BG64565B1 - Вектор за експресия на волски хормон на растежа и метод за неговото масово производство - Google Patents
Вектор за експресия на волски хормон на растежа и метод за неговото масово производство Download PDFInfo
- Publication number
- BG64565B1 BG64565B1 BG100264A BG10026495A BG64565B1 BG 64565 B1 BG64565 B1 BG 64565B1 BG 100264 A BG100264 A BG 100264A BG 10026495 A BG10026495 A BG 10026495A BG 64565 B1 BG64565 B1 BG 64565B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- growth hormone
- bovine growth
- gene
- coli
- expression vector
- Prior art date
Links
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 38
- 101150019416 trpA gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 27
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 10
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 claims description 5
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 5
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 9
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 3
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- SXOUIMVOMIGLHO-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-indol-2-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C=CC(=O)O)=CC2=C1 SXOUIMVOMIGLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000007952 growth promoter Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 101000981883 Brevibacillus parabrevis ATP-dependent tryptophan/phenylalanine/tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 101000981889 Brevibacillus parabrevis Linear gramicidin-PCP reductase Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 101000906861 Chondromyces crocatus ATP-dependent tyrosine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000932768 Conus catus Alpha-conotoxin CIC Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000009982 effect on human Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- UMSVPCYSAUKCAZ-UHFFFAOYSA-N propane;hydrochloride Chemical compound Cl.CCC UMSVPCYSAUKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940115271 ralgro Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/36—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription termination element
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до получаващ вектор, включващ ген на телешки хормон на растежа (вgн), в който нуклеотидната последователност в 5'-крайния си участък е без изменение на аминокиселинната последователност, кодирана в нея. Използва се тrра копиращ завършващ ген, въведен след 3'-крайния участък на модифицирания вgн ген за трансформиране на е.соli клетка за масово производство на вgн. а
Description
Област на техниката
Настоящото изобретение се отнася до метод за масово производство на волски хормон на растежа (BGH). По-специално то се отнася до вектора за експресия, обхващащ изменен ген на волския хормон на растежа, където нуклеотидната секвенция в областта на 5’-ия край е модифицирана без промяна на аминокиселинната секвенция, кодирана в него, a trpA терминатор на транскрипцията е инсериран след 3 ’-ия край на модифицирания ген на волски хормон на растежа; Е. coli клетка, трансформирана с експресионен вектор; до метод за масово производство на волски хормон на растежа, който обхваща култивиране на Е. coli трансформант и отделяне на волски хормони на растежа от културата.
Предшестващо състояние на техниката
Стероидни растежни промотори от животински произход като Estradiol-Compudose (Eli Lilly), Estradiol Benzoate-Synovax (Syntax Agribusiness Inc.) и Zeramol-Ralgro (International Minerals and Chemicals) са използвани при отглеждането на добитък за увеличаване на хранителната ефективност и увеличаване на теглото на добитъка. Все пак, употребата на такива стероидни растежни промотори от животински произход се ограничи, поради факта, че същите са разтворими в мазнини и следователно имат дълго преседяване в тъканите на добитъка, което може да има негативен резултат върху хора при консумация.
За разлика от това, животинските растежни хормони, които се произвеждат и отделят от хипофизната жлеза на животните, не са разтворими в мазнини, показват специфики на видовете и се съобщава, че подпомагат растежа и млекодобива от добитъка и че увеличават хранителната ефективност (Бауман, Д. Е. и колектив, Journal of Animal Sciences, 60, 583 (1985); Харт, И.С. и колектив, Journal of Endocrinology, 105, 189 (1985); Нюзуоч, 17 юни 1985; и Wall Street Journal, 22 юли 1986).
След 1940 г. хормоните на естествените животински хормони на растежа, отделени и пречистени от хипофизните жлези на животните, се използват за ускоряване на растежа на животните, но тяхното приложение при отглеждането 5 на животни е ограничено от ограничената доставка на хормони. Изследвания в последно време в областта на генетичните технологии позволяват масово производство на животински хормони на растежа чрез употреба на микроорга10 низми, например Е. coli.
Π. X. Сийбург и колектив разделят допълнителната ДНК, кодираща волския хормон на растежа, от волската хипофизна жлеза; определят нуклеотидна секвенция на сДНК и аминоки15 селинната секвенция на волския хормон на растежа; клонират сДНК във вектор на експресия на Е. coli, обхващащ trp промотор и експресиран волски хормон на растежа в Е. coli, който се трансформира с вектора (ДНК, 2, 37(1983).
Следтоваса правени много опити за увеличаване на степента на експресия на волските хормони на растежа в Е. coli.
