BG64565B1 - Vector for bovine growth hormone expression and method for its mass production - Google Patents

Vector for bovine growth hormone expression and method for its mass production Download PDF

Info

Publication number
BG64565B1
BG64565B1 BG100264A BG10026495A BG64565B1 BG 64565 B1 BG64565 B1 BG 64565B1 BG 100264 A BG100264 A BG 100264A BG 10026495 A BG10026495 A BG 10026495A BG 64565 B1 BG64565 B1 BG 64565B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
growth hormone
bovine growth
gene
coli
expression vector
Prior art date
Application number
BG100264A
Other languages
Bulgarian (bg)
Other versions
BG100264A (en
Inventor
Chun-Hyung Kim
Jooug-Myung Cho
Original Assignee
Lg Chemical Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lg Chemical Ltd filed Critical Lg Chemical Ltd
Publication of BG100264A publication Critical patent/BG100264A/en
Publication of BG64565B1 publication Critical patent/BG64565B1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/61Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/36Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription termination element

Abstract

The invention relates to a producing vector including a gene of bovine growth hormone (BGH) where the nucleotide sequence in its 5'-end sector has no change of the amino acid sequence encoded in it. A trpA copying completing gene is used introduced after the 3'-end sector of the modified BGH gene for the transformation of an E. coli cell for mass BGH production.

Description

Област на техникатаTechnical field

Настоящото изобретение се отнася до метод за масово производство на волски хормон на растежа (BGH). По-специално то се отнася до вектора за експресия, обхващащ изменен ген на волския хормон на растежа, където нуклеотидната секвенция в областта на 5’-ия край е модифицирана без промяна на аминокиселинната секвенция, кодирана в него, a trpA терминатор на транскрипцията е инсериран след 3 ’-ия край на модифицирания ген на волски хормон на растежа; Е. coli клетка, трансформирана с експресионен вектор; до метод за масово производство на волски хормон на растежа, който обхваща култивиране на Е. coli трансформант и отделяне на волски хормони на растежа от културата.The present invention relates to a method for the mass production of bovine growth hormone (BGH). In particular, it relates to an expression vector comprising an altered bovine growth hormone gene, wherein the nucleotide sequence at the 5'-end region is modified without altering the amino acid sequence encoded therein and the trpA transcription terminator is inserted after the 3 'end of the modified bovine growth hormone gene; E. coli cell transformed with expression vector; to a method for the mass production of bovine growth hormone, which comprises culturing an E. coli transformant and separating bovine growth hormones from the culture.

Предшестващо състояние на техникатаBACKGROUND OF THE INVENTION

Стероидни растежни промотори от животински произход като Estradiol-Compudose (Eli Lilly), Estradiol Benzoate-Synovax (Syntax Agribusiness Inc.) и Zeramol-Ralgro (International Minerals and Chemicals) са използвани при отглеждането на добитък за увеличаване на хранителната ефективност и увеличаване на теглото на добитъка. Все пак, употребата на такива стероидни растежни промотори от животински произход се ограничи, поради факта, че същите са разтворими в мазнини и следователно имат дълго преседяване в тъканите на добитъка, което може да има негативен резултат върху хора при консумация.Steroidal growth promoters of animal origin such as Estradiol-Compudose (Eli Lilly), Estradiol Benzoate-Synovax (Syntax Agribusiness Inc.) and Zeramol-Ralgro (International Minerals and Chemicals) have been used in livestock breeding to increase nutritional efficiency and weight gain of the cattle. However, the use of such steroidal growth promoters of animal origin is limited due to the fact that they are soluble in fats and therefore have a long residual life in the tissues of livestock, which can have a negative effect on human consumption.

За разлика от това, животинските растежни хормони, които се произвеждат и отделят от хипофизната жлеза на животните, не са разтворими в мазнини, показват специфики на видовете и се съобщава, че подпомагат растежа и млекодобива от добитъка и че увеличават хранителната ефективност (Бауман, Д. Е. и колектив, Journal of Animal Sciences, 60, 583 (1985); Харт, И.С. и колектив, Journal of Endocrinology, 105, 189 (1985); Нюзуоч, 17 юни 1985; и Wall Street Journal, 22 юли 1986).In contrast, animal growth hormones, which are produced and released from the pituitary gland of animals, are insoluble in fat, show species specificity, and are reported to promote growth and milk production in livestock and to increase nutritional efficiency (Bauman, D. E. and Collective, Journal of Animal Sciences, 60, 583 (1985); Hart, IS and Collective, Journal of Endocrinology, 105, 189 (1985); Newswalk, June 17, 1985; and the Wall Street Journal, 22 July 1986).

След 1940 г. хормоните на естествените животински хормони на растежа, отделени и пречистени от хипофизните жлези на животните, се използват за ускоряване на растежа на животните, но тяхното приложение при отглеждането 5 на животни е ограничено от ограничената доставка на хормони. Изследвания в последно време в областта на генетичните технологии позволяват масово производство на животински хормони на растежа чрез употреба на микроорга10 низми, например Е. coli.Since 1940, the hormones of natural animal growth hormones, separated and purified from the pituitary glands of animals, have been used to accelerate animal growth, but their use in raising 5 animals is limited by the limited supply of hormones. Recent studies in the field of genetic technology allow the mass production of animal growth hormones by the use of microorganism10 strains, such as E. coli.

Π. X. Сийбург и колектив разделят допълнителната ДНК, кодираща волския хормон на растежа, от волската хипофизна жлеза; определят нуклеотидна секвенция на сДНК и аминоки15 селинната секвенция на волския хормон на растежа; клонират сДНК във вектор на експресия на Е. coli, обхващащ trp промотор и експресиран волски хормон на растежа в Е. coli, който се трансформира с вектора (ДНК, 2, 37(1983).Π. X. Seiburg and the team separate the extra DNA encoding the growth hormone from the pituitary gland; determine the nucleotide sequence of cDNA and amino acids15 the selective sequence of bovine growth hormone; clone cDNA into an E. coli expression vector, encompassing the trp promoter and expressed bovine growth hormone in E. coli, which is transformed with the vector (DNA, 2, 37 (1983).

Следтоваса правени много опити за увеличаване на степента на експресия на волските хормони на растежа в Е. coli.There have been many attempts since then to increase the expression level of bovine growth hormones in E. coli.

Например X. Дж. Джордж и колектив откриват, че степента на експресия зависи от нук25 леотидната секвенция и дължината на региона между рибозомосвързващия сайт и началния кодон, ATG; и произвеждат волски хормони на растежа в количество, равняващо се на 15% от всички протеини, произведени в Е. coli (ДНК, 4,273, 30 (1985).For example, X. J. George and team find that the degree of expression depends on the nucleotide sequence 25 and the length of the region between the ribosome binding site and the start codon, ATG; and produce bovine growth hormones in an amount equal to 15% of all proteins produced in E. coli (DNA, 4,273, 30 (1985)).

Олсен и колектив произвеждат волски хормони на растежа в количество между 10% и 15% на базата на общото количество протеини, произведени в клетка на Е. coli, чрез отглежда35 не на трансформираната клетка с вектор на експресия, обхващаща модифициран ген на волски хормон на растежа, в който регионът между рибозомо-свързващия сайт и началния кодон, ATG, е А-Т богат, под контрола на trp промотор 40 (J. Biotechnol., 9, 179, (1989).Olsen and the team produce bovine growth hormones in an amount of between 10% and 15% based on the total amount of proteins produced in an E. coli cell by growing the transformed cell with an expression vector comprising a modified bovine growth hormone gene , in which the region between the ribosome-binding site and the start codon, ATG, is AT-rich under the control of trp promoter 40 (J. Biotechnol., 9, 179, (1989).

