JPH0716433B2 - ウシ成長ホルモンの高レベル産生 - Google Patents

ウシ成長ホルモンの高レベル産生

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JPH0716433B2
JPH0716433B2 JP61164846A JP16484686A JPH0716433B2 JP H0716433 B2 JPH0716433 B2 JP H0716433B2 JP 61164846 A JP61164846 A JP 61164846A JP 16484686 A JP16484686 A JP 16484686A JP H0716433 B2 JPH0716433 B2 JP H0716433B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換え体DNA技術による、ウシ成長ホルモン
の高レベルの微生物的産生に関する。この高レベル産生
は、ウシ成長ホルモンを符号化した遺伝子を持つた組換
え体ベクターによつて形質転換されたE.coli細胞の高密
度醗酵によつて達成される。
ウシ成長ホルモン（BGH）は191個のアミノ酸からなる蛋
白であり、まず最初に下垂体前葉中で、Ｎ末端に26個の
アミノ酸が追加結合している前駆物質「前成長ホルモ
ン」として合成される。この26個のアミノ酸からなるシ
グナル配列は、下垂体細胞から分泌される間に変化を受
けて、完全な成長ホルモンを生じる。脳下垂体から精製
したBGHを用いた試用実験で、このホルモンを投与した
ウシに乳汁産生能の増加と餌から乳汁への変換率の向上
が見られることが証明された〔マツクリンL.J.（Machli
n,L.J.,）著．ジヤーナル・オブ・デアリー・サイエン
ス，56:575−580〔1973）〕。このホルモンの多大な経
済的価値が刺激となつて、工業的量のBGHを相応な値段
で得ることが関心の的となつた。
従つて、近年の研究の多くが、この商業的に価値のある
ホルモンを組換え体DNA技術を用いて微生物的に合成す
る方法を得ることに焦点をおいて行われてきた。当分野
に於て既知の遺伝子クローニング技術や遺伝子操作技術
が、所望の宿主細胞中でのBGHの合成を指示することが
できる調節部位に結合しているBGH符号化cDNAを含んで
いる組換え体表現ベクターを生成するために用いられて
きた。これらの表現ベクターで形質転換されている微生
物が所望の成長ホルモンを生成することが示されてい
る。例えば、ケツシエツト（Keshet）等（ヌクレイツク
・アシツド・リサーチ，９:19−30〔1981〕）は、pBR32
2によつて符号化されるβ−ラクタミナーゼの部位を有
する結合蛋白である完全な長さのBGHポリペプチドのE.c
oliに於けるクローニングを報告しており、このBGHポリ
ペプチドが低レベルでしか表現されなかつたことを報告
している。アミノ末端の様々な部位が欠損したBGHポリ
ペプチド符号化ベクターを含めて数種の表現ベクターの
構成法が、ヨーロツパ特許出願公開 第０ 103 395号
に記載されている。完全なBGHホルモンのアミノ末端の
種々の部位が欠損したBGHポリペプチドは生物学的活性
を保持しており、また記載されている表現系に於て完全
なBGHホルモンよりもずつと高レベルに表現されるとい
うことがわかつた。全表現ベクトル（及び、BGH合成を
調節する温度感受性リプレツサー符号化遺伝子を持つた
プラスミド）で系質転換された種々の大腸菌（E.coli）
株に於るBGHの生成率は、小規模培養で100mg/以下で
あつた。これら形質転換株の大規模醗酵については報告
がない。シーバーグ（Seeburg）等の（DNA,２:37−45