Например X. Дж. Джордж и колектив откриват, че степента на експресия зависи от нук25 леотидната секвенция и дължината на региона между рибозомосвързващия сайт и началния кодон, ATG; и произвеждат волски хормони на растежа в количество, равняващо се на 15% от всички протеини, произведени в Е. coli (ДНК, 4,273, 30 (1985).
Олсен и колектив произвеждат волски хормони на растежа в количество между 10% и 15% на базата на общото количество протеини, произведени в клетка на Е. coli, чрез отглежда35 не на трансформираната клетка с вектор на експресия, обхващаща модифициран ген на волски хормон на растежа, в който регионът между рибозомо-свързващия сайт и началния кодон, ATG, е А-Т богат, под контрола на trp промотор 40 (J. Biotechnol., 9, 179, (1989).
Уотсън и колектив произвеждат волски хормони на растежа в количество 20% на базата на общото количество протеини, произведени от клетка на Е. coli, чрез отглеждане на трансфор4 5 мирана клетка с плазмид, обхващащ модифициран ген на волски хормон на растежа, в който един от нуклеотидите, кодиращ четири аминокиселини в региона наЬГтерминала на волския хормон на растежа, е променен чрез случайна му50 тация (Gene, 86, 137 (1990).
Също така е публикувано, че модифициран ген на волски хормон на растежа се приготвя с употребата на кодони, предпочитани от Е. coli; конструира се вектор на експресия за волски хормон на растежа чрез инсериране на ген на волски хормон на растежа във вектор на Е. coli, обхващащ ген на хормон за растеж на сьомга под контрола на trp промотор и лигиране на синтетична връзка между гена на хормон на растежа на сьомга и гена на волския хормон на растежа и се произвежда волски хормон на растежа в количество 27% на базата на общото количество протеини, получени след отглеждане на клетка на Е. coli, трансформирана с вектора (корейски патент публикация № 92-3665).
Максималното количество волски хормон на растежа, което може да бъде произведено чрез процесите от известното ниво на техниката, е ограничено до 30% на базата на общото количество протеини в Е. coli.
От друга страна, транскрипционният терминатор trpA е описан като много ефективен rho-независим терминатор (Кристи, Г. Е. и колектив, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,4180 (1981), и следователно желаният протеин може да бъде масово произвеждан, докато се ограничава производството на нежеланите протеини, получени от плазмид, чрез внедряване на транскрипционен терминатор trpA след 3 ’-пя край на гена, кодиращ търсения протеин (Генц, Р. и колектив, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4936(1981).
Матсуки и колектив получават калмодулин от клетки на плъх в количество 30% на базата на общото количество протеини в Е. coli чрез култивиране на клетка с плазмид, обхващащ trpA промотор, ген калмодулин и транскрипционен терминатор trpA (Biotech. Appl. Biochem, 12, 284(1990).
Сато и колектив съобщават, че когато интерлевкин-2 ген е извлечен чрез използване на плазмид, обхващащ интерлевкин-2 ген, под контрола на trpA промотор и транскрипционен терминатор trpA след 3’-ия край на интерлевкин-2 гена, се получава около 5 пъти по-голямо количество на интерлевкин-2 ген в сравнение с произведеното чрез контролна група, където не е внедрен trpA терминатор (J. Biochem., 101, 525 (1987).
Независимо от тези разработки продължава да съществува необходимост от разработване на метод за масово производство на волски хормон на растежа в търговски изпълним и икономически мащаб.
Техническа същност на изобретението
Предмет на настоящото изобретение е да представи експресионен вектор, който да е подходящ за масово производство на волски хормон на растежа.
Друга цел на настоящото изобретение е да осигури като приемник клетка, трансформирана с експресионния вектор.
Предмет на настоящото изобретение е да представи и метод за масово производство на волски хормон на растежа, включващ култивиране на трансформанта.
Съгласно настоящото изобретение е представен подобрен метод за масово производство на волски хормон на растежа чрез конструиране на вектор на експресия, обхващащ модифициран ген на волски хормон на растежа, където нуклеотидната секвенция в областта на 5'-ия край е модифицирана без промяна на аминокиселинната секвенция, кодирана в него, а транскрипционен терминатор trpA е внедрен след 3'-ия край на модифицирания ген на волски хормон на растежа. Изобретението представя и производство на волски хормон на растежа в количество, по-голямо от 50% на базата на общото количество протеини, получени чрез отглеждане на Е. coli клетка, трансформирана чрез споменатия вектор.
