여 페디오신(pediocin)을 생산하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 용어 “플라스미드”는 당해 분야에 통상적으로 공지된 바와 같은 의미를 가지며, 즉 세균에 존재하는 환상의 비-염색체성 요소이다. 플라스미드의 제조, 플라스미드 DNA의 전달 및 결합, 형질 전환 등을 위해 당업자는 공지의 방법들을 사용할 수 있다. 상기 방법들은 문헌(예를 들면, Sambrook, J. et al., 'Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition', Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)) 등에 기술되어 있다.

본 발명의 플라스미드 pJW79는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 플라스미드 pJW79는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8)로부터 분리된 것을 특징으로 한다. 또한 상기 플라스미드는 상기 서열번호 1의 첫 번째 염기에서 마지막 염기까지 연결된 원형 플라스미드를 형성할 수 있다.

본 발명자들은 상기 페디오코커스 펜토사세우스부터 본 발명의 플라스미드 pJW79를 분리하기 위하여, 페디오코커스 펜토사세우스에 함유된 플라스미드를 플라스미드 DNA 추출법(large plasmid DNA 추출법, Park et al., 2008, Biotechnol. Lett. 30: 165-172)으로 추출하고 이를 전기 영동한 결과(<도 1> 레인 1 참조)와 상기 페디오코커스 펜토사세우스에 노보비오신(novobiocin)을 처리하여 항균활성이 소실된 경우 전기 영동한 결과(<도 1> 레인 2 참조)를 비교하여 항균 활성을 지닌 본 발명의 플라스미드 pJW79를 분리하였다(<실시예 1> 참조).

또한 본 발명자들은 상기 분리된 본 발명의 플라스미드 pJW79의 염기서열을 분석하여 11762 bp로 이루어진 서열번호 1의 염기서열을 가진다는 것을 알아내었다(<실시예 2> 참조).

나아가 본 발명자들은 상기 본 발명의 플라스미드 pJW79에 존재하는 잠재적(putative) ORF를 분석한 결과, 총 9개의 ORF를 밝혀내었으며 그들의 위치와 크기 그리고 다양한 균주의 유전자와 비교하여 동일성을 검증하였다(<실시예 3> 참조).

따라서 본 발명의 플라스미드는 당업계에 공지된 방법에 따라 벡터로써 활용이 가능하며 항균 물질인 페디오신을 대량 생산할 수 있는데 유용하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 플라스미드는 장내 유산균의 메타게놈(metagenome) 분석이나 장염치료물질을 생산하는데 유용한 발현 벡터로 활용이 가능하다.

이에 본 발명의 클로닝 벡터는 상기 플라스미드 pJW79에 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별 마커가 삽입된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 클로닝 벡터는 유산균에서의 유전자의 클로닝에 매우 유용하다. 본 발명의 클로닝 벡터에 사용되는 프로모터는 유산균에서 발현을 유도할 수 있는 프로모터라면 제한 없이 사용될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 16S rRNA 프로모터, low-pH-inducible 프로모터, Hypoxia-inducible 프로모터, ptsH(phosphotransferase system HPr(phosphocarrier protein)) 프로모터 등이 포함된다.

본 발명에서 "MCS(multiple cloning site)"란 다양한 제한효소 부위를 갖는 DNA 단편을 말하는 것으로서, 이는 특정 제한효소로 인지되어 절단되므로 절단된 MCS의 부위에 목적 유전자의 삽입을 가능하게 한다. 본 발명의 클로닝 벡터에 사용될 수 있는 MCS는 당업계에 공지된 MCS라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 이는 MCS를 가지고 있는 당업계에 공지된 다양한 벡터(예: pUC18, pUC19 등)에서 얻을 수 있다.

또한 본 발명에서“선별 마커(selection marker)"란 유전자의 클로닝 여부를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 마커 유전자가 사용될 수 있다. 바람직하게는 항생제 저항성 유전자, 발색 효소 유전자 또는 발광/형광 유전자가 사용될 수 있다.

항생제 저항성 유전자의 예로는, 이에 제한되지는 않으나, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자, 암피실린 저항성 유전자, 가나마이신 저항성 유전자, 에리쓰로 마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자가 있다. 또한 발색 효소 유전자의 예로는 β-갈락토시다제 유전자, β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자가 있다. 상기 발광 유전자의 예로는 루시퍼라제 유전자가 있고, 상기 형광 유전자의 예로는 BFP(blue fluorescent protein) 유전자, CFP(cyan fluorescent protein) 유전자, GFP(green fluorescent protein) 유전자, YFP(yellow fluorescent protein) 유전자, RFP(red fluorescent protein) 유전자가 있다. 이외에도 선별 마커로 당업계에 공지된 다양한 유전자가 본 발명에 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 셔틀 벡터는 상기 플라스미드 pJW79, 대장균의 복제 원점, 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별마커를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 셔틀 벡터는 유산균의 복제 원점 및 대장균의 복제 원점을 모두 가지고 있으므로 유산균 및 대장균에서 상호 복제가 가능하다. 따라서 상기 셔틀 벡터는 목적 유전자를 유산균과 대장균에서 대량 복제 및 발현시킬 수 있다.