〔1983〕）はウシ及びブタ成長ホルモン用cDNAのクロー
ニングと、完成な成長ホルモン符号化表現ベクターの構
成法（即ち、ベクターの構成中に生体外で前シグナル配
列部又はシグナル配列部を取り除く）とを記述してい
る。E.coli細胞をBGH表現ベクトルで形質転換し、BGH合
成をプラズミドで生じたE.coli trp調整部位で調整し
た。形質転換E.coli細胞の高密度醗酵で約1.5g/のBGH
が生成したと報告されているが、醗酵条件の記載はな
い。
クローニングされた遺伝子による蛋白産物を最高表現レ
ベルで得ようとする試みはしばしば失敗する。これらの
遺伝子は数個の異つた調整部位に結合するか、又は数種
の宿主細胞株に形質転換されるので、比較分析によると
形質転換株が所望のタンパクを最高レベル産生すること
がわかる。今日まで、微生物学的に産生される成長ホル
モンの生成率向上の努力が、主に、細胞表現の増強を目
的として行われる遺伝子操作のレベルで行われてきた。
成長ホルモンを最高可能な生成率で生成することが可能
な工業的規模の醗酵法の発展がまだ必要である。
本発明は、BGH生成に最適な条件下で、BGH符号化遺伝子
を含む組み換体ベクターによつて形質転換されたE.coli
細胞の醗酵によつてBGHを高レベルで産生する方法を提
供する。BGH表現は、E.coli宿主株をも形質転換した第
２プラスミドの情報を含む温度感受性リプレツサーによ
つて調整される。本発明の方法を用いて、１当りBGH
を3.6〜5.9g生成する高密度醗酵を得た。
このBGH産生法は、λフアージプロモータオペレーター
の調節下にウシ成長ホルモンの表現を指示する表現ベク
ターとλcI857温度感受性リプレツサー蛋白の表現を指
示する表現ベクターとを含む形質転換E.coliを水性醗酵
培地に接種することからなる。この形質転換株は、培地
中の溶存酸素の濃度が20〜60％飽和にそして培地の温度
が約26〜30℃に維持されている初期生育期の間、醗酵培
地中で生育させられる。この初期生育期に引き続く誘導
期では醗酵培地温度を最低約42℃まで上げて温度感受性
cI857リプレツサー蛋白を不活化することによつてBGH合
成を誘導し、その後温度を約38〜41℃に好ましくは約40
℃に下げてから、誘導期の残りの期間、培地中の溶存酸
素濃度を約10〜40％飽和に維持して形質転換株の生育を
続ける。この様にして生成したウシ成長ホルモンはその
後形質転換細胞から回収される。
我々は、BGH符号化プラズミドによつて形質転換された
E.coli株に於るBGH産生を促進する方法を開発した。本
発明の方法に於てBGH表現を指示するプラズミドは、λ
バクテリオフアージに由来するプロモータ・オペレータ
部位、好ましくはλPLプロモータ・オペレータ部位から
なる調整部位によつてBGHの表現が指示される適当なも
のであれば、どんなBGH符号化プラズミドであつてもよ
い。この調整部位はシヤイン・ダルガーノ（Shine−Dal
gano）（リボゾーム結合性）部位もまた含んでおり、こ
のシヤイン・ダルガーノ部位はmuバクデリオフアージに
由来することが好ましい。このBGH符号化配列は調整部
位に結合されるのであるが、この配列はBGH又はBGHの生
物学的活性フラグメント等のアミノ酸配列を持つポリペ
プチドの情報符号化DNA配列を含む。本明細書中に用い
られている様に、「ウシ成長ホルモン」や「BGH」とい
う言葉は、このホルモンのアミノ末端の種々の部位が欠
損したり又はこのポリペプチドの生物学的活性を破壊し
ないようにBGH配列中の置換や修飾が行われてできたフ
ラグメントを含む。このホルモンのアミノ末端の種々の
部位が欠損してできたBGHポリペプチドは生物学的活性
