JP3234478B2 - 牛成長ホルモンの大量生産方法 - Google Patents
牛成長ホルモンの大量生産方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、牛成長ホルモンの
５'−末端遺伝子の一部を、該末端にコードされるアミ
ノ酸配列を変えないで変異させるとともに、この牛成長
ホルモンの３'−末端の後にtrp Ａ転写ターミネーター
遺伝子を結合させて得られる発現ベクターを利用するこ
とによって牛成長ホルモンのみを大量に生産する方法に
関するものである。
５'−末端遺伝子の一部を、該末端にコードされるアミ
ノ酸配列を変えないで変異させるとともに、この牛成長
ホルモンの３'−末端の後にtrp Ａ転写ターミネーター
遺伝子を結合させて得られる発現ベクターを利用するこ
とによって牛成長ホルモンのみを大量に生産する方法に
関するものである。
【０００２】より詳細には、大韓民国特許出願第８６−
１１７１２号に開示された牛成長ホルモン遺伝子の塩基
配列を用いて該遺伝子の５'−末端部分にコードされる
アミノ酸配列を変化させないで、該５'−末端部分の塩
基配列のみをランダムに変化させるプライマー(primer)
を合成した後、これを用いて牛成長ホルモン遺伝子を大
量に増幅させ、また該遺伝子の３'−末端にtrpＡ転写タ
ーミネーターを連結させて得られる牛成長ホルモン遺伝
子を含む発現ベクターを用いることによって牛成長ホル
モン蛋白を大量製造する方法を提供する。
１１７１２号に開示された牛成長ホルモン遺伝子の塩基
配列を用いて該遺伝子の５'−末端部分にコードされる
アミノ酸配列を変化させないで、該５'−末端部分の塩
基配列のみをランダムに変化させるプライマー(primer)
を合成した後、これを用いて牛成長ホルモン遺伝子を大
量に増幅させ、また該遺伝子の３'−末端にtrpＡ転写タ
ーミネーターを連結させて得られる牛成長ホルモン遺伝
子を含む発現ベクターを用いることによって牛成長ホル
モン蛋白を大量製造する方法を提供する。
【０００３】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】これ
まで使われた動物成長促進剤はステロイド(steroid)系
の製品(例：Estradiol-Compudose、Eli Lilly社製、Est
radiol Benzoate-Synovax、Syntax Agribusiness Inc.
社製、Zeramol-Ralgro、International Minerals and C
hemicals社製)であったが、これらは脂溶性(fat−solub
le)であるため動物の体内に残留し、これを摂取すると
人体に悪い影響を及ぼすことが明らかになり、米国を初
め先進各国では現在使用を禁止している。
まで使われた動物成長促進剤はステロイド(steroid)系
の製品(例：Estradiol-Compudose、Eli Lilly社製、Est
radiol Benzoate-Synovax、Syntax Agribusiness Inc.
社製、Zeramol-Ralgro、International Minerals and C
hemicals社製)であったが、これらは脂溶性(fat−solub
le)であるため動物の体内に残留し、これを摂取すると
人体に悪い影響を及ぼすことが明らかになり、米国を初
め先進各国では現在使用を禁止している。
【０００４】一方、動物の脳下垂体で生産分泌される成
長ホルモンは不脂溶性であるとともに種特異性(Species
−Specific)を示し、動物の成長促進、乳牛の牛乳分泌
増加および飼料効率を高める効果があると判明した。
(参考文献：Bauman,D.E.et al.,Journal of Animal Sci
ence,60,583(1985);Hart,I.C.,et al.,Journal of Endo
crinology, 105,189(1985);Newswatch,June 17,1985;Wa
ll Street Journal,July22,1986)。このような成長ホル
モンは１９４０年以来、動物の脳下垂体から直接抽出、
精製して研究目的に使用されたが、この方法で生産でき
る量は極めて制限されており家畜業用に実用化すること
はできなかった。しかし、遺伝子工学技術の最近の発達
によりこのような動物成長ホルモンを大腸菌を利用して
大量に生産できるようになった。
長ホルモンは不脂溶性であるとともに種特異性(Species
−Specific)を示し、動物の成長促進、乳牛の牛乳分泌
増加および飼料効率を高める効果があると判明した。
(参考文献：Bauman,D.E.et al.,Journal of Animal Sci
ence,60,583(1985);Hart,I.C.,et al.,Journal of Endo
crinology, 105,189(1985);Newswatch,June 17,1985;Wa
ll Street Journal,July22,1986)。このような成長ホル
モンは１９４０年以来、動物の脳下垂体から直接抽出、
精製して研究目的に使用されたが、この方法で生産でき
る量は極めて制限されており家畜業用に実用化すること
はできなかった。しかし、遺伝子工学技術の最近の発達
によりこのような動物成長ホルモンを大腸菌を利用して
大量に生産できるようになった。
【０００５】シーバーグ(Seeburg)らは、牛の脳下垂体
から牛成長ホルモンをコードするｃＤＮＡを分離して塩
基配列およびアミノ酸配列を明らかにし、この遺伝子を
trpプロモーターを用いた大腸菌発現ベクターにクロー
ニングして発現させた(Seeburg,P.H.,et al.,DNA,2,37
(1983))。その後、多くの研究グループが牛成長ホルモ
ンの発現率を高めることを試みた。
から牛成長ホルモンをコードするｃＤＮＡを分離して塩
基配列およびアミノ酸配列を明らかにし、この遺伝子を
trpプロモーターを用いた大腸菌発現ベクターにクロー
ニングして発現させた(Seeburg,P.H.,et al.,DNA,2,37
(1983))。その後、多くの研究グループが牛成長ホルモ
ンの発現率を高めることを試みた。
【０００６】ジョウジ(George)らは、牛成長ホルモン遺
伝子のリボソーム結合部位(ribosome binding site)と
翻訳開始コドンＡＴＧとの間の塩基の配列および長さに
よって発現率が変化することを明らかにするとともに、
この部位の塩基を調節することによって大腸菌全蛋白対
比１５％の牛成長ホルモンを発現させた(George H.J.,e
t al.,DNA,4,273(1985))。オルセン(Olsen)らは，牛成
長ホルモン遺伝子のリボソーム結合部位と翻訳開始コド
ンＡＴＧとの間の塩基配列におけるＡ−Ｔ塩基対の割合
を多くしたものとtrpプロモーターを含む大腸菌発現ベ
クターを使って牛成長ホルモン遺伝子を発現させた結
果、大腸菌全蛋白対比１５％〜２０％の牛成長ホルモン
が生産されることを報告した(Olsen,M.K.,et al.,J.Bio
technol.,9,179(1989))。ワトソン(Watson)らは、牛成
長ホルモン遺伝子がクローニングされたプラスミドをラ
ンダム突然変異(random mutation)させた結果、牛成長