본 발명의 셔틀 벡터에 사용되는 대장균의 복제 원점은 당업계에 잘 알려진 대장균 유래 형질전환용 벡터(예컨대, pUC18, pUC19 등)로부터 얻을 수 있다. 대장균의 복제 원점의 염기서열은 당업계에 잘 공지되어 있으므로, 당업자라면 공지된 대장균의 복제 원점을 본 발명의 셔틀 벡터에 용이하게 삽입할 수 있다.

또한 본 발명의 셔틀 벡터에 사용될 수 있는 프로모터는 유산균 및 대장균에서 발현을 유도할 수 있는 프로모터라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 그 예는 상기 언급한 바와 같다. 상기 셔틀 벡터에 사용될 수 있는 선별 마커도 상기 언급한 바와 같다.

본 발명의 셔틀 벡터는 상기 본 발명의 클로닝 벡터에 대장균의 복제 원점의 염기서열을 직접 삽입하여 제조할 수도 있다. 다른 방법으로는 본 발명의 플라스미드 pJW79와 대장균 유래 형질전환용 벡터를 연결하여 제조될 수 있다. 즉, 본 발명의 플라스미드 pJW79를 제한효소, 바람직하게는 원-컷 사이트를 가진 SalI 또는 HindⅢ로 절단하여 선형 플라스미드 DNA로 제조한 후, 이를 동일한 제한효소로 절단한 대장균 유래 형질전환용 벡터와 유전공학적 방법(예: ligation)으로 연결하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 제공되는 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터에는 목적 유전자가 삽입될 수 있다. 본 발명에서 “목적 유전자(target gene)”이라 함은 유산균에서 클로닝 하고자 하는 유전자 또는 특정 숙주세포에서 발현시키고자 하는 유전자를 말한다.

상기 목적 유전자는 본 발명의 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터 내에 존재하는 MCS 내에 삽입될 수 있다. 예컨대, 목적 유전자는 각 벡터의 MCS 내에 삽입될 수 있도록 제한효소 서열을 포함하는 프라이머로 PCR 증폭한 후, 제한효소로 절단하여 동일한 제한효소로 절단된 클로닝 벡터 또는 셔틀 벡터의 MCS 내에 삽입된다. 상기 목적 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. "작동가능하게 연결된다(operably linked)"는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 즉, 상기 목적 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터에 의해 그 발현이 조절될 수 있도록 연결될 수 있다. 본 발명에 사용되는 목적 유전자로는 실험자가 유산균에서 클로닝하고자 하는 것이거나 및 대장균에서 발현시키고자 하는 모든 유전자를 다 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 벡터를 유산균에 형질전환시키는 경우에는 상기 유산균에 대해 프로바이오틱스로서의 활성, 기능 및/또는 유용성을 높일 수 있는 유전자를 목적 유전자로 사용할 수 있다.

특히 본 발명이 플라스미드 pJW79는 페디오신 오페론을 포함하고 있어 항균활성 물질의 생산이 가능하므로 이의 기능을 증대시켜주는 다양한 유전자를 목적 유전자로 이용할 수 있다.

본 발명의 벡터의 MCS 부위로 삽입 가능한 의학, 산업적으로 유용한 목적 유전자의 예로는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등을 암호화하는 유전자가 있다. 그 구체적인 예로는, 트롬보포이에틴, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 콜로니 자극인자, 글루카곤-유 사 펩타이드(GLP-1 등), G-단백질 관련 수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포괴사 당 단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, α-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ 및 XⅢ, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피 세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리 오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편 등을 암호화하는 유전자일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

또한 본 발명에서 제공하는 모든 벡터들에는 유전자의 발현을 조절하기 위하여 프로모터 이외에 발현 조절 서열이 추가로 포함될 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 발현 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터(promoter) 이외에 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터(operator) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

또한 본 발명의 벡터의 기능을 유지하는 한, 일부 서열 특히 구조적인 기능을 하는 서열 부위가 제거된 벡터도 본 발명의 벡터에 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 미생물은 상기 벡터로 형질전환된 것을 특징으로 한다.

상기 미생물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 유산균 또는 대장균을 말한다. 상기 대장균은 XL1-blue, JM-109 등 일반적인 대장균이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 이와 같이 형질전환된 미생물은 단백질의 대량 생산에 유용하게 이용될 수 있다. 따라서 형질전환된 미생물을 배양하여 배양물로부터 대량 생산된 단백질을 수득할 수 있다.

상기 형질전환하기 위하여 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 열 충격 방법(heat shock method), 칼슘 포스페이트 침전법, 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한 본 발명의 페디오신(pediocin)을 생산하는 방법은 상기 플라스미드 pJW79를 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 플라스미드 pJW79는 페디오신 오페론을 포함하고 있으므로 본 발명의 플라스미드로 미생물을 상기 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 방법으로 형질전환하고 상기 형질전환된 미생물으로부터 페디오신을 분리 및 정제하여 수득할 수 있다. 구체적으로 상기 형질전환 미생물을 배양하여 예를 들면, 형질전환 미생물이 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 다음, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배양이 완료되면, 상기 배양물로부터 페디오신을 회수할 수 있다.