を保持していることが示されている。本発明の好ましい
具体例では、BGH符号化プラズミドは△9BGH、即ち完全
なホルモンの最初の９つのアミノ末端アミノ酸が欠如し
た形のアミノ酸配列を有するポリペプチドを符号化して
いる。
有利なことに、このプラズミドはまた、このプラズミド
によつて形質転換された細胞を選択する為の選択用マー
カーを符号化する遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子を
も有する。
本発明の方法で用いる形質転換株は、λcI857リプレツ
サー遺伝子をもまた含んでいる。この温度感受性突然変
異遺伝子で符号化されたリプレツサー蛋白は、λフアー
ジ遺伝子調節部位のオペレータ（PLオペレータを含む）
と相互に作用して、調節部位でのオペレータからの遺伝
子の転写を防ぐことが知られている。
このリプレツサー蛋白は、種々の形質転換株に於て、組
換え体ベクターによつて符号化される所望の蛋白の合成
を調節するのに用いられてきた。例えば、C.クイーン
（C.Queen）（ジヤーナル・オブ・モレキユラー・アン
ド・アプライド・ジエネテイクス,2:1（1983））、H.ク
ツパー（H.Kupper）（ヨーロツパ特許出願公告No.0 07
6 037）およびG.ブエル（G.Buell）（ヨーロツパ特許
出願公告No.0 103 395）はすべてcI857リプレツサー
を用いて組換え体ベクターによつて符号化された所望の
蛋白の合成を調節する方法を述べている。このcI857遺
伝子は、所望の蛋白の遺伝子を運ぶベクター（及びこの
蛋白の表現を指示するλプロモータ・オペレータ部位）
上又は宿主細胞へ形質転換される別のプラスミド上で運
ばれる。所望の蛋白の合成は、形質転換宿主細胞を28〜
32℃の温度で所望の細胞密度に達するまで培養すること
によつて抑制された。我々研究者はその後、残りの培養
期の間温度を42〜43℃に上げることによつてcI857リプ
レツサーを不活化した（即ち所望の蛋白の合成を誘起し
た）。
cI857遺伝子は、BGH合成を調節するために本発明の方法
で用いられており、恐らく宿主細胞染色体中ではBGH符
号化プラスミド上又は第２プラスミド上で運ばれる。本
発明のより好ましい具体例ではcI857リプレツサー蛋白
の表現を指示する第２プラスミドは、BGH符号化プラス
ミドと共に宿主株へ形質転換される。我々は、λPLプロ
モータ・オペレータと相互に作用するcI857リプレツサ
ーは37℃という低い温度である程度不活化されることを
観察しており、この事は振とうフラスコ培養で封入体が
形成される（BGH合成を示す）ことによつて証明され
る。しかしながら、最も良い結果が得られたのは、１時
間温度を42℃に上げてcI857リプレツサーを不活化した
後残りの醗酵期間中温度を40℃に下げておく方法であつ
た。
用いる宿主細胞は、細胞を形質転換する為に使用する表
現ベクターがその中で安定に維持される、高密度醗酵に
適したものであれば、どんな形質転換可能なE.coli株で
あつてもよい。当分野ではそのような株が多く知られて
おり、そのうちの適当な株の一つがE.coli HB101（ロイ
シン・ラクトース・プロリン・チアミン・hrs・hsm・su
pE・recA.smr）である。
本発明の方法に使用するのに好ましい形質転換株はE.co
li HB101（PL−mu−△９（Ser）BGHとpcI857）である。
これらのプラスミドを含むE.coli形質転換体の構成法は
ヨーロツパ特許出願公告第０ 103 395号に記載されて
おり、参考の為に本明細書中にその開示を包含している
この文献はこれ以後EPO 0 103 395と呼ぶ。E.coli HB