Уотсън и колектив произвеждат волски хормони на растежа в количество 20% на базата на общото количество протеини, произведени от клетка на Е. coli, чрез отглеждане на трансфор4 5 мирана клетка с плазмид, обхващащ модифициран ген на волски хормон на растежа, в който един от нуклеотидите, кодиращ четири аминокиселини в региона наЬГтерминала на волския хормон на растежа, е променен чрез случайна му50 тация (Gene, 86, 137 (1990).Watson and the team produce bovine growth hormones at 20% based on the total amount of proteins produced by an E. coli cell by growing a transformed 5 plasmid cell comprising a modified bovine growth hormone gene in which one of the the nucleotides encoding four amino acids in the region of the 1G terminal of the bovine growth hormone were altered by random mutation (Gene, 86, 137 (1990).

Също така е публикувано, че модифициран ген на волски хормон на растежа се приготвя с употребата на кодони, предпочитани от Е. coli; конструира се вектор на експресия за волски хормон на растежа чрез инсериране на ген на волски хормон на растежа във вектор на Е. coli, обхващащ ген на хормон за растеж на сьомга под контрола на trp промотор и лигиране на синтетична връзка между гена на хормон на растежа на сьомга и гена на волския хормон на растежа и се произвежда волски хормон на растежа в количество 27% на базата на общото количество протеини, получени след отглеждане на клетка на Е. coli, трансформирана с вектора (корейски патент публикация № 92-3665).It has also been reported that a modified bovine growth hormone gene is prepared using codons preferred by E. coli; an expression vector for bovine growth hormone is constructed by inserting a bovine growth hormone gene into an E. coli vector comprising a salmon growth hormone gene under the control of a trp promoter and ligating a synthetic link between the growth hormone gene salmon and bovine growth hormone gene and 27% bovine bovine growth hormone is produced based on the total amount of proteins obtained after growing an E. coli cell transformed with the vector (Korean Patent Publication No. 92-3665).

Максималното количество волски хормон на растежа, което може да бъде произведено чрез процесите от известното ниво на техниката, е ограничено до 30% на базата на общото количество протеини в Е. coli.The maximum amount of bovine growth hormone that can be produced by processes known in the art is limited to 30% based on the total amount of proteins in E. coli.

От друга страна, транскрипционният терминатор trpA е описан като много ефективен rho-независим терминатор (Кристи, Г. Е. и колектив, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,4180 (1981), и следователно желаният протеин може да бъде масово произвеждан, докато се ограничава производството на нежеланите протеини, получени от плазмид, чрез внедряване на транскрипционен терминатор trpA след 3 ’-пя край на гена, кодиращ търсения протеин (Генц, Р. и колектив, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4936(1981).On the other hand, the trpA transcriptional terminator has been described as a very effective rho-independent terminator (Christie, G. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,4180 (1981), and therefore the desired protein may be mass-produced while restricting the production of unwanted proteins derived from plasmids by introducing the trpA transcriptional terminator after the 3 'end of the gene encoding the desired protein (Genz, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 78, 4936 (1981).

Матсуки и колектив получават калмодулин от клетки на плъх в количество 30% на базата на общото количество протеини в Е. coli чрез култивиране на клетка с плазмид, обхващащ trpA промотор, ген калмодулин и транскрипционен терминатор trpA (Biotech. Appl. Biochem, 12, 284(1990).Matsuki and staff received calmodulin from rat cells in 30% based on the total amount of proteins in E. coli by culturing a cell with a plasmid spanning the trpA promoter, the calmodulin gene, and the trpA transcription terminator (Biotech. Appl. Biochem, 12, 284 (1990).

Сато и колектив съобщават, че когато интерлевкин-2 ген е извлечен чрез използване на плазмид, обхващащ интерлевкин-2 ген, под контрола на trpA промотор и транскрипционен терминатор trpA след 3’-ия край на интерлевкин-2 гена, се получава около 5 пъти по-голямо количество на интерлевкин-2 ген в сравнение с произведеното чрез контролна група, където не е внедрен trpA терминатор (J. Biochem., 101, 525 (1987).Sato and the team report that when the interleukin-2 gene is extracted using a plasmid spanning the interleukin-2 gene, under the control of the trpA promoter and the trpA transcriptional terminator after the 3 'end of the interleukin-2 gene, it is produced about 5 times higher amount of interleukin-2 gene compared to that produced by a control group where no trpA terminator was introduced (J. Biochem. 101, 525 (1987).

Независимо от тези разработки продължава да съществува необходимост от разработване на метод за масово производство на волски хормон на растежа в търговски изпълним и икономически мащаб.Notwithstanding these developments, there is still a need to develop a method for the mass production of bovine growth hormone on a commercially viable and economic scale.

Техническа същност на изобретениетоSUMMARY OF THE INVENTION

Предмет на настоящото изобретение е да представи експресионен вектор, който да е подходящ за масово производство на волски хормон на растежа.It is an object of the present invention to provide an expression vector suitable for mass production of bovine growth hormone.

Друга цел на настоящото изобретение е да осигури като приемник клетка, трансформирана с експресионния вектор.It is another object of the present invention to provide, as a host, a cell transformed with the expression vector.

Предмет на настоящото изобретение е да представи и метод за масово производство на волски хормон на растежа, включващ култивиране на трансформанта.It is also an object of the present invention to provide a method for the mass production of bovine growth hormone comprising the cultivation of the transformant.

Съгласно настоящото изобретение е представен подобрен метод за масово производство на волски хормон на растежа чрез конструиране на вектор на експресия, обхващащ модифициран ген на волски хормон на растежа, където нуклеотидната секвенция в областта на 5'-ия край е модифицирана без промяна на аминокиселинната секвенция, кодирана в него, а транскрипционен терминатор trpA е внедрен след 3'-ия край на модифицирания ген на волски хормон на растежа. Изобретението представя и производство на волски хормон на растежа в количество, по-голямо от 50% на базата на общото количество протеини, получени чрез отглеждане на Е. coli клетка, трансформирана чрез споменатия вектор.According to the present invention there is provided an improved method for the mass production of bovine growth hormone by constructing an expression vector comprising a modified bovine growth hormone gene, wherein the nucleotide sequence at the 5'-end region is modified without altering the amino acid sequence, encoded therein, and the trpA transcriptional terminator is inserted after the 3 'end of the modified bovine growth hormone gene. The invention also provides the production of bovine growth hormone in an amount greater than 50% based on the total amount of proteins obtained by growing an E. coli cell transformed by said vector.