ホルモンのＮ末端の４個のアミノ酸をコードする塩基配
列中１個の塩基が置換された突然変異体を得、この変異
体を用いると大腸菌全蛋白対比２０％の牛成長ホルモン
が発現したことを報告した(Watson,et al.,Gene,86,137
(1990))。本発明者も、牛成長ホルモンの遺伝子を大腸
菌に適合するコドンをもって修正し、これをtrpプロモ
ーターの調節を受ける鮭成長ホルモン遺伝子を持つ大腸
菌発現ベクターにクローニングさせるとともに、リボソ
ーム結合部位と開始コドンＡＴＧとの間にｍＲＮＡ２次
構造が生じないように鮭成長ホルモン遺伝子と牛成長ホ
ルモン遺伝子との間に合成リンカーを連結して牛成長ホ
ルモンの発現ベクターを作った後、これを大腸菌で発現
させた結果、大腸菌全蛋白対比２７％の牛成長ホルモン
を生産し得たことを報告した(大韓民国特許公告第９２
−３６６５号)。
伝子のリボソーム結合部位(ribosome binding site)と
翻訳開始コドンＡＴＧとの間の塩基の配列および長さに
よって発現率が変化することを明らかにするとともに、
この部位の塩基を調節することによって大腸菌全蛋白対
比１５％の牛成長ホルモンを発現させた(George H.J.,e
t al.,DNA,4,273(1985))。オルセン(Olsen)らは，牛成
長ホルモン遺伝子のリボソーム結合部位と翻訳開始コド
ンＡＴＧとの間の塩基配列におけるＡ−Ｔ塩基対の割合
を多くしたものとtrpプロモーターを含む大腸菌発現ベ
クターを使って牛成長ホルモン遺伝子を発現させた結
果、大腸菌全蛋白対比１５％〜２０％の牛成長ホルモン
が生産されることを報告した(Olsen,M.K.,et al.,J.Bio
technol.,9,179(1989))。ワトソン(Watson)らは、牛成
長ホルモン遺伝子がクローニングされたプラスミドをラ
ンダム突然変異(random mutation)させた結果、牛成長
ホルモンのＮ末端の４個のアミノ酸をコードする塩基配
列中１個の塩基が置換された突然変異体を得、この変異
体を用いると大腸菌全蛋白対比２０％の牛成長ホルモン
が発現したことを報告した(Watson,et al.,Gene,86,137
(1990))。本発明者も、牛成長ホルモンの遺伝子を大腸
菌に適合するコドンをもって修正し、これをtrpプロモ
ーターの調節を受ける鮭成長ホルモン遺伝子を持つ大腸
菌発現ベクターにクローニングさせるとともに、リボソ
ーム結合部位と開始コドンＡＴＧとの間にｍＲＮＡ２次
構造が生じないように鮭成長ホルモン遺伝子と牛成長ホ
ルモン遺伝子との間に合成リンカーを連結して牛成長ホ
ルモンの発現ベクターを作った後、これを大腸菌で発現
させた結果、大腸菌全蛋白対比２７％の牛成長ホルモン
を生産し得たことを報告した(大韓民国特許公告第９２
−３６６５号)。
【０００７】一方、trpＡ転写ターミネーターは、非常
に効率的なrho−非依存性(rho-independent)ターミネー
ターであると報告されており(Christie,G.E.,et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78,4180(1981))、発現させよ
うとする遺伝子の３'−末端にtrpＡ転写ターミネーター
を挿入して不必要な転写過程を遮断することによってプ
ラスミドによる不必要な蛋白生産を抑制しながら所望の
蛋白のみを大量生産できると報告されている(Gentz,R.,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78,4936(1981))。
実際に、Matsukiらは、鼠のカルモジュリン(Calmoduli
n)遺伝子をtrpプロモーターおよびtrpＡ転写ターミネー
ターによって変成された遺伝子を含むベクターを大腸菌
に用いて発現させた結果、大腸菌全蛋白対比３０％の鼠
カルモジュリンが発現したことを報告し(Matsuki、S.,et
al.,Biotech.Appl.Biochem.,12,284(1990))、また、Sa
toらは、インターロイキン−２遺伝子をtrpプロモータ
ーの存在下大腸菌を用いて発現させた場合、trpＡ転写
ターミネーターを挿入することによって発現率が約５倍
増加したことを報告している(Sato,et al.,J.Biochem.,
101,525(1987))。
に効率的なrho−非依存性(rho-independent)ターミネー
ターであると報告されており(Christie,G.E.,et al.,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78,4180(1981))、発現させよ
うとする遺伝子の３'−末端にtrpＡ転写ターミネーター
を挿入して不必要な転写過程を遮断することによってプ
ラスミドによる不必要な蛋白生産を抑制しながら所望の
蛋白のみを大量生産できると報告されている(Gentz,R.,
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78,4936(1981))。
実際に、Matsukiらは、鼠のカルモジュリン(Calmoduli
n)遺伝子をtrpプロモーターおよびtrpＡ転写ターミネー
ターによって変成された遺伝子を含むベクターを大腸菌
に用いて発現させた結果、大腸菌全蛋白対比３０％の鼠
カルモジュリンが発現したことを報告し(Matsuki、S.,et
al.,Biotech.Appl.Biochem.,12,284(1990))、また、Sa
toらは、インターロイキン−２遺伝子をtrpプロモータ
ーの存在下大腸菌を用いて発現させた場合、trpＡ転写
ターミネーターを挿入することによって発現率が約５倍
増加したことを報告している(Sato,et al.,J.Biochem.,
101,525(1987))。
【０００８】
【課題を解決するための手段】しかし、前記の方法で牛
成長ホルモンを生産する場合、大腸菌全蛋白対比３０％
以上の収率が得られないという限界がある。本発明者
は、牛成長ホルモン発現率を更に高め得る発現ベクター
製作に鋭意努力した結果、牛成長ホルモン遺伝子の５'
−末端部分にコードされるアミノ酸配列を変化させずに
該部分の塩基配列のみをランダムに変化させ得るランダ
ムプライマーを用いて牛成長ホルモン遺伝子を合成した
後、この牛成長ホルモン遺伝子と該遺伝子の３'−末端
後に挿入されたtrpＡ転写ターミネーターを含む発現ベ
クターを大腸菌で発現させると、大腸菌全蛋白対比５０
％以上の高収率で牛成長ホルモンを大量発現できること
を発見した。
成長ホルモンを生産する場合、大腸菌全蛋白対比３０％
以上の収率が得られないという限界がある。本発明者
は、牛成長ホルモン発現率を更に高め得る発現ベクター
製作に鋭意努力した結果、牛成長ホルモン遺伝子の５'
−末端部分にコードされるアミノ酸配列を変化させずに
該部分の塩基配列のみをランダムに変化させ得るランダ
ムプライマーを用いて牛成長ホルモン遺伝子を合成した
後、この牛成長ホルモン遺伝子と該遺伝子の３'−末端
後に挿入されたtrpＡ転写ターミネーターを含む発現ベ
クターを大腸菌で発現させると、大腸菌全蛋白対比５０
％以上の高収率で牛成長ホルモンを大量発現できること
を発見した。
【０００９】従って、本発明の目的は、牛成長ホルモン
遺伝子の５'−末端の遺伝子塩基配列を変化させｍＲＮ