101（PL−mu−△９（Ser）BGHとpcI857）は、ブダペス
ト条約に基づきアメリカ合衆国メリーランド州ロックビ
ルにあるアメリカンタイプカルチャーコレクションに識
別番号 大腸菌 IMC＃1,大腸菌 IMC＃２（それぞれ受
託番号53030,53031）として寄託されている。本発明の
方法が、BGH表現がcI857遺伝子生成物の調節下にある他
の形質転換株を用いてBGHの高レベル産生するのに等し
く適用されることは、評価されることであろう。
第１図に示されているプラスミドPL−mu−△９（Ser）B
GHは、完全なホルモンの最初の９つのアミノ末端アミノ
酸が欠如しており、通常はBGH中に存在しない余分のセ
リン残基をＮ末端に含むBGHポリペプチドを符号化して
いる。この余分のセリン残基は、遺伝子操作の産物とし
て、遺伝子の第５′端に存在する。BGH符号化配列の表
現は、λフアージPLプロモータ・オペレータを含む調節
部位、muバクテリオフアージ由来のシヤイン・タルガル
ノ（Shine−Dalgarno）部位及びBGH配列に隣接した（及
び５′）開始コドンによつて調節される。このプラスミ
ドは、アンピシリン耐性の遺伝子もまた持つている。
第１図について説明すると、△９（Ser）BGH遺伝子は、
pBR322〔G.サツクリツフエ（G.Sutcliffe），コールド
・スプリング・ハーバー・シンポジア,1978〕の誘導体
であるプラスミドpPLC24（Gene,15:81−93,1981）上に
クローニングされていた。このプラスミド上の点Ａは、
サツクリツフエ（Sucliffe）配列中のヌクレオチド4180
である。プラスミドpBR322はこの点Ａから反時計回り
に、pBR322配列のヌクレオチド375のあるBam HI認識部
位まで続く。点Ａから時計回りに見ると、Tn903からの3
01塩基対フラグメントがあり、その次に291塩基対PLプ
ロモータが位置している。Eco RI制限部位は、このプロ
モータを、リボソーム結合部位を与えるmu配列から開始
ATGコドンまで分割する。△９（Ser）BGH構造部に於
て、10から190までのアミノ酸が後に続いておりBGHの最
終アミノ酸であるセリンを符号化している、DNAが含ま
れている。この部分に続いて、非翻訳DNAの65の塩基対
と、最初のクローニングの過程でアニーリングされたホ
モポリマーテイル由来の23のdG/dC塩基対、そして最後
にはBam HI認識部位が位置しており、この認識部位に合
成DNAが入り込んでいる。
第２図中に示されているプラスミドpcI857は、cI857温
度感受性リプレツサーを符号化すると共にカナマイシン
耐性遺伝子を運ぶ多重コピープラスミドである。両方の
プラスミドによつて形質転換されたE.coli HB101細胞
は、ヨーロツパ特許出願公開第０ 103 395号に記載さ
れていると同様の方法で、アンピシリンとカナマイシン
の両方を補つたルリア（Luria）肉汁中で生育させるこ
とによつて選択した。
得られた形質転換株を、醗酵器中の水性培地に接種す
る。水性醗酵培地は、E.coliの高密度生育を支えるのに
適当なものであればどんな培地でもよい。この培地は、
細胞生育に必要な炭素源、窒素源、塩類及びその他の栄
養素を含んでいる。適当な炭素源には、グリセロールと
水和グルコース（セレロース として市販されている）
が含まれる。適当な窒素源には、カゼインの酸加水分解
物〔ハイカーゼ アミノ酸（HyCase Amino Acids）又は
カサミノ酸（Casamino Acids）として市販されてい
る〕、カゼインの酵素加水分解物〔エヌゼツト・アミン
Ａ（NZ Amine A）、カサトーン（Casatone）及びトリプ
トン（Tryptone）〕植物性加水分解蛋白（大豆ペプト