Описание на приложените фигури
Целите и характеристиките на настоящото изобретение се поясняват в следващото описание на изобретението, разгледано в съчетание с приложените фигури, от които:
фигура 1 представлява сравнение на нуклеотидната секвенция в областта на 5'-ия край на гена на волски хормон на растежа (ptrphs BGH 1 -13) с нейна разновидност (ptrphs BGHRAN #5);
фигура 2А показва схематична диаграма за конструиране на плазмид ptrphs BGHRAN, обхващащ модифициран ген на волски хормон на растежа;
фигура 2В разкрива схематична диаграма за конструиране на плазмиди ptrp3H BGH 1 -13 и ptrp3H BGHRA, обхващащи ген на волски хормон на растежа или негова разновидност заедно с транскрипционен терминатор trpA, лигиран в 3'-ия край, съответно;
фигура 3 показва резултата от SDS-полиакриламид гел електрофореза (PAGE), използваща преципитати на Е. coli клетка, трансформирана с плазмиди ptrphs BGH 1-13, ptrphs BGHRAN #5, ptrp3H BGH 1-13 или ptrp3H BGHRAN; и фигура 4 представя резултатите от определяне на количеството волски хормон на растежа с денсиметър, което количество се извлича в Е. coli клетки, трансформирани с плазмиди ptrphs BGH 1-13, ptrphs BGHRAN #5,ptrp3HBGH 1 -13 и ptrp3H BGHRAN, съответно.
Подробно описание на изобретението
В съответствие с един от аспектите на настоящото изобретение е представен вектор на експресия за масово производство на волски хормон на растежа, който вектор обхваща модифициран ген на волски хормон на растежа и транскрипционен терминатор trpA, инсериран след 3 ’-ия край на модифицирания ген.
Модифицираният ген на волски хормон на растежа съгласно настоящото изобретение има модифицирана нуклеотидна секвенция в областта на 5'-ия й край за минимизиране на формирането на вторична структура в тРНК и увеличаване на степента на експресия, докато се кодира непроменената аминокиселинна секвенция от нормален волски хормон на растежа. Модифицираният ген на волски хормон на растежа съгласно настоящото изобретение преференциално има в областта на 5'-ия край нуклеотидна секвенция от:
5'-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3' където ATG е начален кодон на ген на волски хормон на растежа.
Векторът на експресия в съответствие с настоящото изобретение може да се приготви съгласно всеки конвенционален метод за генетична рекомбинация или метод за синтезиране на гени, например съгласно описаната по-долу процедура.
Първоначално се синтезират произволни праймъри, базирани на информацията за нуклеотидните секвенции на ген на волски хормон на растежа (виж корейски патент, публикация No 92-3665). Тези произволни праймъри са предназначени за въвеждане на волски хормон на растежа на разпознавателен сайт за ограничаване по отношение на ензим SacI и за произволно модифициране на нуклеотидната секвенция, кодираща волски хормон на растежа, без промяна на аминокиселинната секвенция, кодирана в него.
Също така е приготвен праймър, който отговаря на част от Amp ген в рекомбиниран вектор ptrphs BGH 1-13, обхващащ ген на волски хормон на растежа (виж корейски патент, публикация No 92-3665; АТСС 68975 (депозиран на 6 май 1992) и има разпознавателен сайт по отношение на рестрикционен ензим Pvul. Освен това, се извършва PCR чрез използване на посочените праймъри и плазмид ptrphs BGH 1-13 като мостра за получаване на модифициран ген на волски хормон на растежа. Полученият ген на волски хормон на растежа се смила с рестрикционни ензими Pvul и SacI и е лигиран с ДНК фрагмент, който се получава чрез смилане на плазмид ptrphs BGH 1-13 със същите ензими, за получаване на вектор на експресия на волски хормон на растежа. Векторът на експресия се използва за трансформиране на Е. coli и се отделя плазмид, обхващащ модифицирания ген на волски хормон на растежа, наречен ptrphs BGHRAN.
Впоследствие, за да се въведе транскрипционен терминатор trpA във вектора на експресия на волски хормон на растежа, се приготвят праймъри за PCR, съдържащи ген на транскрипционен терминатор trpA, разпознавателен сайт за ограничение по отношение на ензим Sall и друг разпознавателен сайт за ограничение по отношение на ензим Pvul. След това се извършва PCR чрез използване на посочените праймъри и плазмид ptrphs BGH 1-13, като мостра за получаване на ДНК фрагмент, обхващащ транскрипционен терминатор trpA. Полученият ДНК фрагмент се разтваря с ограничение по отношение на ензими Pvul и Sall и се лигира с ДНК фрагмент, който е получен чрез разтваряне на плазмид ptrphs BGHRAN със същите ензими, за получаване на вектор на експресия на волски хормон на растежа. Векторът на експресия се използва за трансформиране на Е. coli и се отделя плазмид, наречен ptrp3H BGHRAN, който обхваща модифицирания ген на волски хормон на растежа и транскрипционния терминатор trpA.