Ａの２次構造の形成を最小化するとともに３'−末端後
にｔｒｐＡ転写ターミネーターを挿入することによって
得られる遺伝子を含み、大腸菌において全蛋白対比５０
％以上の牛成長ホルモン発現を誘導できる発現ベクター
およびその製造方法を提供し、これに伴って大量の牛成
長ホルモンを安く供給することにある。
遺伝子の５'−末端の遺伝子塩基配列を変化させｍＲＮ
Ａの２次構造の形成を最小化するとともに３'−末端後
にｔｒｐＡ転写ターミネーターを挿入することによって
得られる遺伝子を含み、大腸菌において全蛋白対比５０
％以上の牛成長ホルモン発現を誘導できる発現ベクター
およびその製造方法を提供し、これに伴って大量の牛成
長ホルモンを安く供給することにある。
【００１０】本発明によって、牛成長ホルモン遺伝子の
５’−末端塩基配列が、この末端にコードされるアミノ
酸の配列を変化させずに変化させた牛成長ホルモン遺伝
子、および更に前記遺伝子の３'−末端に連結されたtrp
Ａ転写ターミネーター遺伝子が含まれることを特徴とす
る発現ベクター、前記ベクターによって形質転換された
大腸菌およびこれを用いて牛成長ホルモンを製造する方
法を提供するものである。
５’−末端塩基配列が、この末端にコードされるアミノ
酸の配列を変化させずに変化させた牛成長ホルモン遺伝
子、および更に前記遺伝子の３'−末端に連結されたtrp
Ａ転写ターミネーター遺伝子が含まれることを特徴とす
る発現ベクター、前記ベクターによって形質転換された
大腸菌およびこれを用いて牛成長ホルモンを製造する方
法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の発現ベクターは牛成長ホルモン遺伝子の５'−
末端部分の塩基配列が牛成長ホルモンｍＲＮＡの２次構
造の形成を最小化させることによって遺伝子の発現率を
高めるように変化させた牛成長ホルモン遺伝子を含み、
好ましくは下記のような塩基配列(配列番号：１)を有す
る５'−末端部分を含む： 5'−ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3'
本発明の発現ベクターは牛成長ホルモン遺伝子の５'−
末端部分の塩基配列が牛成長ホルモンｍＲＮＡの２次構
造の形成を最小化させることによって遺伝子の発現率を
高めるように変化させた牛成長ホルモン遺伝子を含み、
好ましくは下記のような塩基配列(配列番号：１)を有す
る５'−末端部分を含む： 5'−ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3'
【００１２】また本発明の発現ベクターは牛成長ホルモ
ン遺伝子の３'−末端に連結されたtrpＡ転写ターミネー
ターを含み、trpＡ転写ターミネーターは好ましくは次
の塩基配列(配列番号：２)を有する。 5'-AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTTT- 3'
ン遺伝子の３'−末端に連結されたtrpＡ転写ターミネー
ターを含み、trpＡ転写ターミネーターは好ましくは次
の塩基配列(配列番号：２)を有する。 5'-AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTTT- 3'
【００１３】このような本発明の発現ベクターは公知の
遺伝子組換えまたは合成方法を用いて製造することがで
き、例えば次のような方法で製造することができる。先
ず、牛成長ホルモンをコードする塩基配列情報(韓国特
許公告第９２−３６６５号)に基づき、牛成長ホルモン
遺伝子の５'−末端塩基配列を変化させるために行うポ
リメラーゼ連鎖反応法(polymerase chain reaction,PC
R)に用いられるランダムプライマー(random primer)を
合成する。このランダムプライマーは、牛成長ホルモン
遺伝子が制限酵素ＳacＩの認識部位を含むように考案さ
れているとともにアミノ酸の配列を変化させずに塩基配
列のみがランダムに変化するように設計されている。ま
た牛成長ホルモン遺伝子がクローニングされた組換えベ
クターptrphs ＢＧＨ １−１３(大韓民国特許公告第
９２−３６６５号：ＡＴＣＣ ６８９７５(１９９２.
５.６寄託))の唯一の制限酵素ＰvuＩ認知部位を含むよ
うに設計されたプライマーを合成した後、このプライマ
ーとランダムプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反
応を行うことによって牛成長ホルモン遺伝子の５'−末
端の塩基配列を変化させた変異遺伝子を増幅し、増幅さ
れた遺伝子を制限酵素で切断して得られる遺伝子断片
と、ptrphs ＢＧＨ １−１３組換えベクターを制限酵
素ＰvuＩとＳacＩで切断して得られる断片とを接合させ
た後、大腸菌を形質転換させてptrphs ＢＧＨＲＡＮプ
ラスミドを得る。
遺伝子組換えまたは合成方法を用いて製造することがで
き、例えば次のような方法で製造することができる。先
ず、牛成長ホルモンをコードする塩基配列情報(韓国特
許公告第９２−３６６５号)に基づき、牛成長ホルモン
遺伝子の５'−末端塩基配列を変化させるために行うポ
リメラーゼ連鎖反応法(polymerase chain reaction,PC
R)に用いられるランダムプライマー(random primer)を
合成する。このランダムプライマーは、牛成長ホルモン
遺伝子が制限酵素ＳacＩの認識部位を含むように考案さ
れているとともにアミノ酸の配列を変化させずに塩基配
列のみがランダムに変化するように設計されている。ま
た牛成長ホルモン遺伝子がクローニングされた組換えベ
クターptrphs ＢＧＨ １−１３(大韓民国特許公告第
９２−３６６５号：ＡＴＣＣ ６８９７５(１９９２.
５.６寄託))の唯一の制限酵素ＰvuＩ認知部位を含むよ
うに設計されたプライマーを合成した後、このプライマ
ーとランダムプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反
応を行うことによって牛成長ホルモン遺伝子の５'−末
端の塩基配列を変化させた変異遺伝子を増幅し、増幅さ
れた遺伝子を制限酵素で切断して得られる遺伝子断片
と、ptrphs ＢＧＨ １−１３組換えベクターを制限酵
素ＰvuＩとＳacＩで切断して得られる断片とを接合させ
た後、大腸菌を形質転換させてptrphs ＢＧＨＲＡＮプ
ラスミドを得る。
【００１４】また、trpＡ転写ターミネーターを牛成長
ホルモン発現ベクターに挿入する目的のために、trpＡ
転写ターミネーター遺伝子および制限酵素ＳalＩ認識部
位を含むようにプライマーを合成するとともに、またプ
ライマーはptrphs ＢＧＨＲＡＮ組換えベクターの唯一
の制限酵素ＰvuＩ認識部位を含むようにプライマーを合
成した後、これらプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行って遺伝子を増幅した後、この増幅された遺伝
子を制限酵素で切断して得た遺伝子断片とptrphs ＢＧ
ＨＲＡＮプラスミドを制限酵素ＰvuＩとＳalＩで切断し
て得た遺伝子断片を連結した後、連結混合物で大腸菌を
形質転換させてptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮプラスミドを得
る。
ホルモン発現ベクターに挿入する目的のために、trpＡ