ン、加水分解コーングルテン、棉実ペプトン）、肉ペプ
トン及び酵母抽出物が含まれる。上述の炭素源及び窒素
源は、単に既知で市販されているものの実例に過ぎな
い。その他の適当な炭素及び窒素源は、当業者にはすぐ
にわかることであろう。培地には、宿主細胞がプラスミ
ドを保持するのに必要なものであればどんな成分を加え
てもよい。例えば、形質転換株E.coli HB101（PL−mu−
△９（Ser）BGHとpcI857）を醗酵器中で生育させる時に
は、抗生物質のアンピシリンとカナマイシンを添加す
る。
培地温度を調節する手段と、培地を撹拌し空気にさらす
手段と、取り込み空気に酸素を添加する手段とを備えて
いれば、当分野で知られているどんな従来型の醗酵用器
機を用いてもよい。
醗酵用培地に形質転換株の培養物を接種する。この培養
物は、約30℃で８〜24時間（又は培養産物のA550即ち55
0ナノメータでの吸光度が４〜10になるまで）、例えば2
0rpm回転の撹拌であらかじめ培養しておくのが有利であ
り、また30゜で15〜20時間又はA550が４〜６になるまで
培養するのが好ましい。この培養物は例えばルリア（Lu
ria）肉汁等のどんな適当な培地に生育させてもよい。
醗酵器に接種する培養物の容量は、醗酵器中の培地容量
の1/50〜1/20倍であり、1/25倍であるのが好ましい。
本発明の方法では、醗酵は２相で行われる。醗酵培地に
形質転換株を接種した後、培地中の溶存酸素濃度を20〜
60％飽和に好ましくは約50％飽和に維持して初期培養を
行う。この初期培養は、溶存酸素濃度を所望のレベルに
維持するのに十分な速度で循環空気を供給する一方、適
当な機械的手段で醗酵培地を撹拌することによつて達成
される。循環空気を１分間につき１容量液体当り0.8〜
1.2容量の好ましくは約1.0容量（STP）の速度で供給
し、培地を800〜1.200rpm、好ましくは約1.000rpmの回
転数で撹拌するのが適当である。撹拌器は100ガロンの
醗酵培地当り好ましくは約0.5〜2.0馬力の出力を持つモ
ータで作動させる。初期培養期間中の培地の温度は、cI
857リプレツサー蛋白が活性である一方E.coliの生育が
維持され、従つて形質転換株中のBGH表現が抑制されさ
えすれば、どんな温度でもよい。初期生育期の間、温度
を26〜30℃に保つのが好ましく、約28℃に保つのが最も
好ましい。
この初期培養は細胞密度（醗酵器から取り出した培養試
料のA550で測定する）が50〜60に達するまで続けられ、
通常はそれは醗酵培地に接種してから約23〜25時間後で
ある。この時点で、第２醗酵期である誘導期が始まる。
醗酵培地の温度を最低約42℃（好ましくは42℃）まで上
げて約１時間この温度に保つことによつてcI857リプレ
ツサー蛋白の不活化すると共に形質転換株中でのBGHの
産生を誘引する。その後温度を約38〜41℃に好ましくは
約40℃に下げる。この温度では、cI857リプレツサー蛋
白は不活性であるが、E.coliの生育にとつては42℃の条
件よりも好都合である。
誘導期の間、培地中の溶存酸素濃度は約10〜40％飽和に
維持される。この溶存酸素濃度を維持する為に、どんな
適当な通気用及び撹拌用手段を用いてもよい。本発明の
好ましい具体例に於ては、循環空気を１分間につき１容
量液体当り0.8〜1.2容量、好ましくは約1.0容量（STP）
の速度で供給し、培地を800〜1.200rpm、好ましくは約
1.200rpmで撹拌する。撹拌器は、100ガロンの醗酵培地
当り好ましくは約0.5〜2.0馬力の出力を持つモーターで
作動させる。誘導期の間は酸素消費率が増加するので、
所望の溶存酸素濃度を維持する為に、循環空気源中に存