상기 배양물에서 발현된 페디오신의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위하여 상기 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전)등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 페디오신을 정제할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990))

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 플라스미드 pJW79은 벡터로써 활용하여 다양한 방법으로 목적 단백질을 발현하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 헬리코박터피로리(Helicobacter pylori)등의 균에 강한 항균활성이 있는 페디오신을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

신규 플라스미드( pJW79 )의 추출 및 분리

페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8)(기탁번호: KCTC 10297BP)로부터 페디오신(pediocin) 오페론을 포함하는 플라스미드를 추출하기 위하여 플라스미드 DNA 추출법(large plasmid DNA 추출법, Park et al., 2008, Biotechnol. Lett. 30: 165-172)을 이용하여 플라스미드를 추출하고 추출된 플라스 미드를 0.8%의 아가로스 겔에 로딩하여 전기 영동한 결과를 도 1에 기재하였다.

상기 도 1에 기재된 바와 같이, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8)내에 최소 4개의 서로 다른 플라스미드가 존재한다는 것을 알 수 있었다(도 1의 레인 1 참조).

이에 본 발명자들은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8)로부터 항균활성이 있는 페디오신(pediocin) 오페론을 포함하는 플라스미드(pJW79)를 확인하기 위하여, 공지된 Miller의 방법(Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p54)을 이용하였다.

구체적으로 wild-type 균주를 노보비오신(novobiocin)으로 처리한 후 플라스미드가 제거되어 항균활성이 소실된 균주를 찾기 위해, 상기 균주의 항균활성에 의하여 생장이 저해되는 것으로 알려진 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)를 대상으로 공지된 Sarkar와 Banerjee의 방법(J. Food Sci . Tech. 33: 231-233, 1996)에 따라 스팟-온-론 방법(spot-on-lawn method)을 사용하여 스크리닝을 실시하였다(도 2 참조). 상기 스크리닝을 통하여 분리된 균주에서 플라스미드를 추출하여 wild-type 균주에서 추출된 플라스미드와 함께 아가로스 전기영동을 실시하여 비교하고 그 결과를 도 1에 기재하였다.

상기 도 1에 기재된 바와 같이, wild-type 균주에는 포함되어 있으나 항균활성이 소실된 균주에는 포함되어 있지 않은 신규한 플라스미드를 분리할 수 있었다 (도 1의 레인 2 참조). 따라서 상기 본 발명의 플라스미드는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8)로부터 항균활성이 있는 페디오신(pediocin) 오페론을 포함하는 플라스미드로써 이를 본 발명자들은 ‘pJW79’로 명명하였다.

< 실시예 2>

본 발명의 신규 플라스미드( pJW79 )의 염기서열 분석

먼저 상기 <실시예 1>에서 추출 및 분리된 본 발명의 신규 플라스미드(pJW79)를 정제하기 위하여 wild-type 균주로부터 총 플라스미드를 추출하고 아가로스에서 전기 영동한 후 상기 <실시예 1>의 결과로 알아낸 본 발명의 신규 플라스미드(pJW79) 밴드의 DNA를 HindⅢ를 이용하여 인-겔 절단(in-gel digestion)하였다. 상기 절단된 DNA를 추출하여 클로닝 벡터인 pBlueScriptII SK(+)에 클로닝하고, 이와는 별도로 모든 플라스미드를 HindIII 또는 ClaI으로 자른 후 pBlueScriptII SK(+)에 클로닝하여 플라스미드 라이브러리를 구축하였다. 상기로부터 수득한 서브클론(subclone)들에 대해 자동화된 DNA 시퀀서(sequencer)를 이용하여 염기서열을 결정하고 결정된 단편의 염기서열들은 DNA 분석용 프로그램인 DNASIS MAX(Hitachi, 일본)를 사용하여 얼라이먼트(alignment)를 통해 연결되어 최종적인 염기서열을 완성하였다.

상기 결과로부터 본 발명의 신규 플라스미드(pJW79)는 11762 bp로 이루어진 서열번호 1의 염기서열을 가진다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

본 발명의 신규 플라스미드( pJW79 )의 염기서열 분석을 통한 잠재적 ORF 의 결정

상기 <실시예 2>에서 분석된 본 발명의 신규 플라스미드(pJW79)에 존재하는 잠재적 ORF를 분석하기 위해 DNASIS MAX(Hitachi, 일본)를 사용하였으며 그 결과 분석된 ORF들은 다시 ORF 상부(upstream)의 염기서열을 프로모터 검색 프로그램(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)에 기초하여 분석한 후 원핵 생물체의 유전자 프로모터의 특징인 -35와 -10 부위가 존재하는지를 확인하여 잠재적인 ORF를 결정하였다. 또한 잠재적인 ORF들은 GenBank 데이터베이스(NCBI)를 이용하여 동일성(identity)을 조사하여 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