Описание на приложените фигуриDescription of the attached figures

Целите и характеристиките на настоящото изобретение се поясняват в следващото описание на изобретението, разгледано в съчетание с приложените фигури, от които:The purposes and features of the present invention are explained in the following description of the invention, taken in conjunction with the accompanying drawings, of which:

фигура 1 представлява сравнение на нуклеотидната секвенция в областта на 5'-ия край на гена на волски хормон на растежа (ptrphs BGH 1 -13) с нейна разновидност (ptrphs BGHRAN #5);Figure 1 is a comparison of the nucleotide sequence in the region of the 5'th end of the bovine growth hormone gene (ptrphs BGH 1 -13) with its variant (ptrphs BGHRAN # 5);

фигура 2А показва схематична диаграма за конструиране на плазмид ptrphs BGHRAN, обхващащ модифициран ген на волски хормон на растежа;Figure 2A shows a schematic diagram for constructing a plasmid ptrphs BGHRAN comprising a modified bovine growth hormone gene;

фигура 2В разкрива схематична диаграма за конструиране на плазмиди ptrp3H BGH 1 -13 и ptrp3H BGHRA, обхващащи ген на волски хормон на растежа или негова разновидност заедно с транскрипционен терминатор trpA, лигиран в 3'-ия край, съответно;Figure 2B shows a schematic diagram for constructing plasmids ptrp3H BGH 1 -13 and ptrp3H BGHRA, comprising the bovine growth hormone gene or variant thereof, together with the trpA transcriptional terminator ligated at the 3 'end, respectively;

фигура 3 показва резултата от SDS-полиакриламид гел електрофореза (PAGE), използваща преципитати на Е. coli клетка, трансформирана с плазмиди ptrphs BGH 1-13, ptrphs BGHRAN #5, ptrp3H BGH 1-13 или ptrp3H BGHRAN; и фигура 4 представя резултатите от определяне на количеството волски хормон на растежа с денсиметър, което количество се извлича в Е. coli клетки, трансформирани с плазмиди ptrphs BGH 1-13, ptrphs BGHRAN #5,ptrp3HBGH 1 -13 и ptrp3H BGHRAN, съответно.Figure 3 shows the result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using precipitates of E. coli cell transformed with plasmids ptrphs BGH 1-13, ptrphs BGHRAN # 5, ptrp3H BGH 1-13 or ptrp3H BGHRAN; and Figure 4 presents the results of determining the amount of bovine growth hormone by densimeter, which amount is recovered in E. coli cells transformed with plasmids ptrphs BGH 1-13, ptrphs BGHRAN # 5, ptrp3HBGH 1-13 and ptrp3H BGHRAN, respectively.

Подробно описание на изобретениетоDetailed description of the invention

В съответствие с един от аспектите на настоящото изобретение е представен вектор на експресия за масово производство на волски хормон на растежа, който вектор обхваща модифициран ген на волски хормон на растежа и транскрипционен терминатор trpA, инсериран след 3 ’-ия край на модифицирания ген.In accordance with one aspect of the present invention, there is provided an expression vector for the mass production of bovine growth hormone, which vector comprises a modified bovine growth hormone gene and a trpA transcription terminator inserted after the 3 'end of the modified gene.

Модифицираният ген на волски хормон на растежа съгласно настоящото изобретение има модифицирана нуклеотидна секвенция в областта на 5'-ия й край за минимизиране на формирането на вторична структура в тРНК и увеличаване на степента на експресия, докато се кодира непроменената аминокиселинна секвенция от нормален волски хормон на растежа. Модифицираният ген на волски хормон на растежа съгласно настоящото изобретение преференциално има в областта на 5'-ия край нуклеотидна секвенция от:The modified bovine growth hormone gene of the present invention has a modified nucleotide sequence at its 5'end to minimize secondary structure formation in mRNA and increase expression while encoding the unchanged amino acid sequence of normal bovine hormone sequence growth. The modified bovine growth hormone gene of the present invention preferably has, in the region of the 5'-end nucleotide sequence, of:

5'-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3' където ATG е начален кодон на ген на волски хормон на растежа.5'-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3 'where ATG is the start codon of the bovine growth hormone gene.

Векторът на експресия в съответствие с настоящото изобретение може да се приготви съгласно всеки конвенционален метод за генетична рекомбинация или метод за синтезиране на гени, например съгласно описаната по-долу процедура.The expression vector according to the present invention can be prepared according to any conventional method of genetic recombination or method for synthesizing genes, for example according to the procedure described below.

Първоначално се синтезират произволни праймъри, базирани на информацията за нуклеотидните секвенции на ген на волски хормон на растежа (виж корейски патент, публикация No 92-3665). Тези произволни праймъри са предназначени за въвеждане на волски хормон на растежа на разпознавателен сайт за ограничаване по отношение на ензим SacI и за произволно модифициране на нуклеотидната секвенция, кодираща волски хормон на растежа, без промяна на аминокиселинната секвенция, кодирана в него.Initially, any primers were synthesized based on information on the nucleotide sequences of the bovine growth hormone gene (see Korean Patent Publication No. 92-3665). These random primers are intended to introduce bovine growth hormone on a recognition site for restriction to the SacI enzyme and to arbitrarily modify the nucleotide sequence encoding bovine growth hormone without altering the amino acid sequence encoded therein.

Също така е приготвен праймър, който отговаря на част от Amp ген в рекомбиниран вектор ptrphs BGH 1-13, обхващащ ген на волски хормон на растежа (виж корейски патент, публикация No 92-3665; АТСС 68975 (депозиран на 6 май 1992) и има разпознавателен сайт по отношение на рестрикционен ензим Pvul. Освен това, се извършва PCR чрез използване на посочените праймъри и плазмид ptrphs BGH 1-13 като мостра за получаване на модифициран ген на волски хормон на растежа. Полученият ген на волски хормон на растежа се смила с рестрикционни ензими Pvul и SacI и е лигиран с ДНК фрагмент, който се получава чрез смилане на плазмид ptrphs BGH 1-13 със същите ензими, за получаване на вектор на експресия на волски хормон на растежа. Векторът на експресия се използва за трансформиране на Е. coli и се отделя плазмид, обхващащ модифицирания ген на волски хормон на растежа, наречен ptrphs BGHRAN.A primer was also prepared that corresponds to a portion of the Amp gene in the recombinant vector ptrphs BGH 1-13 comprising the bovine growth hormone gene (see Korean Patent Publication No. 92-3665; ATCC 68975 (deposited May 6, 1992) and has a recognition site for the Pvul restriction enzyme, and PCR is also performed using the primers and plasmids ptrphs BGH 1-13 as a sample to produce a modified bovine growth hormone gene. with restriction enzymes Pvul and SacI and is ligated with a DNA fragment that c is obtained by digesting plasmid ptrphs BGH 1-13 with the same enzymes to produce an expression vector of bovine growth hormone The expression vector is used to transform E. coli and a plasmid spanning the modified bovine growth hormone gene is isolated called ptrphs BGHRAN.

Впоследствие, за да се въведе транскрипционен терминатор trpA във вектора на експресия на волски хормон на растежа, се приготвят праймъри за PCR, съдържащи ген на транскрипционен терминатор trpA, разпознавателен сайт за ограничение по отношение на ензим Sall и друг разпознавателен сайт за ограничение по отношение на ензим Pvul. След това се извършва PCR чрез използване на посочените праймъри и плазмид ptrphs BGH 1-13, като мостра за получаване на ДНК фрагмент, обхващащ транскрипционен терминатор trpA. Полученият ДНК фрагмент се разтваря с ограничение по отношение на ензими Pvul и Sall и се лигира с ДНК фрагмент, който е получен чрез разтваряне на плазмид ptrphs BGHRAN със същите ензими, за получаване на вектор на експресия на волски хормон на растежа. Векторът на експресия се използва за трансформиране на Е. coli и се отделя плазмид, наречен ptrp3H BGHRAN, който обхваща модифицирания ген на волски хормон на растежа и транскрипционния терминатор trpA.Subsequently, in order to introduce the trpA transcriptional terminator into the expression vector of bovine growth hormone, PCR primers containing the trpA transcription terminator gene, restriction site for the Sall enzyme, and other restriction recognition site are prepared. the Pvul enzyme. PCR was then performed using the primers and plasmid ptrphs BGH 1-13 used as the sample to produce a DNA fragment spanning the trpA transcription terminator. The resulting DNA fragment was digested with restriction on the Pvul and Sall enzymes and ligated with the DNA fragment obtained by dissolving the pHRPs BGHRAN plasmid with the same enzymes to produce a bovine growth hormone expression vector. The expression vector is used to transform E. coli and a plasmid, called ptrp3H BGHRAN, is released, which spans the modified bovine growth hormone gene and the trpA transcription terminator.