転写ターミネーター遺伝子および制限酵素ＳalＩ認識部
位を含むようにプライマーを合成するとともに、またプ
ライマーはptrphs ＢＧＨＲＡＮ組換えベクターの唯一
の制限酵素ＰvuＩ認識部位を含むようにプライマーを合
成した後、これらプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応を行って遺伝子を増幅した後、この増幅された遺伝
子を制限酵素で切断して得た遺伝子断片とptrphs ＢＧ
ＨＲＡＮプラスミドを制限酵素ＰvuＩとＳalＩで切断し
て得た遺伝子断片を連結した後、連結混合物で大腸菌を
形質転換させてptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮプラスミドを得
る。
【００１５】このような本発明の発現ベクターを用いて
発現に好適な大腸菌を形質転換させて大腸菌形質転換体
を調製し、この大腸菌形質転換体を適切な培地で培養し
た後、発現した高収率の牛成長ホルモンを分離・精製し
て生産する。
発現に好適な大腸菌を形質転換させて大腸菌形質転換体
を調製し、この大腸菌形質転換体を適切な培地で培養し
た後、発現した高収率の牛成長ホルモンを分離・精製し
て生産する。
【００１６】以下、本発明を実施例に基づいてより具体
的に説明するが、下記実施例は本発明を例示するもので
あって制限するものではない。 実施例１：５'−末端に修飾した塩基配列を有する牛成
長ホルモン遺伝子の増幅および修飾牛成長ホルモンの発
現ベクターの製作 (段階１)クローニングされた牛成長ホルモン遺伝子の塩
基配列(大韓民国特許公告第９２−３６６５号)の情報か
ら次のようなランダムプライマーを合成した。プライマ
ーＰＢＧＨＲＡＮ(5'-TGCTGAGCTC GNAGNACNGC RTTNGCRA
AN AGNCCNGANA GNGACATNGC NGGRAANGCC ATTTATAATT CCT
CCA-3')(配列番号：３)は制限酵素ＳacＩ認識部位を有
しており、牛成長ホルモン遺伝子の５'−末端部分がコ
ードする１６個のアミノ酸配列を変化させずに塩基配列
のみを変化させたものである。前記配列中、ＮはＡ，
Ｔ，ＧまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである。プライ
マーＰＰＢＲ３７２０(5'-TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTC
A-3')(配列番号：４)は牛成長ホルモン発現ベクターで
あるptrphs ＢＧＨ １−１３のＡmpr遺伝子に位置す
るとともに制限酵素ＰvuＩ認識部位を含んでいる。
的に説明するが、下記実施例は本発明を例示するもので
あって制限するものではない。 実施例１：５'−末端に修飾した塩基配列を有する牛成
長ホルモン遺伝子の増幅および修飾牛成長ホルモンの発
現ベクターの製作 (段階１)クローニングされた牛成長ホルモン遺伝子の塩
基配列(大韓民国特許公告第９２−３６６５号)の情報か
ら次のようなランダムプライマーを合成した。プライマ
ーＰＢＧＨＲＡＮ(5'-TGCTGAGCTC GNAGNACNGC RTTNGCRA
AN AGNCCNGANA GNGACATNGC NGGRAANGCC ATTTATAATT CCT
CCA-3')(配列番号：３)は制限酵素ＳacＩ認識部位を有
しており、牛成長ホルモン遺伝子の５'−末端部分がコ
ードする１６個のアミノ酸配列を変化させずに塩基配列
のみを変化させたものである。前記配列中、ＮはＡ，
Ｔ，ＧまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである。プライ
マーＰＰＢＲ３７２０(5'-TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTC
A-3')(配列番号：４)は牛成長ホルモン発現ベクターで
あるptrphs ＢＧＨ １−１３のＡmpr遺伝子に位置す
るとともに制限酵素ＰvuＩ認識部位を含んでいる。
【００１７】(段階２)反応管に牛成長ホルモン発現ベク
ターptrphs ＢＧＨ １−１３(大韓民国特許公告第９
２−３６６５号参照、ＡＴＣＣ ６８９７５)１ngと段
階１で作ったプライマーＰＢＧＨＲＡＮ ２μgおよび
プライマーＰＰＢＲ ３７２０ ３μgを鋳型に入れた
後、１０μlの１０ｘポリメラーゼ反応緩衝溶液、１０
μlの場合ｄＮＴＰ(ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰおよ
びｄＴＴＰを各々２mＭ含む)と２.５単位のＴaqポリメ
ラーゼを加え蒸留水で総容量を１００μlにした後、９
５℃で１分(denaturation)、５５℃で４０秒(annealin
g)、７２℃に２分(polymerization)の条件でポリメラー
ゼ連鎖反応を２５回行った。ここで得たＰＣＲ産物を５
％ポリアクリルアミドゲルを用いて分離した結果、約９
９０塩基対のＤＮＡが増幅されたことが確認され、この
ＤＮＡを同一のポリアクリルアミドゲルを用いて分離精
製した。以下この断片をＢＧＨＲＡＮと称する。
ターptrphs ＢＧＨ １−１３(大韓民国特許公告第９
２−３６６５号参照、ＡＴＣＣ ６８９７５)１ngと段
階１で作ったプライマーＰＢＧＨＲＡＮ ２μgおよび
プライマーＰＰＢＲ ３７２０ ３μgを鋳型に入れた
後、１０μlの１０ｘポリメラーゼ反応緩衝溶液、１０
μlの場合ｄＮＴＰ(ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰおよ
びｄＴＴＰを各々２mＭ含む)と２.５単位のＴaqポリメ
ラーゼを加え蒸留水で総容量を１００μlにした後、９
５℃で１分(denaturation)、５５℃で４０秒(annealin
g)、７２℃に２分(polymerization)の条件でポリメラー
ゼ連鎖反応を２５回行った。ここで得たＰＣＲ産物を５
％ポリアクリルアミドゲルを用いて分離した結果、約９
９０塩基対のＤＮＡが増幅されたことが確認され、この
ＤＮＡを同一のポリアクリルアミドゲルを用いて分離精
製した。以下この断片をＢＧＨＲＡＮと称する。
【００１８】(段階３)プラスミドptrphs ＢＧＨ １−
１３ ２μgをでＮＥＢ(New England Biolab.社)緩衝溶
液１(１０mＭ Bis Trispropane−ＨＣl，１０mＭ Ｍg
Ｃl2，１mＭＤＴＴ，pＨ ７.０)中で制限酵素ＳacＩを
用いて完全切断した後、引き続いてＮＥＢ緩衝溶液３
(１００mＭ ＮaＣl，５０mＭ Tris−ＨＣl，１０mＭ
ＭgＣl2，１ｍＭ ＤＴＴ，pＨ７.９)中で制限酵素Ｐv
uＩを用いて完全切断し、０.７％アガロースゲルを用い
て約２kb断片を分離した。以下この断片を断片ＰＢＧＨ
−Ｔ／Ｐと称する。一方、段階２で得た断片ＢＧＨＲＡ
ＮをＮＥＢ緩衝溶液１中で制限酵素ＳacＩを用いて完全
切断した後、さらにＮＥＢ緩衝溶液３中で制限酵素Ｐvu
Ｉを用いて完全切断した後、フェノール／クロロホルム
で抽出して２０μlのＴＥ溶液に溶解した。こうして得
られた断片を断片ＢＧＨＲＡＮ−Ｔ／Ｐと称する。
１３ ２μgをでＮＥＢ(New England Biolab.社)緩衝溶
液１(１０mＭ Bis Trispropane−ＨＣl，１０mＭ Ｍg