본 발명의 신규 플라스미드(pJW79)에 포함된 잠재적 ORF의 특징

ORF	위치	크기(bp)	비교 균주	동일성(%)
2	831~ 1754	924	Pediococcus acidilactici H plasmid pSMB74: RepB gene	80
			P.halophilus RepA and RepB genes	79
6	1690~ 2217	528	Pediococcus acidilactici H plasmid pSMB74 replication protein (orfX)	89
4	9245~ 9853	609	Lactobacillus curvatus CRL705 plasmid pRC18: Hypothetical membrane protein	97
5	10661~ 11248	588	Pediococcus acidilactici H plasmid pSMB74 : Tyrosine recombinase	93
20	11666~ 117	214	Lactobacillus curvatus strain CRL705 plasmid pRC18 : hypothetical protein	97
7	3448~ 3636	189	Bacillus coagulans plasmid pI4 coagulin operon : coaA gene	100
			Pediococcus acidilactici H plasmid pSMB74 : papA gene	98
8	3674~ 4012	339	Bacillus coagulans plasmid pI4 coagulin operon : coaB gene	99
			Lactobacillus plantarum plasmid pWHE92 pediocin AcH production operon : papB gene	99
9	4036~ 4560	525	Lactobacillus plantarum plasmid pPLA4 : accessory protein	99
			Pediococcus pentosaceus plasmid pS34 : papC gene	99
10	4659~ 6833	2175	Pediococcus acidilactici strain K10 pediocin operon : pedD gene	99
			Pediococcus acidilactici H plasmid pSMB74 : papD gene	99
			Pediococcus acidilacticibacteriocin operon genes : bacteriocin operon-associated ORF gene	99

본 발명의 플라스미드 pJW79은 벡터로써 활용하여 다양한 방법으로 목적 단백질을 발현하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 헬리코박터피로리(Helicobacter pylori)등의 균에 강한 항균활성이 있는 페디오신을 대량 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8)에서 플라스미드를 추출한 결과를 나타낸 것이다.

레인 1: wild-type 균주에서 추출된 총 플라스미드

레인 2: 페디오신(pediocin)을 코딩하는 플라스미드가 제거된 균주에서 추출된 총 플라스미드

도 2는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus CBT-8) 균주를 노보비오신(novobiocin)으로 처리하여 항균활성이 소실된 균주(화살표 지시 부분)를 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.