Векторите за експресия съгласно настоящото изобретение се използват за трансформиране на Е. coli клетка, например Е. coli W3110 (АТСС 37339), подходяща за получаване на ген на волски хормон на растежа във вектора за експресия. Трансформираната Е. coli клетка се култивира при условия, които позволяват получаването на волски хормон на растежа, и полученият волски хормон на растежа да бъде отделен и пречистен от културата в съответствие с който и да е конвенционален метод.The expression vectors of the present invention are used to transform an E. coli cell, for example, E. coli W3110 (ATCC 37339), suitable for the production of bovine growth hormone gene into the expression vector. The transformed E. coli cell is cultured under conditions that allow for the production of bovine growth hormone and the resulting bovine growth hormone to be separated and purified from the culture according to any conventional method.

Настоящото изобретение представя метод за масово производство на волски хормон на растежа, който включва култивиране на Е. coli клетки, трансформирани с вектора на експресия съгласно настоящото изобретение, и отделяне на волски хормон на растежа от културата. В съответствие с метода, обект на изобретението, е възможно да се получи волски хормон на растежа от Е. coli трансформант в количество, по-голямо от 50% от общото количество произведени протеини.The present invention provides a method for the mass production of bovine growth hormone, which involves culturing E. coli cells transformed with the expression vector of the present invention, and separating bovine growth hormone from culture. In accordance with the method of the invention, it is possible to produce bovine growth hormone from E. coli transformant in an amount greater than 50% of the total protein produced.

Следващите примери имат за цел допълнително да илюстрират настоящото изобретение, без да ограничават обхвата му.The following examples are intended to further illustrate the present invention without limiting its scope.

Процентите, представени по-долу, за твърди вещества в твърда смес, течност в течност и твърди вещества в течност са дадени в wt/wt, vol/vol и wt/vol, съответно, освен ако специално не е уточнено друго.The percentages given below for solids in solids, liquids in liquids and solids in liquids are given in wt / wt, vol / vol and wt / vol, respectively, unless specifically stated otherwise.

Пример 1. Получаване на модифициран ген на волски хормон на растежа и конструиране на съдържащ го експресионен вектор.Example 1. Preparation of a modified ox of growth hormone gene and constructing an expression vector containing it.

Стъпка 1. Основавайки се на информацията за нуклеотидните секвенциии на ген на волски хормон на растежа (виж корейски патент, публикация No 92-3665), са синтезирани произволни праймъри за PCR, които съответстват на областта на 5'-ия край на волски хормон на растежа и имат следващите нуклеотидни секвенции: Праймър PBGHRAN:Step 1. Based on the information on the nucleotide sequences of the bovine growth hormone gene (see Korean Patent Publication No. 92-3665), random PCR primers corresponding to the region of the 5 'end of bovine hormone are synthesized. growth and having the following nucleotide sequences: Primer PBGHRAN:

5'-TGCTGAGCTCGNAGNACNGCRTT NGCRAANAGNCCNGANAGNGACATNGC NGGRAANGCCATTTATAATTCCTCCA-3’ където N означава А, Т, G или С; a R означава А или G.5'-TGCTGAGCTCGNAGNACNGCRTT NGCRAANAGNCCNGANAGNGACATNGC NGGRAANGCCATTTATAATTCCTCCA-3 'where N is A, T, G or C; and R is A or G.

Праймър PBGHRAN включва SacI разпознавателен сайт и модифицирана нуклеотидна секвенция, кодираща 16 аминокиселини от N-терминала на волски хормон на растежа.The PBGHRAN primer includes a SacI recognition site and a modified nucleotide sequence encoding 16 amino acids from the bovine growth hormone N-terminal.

Също така са синтезирани и праймър PPBR3720, включващ и част от Amp ген в плазмид ptrphs BGH 1-13 (виж корейски патент, публикация No 92-3665; АТСС 68975), и Pvul разпознавателен сайт, като тяхната нуклеотидна секвенция има следния вид:Primer PPBR3720, including a portion of the Amp gene in plasmid ptrphs BGH 1-13 (see Korean Patent Publication No. 92-3665; ATCC 68975), and Pvul recognition site were also synthesized, with their nucleotide sequence as follows:

5'-TCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA3'.5'-TCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCA3 '.

Стъпка 2. В епруветка се смесват 1 ng от плазмид ptrphs BGH 1-13 като матрица, 2 pg от всеки от праймърите PBGHRAN и PPBR3720, получени в стъпка 1,10 μΐ от 10х полимеризиращ буфер (10 mM Tris-HCl, pH 8.3,500 тМ КС1,15 тМ MgCl2,0.1% (W/V) желатин), 10 μΐ смес от dNTP’s (по 2 тМ от dGTP, dATP, dCTP и dTTP),Step 2. Mix 1 ng of plasmid ptrphs BGH 1-13 as a matrix into a tube, 2 pg of each PBGHRAN and PPBR3720 primers obtained in step 1.10 μΐ of 10x polymerization buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KC1.15 mM MgCl 2 , 0.1% (W / V) gelatin), 10 μΐ mixture of dNTP's (2 mM each of dGTP, dATP, dCTP and dTTP),

2.5 единици от Taq ДНК (Perkin Elmer Cetus, USA) и се добавя дестилирана вода за получаване на обем от 100 μΐ.2.5 units of Taq DNA (Perkin Elmer Cetus, USA) and distilled water was added to obtain a volume of 100 μΐ.

PCR се извършва чрез повтаряне 25 пъти на цикъла от: 95°С за 1 min (денатуриране), 55°С за 40 s (отгряване) и 72°С за 2 min (полимеризация). PCR продуктът, получен по гореспоменатия начин, се подлага на 5% полиакриламид гел електрофореза и като резултат се потвърждава, че се получава около 990 Ьр от ДНК. ДНК се филтрира чрез същата полиакриламид гел електрофореза и получава наименованието фрагмент BGHRAN.PCR was performed by repeating 25 cycles of: 95 ° C for 1 min (denaturation), 55 ° C for 40 s (annealing) and 72 ° C for 2 min (polymerization). The PCR product obtained as mentioned above was subjected to 5% polyacrylamide gel electrophoresis and as a result confirmed to produce about 990 bp of DNA. The DNA was filtered by the same polyacrylamide gel electrophoresis and was named BGHRAN fragment.