Векторите за експресия съгласно настоящото изобретение се използват за трансформиране на Е. coli клетка, например Е. coli W3110 (АТСС 37339), подходяща за получаване на ген на волски хормон на растежа във вектора за експресия. Трансформираната Е. coli клетка се култивира при условия, които позволяват получаването на волски хормон на растежа, и полученият волски хормон на растежа да бъде отделен и пречистен от културата в съответствие с който и да е конвенционален метод.
Настоящото изобретение представя метод за масово производство на волски хормон на растежа, който включва култивиране на Е. coli клетки, трансформирани с вектора на експресия съгласно настоящото изобретение, и отделяне на волски хормон на растежа от културата. В съответствие с метода, обект на изобретението, е възможно да се получи волски хормон на растежа от Е. coli трансформант в количество, по-голямо от 50% от общото количество произведени протеини.
Следващите примери имат за цел допълнително да илюстрират настоящото изобретение, без да ограничават обхвата му.
Процентите, представени по-долу, за твърди вещества в твърда смес, течност в течност и твърди вещества в течност са дадени в wt/wt, vol/vol и wt/vol, съответно, освен ако специално не е уточнено друго.
Пример 1. Получаване на модифициран ген на волски хормон на растежа и конструиране на съдържащ го експресионен вектор.
Стъпка 1. Основавайки се на информацията за нуклеотидните секвенциии на ген на волски хормон на растежа (виж корейски патент, публикация No 92-3665), са синтезирани произволни праймъри за PCR, които съответстват на областта на 5'-ия край на волски хормон на растежа и имат следващите нуклеотидни секвенции: Праймър PBGHRAN:
5'-TGCTGAGCTCGNAGNACNGCRTT NGCRAANAGNCCNGANAGNGACATNGC NGGRAANGCCATTTATAATTCCTCCA-3’ където N означава А, Т, G или С; a R означава А или G.
Праймър PBGHRAN включва SacI разпознавателен сайт и модифицирана нуклеотидна секвенция, кодираща 16 аминокиселини от N-терминала на волски хормон на растежа.
Също така са синтезирани и праймър PPBR3720, включващ и част от Amp ген в плазмид ptrphs BGH 1-13 (виж корейски патент, публикация No 92-3665; АТСС 68975), и Pvul разпознавателен сайт, като тяхната нуклеотидна секвенция има следния вид:
5'-TCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA3'.
Стъпка 2. В епруветка се смесват 1 ng от плазмид ptrphs BGH 1-13 като матрица, 2 pg от всеки от праймърите PBGHRAN и PPBR3720, получени в стъпка 1,10 μΐ от 10х полимеризиращ буфер (10 mM Tris-HCl, pH 8.3,500 тМ КС1,15 тМ MgCl2,0.1% (W/V) желатин), 10 μΐ смес от dNTP’s (по 2 тМ от dGTP, dATP, dCTP и dTTP),
2.5 единици от Taq ДНК (Perkin Elmer Cetus, USA) и се добавя дестилирана вода за получаване на обем от 100 μΐ.
PCR се извършва чрез повтаряне 25 пъти на цикъла от: 95°С за 1 min (денатуриране), 55°С за 40 s (отгряване) и 72°С за 2 min (полимеризация). PCR продуктът, получен по гореспоменатия начин, се подлага на 5% полиакриламид гел електрофореза и като резултат се потвърждава, че се получава около 990 Ьр от ДНК. ДНК се филтрира чрез същата полиакриламид гел електрофореза и получава наименованието фрагмент BGHRAN.
Стъпка 3. 2 μg от плазмид ptrphs BGH 113 са изцяло смлени със SacI в NEB (New England Biolabs Inc.) буфер 1 (10 mM Bis Tris пропан-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.0) при 37°C за 1 до 2 h, след което напълно се смила с Pvul в NEB буфер 3 (100 mM NaCl, 50 тМ Tris-HCl, 10 тМ MgCl2,1 тМ DTT, pH 7.9) при същите условия. Получената смес се подлага на
0.7% агар-агар гел електрофореза за отделяне на около 2 kb фрагмент, който се нарича фрагмент PBGH-T/P.
pg от фрагмент BGHRAN, получен в стъпка 2, напълно се смила със SacI в NEB буфер 1, след което напълно се смила с Pvul в NEB буфер 3. Полученият ДНК фрагмент се екстрахира с фенол/хлороформ, след което се разтваря в 20 μΐ от ТЕ буфер. ДНК фрагментът се нарича фрагмент BGHRAN-T/P.
Чрез използване на получения ДНК фрагмент се извършва лигираща реакция, както е описано по-долу.