<110> CHUNG, MYUNG JUN <120> Novel plasmid isolated from Pediococcus pentosaceus and use thereof <130> NP08-0063 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11762 <212> DNA <213> pJW79 plasmid <400> 1 aagcttcttt caatgaacct gacgagatca aaaagaattt gtatgattcc ctatatactt 60 atattttgca aaaaaagaca agaagatatt attaatcgtc ctagcttcgt tatttagccc 120 tttaaaagcc ttctgagggc ttttaattct tgctttagta taaacgtata tgaatggtct 180 taaaatcgct agaaacgaaa aataagaccc ttaaaaagga acatagcagc taaaatcttg 240 ttaagattca gaaaaaataa ctgtttgctg tcaatggtag cggacgagcg tagcgtggga 300 gcataaggaa ttgacagctc taaaccagtc ttaacactga attggcgaaa gccaaagttt 360 ctataaaacc ttgctttcct gcttaacggc gagtgaaaaa gcggttaagc tggctcagct 420 tggacggggt tcggggcgtt agcgtccgta ttaaatgtgg cttaccataa ccaacgaaca 480 gagtgaggtg caaggagctg tgcgactgga gtttaatgtg agccggtttt tggctcactc 540 ctttgtgttt tttgtttcta gattttaatc tcgtacagcg gtgcctcttt tatacctctt 600 ttataaacct cttttaaacc tcttttagac ccctcttgag ccttactctc ccaaggctca 660 cagaaggtta tcaagtacct tttgtctgtt tatcaagtac cttttgtctg tttatcaagt 720 accttttgtc tgtttatcaa gtaccttttg tctgtttatc aagtaccttt ataagttctg 780 tacttgataa aaaggtactt ttattttaat atgtgtttga ggtgataatc atggctaatg 840 agttagttaa gtatgatcct gagttgaata ctattccctt gagaaaattt accccaattg 900 agatgaattt atttttttca attatttccc gcatgcggga tcaagggaat aaaactgttc 960 gtttctcttt tgaccagtta aaagagctta gtaactataa accaaccgca aataaacgtt 1020 ttattgatga tattgaaaat acataccaaa agatcctcag ccttaggttt ggccgtagaa 1080 gtaagagtgg cttaaatcgt gaattttttg ttatgtttac tgaatttgaa attaaaggtg 1140 aagctgaaga accttatgtt gatattcaga tttatcccaa agcattgcac ttgctaaacg 1200 atttagaaag ttgggttcgt tatgccctaa cagaatttag aaatttaaaa agcagttacg 1260 ctaaaacaat gtttcgtcta attaagcaat ttcgaactac tggctattct tatttctcta 1320 aagaagattt ttttgaattg cttgatatac ctaaaagtta ttggaatagt ccttcaaagg 1380 ttgacaaaaa ggttattaag ccaattagag aagaattaac cccgcttttt agagggctaa 1440 cgattagaaa aaaatatggt aaaggcagag gaaaaccagt tatcggttat tcttttactt 1500 ggaaacctga aagcaaggac gcaaatgatt tttctcaagg caaatttcaa gatgagcgtc 1560 aaaaactctt taacattcag cacaatgatg aattatcaga taaagaaaag tggcgtgcaa 1620 ttgacaaagt taaatgcttg cctttaggaa caactgaaaa acaggtactg gctgaaaaac 1680 aagctgaaca tgatcaaaaa atcagagatc aagcaagaca agaatttctc gctgatctcc 1740 gaaaggggtt ttaaaatcat gtctaaaact attagagaac ttgctgatga attgaatgtc 1800 tccaaacaga ctattcaata tcactaccaa agactaccag caaagaacca acaaaagaat 1860 agtcagggca caaaccttat tagtcctaca gcagaaagaa ttataagaag caaggtagca 1920 aagcctttgc tagcaaaaaa acagcaaaga ggtagcaaag aattgccaaa gactagcaaa 1980 gaaaataatg atctggttgc tactctgaga agagaagtag aagatttaaa ggctcaacgt 2040 gacaaacagc ttgctaccaa agaccgacaa atagaccatc taacaaaatt ggtggatcag 2100 cagcaacaat tacaattagc aacagtagca gataaccgtc gattaaaaga tcatgtacaa 2160 aagctaagtg ggcaactaac tcaaaaaact aacgacaact tgtcgcccgg aaaatgatct 2220 ttttaacatc caagataaag aaagcaaaat agctaaacca gaagattgtt aaatctggta 2280 gtaataaaga tggcatncac acaaatagag ctattaaacg ttggtggaaa ttctggtaaa 2340 agttaatgta agccttaagg tttcaactaa agcaattacg gtcaaccata accatagtat 2400 tggattgtca ttttattggc tataaaatag taaatcagtg aatttcatta caaaagggct 2460 cacaaaaaat tgttttcttc ctccaacaat agcgagacgc ttttctaatt gcttgaccca 2520 aagagcaata gaatattttg aaggtccaaa ttattctgtt aatgatttaa gtgaacggcc 2580 ttcttggtga aatttaacca atgaatcttt gaagtcttgt gaataacgaa ttgacataaa 2640 aatactccta tattttcatt ttgcggactg aataaaaata gtccattttt tagtataaga 2700 gcagtaaaac cagacgtgga aaccacgtgg tcttttagtt gattcagtaa aagaagccga 2760 aaccaacgtg aaaacgttgg tttcggcttc tttggctttt aattgcggga acgcacacaa 2820 agagccaaaa aagattactg gcagccatct tctgatggct gccagtaatc ttttttaagt 2880 tcttgttcaa aaggtttgat aaaatcaaag aattgcggga acgcacacaa agagccaaaa 2940 aagattactg gcagccatct tctgatggct gccagtaatc ttttttaagt tcttgttcaa 3000 aaggtttgat aaaatcaaag ctagaaacta gctccggtca tgcttgttgc gatcattatc 3060 gcgtaagtct tctacgtggg catcaccact cgtatcgata tctagttctt cgcggccgac 3120 gttttcactt acttgtttca catcttcgtg ttcttgttta cgaatgttaa cttcttctcg 3180 aacgaccggg cgtttgttga catcggtagt tgcagccgca ccatctccgg gctttctttc 3240 gatcacgatt tcttctcgtt taaaatgaat atataaactg tgtcataact taaaagatac 3300 tgcgttgata gccaggtttc aaaaattgac caagatcgtt aaccagtttt ggtgcgaaaa 3360 tatctaacta atacttgaca tttaaattga gtgggaacta gaataagcgc gtattaagga 3420 taatttaaga agaaggagat ttttgtgatg aaaaaaattg aaaaattaac tgaaaaagaa 3480 atggccaata tcattggtgg taaatactac ggtaatgggg ttacttgtgg caaacattcc 3540 tgctctgttg actggggtaa ggctaccacc tgcataatca ataatggagc tatggcatgg 3600 gctactggtg gacatcaagg tactcataaa tgctagcatt atgctgagct ggcatcaata 3660 aaggggtgat tttatgaata agactaagtc ggaacatatt aaacaacaag ctttggactt 3720 atttactagg ctacagtttt tactacagaa acacgatact atcgaacctt accagtacgt 3780 tttagatatt ctggagactg