Стъпка 3. 2 μg от плазмид ptrphs BGH 113 са изцяло смлени със SacI в NEB (New England Biolabs Inc.) буфер 1 (10 mM Bis Tris пропан-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7.0) при 37°C за 1 до 2 h, след което напълно се смила с Pvul в NEB буфер 3 (100 mM NaCl, 50 тМ Tris-HCl, 10 тМ MgCl2,1 тМ DTT, pH 7.9) при същите условия. Получената смес се подлага наStep 3. 2 μg of plasmid ptrphs BGH 113 were completely digested with SacI in NEB (New England Biolabs Inc.) buffer 1 (10 mM Bis Tris propane-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, pH 7.0) at 37 ° C for 1 to 2 h, then completely digested with Pvul in NEB buffer 3 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, pH 7.9) under the same conditions. The resulting mixture was subjected to

0.7% агар-агар гел електрофореза за отделяне на около 2 kb фрагмент, който се нарича фрагмент PBGH-T/P.0.7% agar-agar gel electrophoresis to separate about 2 kb fragment, called the PBGH-T / P fragment.

pg от фрагмент BGHRAN, получен в стъпка 2, напълно се смила със SacI в NEB буфер 1, след което напълно се смила с Pvul в NEB буфер 3. Полученият ДНК фрагмент се екстрахира с фенол/хлороформ, след което се разтваря в 20 μΐ от ТЕ буфер. ДНК фрагментът се нарича фрагмент BGHRAN-T/P.pg of the BGHRAN fragment obtained in step 2 was completely digested with SacI in NEB buffer 1, then completely digested with Pvul in NEB buffer 3. The resulting DNA fragment was extracted with phenol / chloroform and then dissolved in 20 μΐ of TE buffer. The DNA fragment is called the BGHRAN-T / P fragment.

Чрез използване на получения ДНК фрагмент се извършва лигираща реакция, както е описано по-долу.Using the resulting DNA fragment, a ligation reaction was performed as described below.

В епруветка се поставят 100 ng от фрагментите BGHRAN-T/P и PBGH-T/P, 2 μΐ от 10х лигиращ буфер и 10 части Т4 ДНК лигиращ елемент; добавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 20 μΐ. Цитирането се осъществява при 16°С за 12 h.Place 100 ng of BGHRAN-T / P and PBGH-T / P fragments in a test tube, 2 μΐ of 10x ligation buffer and 10 parts of T4 DNA ligation element; distilled water is added to obtain a total volume of 20 μΐ. Citation was performed at 16 ° C for 12 h.

Е. coli W3110 (АТСС 37339) се трансформира с лигиращата смес за получаване на рекомбиниран Е. coli трансформант, съдържащ плазмид ptrphs BGHRAN, обхващащ фрагмент BGHRAN (виж фиг. 2).E. coli W3110 (ATCC 37339) was transformed with the ligation mixture to obtain a recombinant E. coli transformant containing plasmid ptrphs BGHRAN comprising the BGHRAN fragment (see Fig. 2).

Пример 2. Получаване на модифициран ген на волски хормон на растежа и установяване на секвенцията на генаExample 2. Preparation of a Modified Bovine Hormone Growth Gene and Establishing the Gene Sequence

Стъпка 1. Около 100 Е. coli трансформант колонии, получени в пример 1, са култивирани в течна Luria среда (6% бактотриптон, 0.5% екстракт от дрожди, 1% NaCI), съдържаща 50 pg/ ml ампицилин при 37°С за 12 h. 3 ml от културата се трансферира в 300 ml от М9 среда (40 тМ iqHPO4,22 тМ КН2РО4, 8.5 тМ NaCI, 18.7 тМ NH4C1, 1% глюкоза, 0.1 тМ MgSO4, 0.1 тМ СаС12, 0.4% казамино киселина, 10 pg/ml витамин В„ 40 pg/ml ампицилин); културата се разклаща при 37°С за 4 h.Step 1. About 100 E. coli transformant colonies obtained in Example 1 were cultured in liquid Luria medium (6% bactotrypton, 0.5% yeast extract, 1% NaCI) containing 50 pg / ml ampicillin at 37 ° C for 12 h. 3 ml of culture was transferred to 300 ml of M9 medium (40 mM iqHPO 4 , 22 mM KH 2 PO 4 , 8.5 mM NaCl, 18.7 mM NH 4 C1, 1% glucose, 0.1 mM MgSO 4 , 0.1 mM CaCl 2 , 0.4 % casino acid, 10 pg / ml vitamin B (40 pg / ml ampicillin); the culture was shaken at 37 ° C for 4 h.

Когато O.D. стойността на културата при 650 пт достигне 0.3, към нея се добавя индолакрилна киселина (IAA) за получаване на крайна концентрация от 50 g/ml. След 4 h се определя O.D. на получената култура и тя се центрофугира при 11,000 o6./min за 25 min за събиране на Е. coli клетъчните преципитати. Клетъчните преципитати се подлагат на 15% SDS-PAGE чрез прилагане на метода на Лаемли (Nature, 227,680 (1970) за потвърждаване на получаването на волски хормон на растежа. Клонингите, показващи 40% по-голямо количество на волски хормон на растежа, в сравнение с Е. coli трансформанта, обхващащ плазмид ptrphs BGH 1-13 (контролна група), са избрани и съдържащият ги плазмид се нарича ptrphs BGHRAN #5 (виж фиг. 3).When O.D. the culture value at 650 pt reached 0.3, to which indolacrylic acid (IAA) was added to obtain a final concentration of 50 g / ml. After 4 h, O.D. of the resulting culture and it was centrifuged at 11,000 rpm for 25 min to collect E. coli cell precipitates. Cell precipitates were subjected to 15% SDS-PAGE by applying the Laemli method (Nature, 227,680 (1970) to confirm the production of bovine growth hormone. Clones showing a 40% greater amount of bovine growth hormone compared to with the E. coli transformant comprising plasmid ptrphs BGH 1-13 (control group) were selected and the plasmid containing them was called ptrphs BGHRAN # 5 (see Fig. 3).

Стъпка 2. Установяване последователността на гена на волски хормон на растежа в плазмид ptrphs BGHRAN #5, получен в стъпка 2, се извършва по следния начин: плазмид ptrphs BGHRAN #5 напълно се смила със SacI в NEB буфер 1, след което напълно се смила с EcoRI вStep 2. Determine the sequence of the bovine growth hormone gene in plasmid ptrphs BGHRAN # 5 obtained in step 2 as follows: plasmid ptrphs BGHRAN # 5 was completely digested with SacI in NEB buffer 1 and then completely digested with EcoRI d

NEB буфер 3. Получената смес се подлага на 7% полиакриламидна гел електрофореза за отделяне на ДНК фрагмент, имащ около 187 Ьр, който фрагмент се нарича BGHRAN-T/R.NEB buffer 3. The resulting mixture was subjected to 7% polyacrylamide gel electrophoresis to remove a DNA fragment having about 187 bp, which fragment is called BGHRAN-T / R.

От друга страна, 2 pg от плазмид М13тр18 напълно се смила със SacI в NEB буфер 1, след което изцяло се смила с EcoRI в NEB буфер 3. Получената смес се подлага на 0.7% агар-агар гел електрофореза за отделяне на ДНК фрагмент от около 7 kb, който се нарича фрагмент M13-T/R.On the other hand, 2 pg of plasmid M13tr18 was completely digested with SacI in NEB buffer 1, then completely digested with EcoRI in NEB buffer 3. The resulting mixture was subjected to 0.7% agar-agar gel electrophoresis to remove the DNA fragment from ca. 7 kb, which is called the M13-T / R fragment.

В епруветка се поставят 100 ng от фрагментите BGHRAN-TR и Μ13-T/R, 2 μΐ от 1 Ох лигиращ буфер и 10 части от Т4 ДНК за лигиране; прибавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 20 μΐ. Лигирането се осъществява при 16°С за 12 h.Place 100 ng of BGHRAN-TR and Μ13-T / R fragments in a test tube, 2 μΐ of 1x ligation buffer and 10 portions of T4 DNA for ligation; distilled water was added to obtain a total volume of 20 μΐ. The ligation was carried out at 16 ° C for 12 h.