В епруветка се поставят 100 ng от фрагментите BGHRAN-T/P и PBGH-T/P, 2 μΐ от 10х лигиращ буфер и 10 части Т4 ДНК лигиращ елемент; добавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 20 μΐ. Цитирането се осъществява при 16°С за 12 h.
Е. coli W3110 (АТСС 37339) се трансформира с лигиращата смес за получаване на рекомбиниран Е. coli трансформант, съдържащ плазмид ptrphs BGHRAN, обхващащ фрагмент BGHRAN (виж фиг. 2).
Пример 2. Получаване на модифициран ген на волски хормон на растежа и установяване на секвенцията на гена
Стъпка 1. Около 100 Е. coli трансформант колонии, получени в пример 1, са култивирани в течна Luria среда (6% бактотриптон, 0.5% екстракт от дрожди, 1% NaCI), съдържаща 50 pg/ ml ампицилин при 37°С за 12 h. 3 ml от културата се трансферира в 300 ml от М9 среда (40 тМ iqHPO4,22 тМ КН2РО4, 8.5 тМ NaCI, 18.7 тМ NH4C1, 1% глюкоза, 0.1 тМ MgSO4, 0.1 тМ СаС12, 0.4% казамино киселина, 10 pg/ml витамин В„ 40 pg/ml ампицилин); културата се разклаща при 37°С за 4 h.
Когато O.D. стойността на културата при 650 пт достигне 0.3, към нея се добавя индолакрилна киселина (IAA) за получаване на крайна концентрация от 50 g/ml. След 4 h се определя O.D. на получената култура и тя се центрофугира при 11,000 o6./min за 25 min за събиране на Е. coli клетъчните преципитати. Клетъчните преципитати се подлагат на 15% SDS-PAGE чрез прилагане на метода на Лаемли (Nature, 227,680 (1970) за потвърждаване на получаването на волски хормон на растежа. Клонингите, показващи 40% по-голямо количество на волски хормон на растежа, в сравнение с Е. coli трансформанта, обхващащ плазмид ptrphs BGH 1-13 (контролна група), са избрани и съдържащият ги плазмид се нарича ptrphs BGHRAN #5 (виж фиг. 3).
Стъпка 2. Установяване последователността на гена на волски хормон на растежа в плазмид ptrphs BGHRAN #5, получен в стъпка 2, се извършва по следния начин: плазмид ptrphs BGHRAN #5 напълно се смила със SacI в NEB буфер 1, след което напълно се смила с EcoRI в
NEB буфер 3. Получената смес се подлага на 7% полиакриламидна гел електрофореза за отделяне на ДНК фрагмент, имащ около 187 Ьр, който фрагмент се нарича BGHRAN-T/R.
От друга страна, 2 pg от плазмид М13тр18 напълно се смила със SacI в NEB буфер 1, след което изцяло се смила с EcoRI в NEB буфер 3. Получената смес се подлага на 0.7% агар-агар гел електрофореза за отделяне на ДНК фрагмент от около 7 kb, който се нарича фрагмент M13-T/R.
В епруветка се поставят 100 ng от фрагментите BGHRAN-TR и Μ13-T/R, 2 μΐ от 1 Ох лигиращ буфер и 10 части от Т4 ДНК за лигиране; прибавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 20 μΐ. Лигирането се осъществява при 16°С за 12 h.
μΐ от получената лигирана смес се смесват с 200 μΐ от Е. coli JM105 (АТСС 47016) устойчиви клетки и към сместа се прибавят 8 μΐ от 0.2М IPIG разтвор, 100 μΐ от преди култивирането спомагателни клетки (Е. coli JM105), 3 ml от 2xYT висш агар-агар (мек агар-агар; 16 g Бактотриптон, 10 g екстракт от дрожди, 5 g NaCI, 5 g бактоагар-агар/1) и 25 μΐ от 4% Х-гел. Сместа се разпределя на Min А плоча (10.5 gKH2PO4, 1 g (NH4)2SO4, 0.5 g Na-цитрат, 12 g Бактоагарагар, 1 ml 20% MgSO4, 0.5 ml 1% витамин B, 10 ml 50% глюкоза/1), след което се култивира при 37°С за 12 h.
Получените в средата прозрачни плаки се събират, трансферират се към 2 ml от 2xYT течна среда, след което се култивират при 37°С за 5 h. Културата се центрофугира за отделяне на повърхността на вещество и към него се прибавят 1/4 обема от PEG/NaCl (20% полиетилен гликол, 2.5 MnaCl). М13 фаза се отделя от плаващото по повърхността вещество; от него се екстрахира ДНК, а нуклеотидната секвенция на областта на 5'-ия край на гена на волски хормон на растежа се потвърждава (виж фиг. 1).