Ｃl2，１mＭＤＴＴ，pＨ ７.０)中で制限酵素ＳacＩを
用いて完全切断した後、引き続いてＮＥＢ緩衝溶液３
(１００mＭ ＮaＣl，５０mＭ Tris−ＨＣl，１０mＭ
ＭgＣl2，１ｍＭ ＤＴＴ，pＨ７.９)中で制限酵素Ｐv
uＩを用いて完全切断し、０.７％アガロースゲルを用い
て約２kb断片を分離した。以下この断片を断片ＰＢＧＨ
−Ｔ／Ｐと称する。一方、段階２で得た断片ＢＧＨＲＡ
ＮをＮＥＢ緩衝溶液１中で制限酵素ＳacＩを用いて完全
切断した後、さらにＮＥＢ緩衝溶液３中で制限酵素Ｐvu
Ｉを用いて完全切断した後、フェノール／クロロホルム
で抽出して２０μlのＴＥ溶液に溶解した。こうして得
られた断片を断片ＢＧＨＲＡＮ−Ｔ／Ｐと称する。
【００１９】前記で得た断片を用いて次のように接合反
応を行った。反応管に、前記の断片ＢＧＨＲＡＮ−Ｔ／
Ｐ１００ng、断片ＰＢＧＨ−Ｔ／Ｐ１００ng、２μlの
１０ｘ接合緩衝溶液と１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
入れ総容量が２０μlになるように蒸留水を加えた後、
１６℃で１２時間反応させた。この接合反応物を用いて
大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ３７３３９)を形質転換さ
せて断片ＢＧＨＲＡＮを含むプラスミドptrphs ＢＧＨ
ＲＡＮを得た(図２)。
応を行った。反応管に、前記の断片ＢＧＨＲＡＮ−Ｔ／
Ｐ１００ng、断片ＰＢＧＨ−Ｔ／Ｐ１００ng、２μlの
１０ｘ接合緩衝溶液と１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを
入れ総容量が２０μlになるように蒸留水を加えた後、
１６℃で１２時間反応させた。この接合反応物を用いて
大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ３７３３９)を形質転換さ
せて断片ＢＧＨＲＡＮを含むプラスミドptrphs ＢＧＨ
ＲＡＮを得た(図２)。
【００２０】実施例２：５'−末端に修飾した塩基配列
を有する牛成長ホルモン遺伝子の発現誘導およびその塩
基配列の確認 (段階１)前記実施例１で得た組換え大腸菌コロニー１０
０余個を５０μg／mlのアンピシリンが含まれた液体ル
リア(Luria)培地(６％バクトトリップトン、０.５％酵
母抽出物、１％塩化ナトリウム)中で１２時間培養した
後、この培養液３mlを３００mlのＭ９培地(４０mＭ Ｋ
2ＨＰＯ4，２２mＭ ＫＨ2ＰＯ4，８.５mＭ ＮaＣl，
１８.７mＭ ＮＨ4Ｃl，１％グルコース，０.１mＭ Ｍ
gＳＯ4，０.１mＭＣaＣl2，０.４％カサミノ酸、１０μ
g／ml Ｖit.Ｂ１、４０μg／mlアンピシリン)に移して
３７℃で約４時間振盪培養し、細菌の６５０nmの波長で
の吸光度が約０.３程度になったときインドールアクリ
ル酸(indoleacrylic acid，ＩＡＡ)を最終濃度５０μg
／mlとなるように加えた。ＩＡＡを加えてから約４時間
後に細胞培養液の吸光度を測定した後、遠心分離器(Bec
kman J2-21,JA14 rotor)を用いて１１,０００rpmで２５
分間遠心分離して細菌細胞沈澱物を取り集め、この細胞
沈澱物をレムリの方法(Laemmli,Nature,227,680(1970))
によってＳＤＳの存在下に１５％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いて電気泳動させて牛成長ホルモンの発現度を測
定した。この結果、プラスミドptrphs ＢＧＨ １−１
３を含む対照大腸菌に比べて牛成長ホルモンの発現量が
４０％増加したクローンを選別し、これに含まれるプラ
スミドをptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５と命名した(図
３)。
を有する牛成長ホルモン遺伝子の発現誘導およびその塩
基配列の確認 (段階１)前記実施例１で得た組換え大腸菌コロニー１０
０余個を５０μg／mlのアンピシリンが含まれた液体ル
リア(Luria)培地(６％バクトトリップトン、０.５％酵
母抽出物、１％塩化ナトリウム)中で１２時間培養した
後、この培養液３mlを３００mlのＭ９培地(４０mＭ Ｋ
2ＨＰＯ4，２２mＭ ＫＨ2ＰＯ4，８.５mＭ ＮaＣl，
１８.７mＭ ＮＨ4Ｃl，１％グルコース，０.１mＭ Ｍ
gＳＯ4，０.１mＭＣaＣl2，０.４％カサミノ酸、１０μ
g／ml Ｖit.Ｂ１、４０μg／mlアンピシリン)に移して
３７℃で約４時間振盪培養し、細菌の６５０nmの波長で
の吸光度が約０.３程度になったときインドールアクリ
ル酸(indoleacrylic acid，ＩＡＡ)を最終濃度５０μg
／mlとなるように加えた。ＩＡＡを加えてから約４時間
後に細胞培養液の吸光度を測定した後、遠心分離器(Bec
kman J2-21,JA14 rotor)を用いて１１,０００rpmで２５
分間遠心分離して細菌細胞沈澱物を取り集め、この細胞
沈澱物をレムリの方法(Laemmli,Nature,227,680(1970))
によってＳＤＳの存在下に１５％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いて電気泳動させて牛成長ホルモンの発現度を測
定した。この結果、プラスミドptrphs ＢＧＨ １−１
３を含む対照大腸菌に比べて牛成長ホルモンの発現量が
４０％増加したクローンを選別し、これに含まれるプラ
スミドをptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５と命名した(図
３)。
【００２１】(段階２)前記段階１で選別されたptrphs
ＢＧＨＲＡＮ ＃５クローンの塩基配列を確認するため
にサンガー(Sangar)らの方法による実験を次のように行
った。先ず、プラスミドptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５
２μgをＮＥＢ緩衝溶液１中で制限酵素ＳacＩを用いて
完全切断した後、次いでＮＥＢ緩衝溶液３中で制限酵素
ＥcoＲＩを用いて完全切断し、７％アクリルアミドゲル
を用いて約１８７塩基対のＤＮＡ断片を分離精製した。
以下このＤＮＡ断片を断片ＢＧＨＲＡＮ−Ｔ／Ｒと称す
る。一方、プラスミドＭ１３mp１８ ２μgをＮＥＢ緩
衝溶液１で制限酵素ＳacＩを用いて完全切断した後、Ｎ
ＥＢ緩衝溶液３で制限酵素ＥcoＲＩを用いて完全切断し
た。その後反応混合物は０.７％アガロースゲルを用い
て約７kbのＤＮＡ断片を分離した。以下このＤＮＡ断片
を断片Ｍ１３−Ｔ／Ｒと称する。前記の断片ＢＧＨＲＡ
Ｎ−Ｔ／Ｒ１００ng、断片Ｍ１３−Ｔ／Ｒ１００ng、２
μlの１０ｘ接合緩衝溶液および１０単位の４ＤＮＡリ
ガーゼを接合反応容器に入れ蒸留水で総容量を２０μl
にした後、１６℃で１２時間反応させた。この接合反応
物１０μlを大腸菌ＪＭ１０５(ＡＴＣＣ ４７０１６)
コンピテント(competent)細胞２００μlと混合した後、
ここに、８μlの０.２Ｍ ＩＰＴＧ溶液、予め培養され
たヘルパー(helper)細胞(大腸菌ＪＭ１０５)１００μ
l、３mlの２ＸＹＴ上層寒天(軟性寒天：１６ｇバクトト
リップトン、１０ｇ酵母抽出物、５g ＮaＣl、５ｇバ
クト寒天／ｌ)と２５μlの４％Ｘ−gal溶液を加えた。