μΐ от получената лигирана смес се смесват с 200 μΐ от Е. coli JM105 (АТСС 47016) устойчиви клетки и към сместа се прибавят 8 μΐ от 0.2М IPIG разтвор, 100 μΐ от преди култивирането спомагателни клетки (Е. coli JM105), 3 ml от 2xYT висш агар-агар (мек агар-агар; 16 g Бактотриптон, 10 g екстракт от дрожди, 5 g NaCI, 5 g бактоагар-агар/1) и 25 μΐ от 4% Х-гел. Сместа се разпределя на Min А плоча (10.5 gKH2PO4, 1 g (NH4)2SO4, 0.5 g Na-цитрат, 12 g Бактоагарагар, 1 ml 20% MgSO4, 0.5 ml 1% витамин B, 10 ml 50% глюкоза/1), след което се култивира при 37°С за 12 h.μΐ of the resulting ligated mixture was mixed with 200 μΐ of E. coli JM105 (ATCC 47016) resistant cells and 8 μΐ of 0.2M IPIG solution, 100 μΐ of pre-culture auxiliary cells (E. coli JM105), 3 ml was added to the mixture. of 2xYT higher agar agar (soft agar agar; 16 g Bactotrypton, 10 g yeast extract, 5 g NaCI, 5 g bactoagar agar / 1) and 25 μΐ of 4% X-gel. The mixture was partitioned onto a Min A plate (10.5 gKH 2 PO 4 , 1 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.5 g Na-citrate, 12 g Bactoagaragar, 1 ml 20% MgSO 4 , 0.5 ml 1% vitamin B, 10 ml 50% glucose / l) then cultured at 37 ° C for 12 h.

Получените в средата прозрачни плаки се събират, трансферират се към 2 ml от 2xYT течна среда, след което се култивират при 37°С за 5 h. Културата се центрофугира за отделяне на повърхността на вещество и към него се прибавят 1/4 обема от PEG/NaCl (20% полиетилен гликол, 2.5 MnaCl). М13 фаза се отделя от плаващото по повърхността вещество; от него се екстрахира ДНК, а нуклеотидната секвенция на областта на 5'-ия край на гена на волски хормон на растежа се потвърждава (виж фиг. 1).The resulting clear plates were collected, transferred to 2 ml of 2xYT liquid medium, and then cultured at 37 ° C for 5 h. The culture was centrifuged to remove the surface of the substance, and 1/4 volume of PEG / NaCl (20% polyethylene glycol, 2.5 MnaCl) was added thereto. The M13 phase is separated from the floating substance; DNA is extracted from it and the nucleotide sequence of the region of the 5'th end of the bovine growth hormone gene is confirmed (see Fig. 1).

Пример 3. Конструиране на експресионен вектор, включващ гена trpA за крайна транскрипция.Example 3. Construction of an expression vector comprising the trpA gene for final transcription.

Стъпка 1. За получаване на trpA ген за крайна транскрипция и за инсерирането му във векторите на експресия на волски хормон на растежа, получени в пример 2, се синтезират следните праймъри:Step 1. The following primers were synthesized to obtain the trpA end-transcription gene and to insert it into the bovine growth hormone expression vectors obtained in Example 2:

Праймър PTRPATER:PTRPATER primer:

’-GCTTTGTCGACTAATTAAAGCCC GCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCCT CGCGCGTTTCGGT-3 ’.'-GCTTTGTCGACTAATTAAAGCCC GCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCCT CGCGCGTTTCGGT-3'.

Праймър PTRPATER включва разпознавателен сайт за Sall и 25ти-50ти и 51ви-67ми нуклеотид съответстват на гена на транскрипционен терминатор trpA и нуклеотидната секвенция след 3'-ия край на гена на волски хормон на растежа във вектора, съответно.The PTRPATER primer includes a Sall recognition site and the 25th-50th and 51st-67th nucleotides correspond to the trpA transcription terminator gene and the nucleotide sequence after the 3'-end of the bovine growth hormone gene in the vector, respectively.

Както е показано по-долу, плазмид PPBR3740 съответства на част от Amp гена в плазмид ptrphs BGH 1-13 и обхваща разпознавателен сайт за Pvul.As shown below, plasmid PPBR3740 corresponds to a portion of the Amp gene in plasmid ptrphs BGH 1-13 and encompasses a Pvul recognition site.

Плазмид PPBR3740:5’-TGACAACGATCG GAGGACCGAAGGA-3’.Plasmid PPBR3740: 5′-TGACAACGATCG GAGGACCGAAGGA-3 '.

Стъпка 2. В епруветка се поставят 1 ng от плазмид ptrphs BGH 1-13 като матрица, 2 pg от всеки от праймърите PTRPATER и PPBR3740, приготвени в стъпка 1, 10 μΐ от 10х полимерен буфер (10 mM Tris-HCl, pH 8.3,500 тМ КС1,15 тМ MgCl2, 0.1% (w/v) желатин), 10 μΐ от 2 mM dNTP (всеки от dGTP, dATP, dCTP и dTTP е 2 mM) и 2.5 части от Taq ДНК полимераза; добавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 100 μΐ. Изпълнява се PCR чрез повторение 25 пъти на цикъла от: 95°С за 1 min, 55°С за 40 s и 72°С за 2 min.Step 2. Place 1 ng of plasmid ptrphs BGH 1-13 in a tube in a tube, 2 pg of each PTRPATER and PPBR3740 primers prepared in step 1, 10 μ 10 of 10x polymer buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KC1.15 mM MgCl 2 , 0.1% (w / v) gelatin), 10 μΐ of 2 mM dNTP (each dGTP, dATP, dCTP and dTTP is 2 mM) and 2.5 parts of Taq DNA polymerase; distilled water is added to obtain a total volume of 100 μΐ. PCR was performed 25 times over a cycle of: 95 ° C for 1 min, 55 ° C for 40 s and 72 ° C for 2 min.

Полученият PCR продукт се подлага на 1 % агар-агар гел електрофореза за потвърждаване, че се получават около 1.5 kb от ДНК. ДНК се пречиства по същия начин чрез агар-агар гел електрофореза и полученият фрагмент се нарича фрагмент PBR.The resulting PCR product was subjected to 1% agar-agar gel electrophoresis to confirm that about 1.5 kb of DNA was obtained. DNA is purified in the same way by agar-agar gel electrophoresis and the resulting fragment is called a PBR fragment.

Стъпка 3. 2 μg от плазмид ptrphs BGH 113 напълно се смила със Sall и Pvul в NEB буфер 3 и получената смес се подлага на 0.7% агарагар гел електрофореза за отделяне на фрагмент от около 1.5 kb, който се нарича фрагмент PBGHP/L.Step 3. 2 μg of plasmid ptrphs BGH 113 was completely digested with Sall and Pvul in NEB buffer 3 and the resulting mixture was subjected to 0.7% agaragar gel electrophoresis to remove a fragment of about 1.5 kb, called the PBGHP / L fragment.

μg от плазмид ptrphs BGHRAN #5, получен в стъпка 1 от пример 2, изцяло се смила със Sall и Pvul в NEB буфер 3 и получената смес се подлага на 0.7% агар-агар гел електрофореза за отделяне на около 1.5 kb фрагмент, който се нарича фрагмент PBGHRAN-P/L.μg of plasmid ptrphs BGHRAN # 5 obtained in step 1 of Example 2 was completely digested with Sall and Pvul in NEB buffer 3 and the resulting mixture was subjected to 0.7% agar-agar gel electrophoresis to separate about 1.5 kb of the fragment called the PBGHRAN-P / L fragment.