Пример 3. Конструиране на експресионен вектор, включващ гена trpA за крайна транскрипция.
Стъпка 1. За получаване на trpA ген за крайна транскрипция и за инсерирането му във векторите на експресия на волски хормон на растежа, получени в пример 2, се синтезират следните праймъри:
Праймър PTRPATER:
’-GCTTTGTCGACTAATTAAAGCCC GCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCCT CGCGCGTTTCGGT-3 ’.
Праймър PTRPATER включва разпознавателен сайт за Sall и 25ти-50ти и 51ви-67ми нуклеотид съответстват на гена на транскрипционен терминатор trpA и нуклеотидната секвенция след 3'-ия край на гена на волски хормон на растежа във вектора, съответно.
Както е показано по-долу, плазмид PPBR3740 съответства на част от Amp гена в плазмид ptrphs BGH 1-13 и обхваща разпознавателен сайт за Pvul.
Плазмид PPBR3740:5’-TGACAACGATCG GAGGACCGAAGGA-3’.
Стъпка 2. В епруветка се поставят 1 ng от плазмид ptrphs BGH 1-13 като матрица, 2 pg от всеки от праймърите PTRPATER и PPBR3740, приготвени в стъпка 1, 10 μΐ от 10х полимерен буфер (10 mM Tris-HCl, pH 8.3,500 тМ КС1,15 тМ MgCl2, 0.1% (w/v) желатин), 10 μΐ от 2 mM dNTP (всеки от dGTP, dATP, dCTP и dTTP е 2 mM) и 2.5 части от Taq ДНК полимераза; добавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 100 μΐ. Изпълнява се PCR чрез повторение 25 пъти на цикъла от: 95°С за 1 min, 55°С за 40 s и 72°С за 2 min.
Полученият PCR продукт се подлага на 1 % агар-агар гел електрофореза за потвърждаване, че се получават около 1.5 kb от ДНК. ДНК се пречиства по същия начин чрез агар-агар гел електрофореза и полученият фрагмент се нарича фрагмент PBR.
Стъпка 3. 2 μg от плазмид ptrphs BGH 113 напълно се смила със Sall и Pvul в NEB буфер 3 и получената смес се подлага на 0.7% агарагар гел електрофореза за отделяне на фрагмент от около 1.5 kb, който се нарича фрагмент PBGHP/L.
μg от плазмид ptrphs BGHRAN #5, получен в стъпка 1 от пример 2, изцяло се смила със Sall и Pvul в NEB буфер 3 и получената смес се подлага на 0.7% агар-агар гел електрофореза за отделяне на около 1.5 kb фрагмент, който се нарича фрагмент PBGHRAN-P/L.
Впоследствие 2 μg от фрагмент PBR, получен в стъпка 2, изцяло се смила със Sall и Pvul в NEB буфер 3. Полученият ДНК фрагмент се екстрахира с фенол/хлороформ и след това се разтваря в 20 μΐ от ТЕ буфер. ДНК фрагмен тът се нарича фрагмент PBR-P/L.
Чрез получените по-горе ДНК фрагменти се извършва лигиране. В две епруветки А и В се поставят по 100 ng от всеки от фрагментите PBGH-P/L и PBGHRAN-P/L, съответно. Към всяка от епруветките се добавят по 100 ng от фрагмент PBR-P/L, 2 μΐ от 10х лигиращ буфер и 10 части от Т4 ДНК лигаза; прибавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 20 μΐ. Лигирането се извършва при 16°С за 12 h.
Е. coli W3110 (АТСС 37339) клетки са трансформирани с лигираните смеси в съответствие с СаС12 метод (Маниатис и колектив, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) за получаване на рекомбинирани Е. coli трансформанти, съдържащи плазмид ptrp3H BGH 1-13 (епруветка А) или плазмид ptrp3H BGHRAN (епруветка В) (виж фиг. 2).
Пример 4. Експресия на волски хормон на растежа чрез използване на вектори за експресия, включващи модифициран ген на волски хормон на растежа и trpA терминатор
Е. coli трансформанти, получени в пример 3, се култивират с разклащане в течна Luria среда (6% Бактотриптон, 0,5% екстракт от дрожди, 1% NaCl), включваща 50 μg/μl ампицилин при 37°С за 12 h. 3 μΐ от културата се трансферира в 300 μΐ от М9 среда (40 тМ К2НР04, 22 тМ КН2РО4,8.3 тМ NaCl, 18.7 тМ NH4C1,1% глюкоза, 0.1 тМ MgSO4, 0.1 тМ СаС12, 0.4% казамино киселина, 10 μg/μl витамин Вр 40 μg/μl ампицилин) и се култивира с разклащане при 37°С за 4 h.