在する酸素を醗酵器へ補給するのが好ましい。酸素を醗
酵培地へ供給するどんな従来の方法を用いてもかまわな
い。例えば、酸素源に継ながつている散布器を直接培地
に捜入してもよいし、又は醗酵器に供給する循環空気に
酸素を添加してもよい。
細胞密度A550が約80〜120になるまで、好ましくは100〜
123になるまで、誘導期が継続される。これらの細胞密
度は、通常、誘導期間始後約７〜８時間で到達する。BG
H合成と細胞生育が完全であることを示す醗酵パラメタ
ーは（１）酸素要求の顕著な低下、（２）細胞密度（A
550値）がもうこれ以上増加しないレベルに達したこ
と、及び（３）（pH調節の為の）NaoH利用が停止するこ
とである。
細胞培養中に使われて醗酵培地中から無くなる栄養素
は、当分野で知られているいずれかの方法で補給する。
醗酵中栄養素を継続的に添加してもよいし、分割して添
加してもよい。栄養素を醗酵中の細胞密度A550が30〜35
に達した時と50〜60に達した時と90〜100に達した時の
３回に分割して添加するのが好ましい。栄養素の最初の
供給は初期培養中に、通常は接種後約23〜25時間に行わ
れる。第２の栄養素供給は、誘導期を始める為に温度を
上げるちようど前、通常は接種後約23〜25時間に行われ
る。第３の栄養素供給は、誘導期の間に、通常は接種後
約29時間に行われる。
添加する栄養素は選んだ醗酵培地の組成によるが、一般
的に炭素源と窒素源を含む。供給栄養素はおよそ等重量
のNZアミンＡとグリセロールとから成つているのが有利
である。最初の２回の供給物の各々は醗酵器中の培地１
当り総量約45〜60gの混合栄養素からなり、第３回目
の供給物は培地１当り総量約20〜25gの混合栄養素か
らなるのが好ましい。我々は、接種後16時間に各250mg
のNZアミンＡとグリセロールを１の水に溶かしたもの
を9.4の醗酵培地に添加すると共に、接種後24時間に
各250mgのNZアミンＡとグリセロールとを１の水に溶
かしたものを醗酵培地に添加することによつて優れた結
果を得た。我々はそして、接種後29時間には、各125gの
NZアミンＡとグリセロールとを１の水に溶かしたもの
を醗酵器に添加した。
形質転換株によつて産生されたBGHは、当分野で知られ
ているどんな適当な手段で回収してもよい。細胞を醗酵
培地中から例えば遠心分離によつて採取してよい。採取
した細胞は、例えば超音波処理、フレンチプレス（Fren
chpress）を用いたり又はリゾチーム等の試薬やトリト
ン・エツクス100（Triton−Ｘ−100）等の洗剤を用いた
処理で、酵素的・化学的又は機械的手段で溶解する。BG
Hを細胞溶解物から精製するには、アフイニテイクロマ
トグラフイー、硫酸アンモニウム等からの塩の溶液から
の選択的沈降、イオン交換クロマトグラフイー、等電点
電気泳動又はこれらの方法を組合せた方法のすべてを含
むどんな適当な蛋白精製法を用いてもよい。
本発明の醗酵法では、高密度醗酵で１当り3.6〜5.9g
の△９（Ser）BGHを生成している。PL−mu−△９（Se
r）BGH及びpcI857で形質転換したE.coli宿主で以前研究
を行つた研究者達が小規模培養産物から得られたとして
いるラジオイムノアツセイ（EPO 0 103 395参照）で測
定した△9BGHの生成率は100mg/以下である。本発明の
方法を用いて、我々はこの形質転換株を使つたBGH産生
レベルを向上させることに成功した。
本発明の方法は、以下に続く実施例により詳しく説明さ
れている。実施例は本発明の方法をより詳しく説明する
為のものであり、本発明の範囲を限定する為のものでは
ない。
実施例 １ ウシ成長ホルモンの高度な微生物的産生の条件 10％（V/V）のグリセロールを添加したE.coli HB101（P