Впоследствие 2 μg от фрагмент PBR, получен в стъпка 2, изцяло се смила със Sall и Pvul в NEB буфер 3. Полученият ДНК фрагмент се екстрахира с фенол/хлороформ и след това се разтваря в 20 μΐ от ТЕ буфер. ДНК фрагмен тът се нарича фрагмент PBR-P/L.Subsequently, 2 μg of the PBR fragment obtained in step 2 was completely digested with Sall and Pvul in NEB buffer 3. The resulting DNA fragment was extracted with phenol / chloroform and then dissolved in 20 μΐ of TE buffer. The DNA fragment is called the PBR-P / L fragment.

Чрез получените по-горе ДНК фрагменти се извършва лигиране. В две епруветки А и В се поставят по 100 ng от всеки от фрагментите PBGH-P/L и PBGHRAN-P/L, съответно. Към всяка от епруветките се добавят по 100 ng от фрагмент PBR-P/L, 2 μΐ от 10х лигиращ буфер и 10 части от Т4 ДНК лигаза; прибавя се дестилирана вода за получаване на общ обем от 20 μΐ. Лигирането се извършва при 16°С за 12 h.The DNA fragments obtained above are ligated. 100 ng of each of PBGH-P / L and PBGHRAN-P / L fragments were placed in two tubes A and B, respectively. To each tube were added 100 ng of PBR-P / L fragment, 2 μ 2 of 10x ligation buffer and 10 portions of T4 DNA ligase; distilled water was added to obtain a total volume of 20 μΐ. The ligation was performed at 16 ° C for 12 h.

Е. coli W3110 (АТСС 37339) клетки са трансформирани с лигираните смеси в съответствие с СаС12 метод (Маниатис и колектив, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) за получаване на рекомбинирани Е. coli трансформанти, съдържащи плазмид ptrp3H BGH 1-13 (епруветка А) или плазмид ptrp3H BGHRAN (епруветка В) (виж фиг. 2).E. coli W3110 (ATCC 37339) cells were transformed with the ligation mixture in accordance with SaS1 2 method (Maniatis et al, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) to obtain recombinant E. coli transformants containing plasmid ptrp3H BGH 1-13 (tube A) or plasmid ptrp3H BGHRAN (tube B) (see Fig. 2).

Пример 4. Експресия на волски хормон на растежа чрез използване на вектори за експресия, включващи модифициран ген на волски хормон на растежа и trpA терминаторExample 4. Expression of Bovine Growth Hormone Using Expression Vectors Including a Modified Bovine Growth Hormone Gene and TrpA Terminator

Е. coli трансформанти, получени в пример 3, се култивират с разклащане в течна Luria среда (6% Бактотриптон, 0,5% екстракт от дрожди, 1% NaCl), включваща 50 μg/μl ампицилин при 37°С за 12 h. 3 μΐ от културата се трансферира в 300 μΐ от М9 среда (40 тМ К2НР04, 22 тМ КН2РО4,8.3 тМ NaCl, 18.7 тМ NH4C1,1% глюкоза, 0.1 тМ MgSO4, 0.1 тМ СаС12, 0.4% казамино киселина, 10 μg/μl витамин Вр 40 μg/μl ампицилин) и се култивира с разклащане при 37°С за 4 h.E. coli transformants obtained in Example 3 were cultured with shaking in liquid Luria medium (6% Bactotrypton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) including 50 μg / μl ampicillin at 37 ° C for 12 h. 3 μΐ of culture was transferred to 300 μΐ of M9 medium (40 mM K 2 HP0 4 , 22 mM KH 2 PO 4 , 8.3 mM NaCl, 18.7 mM NH 4 C1.1% glucose, 0.1 mM MgSO 4 , 0.1 mM CaCl 2 , 0.4% casminic acid, 10 μg / μl vitamin B p 40 μg / μl ampicillin) and shaken at 37 ° C for 4 h.

Когато O.D. стойността на културата при 650 шп достигне ниво от около 0.3, към културата се добавя индолакрилна киселина (IAA) за получаване на крайна концентрация от 50 μg/μl. След 4 h се определя O.D. на получената култура и тя се центрофугира с центрофуга (Бекман J2-21, JA14 rotor) при 11,000 o6./min за 25 min за събиране на Е. coli клетъчните преципитати. Клетъчните преципитати се подлагат на 15% SDS-PAGE в съответствие с метода на Лаемли (Nature, 227 680(1970) за потвърждаване на експресията на волски хормон на растежа. Резултатът е показан на фиг. 3.When O.D. the culture value at 650 nm reaches a level of about 0.3, indolacrylic acid (IAA) is added to the culture to obtain a final concentration of 50 μg / μl. After 4 h, O.D. of the resulting culture and it was centrifuged with a centrifuge (Beckman J2-21, JA14 rotor) at 11,000 rpm for 25 min to collect E. coli cell precipitates. The cell precipitates were subjected to 15% SDS-PAGE in accordance with Laemli's method (Nature, 227 680 (1970)) to confirm the expression of bovine growth hormone The result is shown in Fig. 3.

Както е показано на фиг. 3, количеството волски хормон на растежа, получено чрез Е. coli клетки, трансформирани с плазмиди ptrp3H BGH 1-13 или ptrp3H BGHRAN са 39.9% и 57.3%, съ7 ответно, на база на общото количество протеини, получени в клетката. Тези количества са с 40-50% по-големи в сравнение с количествата, получени от Е. coli, трансформирани с плазмиди ptrphs BGH 1-13 и ptrphs BGHRAN #5, т.е. 26.3% и 39.9%, съответно (виж фиг. 4).As shown in FIG. 3, the amount of bovine growth hormone produced by E. coli cells transformed with plasmids ptrp3H BGH 1-13 or ptrp3H BGHRAN were 39.9% and 57.3%, respectively, based on the total amount of proteins produced in the cell. These amounts are 40-50% higher than the amounts obtained from E. coli transformed with plasmids ptrphs BGH 1-13 and ptrphs BGHRAN # 5, i.e. 26.3% and 39.9%, respectively (see Fig. 4).

Е. coli W3110, трансформирани с плазмид ptrp3H BGHRAN, са депозирани на 26 декември 1994 год. при Korean Collection for Type Cultures (KCTC) (Адрес: GERI, KIST, P.O. Box 115, Yusong, Taejon, 305-600, KR) c номер от KCTC 0143BP, съгласно условията на Споразумението от Будапеща за Международните правила за депозиране на микроорганизми за целите на патентните процедури.E. coli W3110 transformed with plasmid ptrp3H BGHRAN was deposited on 26 December 1994 with the Korean Collection for Type Cultures (KCTC) (Address: GERI, KIST, PO Box 115, Yusong, Taejon, 305-600, KR) c No. KCTC 0143BP, under the terms of the Budapest Agreement on International Rules for the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedures.

Изобретението е представено от гледна точка на изложените специфични описания, но трябва да се приеме, че могат да бъдат направени различни модификации и промени към него от специалисти в областта, които промени също попадат в обхвата на изобретението, както е посочено в приложените претенции.The invention is presented in the light of the specific descriptions set forth, but it should be appreciated that various modifications and changes thereto may be made by those skilled in the art, which changes also fall within the scope of the invention as set forth in the appended claims.