gtatcagtaa aactaaacat aaccagcaaa cgcctgaacg 3840 acaagctcgt gtagtctaca acaagattgc cagtcaagcg ttagtagata agttacattt 3900 tactgccgaa gaaaacaaag ttttagcagc catcaatgaa ttggcgcatt ctcaaaaagg 3960 gtggggcgag tttaacatgc tagaaactac caatacgtgg cctagccaat agtactgata 4020 aaggggatat tgtagttgtc taagaaattt tggtcaaata tctttttagc attaggcgcc 4080 tttcttgctt ttgcaggagt tgctaccata tcggtgagtg ctgacagttc cgctactata 4140 gaatcaaata ctagctcgaa aatcatcgat ggtgcaactt atgaagaaaa catcaagggc 4200 gttattccta ttacgctaac tcaatatttg cataaagctc aaactggaga aaaatttatt 4260 gtctttgtcg ggttcaagga gtgtgtgcat tgtcgtaaat tttctccagt catgaaacag 4320 tacttacaac aaagtcagca tcccatttat tacttagact atgggaacaa cgggtctttc 4380 agcatggctt ctcaaaaaca aataactgat ttctattcaa cttttgcaac ccccatgagt 4440 tttatgggaa cgccaactgt tgccttgctc gataatggta aggtggtatc aatgaccgct 4500 ggtgatgata ccactttatc tgatttacaa cagattactg ctgattacaa taatcagtag 4560 tcacctggtt aatatggttt tgtaaccaat gtaaaaggcg atggatcttt gaaatcgtct 4620 ttttttatgc acaaatttta aagatcggtg gtttgcttat gtggactcaa aaatggcaca 4680 aatattatac agcacaagtt gatgaaaatg actgtggttt agctgcacta aatatgatcc 4740 taaaatacta tggttctgat tacatgttgg cccatcttcg acagcttgcc aaaacaactg 4800 ctgacggtac aactgttttg gggcttgtta aagcagcaaa acacttaaat ttaaatgccg 4860 aagctgtgcg tgctgatatg gatgctttga 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ccattaaatc actaactggt gaagcaacta 5760 caaaaaaaaa gattgacaca ctattttctg acttattgca taaaaacttg gcttatcaaa 5820 aagctgatca aggacaacaa gctatcaaag cagctactaa attaatccta actattgtta 5880 tcctttggtg gggtactttt tttgttatgc gacaccaact gtctttaggt cagctgttaa 5940 cttataatgc tttgctcgct tacttcttga ccccattaga aaatattatt aatttacagc 6000 ctaaactaca agctgccaga gtggctaata atcgattaaa tgaggtttat ctagtagagt 6060 ctgaattttc taaatctagg gaaataactg ctctagagca actaaatggt gatattgagg 6120 ttaatcatgt tagttttaac tatggctatt gttctaatat acttgaggat gtttctctaa 6180 caattccaca tcatcagaag attactattg taggcatgag tggttcgggg aaaacgaccc 6240 tagccaagtt gctagttggt ttttttgagc ctcaagaaca gcacggtgaa attcagatta 6300 atcatcacaa tatatctgat attagtcgca caattttacg ccaatatatt aattatgttc 6360 ctcaagaacc tttcattttt tcgggctctg tattagaaaa tttattgtta ggtagccgtc 6420 ctggagtaac tcaacaaatg attgatcaag cttgttcctt tgctgaaatc aaaactgata 6480 tagaaaattt gcctcaaggt tatcatacta gattaagtga aagtggattc aacttatctg 6540 gtgggcaaaa acagcggtta tcaatagcta gagcattatt gtctccggca caatgtttca 6600 tttttgacga atcaaccagt aatttagaca ccattactga acataaaata gtctctaagc 6660 tattactcat gaaagacaaa acgataattt ttgtagcaca tcgtctcaat attgcgtctc 6720 aaaccgataa agttgtcgtt cttgatcatg gaaagattgt tgaacaggga tcacatcgac 6780 aattgttaaa ttataatggg tattatgcac ggttaattca taatcaagaa tagcctgaca 6840 agaaccagtc tgctattgat agactatttt tgtccgtgaa atcctcgcgt atttccgtga 6900 ggagcatagt atatttagcg atcttcaaat tttaagtata ttgattcata tgtttatcct 6960 cctaagtttg aggacaaatc ggattccacg gcctcaatga ctttttttgt gccttataat 7020 taaaggtgtt aaaatacgtc ataacttacc accataaagc agtccaatta atttattgac 7080 ttctaagtaa aataccagga gttttgctat gagttaacta tgatcctagg tggtcactaa 7140 aacattcctt aatttaaggg ctataattaa caaatagacc tttgatcatt tctaaagcca 7200 ttcttcagaa cgttattacg atctgaagaa tggctttatt ggcttgtgca agtaacattt 7260 gcgtgactaa tgctagtaat tcttgctagg attgccttag atccttgatt atgatttagg 7320 aggagtgaga tttgagcttt aaagacgata tcaagacctt gcgcaggcaa tctaacttaa 7380 cccaagaagc gttagctcaa aaattacatg tgacccgtca aacggtctca acttgggaaa 7440 ctggcaagaa tatgccaagt ttagagaccc tgcatgtttt gagtcaattg tttaacatct 7500 cactcgaaaa acttctattt aacgaggaga ttgcaatgaa aaaagataaa gaaccctctt 7560 tggctaccca gatagatcat gatgttaagc ttaaaagtcg ttatcgtcgt tggacttttg 7620 gtttaggtgg cttgatcgta ctagcactgg ttagtattgg tattttatgt ttgggatatt 7680 ataaaggtat tgggacgatt gatcgctttg atccgttttt atcctataaa gtcgggtaca 7740 ctaaattacc tagtgaaaag gaaatttctc ctaacaataa ggcgaccaat ggttactgga 7800 ccgcttggtt caccgataat acgatgggta atgaatggac caaattaacc ttaacgacgg 7860 ggcttaatcc tggggtcaaa gatccttatg tgatggcgta tcataagggc agctatgtta 7920 aagttgcacg tattgtgcct cgcatctaca ttaatcagac ttatgttagc aacttagcag 7980 cgctagatgc cttgttaaac cataaggaaa atacagcgac taacaatcat gaccttaaga 8040 agtataagac acaaatccac atatccgaca ctatccaaca gttagtaact gaatagagaa 8100 ccaccaaatt acaatcccca aagcagcttt agagtctata aatctaaata accattttgt 8160 actaaatact ttttaaatag tctttcaaag cggcattgtt atcgctttga aagactattt 8220 ttgtcaaatt cggagtcaac ttaaatcggt caacacataa aaaataatgt cttttgttta 8280 catttattat aaataatgtt aatttaaaat aaatattatt taattaagga ggggagaaat 8340 atgaactggt ttttaacact agatcaagcg gaccaagaat ttgttaaaca gttagtacat 8400 gcttcgggct ctctaaagca attggcaaag gtatatcaag taagttatcc gaccgtcagg 8460 atgcgcttga ataaaattat tcaaaaaatt gatttaattg aacagaatga tacaagtacc 8520 tttgaaacca aaattatgca attggtaatt