Когато O.D. стойността на културата при 650 шп достигне ниво от около 0.3, към културата се добавя индолакрилна киселина (IAA) за получаване на крайна концентрация от 50 μg/μl. След 4 h се определя O.D. на получената култура и тя се центрофугира с центрофуга (Бекман J2-21, JA14 rotor) при 11,000 o6./min за 25 min за събиране на Е. coli клетъчните преципитати. Клетъчните преципитати се подлагат на 15% SDS-PAGE в съответствие с метода на Лаемли (Nature, 227 680(1970) за потвърждаване на експресията на волски хормон на растежа. Резултатът е показан на фиг. 3.
Както е показано на фиг. 3, количеството волски хормон на растежа, получено чрез Е. coli клетки, трансформирани с плазмиди ptrp3H BGH 1-13 или ptrp3H BGHRAN са 39.9% и 57.3%, съ7 ответно, на база на общото количество протеини, получени в клетката. Тези количества са с 40-50% по-големи в сравнение с количествата, получени от Е. coli, трансформирани с плазмиди ptrphs BGH 1-13 и ptrphs BGHRAN #5, т.е. 26.3% и 39.9%, съответно (виж фиг. 4).
Е. coli W3110, трансформирани с плазмид ptrp3H BGHRAN, са депозирани на 26 декември 1994 год. при Korean Collection for Type Cultures (KCTC) (Адрес: GERI, KIST, P.O. Box 115, Yusong, Taejon, 305-600, KR) c номер от KCTC 0143BP, съгласно условията на Споразумението от Будапеща за Международните правила за депозиране на микроорганизми за целите на патентните процедури.
Изобретението е представено от гледна точка на изложените специфични описания, но трябва да се приеме, че могат да бъдат направени различни модификации и промени към него от специалисти в областта, които промени също попадат в обхвата на изобретението, както е посочено в приложените претенции.
Claims (7)
1. Вектор за експресия на волски хормон на растежа, който включва модифициран ген на волски хормон на растежа, в който нуклеотидната секвенция в региона на 5'-ия му край е модифицирана без промяна на кодираната аминокиселинна секвенция и се инсерира trpA край на транскрипцията след 3 ’-ия край на гена.
2. Вектор за експресия съгласно претенция 1, в който областта на 5 ’-ия края на модифицирания ген на волския хормон на растежа включва нуклеотидна секвенция от:
3. Вектор за експресия съгласно претенция 1, в който транскрипционният терминатор trp А включва нуклеотидна секвенция от: 5’-AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC
ТТТТТТТТ-3’.
4. Вектор за експресия съгласно претенция 3, който е плазмид ptrp3H BGHRAN (KCTC 0143ВР).
20 5. Клетка на Е. coli, трансформирана с век тор за експресия съгласно която и да е претенция от 1 до 4.
5, която е Е. coli W3110, трансформирана с плаз25 мид ptrp3H BGHRAN (KCTC 0143ВР).
5 5’-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT
CTA TCT GGC
CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG
CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3 ’
10 където ATG е начален кодон на ген на вол ски хормон на растежа.
6. Клетката на Е. coli съгласно претенция
7. Метод за масово производство на волски хормон на растежа, който включва култивиране на Е. coli трансформант съгласно претенция 5 и разделяне на волския хормон на растежа
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019940040025A KR100225511B1 (ko) | 1994-12-30 | 1994-12-30 | 소 성장호르몬의 대량 생산 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG100264A BG100264A (bg) | 1996-12-31 |
| BG64565B1 true BG64565B1 (bg) | 2005-07-29 |
Family
ID=36951464
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG100264A BG64565B1 (bg) | 1994-12-30 | 1995-12-28 | Вектор за експресия на волски хормон на растежа и метод за неговото масово производство |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3234478B2 (bg) |
| KR (1) | KR100225511B1 (bg) |
| AR (1) | AR000606A1 (bg) |
| AU (1) | AU713218B2 (bg) |
| BG (1) | BG64565B1 (bg) |
| BR (1) | BR9600009A (bg) |
| CO (1) | CO4480064A1 (bg) |
| NZ (1) | NZ280764A (bg) |
| TW (1) | TW505694B (bg) |
| ZA (1) | ZA9511030B (bg) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109182318A (zh) * | 2018-08-16 | 2019-01-11 | 湖北大学 | 一种利用pBV220表达载体高效表达色氨酸合成酶的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988005078A1 (en) * | 1986-12-31 | 1988-07-14 | Lucky, Ltd. | Method for the production of bovine growth hormone using a synthetic gene |