この混合物を、Ｍｉｎ Ａプレート(１０.５g ＫＨ2Ｐ
Ｏ4，１g(ＮＨ4)2ＳＯ4、０.５ｇクエン酸ナトリウム、
１２gバクト寒天、１ml２０％ＭgＳＯ4、０.５ml１％Ｖ
itＢ、１０mlの５０％グルコース／ｌ)上に塗布した
後、３７℃で１２時間培養して生成させた透明なプラー
ク(plaque)を選り分けて２mlの２ＸＹＴ液体培地に移し
て３７℃、５時間培養した後、遠心分離して得た上澄液
に１／４容積のＰＥＧ／ＮaＣl(２０％polyethylene gl
ycol，２.５Ｍ ＮaＣl)を加えた後、Ｍ１３ファージ(p
hage)を分離した後、一本鎖ＤＮＡを抽出し、牛成長ホ
ルモン遺伝子の５'−末端塩基の配列を確認した(図
１)。
ＢＧＨＲＡＮ ＃５クローンの塩基配列を確認するため
にサンガー(Sangar)らの方法による実験を次のように行
った。先ず、プラスミドptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５
２μgをＮＥＢ緩衝溶液１中で制限酵素ＳacＩを用いて
完全切断した後、次いでＮＥＢ緩衝溶液３中で制限酵素
ＥcoＲＩを用いて完全切断し、７％アクリルアミドゲル
を用いて約１８７塩基対のＤＮＡ断片を分離精製した。
以下このＤＮＡ断片を断片ＢＧＨＲＡＮ−Ｔ／Ｒと称す
る。一方、プラスミドＭ１３mp１８ ２μgをＮＥＢ緩
衝溶液１で制限酵素ＳacＩを用いて完全切断した後、Ｎ
ＥＢ緩衝溶液３で制限酵素ＥcoＲＩを用いて完全切断し
た。その後反応混合物は０.７％アガロースゲルを用い
て約７kbのＤＮＡ断片を分離した。以下このＤＮＡ断片
を断片Ｍ１３−Ｔ／Ｒと称する。前記の断片ＢＧＨＲＡ
Ｎ−Ｔ／Ｒ１００ng、断片Ｍ１３−Ｔ／Ｒ１００ng、２
μlの１０ｘ接合緩衝溶液および１０単位の４ＤＮＡリ
ガーゼを接合反応容器に入れ蒸留水で総容量を２０μl
にした後、１６℃で１２時間反応させた。この接合反応
物１０μlを大腸菌ＪＭ１０５(ＡＴＣＣ ４７０１６)
コンピテント(competent)細胞２００μlと混合した後、
ここに、８μlの０.２Ｍ ＩＰＴＧ溶液、予め培養され
たヘルパー(helper)細胞(大腸菌ＪＭ１０５)１００μ
l、３mlの２ＸＹＴ上層寒天(軟性寒天：１６ｇバクトト
リップトン、１０ｇ酵母抽出物、５g ＮaＣl、５ｇバ
クト寒天／ｌ)と２５μlの４％Ｘ−gal溶液を加えた。
この混合物を、Ｍｉｎ Ａプレート(１０.５g ＫＨ2Ｐ
Ｏ4，１g(ＮＨ4)2ＳＯ4、０.５ｇクエン酸ナトリウム、
１２gバクト寒天、１ml２０％ＭgＳＯ4、０.５ml１％Ｖ
itＢ、１０mlの５０％グルコース／ｌ)上に塗布した
後、３７℃で１２時間培養して生成させた透明なプラー
ク(plaque)を選り分けて２mlの２ＸＹＴ液体培地に移し
て３７℃、５時間培養した後、遠心分離して得た上澄液
に１／４容積のＰＥＧ／ＮaＣl(２０％polyethylene gl
ycol，２.５Ｍ ＮaＣl)を加えた後、Ｍ１３ファージ(p
hage)を分離した後、一本鎖ＤＮＡを抽出し、牛成長ホ
ルモン遺伝子の５'−末端塩基の配列を確認した(図
１)。
【００２２】実施例３：trpＡ転写ターミネーター遺伝
子を有する発現ベクターの製作 (段階１)trpＡターミネーター遺伝子を前記実施例２で
製作した牛成長ホルモン発現ベクターに挿入するために
次のようなプライマーを合成した。プライマーＰＴＲＰ
ＡＴＥＲ (5'-GCTTTGTCGA CTAATTAAAG CCCGCCTAAT GAG
CGGGCTT TTTTTTGCCT CGCGCGTTTC GGT-3')(配列番号：
５)は制限酵素ＳacＩ認識部位を含み、２３番目から５
０番目までの塩基部分はtrpＡ転写ターミネーター遺伝
子を示し、５１番目から６７番目までの塩基部分は発現
ベクター内の牛成長ホルモン遺伝子３'末端からの塩基
配列を示している。プライマーＰＰＢＲ３７４０(5'-TG
ACAACGAT CGGAGGACCG AAGGA-3')(配列番号：６)は牛成
長ホルモンの発現ベクターptrphs ＢＧＨ １−１３の
Ａｍｐr遺伝子に位置するとともに制限酵素Ｐvu Ｉ認識
部位を含んでいる。
子を有する発現ベクターの製作 (段階１)trpＡターミネーター遺伝子を前記実施例２で
製作した牛成長ホルモン発現ベクターに挿入するために
次のようなプライマーを合成した。プライマーＰＴＲＰ
ＡＴＥＲ (5'-GCTTTGTCGA CTAATTAAAG CCCGCCTAAT GAG
CGGGCTT TTTTTTGCCT CGCGCGTTTC GGT-3')(配列番号：
５)は制限酵素ＳacＩ認識部位を含み、２３番目から５
０番目までの塩基部分はtrpＡ転写ターミネーター遺伝
子を示し、５１番目から６７番目までの塩基部分は発現
ベクター内の牛成長ホルモン遺伝子３'末端からの塩基
配列を示している。プライマーＰＰＢＲ３７４０(5'-TG
ACAACGAT CGGAGGACCG AAGGA-3')(配列番号：６)は牛成
長ホルモンの発現ベクターptrphs ＢＧＨ １−１３の
Ａｍｐr遺伝子に位置するとともに制限酵素Ｐvu Ｉ認識
部位を含んでいる。
【００２３】(段階２)反応管に牛成長ホルモン発現ベク
ターptrphs ＢＧＨ １−１３ 1ngを、段階１で作っ
たプライマーＰＴＲＰＡＴＥＲ２μgおよびプライマー
ＰＰＢＲ３７４０２μgとともに鋳型に入れた後、１０
μlの１０ｘポリメラーゼ反応緩衝溶液、１０μlの場合
ｄＮＴＰ(ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを
各々２ｍＭ含む）および２.５単位Ｔaqポリメラーゼを
加えた蒸留水で総容量を１００μlにした後、９５℃で
１分、５５℃で４０秒、７２℃で２分の条件で重合連鎖
反応を２５回行った。生成したＰＣＲ産物を１％アガロ
ースゲルを用いて分離した結果、約１.５kb塩基対のＤ
ＮＡが増幅されたことを確認し、このＤＮＡを同一のア
ガロースゲルを使って分離精製した。以下このＤＮＡ断
片を断片ＰＢＲと称する。
ターptrphs ＢＧＨ １−１３ 1ngを、段階１で作っ
たプライマーＰＴＲＰＡＴＥＲ２μgおよびプライマー
ＰＰＢＲ３７４０２μgとともに鋳型に入れた後、１０
μlの１０ｘポリメラーゼ反応緩衝溶液、１０μlの場合
ｄＮＴＰ(ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを
各々２ｍＭ含む）および２.５単位Ｔaqポリメラーゼを
加えた蒸留水で総容量を１００μlにした後、９５℃で
１分、５５℃で４０秒、７２℃で２分の条件で重合連鎖
反応を２５回行った。生成したＰＣＲ産物を１％アガロ
ースゲルを用いて分離した結果、約１.５kb塩基対のＤ
ＮＡが増幅されたことを確認し、このＤＮＡを同一のア
ガロースゲルを使って分離精製した。以下このＤＮＡ断
片を断片ＰＢＲと称する。
【００２４】(段階３)プラスミドptrphs ＢＧＨ １−
１３(ＡＴＣＣ ６８９７５)２μgをＮＥＢ緩衝溶液３
中で制限酵素ＳacＩとＰvuＩを用いて完全切断し、０.
７％アガロースゲルを用いて約１.５kbのＤＮＡ断片を
分離精製した。以下このＤＮＡ断片を断片ＰＢＧＨ−Ｐ
／Ｌと称する。前記実施例２の段階１で得たプラスミド
ptrphsＢＧＨＲＡＮ ＃５ ２μgをＮＥＢ緩衝溶液３
中で制限酵素ＳalＩとＰvuＩを用いて完全切断し、０.