gacgaaaaaa tatcgttaga cttagcaaaa 8580 caaattattg aagattttaa ggaggaaaaa catgagtgag tttaaagggc ttttaatggg 8640 tatgttgatt gtagctatac tttacgtttt agatagatat ttgccaaaat ggtttggagc 8700 gattcctgga attgcttttc tgttattaat ggtttatatc atctttacta aggatcagtc 8760 tttactaacc aaactaacgt tattgattgt gggagaggca attttaaatg gtatctggtt 8820 agaggcactg ggggatagga agaagaaagc cagcaaagaa atcgaaaaaa tgaaagctaa 8880 ggatatatca cgaaaaaata acacttttta gggcctacaa tcttcaaata acacctataa 8940 caagagcagc accgaatcat tacttactct tgttgcgttt catattttaa aactacacta 9000 ttgttagctg ttgtcatatt gattggaatt tttgttaaaa catacttttt ggggtaggta 9060 gttgcttatg aagactatta tcttggcttg aggtgatggc attttttata cactttagta 9120 gctttgcttc taccagtggg gtctataact atcaaataac gcttataaaa gagcaagcat 9180 agaatcattg cttgctcttt ttgcgtttca tcagcataat tattttgaaa tcaggagggt 9240 atttatgaaa tttggtgatc atcttaaaaa cgcaagaaca gaattgaatc ttactcagga 9300 acaagtttct aatgatttct ttattactag acaaactatt tctagttggg aaaatgaaaa 9360 aacttatcct gacattgcta gcttgattaa attgagtgac tattaccaca tttcattaga 9420 tgttttgtta aaggaggata caggtatgcg tgagtttttg gaaaaggaag aagttacgag 9480 acaaataaaa ccaatttatc gcgatcttat agttattgat ttactagtct gttcattact 9540 aattggtgac ttttttaatc taatacattt aggtgtattt atgctgccaa tatatttctt 9600 gttattgtgc agtgtatctg cattaaacaa gttaagagag ttcgataatt ctagttctct 9660 tggattaaaa tatgcttggc aaaaatattt atctggagaa aaaggatcca aatattcact 9720 tattatgccg atattattta tcatttcagg agtcattgtt gttttattaa aagaattgta 9780 tattggtgga atctttatac taacaggagt ttcagtttta tttttcattt taaaaaaagc 9840 aaaacaccac tgatattccc ccacacatta gggtctataa gttaaaaata gaccctcaaa 9900 aacattgaaa gaatagcccc caatatctat aatgtagata ttgggggcta ttttaattta 9960 tttttttata agtgccccta aactatagct attgattcaa gatttcatgg gagccagttg 10020 caaccaataa caaaatcaat tcatcatgat ctagctgata aataacaatc cagttgtcat 10080 aatttttacc atagttgcca tatctggcag ggtgaaattc acgatagcca cgccaatttc 10140 cttttaatgc atgatcttta atctgtttca aaacaagtac atcttgttca acaattgctt 10200 ctaaacaagg cttcaagaca gttattggga aatgtttttt gactagtttt tttattcacg 10260 ttcaaagatt tggtctgttt aatttgcatc taacttatcg atccaatctt caaagtcagt 10320 caatgaacca atgtttttga cctgccctgt ttctgcttct tttttagcgg ctaaggcttc 10380 cggagaatct aaaaagctga ctaatcgaac ttcattattg gccgctttaa ctaacgataa 10440 gcgtatatac tcagaaacgg ttagcccttg ttttgctaga ttagctttag cccgttcact 10500 aatgtcaggt gttacacgag ttgaaattgt cttgttttta ataatagtat tactcattct 10560 aatccgcctc ctttaagttt accatcgtac tacattataa tattcgattt ttaggttttc 10620 tgcaactaaa ttaattttaa agtaaaggaa ctaacagctt atgcaacaag ttgtcttacc 10680 catcaaagat tcaaacgttc ttaaagaggt tcaagatacg ttactaaata actttaaagc 10740 tggccgacgt aactatacga tttttcaagt tggtaaagcg acgctactgc gagtgagtga 10800 cgttatgggc ttaaaacagg ccgatatttt taatccggac ggttctatta aacaaaatgc 10860 gtttgttcat gaccgaaaaa ctggtaaacc gaataccttg taccttaaac cggttcaaac 10920 agagctctta ttgtaccgtc aatggctact tgatcataga ctagcctctg aatggctctt 10980 tccttccatt caacaccccg agcgccatat tacggaaaaa cagttctata aaatcatgag 11040 caaagtcggc gatcttttaa gcattaatta ccttggtacc cacactatgc gcaaaactgg 11100 ggcttatcgc gtttatacgc aatccaatta caatattggc ttagtcatgc acttattaaa 11160 tcattccagt gaagccatga ctttagctta tttaggctta gaccaagcca gtaccgaaac 11220 tatgttagat caaattgatt ttggttagtt ttatttggat ttttagttgt tgccgaaggc 11280 aacttctgag acagatttta agcacaaaac ctccactaat ttttagtgga gtgtaagtgc 11340 gccttgaccg agatttgctc ggtttgcgga ctcacataga tgttctatgt ataagtgcgc 11400 tattaaactc atttcattcc gtttaatgac gctaaaaaat agctaacttg atcattaaaa 11460 taaaaggttt ttttagttca atgcgcactt acacgtcaac taactttgac gtgtttcgat 11520 accccaaaaa ttgtattaga tttcgctgcg ctcaaacaaa tctttttaat tgctttacac 11580 cgtttttctt tctaaactta atcacaattt ttgaataact aactataaaa agatgccttt 11640 aatttaaacc tgaaataatt agctaatgtt aggagtaact cagatggacg aaaagaaagt 11700 attaaagcca attgatgaaa tgcttgctga tccttggcaa gttgatattc aagaattgtt 11760 tg 11762 <210> 2 <211> 924 <212> DNA <213> ORF-2 <400> 2 atggctaatg agttagttaa gtatgatcct gagttgaata ctattccctt gagaaaattt 60 accccaattg agatgaattt atttttttca attatttccc gcatgcggga tcaagggaat 120 aaaactgttc gtttctcttt tgaccagtta aaagagctta gtaactataa accaaccgca 180 aataaacgtt ttattgatga tattgaaaat acataccaaa agatcctcag ccttaggttt 240 ggccgtagaa gtaagagtgg cttaaatcgt gaattttttg ttatgtttac tgaatttgaa 300 attaaaggtg aagctgaaga accttatgtt gatattcaga tttatcccaa agcattgcac 360 ttgctaaacg atttagaaag ttgggttcgt tatgccctaa cagaatttag aaatttaaaa 420 agcagttacg ctaaaacaat gtttcgtcta attaagcaat ttcgaactac tggctattct 480 tatttctcta aagaagattt ttttgaattg cttgatatac ctaaaagtta ttggaatagt 540 ccttcaaagg ttgacaaaaa ggttattaag ccaattagag aagaattaac cccgcttttt 600 agagggctaa cgattagaaa aaaatatggt 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Claims (9)