Claims (7)

Патентни претенцииClaims 1. Вектор за експресия на волски хормон на растежа, който включва модифициран ген на волски хормон на растежа, в който нуклеотидната секвенция в региона на 5'-ия му край е модифицирана без промяна на кодираната аминокиселинна секвенция и се инсерира trpA край на транскрипцията след 3 ’-ия край на гена.1. A bovine growth hormone expression vector comprising a modified bovine growth hormone gene in which the nucleotide sequence in the region of its 5'end is modified without altering the encoded amino acid sequence and is inserted by the trpA end of transcription after The 3 'end of the gene. 2. Вектор за експресия съгласно претенция 1, в който областта на 5 ’-ия края на модифицирания ген на волския хормон на растежа включва нуклеотидна секвенция от:The expression vector of claim 1, wherein the region of the 5 'end of the modified bovine growth hormone gene comprises a nucleotide sequence of: 3. Вектор за експресия съгласно претенция 1, в който транскрипционният терминатор trp А включва нуклеотидна секвенция от: 5’-AGCCCGCCTA ATGAGCGGGCThe expression vector of claim 1, wherein the trp A transcription terminator includes a nucleotide sequence of: 5′-AGCCCGCCTA ATGAGCGGGC ТТТТТТТТ-3’.TTTTTTTT-3 '. 4. Вектор за експресия съгласно претенция 3, който е плазмид ptrp3H BGHRAN (KCTC 0143ВР).The expression vector of claim 3, which is plasmid ptrp3H BGHRAN (KCTC 0143BP). 20 5. Клетка на Е. coli, трансформирана с век тор за експресия съгласно която и да е претенция от 1 до 4.5. An E. coli cell transformed with an expression vector according to any one of claims 1 to 4. 5, която е Е. coli W3110, трансформирана с плаз25 мид ptrp3H BGHRAN (KCTC 0143ВР).5, which is E. coli W3110 transformed with plasmid 25 ptrp3H BGHRAN (KCTC 0143BP). 5 5’-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT5 5'-ATG GCT TTT CCG GCT ATG TCT CTA TCT GGCCTA TCT GGC CTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAGCTA TTC GCA AAT GCC GTT CTT CGA GCT CAG CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3 ’CAT CTT CAT CAG CTG GCT-3 ' 10 където ATG е начален кодон на ген на вол ски хормон на растежа.10 where ATG is the start codon of an ox of the growth hormone gene. 6. Клетката на Е. coli съгласно претенцияThe cell of E. coli according to claim 7. Метод за масово производство на волски хормон на растежа, който включва култивиране на Е. coli трансформант съгласно претенция 5 и разделяне на волския хормон на растежаA method for the mass production of bovine growth hormone, comprising culturing an E. coli transformant according to claim 5 and separating bovine growth hormone
BG100264A 1994-12-30 1995-12-28 Vector for bovine growth hormone expression and method for its mass production BG64565B1 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019940040025A KR100225511B1 (en) 1994-12-30 1994-12-30 Process for the mass production of bovine growth hormone

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG100264A BG100264A (en) 1996-12-31
BG64565B1 true BG64565B1 (en) 2005-07-29

Family

ID=36951464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG100264A BG64565B1 (en) 1994-12-30 1995-12-28 Vector for bovine growth hormone expression and method for its mass production

Country Status (10)

Country Link
JP (1) JP3234478B2 (en)
KR (1) KR100225511B1 (en)
AR (1) AR000606A1 (en)
AU (1) AU713218B2 (en)
BG (1) BG64565B1 (en)
BR (1) BR9600009A (en)
CO (1) CO4480064A1 (en)
NZ (1) NZ280764A (en)
TW (1) TW505694B (en)
ZA (1) ZA9511030B (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182318A (en) * 2018-08-16 2019-01-11 湖北大学 A method of utilizing pBV220 expression vector high efficient expression tryptophan synthetase

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3789550T2 (en) * 1986-12-31 1994-08-25 Lucky Ltd METHOD FOR PRODUCING A BOVINE GROWTH HORMONE BY MEANS OF AN ARTIFICIAL GENE.
DE4101736A1 (en) * 1991-01-22 1992-07-23 Gruenenthal Gmbh NEW PLASMINOGENACTIVATORS USEFUL POLYPEPTIDES, DAFUER CODING PLASMIDS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND THEIR USE

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182318A (en) * 2018-08-16 2019-01-11 湖北大学 A method of utilizing pBV220 expression vector high efficient expression tryptophan synthetase

Also Published As

Publication number Publication date
KR100225511B1 (en) 1999-10-15
BG100264A (en) 1996-12-31
BR9600009A (en) 1998-01-21
AU4076895A (en) 1996-07-11
ZA9511030B (en) 1996-07-09
AU713218B2 (en) 1999-11-25
KR960023059A (en) 1996-07-18
AR000606A1 (en) 1997-07-10
NZ280764A (en) 1997-02-24
JPH08228787A (en) 1996-09-10
CO4480064A1 (en) 1997-07-09
TW505694B (en) 2002-10-11
JP3234478B2 (en) 2001-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5470719A (en) Modified OmpA signal sequence for enhanced secretion of polypeptides
RU2129606C1 (en) STRAIN ESCHERICHIA COLI JM 105 TRANSFORMED WITH PLASMID PAE12 - PRODUCER OF ALPHA-AMIDATING ENZYME, RECOMBINANT PLASMID PAE12, MURINE CELLULAR LINE C127 TRANSFORMED WITH PLASMID PDBPV-MMTNEO α - PRODUCER OF ALPHA-AMIDATING ENZYME, RECOMBINANT PLASMID PDBPV-MMTNEO α
JP2766781B2 (en) Microorganisms capable of producing bovine growth hormone
JP3250968B2 (en) Large polypeptides with oligopeptide repeat units
RU2072393C1 (en) Method for obtaining recombination polypeptide possessing growth hormone properties
ES2333942T3 (en) INSULIN PRECURSORS AND PROCESS FOR PREPARATION.
JPS5985292A (en) Human-leraxin gene
JPH04501807A (en) Urate oxidase active protein, recombinant gene encoding it, expression vector, microorganism and transformed cell
FR2464997A1 (en) GENES OF HUMAN PROINSULIN AND HUMAN PRE-PROINSULIN, THEIR PREPARATION PROCESS AND THEIR APPLICATIONS
EP1313848A1 (en) Yeast transformant producing recombinant human parathyroid hormone and method for producing the hormone
US4958007A (en) Extraction of human interleukin-4- from bacteria
EP0252894A2 (en) Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha-antitrypsine, process for their production from bacterial clones and their use in the production of somatocrinine
CA2269801A1 (en) Stable expression of triple helical proteins
US6342375B1 (en) Modified methylotrophic Pichia pastoris yeast which secretes human growth hormone
BG64565B1 (en) Vector for bovine growth hormone expression and method for its mass production
CN1055314C (en) Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus
JPH0716433B2 (en) High level production of bovine growth hormone
AU643194B2 (en) Recombinant fish hormone proteins
CN113249241B (en) Construction and application of saccharomyces cerevisiae protease deletion strain
EP0622460A2 (en) Plasmid and escherichia coli transformed with it
KR100427587B1 (en) A New D-Glutamicacid Synthetase DNA, And The Antibiotics-Independent Vector Using Thereof
RU2207374C1 (en) Recombinant plasmid encoding hepatitis b virus surface antigen (hbsag), its preparing and yeast strain hansenula polymorpha as producer of hepatitis b virus surface antigen (hbsag)
WO1993010231A1 (en) Collagen-like polypeptides
EP0363063A2 (en) Sheep growth hormone
AU647374B2 (en) Sheep growth hormone