７％アガロースゲルを用いて約１.５kbのＤＮＡ断片を
分離した。以下このＤＮＡ断片を断片ＰＢＧＨＲＡＮ−
Ｐ／Ｌと称する。一方、前記段階２で得た断片ＰＢＲを
ＮＥＢ緩衝溶液３中で制限酵素ＳalＩとＰvuＩを用いて
完全切断した後、生成した断片をフェノール／クロロホ
ルムで抽出して２０μlのＴＥ溶液に溶存した。以下こ
の断片ＰＢＲ−Ｐ／Ｌと称する。
１３(ＡＴＣＣ ６８９７５)２μgをＮＥＢ緩衝溶液３
中で制限酵素ＳacＩとＰvuＩを用いて完全切断し、０.
７％アガロースゲルを用いて約１.５kbのＤＮＡ断片を
分離精製した。以下このＤＮＡ断片を断片ＰＢＧＨ−Ｐ
／Ｌと称する。前記実施例２の段階１で得たプラスミド
ptrphsＢＧＨＲＡＮ ＃５ ２μgをＮＥＢ緩衝溶液３
中で制限酵素ＳalＩとＰvuＩを用いて完全切断し、０.
７％アガロースゲルを用いて約１.５kbのＤＮＡ断片を
分離した。以下このＤＮＡ断片を断片ＰＢＧＨＲＡＮ−
Ｐ／Ｌと称する。一方、前記段階２で得た断片ＰＢＲを
ＮＥＢ緩衝溶液３中で制限酵素ＳalＩとＰvuＩを用いて
完全切断した後、生成した断片をフェノール／クロロホ
ルムで抽出して２０μlのＴＥ溶液に溶存した。以下こ
の断片ＰＢＲ−Ｐ／Ｌと称する。
【００２５】前記断片ＰＢＲ−Ｐ／Ｌを用いて次のよう
に接合反応を行った。接合反応管Ａに断片ＰＢＧＨ−Ｐ
／Ｌ １００ngを、接合反応管Ｂに断片ＰＢＧＨＲＡＮ
−Ｐ／Ｌ １００ngをそれぞれ入れた後、各管に１００
ngの断片ＰＢＲ−Ｐ／Ｌ、２μlの１０ｘ接合反応溶
液、および１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、蒸
留水で総容量を２０μlにした後、１６℃で１２時間反
応させた。この接合反応物を用いてＣell法に従って大
腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ３７３３９)を形質転換させ
た結果、反応管ＡからtrpＡ転写ターミネーターを含むp
trp３Ｈ ＢＧＨ１−１３を、また反応管ＢからtrpＡ転
写ターミネーターを含むptrp ３ＨＢＧＨＲＡＮを各々
得た(図２参照)。
に接合反応を行った。接合反応管Ａに断片ＰＢＧＨ−Ｐ
／Ｌ １００ngを、接合反応管Ｂに断片ＰＢＧＨＲＡＮ
−Ｐ／Ｌ １００ngをそれぞれ入れた後、各管に１００
ngの断片ＰＢＲ−Ｐ／Ｌ、２μlの１０ｘ接合反応溶
液、および１０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、蒸
留水で総容量を２０μlにした後、１６℃で１２時間反
応させた。この接合反応物を用いてＣell法に従って大
腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ ３７３３９)を形質転換させ
た結果、反応管ＡからtrpＡ転写ターミネーターを含むp
trp３Ｈ ＢＧＨ１−１３を、また反応管ＢからtrpＡ転
写ターミネーターを含むptrp ３ＨＢＧＨＲＡＮを各々
得た(図２参照)。
【００２６】実施例４：trpＡ転写ターミネーターを含
む牛成長ホルモン発現ベクターを用いた牛成長ホルモン
発現誘導 プラスミドptrphs ＢＧＨ １−１３、ptrphs ＢＧＨ
ＲＡＮ ＃５、ptrp３Ｈ ＢＧＨ １−１３およびptrp
３Ｈ ＢＧＨＲＡＮを各々含む組換え大腸菌細胞を各
々、５０μg／mlアンピシリンが含まれた液体ルリア(Lu
ria)培地(６％バクトトリップトン、０.５％酵母抽出
物、１％塩化ナトリウム)で１２時間振盪培養した後、
各々の培養液３mlを各々３００mlのＭ９培地(４０mＭ
Ｋ2ＨＰＯ4，２２mＭ ＫＨ2ＰＯ4，８.３mＭ ＮaＣ
l，１８.７ｍＭ ＮＨ4Ｃl，１％グルコース，０.１mＭ
ＭgＳＯ4，０.１mＭ ＣaＣl2，０.４％カサミノ酸、
１０μg／Ｖit.Ｂ１、４０μg／ml アンピシリン)に移
して３７℃で約４時間振盪培養し、細菌の６５０nmの波
長での吸光度が約０.３程度になったときインドールア
クリル酸(indoleacrylic acid，ＩＡＡ)を最終濃度５０
μg／mlとなるように加えた。ＩＡＡを加えてから約４
時間後に細胞培養液の吸光度を測定した後、遠心分離器
(Beckman J2-21,JA14 rotor)を用いて１１,０００rpmで
２５分間遠心分離して細菌細胞沈澱物を取り集め、この
細胞沈澱物をレムリの方法(Laemmli,Nature,227,680(19
70))によってＳＤＳの存在下で１５％ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて電気泳動させて牛成長ホルモンの発現を
確認した結果を図３に示した。
む牛成長ホルモン発現ベクターを用いた牛成長ホルモン
発現誘導 プラスミドptrphs ＢＧＨ １−１３、ptrphs ＢＧＨ
ＲＡＮ ＃５、ptrp３Ｈ ＢＧＨ １−１３およびptrp
３Ｈ ＢＧＨＲＡＮを各々含む組換え大腸菌細胞を各
々、５０μg／mlアンピシリンが含まれた液体ルリア(Lu
ria)培地(６％バクトトリップトン、０.５％酵母抽出
物、１％塩化ナトリウム)で１２時間振盪培養した後、
各々の培養液３mlを各々３００mlのＭ９培地(４０mＭ
Ｋ2ＨＰＯ4，２２mＭ ＫＨ2ＰＯ4，８.３mＭ ＮaＣ
l，１８.７ｍＭ ＮＨ4Ｃl，１％グルコース，０.１mＭ
ＭgＳＯ4，０.１mＭ ＣaＣl2，０.４％カサミノ酸、
１０μg／Ｖit.Ｂ１、４０μg／ml アンピシリン)に移
して３７℃で約４時間振盪培養し、細菌の６５０nmの波
長での吸光度が約０.３程度になったときインドールア
クリル酸(indoleacrylic acid，ＩＡＡ)を最終濃度５０
μg／mlとなるように加えた。ＩＡＡを加えてから約４
時間後に細胞培養液の吸光度を測定した後、遠心分離器
(Beckman J2-21,JA14 rotor)を用いて１１,０００rpmで
２５分間遠心分離して細菌細胞沈澱物を取り集め、この
細胞沈澱物をレムリの方法(Laemmli,Nature,227,680(19
70))によってＳＤＳの存在下で１５％ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて電気泳動させて牛成長ホルモンの発現を
確認した結果を図３に示した。
【００２７】図３に示されたように、プラスミドptrp３
Ｈ ＢＧＨ １−１３によって形質転換された大腸菌を
用いて発現された牛成長ホルモンと、プラスミドptrp３
ＨＢＧＨＲＡＮによって形質転換された大腸菌を用いて
発現された牛成長ホルモンは各々、大腸菌全蛋白対比３
９.９％と５７.３％の発現率を示した。この発現率は、
プラスミドptrp３Ｈ ＢＧＨ １−１３で形質転換され
た大腸菌を使用した場合の牛成長ホルモンの当該発現率
２６.３％を、またはプラスミドptrphs ＢＧＨＲＡＮ
＃５で形質転換された大腸菌を使った場合の牛成長ホ
ルモンの当該発現率３９.９％に比べて４０〜５０％高
いことが判明した(図４参照)。プラスミドptrp ３Ｈ
ＢＧＨＲＡＮによって形質転換された大腸菌Ｗ３１１０
は１９９４年１２月２６日付で韓国科学技術研究院付設
の遺伝工学研究所遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)に寄託番号ＫＣ
ＴＣ ０１４３ＢＰで寄託されている。
Ｈ ＢＧＨ １−１３によって形質転換された大腸菌を
用いて発現された牛成長ホルモンと、プラスミドptrp３
ＨＢＧＨＲＡＮによって形質転換された大腸菌を用いて
発現された牛成長ホルモンは各々、大腸菌全蛋白対比３
９.９％と５７.３％の発現率を示した。この発現率は、
プラスミドptrp３Ｈ ＢＧＨ １−１３で形質転換され
た大腸菌を使用した場合の牛成長ホルモンの当該発現率
２６.３％を、またはプラスミドptrphs ＢＧＨＲＡＮ
＃５で形質転換された大腸菌を使った場合の牛成長ホ
ルモンの当該発現率３９.９％に比べて４０〜５０％高
いことが判明した(図４参照)。プラスミドptrp ３Ｈ
ＢＧＨＲＡＮによって形質転換された大腸菌Ｗ３１１０
は１９９４年１２月２６日付で韓国科学技術研究院付設
の遺伝工学研究所遺伝子銀行(ＫＣＴＣ)に寄託番号ＫＣ
ＴＣ ０１４３ＢＰで寄託されている。
【００２８】
【発明の効果】以上、牛成長ホルモン遺伝子の５'−末
端部分の塩基配列変換によるｍＲＮＡ２次構造の形成を
最小化するとともに前記遺伝子の３'−末端にtrpＡ転写
ターミネーターを挿入することによって製造された発現
ベクターを用いて大腸菌全蛋白対比５７.３％の高収率
で牛成長ホルモンを生産し得、これによって牛成長ホル
モンを経済的に大量生産する手段を提供する。
端部分の塩基配列変換によるｍＲＮＡ２次構造の形成を