1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 플라스미드 pJW79.
2. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드는 페디오코커스 펜토사세우스 CBT-8(Pediococcus pentosaceus CBT-8)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 플라스미드 pJW79.
3. 제1항의 플라스미드 pJW79에 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별 마커가 삽입된 클로닝 벡터.
4. 제1항의 플라스미드 pJW79, 대장균의 복제 원점, 프로모터, MCS(multiple cloning site) 및 선별마커를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡터.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 프로모터는 16S rRNA 프로모터, low-pH-inducible 프로모터, Hypoxia-inducible 프로모터 및 ptsH(phosphotransferase system HPr(phosphocarrier protein)) 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 벡터.
6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 선별 마커는 항생제 저항성 유전자, 발색 효소 유전자, 발광 유전자 및 형광 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 벡터.
7. 제4항에 있어서, 상기 벡터는 제1항의 플라스미드 pJW79와 대장균 유래 형질전환용 벡터를 연결하여 제조되는 것을 특징으로 하는 셔틀 벡터.
8. 제1항의 플라스미드 pJW79, 제3항의 클로닝 벡터 및 제4항의 셔틀벡터로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 형질전환된 대장균.
9. 제1항의 플라스미드 pJW79를 이용하여 페디오신(pediocin)을 생산하는 방법.

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