| DE4101736A1 (de) * | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Gruenenthal Gmbh | Neue als plasminogenaktivatoren einsetzbare polypeptide, dafuer codierende plasmide und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
-
1994
- 1994-12-30 KR KR1019940040025A patent/KR100225511B1/ko active IP Right Grant
-
1995
- 1995-12-21 NZ NZ280764A patent/NZ280764A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-12-28 BG BG100264A patent/BG64565B1/bg unknown
- 1995-12-28 JP JP34263295A patent/JP3234478B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-12-28 AU AU40768/95A patent/AU713218B2/en not_active Ceased
- 1995-12-28 ZA ZA9511030A patent/ZA9511030B/xx unknown
- 1995-12-28 CO CO95062000A patent/CO4480064A1/es unknown
-
1996
- 1996-01-02 BR BR9600009A patent/BR9600009A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-01-02 AR AR33489496A patent/AR000606A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-25 TW TW085106241A patent/TW505694B/zh not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109182318A (zh) * | 2018-08-16 | 2019-01-11 | 湖北大学 | 一种利用pBV220表达载体高效表达色氨酸合成酶的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ280764A (en) | 1997-02-24 |
| AU713218B2 (en) | 1999-11-25 |
| JPH08228787A (ja) | 1996-09-10 |
| CO4480064A1 (es) | 1997-07-09 |
| TW505694B (en) | 2002-10-11 |
| JP3234478B2 (ja) | 2001-12-04 |
| KR100225511B1 (ko) | 1999-10-15 |
| ZA9511030B (en) | 1996-07-09 |
| AR000606A1 (es) | 1997-07-10 |
| AU4076895A (en) | 1996-07-11 |
| BR9600009A (pt) | 1998-01-21 |
| KR960023059A (ko) | 1996-07-18 |
| BG100264A (bg) | 1996-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5470719A (en) | Modified OmpA signal sequence for enhanced secretion of polypeptides | |
| RU2129606C1 (ru) | ШТАММ ESCHERICHIA COLI JM 105, ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ПЛАЗМИДОЙ PAE12, - ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-АМИДИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PAE12, ЛИНИЯ КЛЕТОК С127 МЫШИ, ТРАНСФИЦИРОВАННАЯ ПЛАЗМИДОЙ PD BPV-ММТ NEO αАЕА75-ПРОДУЦЕНТ АЛЬФА-АМИДИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pd BPV-MMT Neo αAEA75 | |
| JP2766781B2 (ja) | ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物 | |
| JP3250968B2 (ja) | オリゴペプチド反復単位を有する大ポリペプチド | |
| RU2072393C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста | |
| ES2333942T3 (es) | Precursores de insulina y proceso para su preparacion. | |
| JPS5985292A (ja) | ヒト−レラキシン遺伝子 | |
| JPH04501807A (ja) | 尿酸オキシダーゼ活性蛋白質、それをコードした組換え遺伝子、発現ベクター、微生物および形質転換細胞 | |
| FR2464997A1 (fr) | Genes de la proinsuline humaine et de pre-proinsuline humaine, leur procede de preparation et leurs applications | |
| WO2002018570A1 (en) | Yeast transformant producing recombinant human parathyroid hormone and method for producing the hormone | |
| US4958007A (en) | Extraction of human interleukin-4- from bacteria | |
| US6342375B1 (en) | Modified methylotrophic Pichia pastoris yeast which secretes human growth hormone | |
| BG64565B1 (bg) | Вектор за експресия на волски хормон на растежа и метод за неговото масово производство | |
| CN1055314C (zh) | 从葡聚糖明串珠菌克隆和过量表达葡糖－6－磷酸脱氢酶 | |
| JPH0716433B2 (ja) | ウシ成長ホルモンの高レベル産生 | |
| AU643194B2 (en) | Recombinant fish hormone proteins | |
| CN113249241B (zh) | 一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用 | |
| EP0622460A2 (en) | Plasmid and escherichia coli transformed with it | |
| KR100427587B1 (ko) | 신규 ｄ-글루탐산 합성효소 유전자 ｄｎａ 및 이를 이용한 항생제 비의존성 벡터 | |
| RU2207374C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида, кодирующая поверхностный антиген (hbsag) вируса гепатита b, ее получение и штамм дрожжей hansenula polymorpha - продуцент поверхностного антигена (hbsag) вируса гепатита b | |
| EP0613496A1 (en) | Collagen-like polypeptides | |
| WO1990009434A1 (en) | Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells | |
| JP2003079379A (ja) | 成長ホルモンの高発現用ｄｎａおよびその使用 | |
| EP0363063A2 (en) | Sheep growth hormone | |
| AU647374B2 (en) | Sheep growth hormone |