最小化するとともに前記遺伝子の３'−末端にtrpＡ転写
ターミネーターを挿入することによって製造された発現
ベクターを用いて大腸菌全蛋白対比５７.３％の高収率
で牛成長ホルモンを生産し得、これによって牛成長ホル
モンを経済的に大量生産する手段を提供する。
【００２９】
配列番号：１ 配列の長さ：７８ 配列の型：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA 33 TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT 66 CAT CAG CTG GCT 78
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTTT 28
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：７６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 TGCTGAGCTC GNAGNACNGC RTTNGCRAAN AGNCCNGANA GNGACATNGC 50 NGGRAANGCC ATTTATAATT CCTCCA 76
【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCA 25
【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 GCTTTGTCGA CTAATTAAAG CCCGCCTAAT GAGCGGGCTT TTTTTTGCCT 50 CGCGCGTTTC GGT 63
【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマーＤＮＡ 配列 TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGA 25
【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 配列 ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA 33 TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT 66 CAT CAG CTG GCT 78
【図１】 図１：牛成長ホルモン遺伝子(ptrphs ＢＧ
Ｈ １−１３)の５'−末端部分とこの変異体(ptrphs BG
HRAN #5)の塩基配列を比較したもので、
Ｈ １−１３)の５'−末端部分とこの変異体(ptrphs BG
HRAN #5)の塩基配列を比較したもので、
【図２】 図２Ａ：修飾牛成長ホルモン遺伝子を含むプ
ラスミドptrphs ＢＧＨＲＡＮの作製過程を図示したも
のであり、
ラスミドptrphs ＢＧＨＲＡＮの作製過程を図示したも
のであり、
【図３】 図２Ｂ：牛成長ホルモン遺伝子またはその変
異体とその３'−末端に挿入されたtrpＡ転写ターミネー
ターとを各々含むプラスミドptrp３Ｈ ＢＧＨ １−１
３およびptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮの作製過程を図示した
ものであり、
異体とその３'−末端に挿入されたtrpＡ転写ターミネー
ターとを各々含むプラスミドptrp３Ｈ ＢＧＨ １−１
３およびptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮの作製過程を図示した
ものであり、
【図４】 図３：プラスミドptrphs ＢＧＨ １−１
３、ptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５、ptrp３Ｈ ＢＧＨ
１−１３またはptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮで形質転換され
た大腸菌細胞沈澱物を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)の結果を示し、
３、ptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５、ptrp３Ｈ ＢＧＨ
１−１３またはptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮで形質転換され
た大腸菌細胞沈澱物を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)の結果を示し、
【図５】 図４：プラスミドptrphs ＢＧＨ １−１
３、ptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５、ptrp３Ｈ ＢＧＨ
１−１３およびptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮで各々形質転換
された大腸菌細胞で発現された牛成長ホルモンの量をデ
ンシトメーターで測定した結果を示す。
３、ptrphs ＢＧＨＲＡＮ ＃５、ptrp３Ｈ ＢＧＨ
１−１３およびptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮで各々形質転換
された大腸菌細胞で発現された牛成長ホルモンの量をデ
ンシトメーターで測定した結果を示す。
【図６】 図４（つづき）
【図７】 図４（つづき）
【図８】 図４（つづき）
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (56)参考文献 特表 平２−501261（ＪＰ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．101，Ｎｏ．２, ｐ．525−534（1987) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (6)
- 【請求項１】 牛成長ホルモン(ＢＧＨ)の発現ベクター
であって、修飾ＢＧＨ遺伝子およびtrpＡ転写ターミネ
ーターを含み、trpＡ転写ターミネーターが上記ＢＧＨ
遺伝子の終止コドンの下流の５０ヌクレオチド内に挿入
され； コードされたアミノ酸配列を変えることなく、ＢＧＨ遺
伝子の５'−末端部分のヌクレオチド配列(配列番号：
１)： 5'-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3' (式中、ATGは牛成長ホルモン遺伝子の翻訳開始コドンを
指す)が、ｍＲＮＡにおける２次構造の形成を最少化
し、発現率を増大するように修飾されていることを特徴
とする発現ベクター。 - 【請求項２】 前記trpＡ転写ターミネーターが下記塩
基配列(配列番号：２)を有することを特徴とする請求項
１記載の発現ベクター： 5'-AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC TTTTTTTT-3' - 【請求項３】 請求項２記載の発現ベクターptrp３Ｈ
ＢＧＨＲＡＮ (ＫＣＴＣ ０１４３ＢＰ)。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の発
現ベクターによって形質転換された大腸菌。 - 【請求項５】 前記ベクターptrp３Ｈ ＢＧＨＲＡＮに
よって形質転換された請求項４記載の大腸菌Ｗ３１１０
(ＫＣＴＣ ０１４３ＢＰ)。 - 【請求項６】 請求項４または５に記載の大腸菌を培養
した後、牛成長ホルモンを分離することを特徴とする牛
成長ホルモンの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| KR1019940040025A KR100225511B1 (ko) | 1994-12-30 | 1994-12-30 | 소 성장호르몬의 대량 생산 방법 |
| KR1994-40025 | 1994-12-30 |
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| JPH08228787A JPH08228787A (ja) | 1996-09-10 |
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| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．２，ｐ．５２５−５３４（１９８７） |
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