L−mu−△９（Ser）BGHとpcI857）細胞であるATCC53030
の試料を、必要とされるまで−85℃の液体窒素下に保存
した。
９の培地を入れた醗酵器に接種する材料を、500ml容
量の遮光フラスコ中の200mlのLB培地中に得られた細胞
を含むものをいくつか作成することによつて得た。使用
したLB培地の組成は、１当り10gのトリプトンと5gの
酵母抽出物と10gのNaCl並びに、100μg/mlのアンピシリ
ンと50μg/mlのカナマイシンであつた。培地のpHは7.0
に調節した。これらのフラスコは培地の通気が行われる
ように乳汁用ロ過器栓で口をふさぐ一方、フラスコをニ
ユーブランスウイツク（New Brunswick）振とう器中で3
0℃に於て15〜20時間200rpmで振とうした（A550値が４
〜６に達するまで）。
使用した醗酵器は、全容量16のニユー・ブランスウイ
ツク・ミクロゲンであつた。400mlの接種材料を入れた
醗酵器に先ず９の液体培地を充填した。
醗酵培地 最初に加えた９の培地の組成を下記に示す。
培地は15psig水蒸気圧で殺菌（121℃で15〜20分間）し
たと同時にNaOHでpHを6.8に調節した。醗酵の期間中必
要に応じてNaOHを添加することでpHを維持した。
アンピシリンとカナマイシンとを各々の抗生物質濃度が
25mg/Lになるように充分な量だけ培地に加えた。抗生物
質溶液はロ過によつて滅菌した。
醗酵の期間中、醗酵器に３回栄養素を追加供給した。第
１の供給物（A550値が30〜35の時点）は１の水に溶解
した250gのNZアミンＡと250gのグリセロールとからなつ
ていた。この添加操作によつて、温度誘導の前に細胞密
度A550が50〜60に増加した。細胞密度が50〜60の時点で
（接種後約23〜25時間に）、醗酵器に再度250gのNZアミ
ンＡと250gのグリセロールとを加え、温度を１時間42℃
に保つことによつてBGHの合成を誘導した。A550値が90
−100の時点で、栄養素が残りの誘導期の間利用される
ように、125gのNZアミンＡと125gのグリセロールとを最
後に添加した。醗酵の期間中、溶存酸素（DO）濃度を、
ストリツプレコーダに接続した直流電流用探り針で常に
測定した。導入空気を酸素で強化することによつて、DO
を10〜40％飽和（１−4ppm）に誘導期の間維持した。酸
素調節器を備えたガスタンクを使つて導入空気中への酸
素の流入を調節した。ガスを混合した後、酸素強化空気
をロ過してから散布器を通して醗酵器へ入れる。
醗酵器操作 最良の結果が得られる操作条件をこの節に記載してい
る。
1. 期間:0〜24時間 a.培地温度:28℃ b.撹拌速度:1.000RPM c.撹拌器によるエネルギー入力:100ガロン当り1.0〜2.0
馬力 d.通気率:1分間当り10L（STP） e.逆圧:1in2当り3Ibs f.溶解酸素：飽和値の50％ g.追加供給は16時間後（A550が30〜35の時点） h.24時間後に醗酵器から得た培養試料の550nm波長での
吸光度は50〜60であつた。
2. 期間:24〜32時間 a.培地温度 （１）接種後24〜25時間目（１時間）は42℃ （２）接種後25〜32時間目（７時間）は40℃ b.撹拌速度:1.200RPM c.撹拌器によるエネルギ入力:100ガロン当り1.0〜2.0馬
力 d.通気率:1分間当り10L（STP） e.逆圧:1in2当り３〜6Ibs f.溶存酸素:10〜40％飽和 これらの値を得る為に、導入空気に酸素を強化して混合
してから、混合ガスを散布器を通して醗酵器へ導入し
た。
g.最終吸光度:A550値が99〜123 h.（栄養素の）追加供給を24時間後と29時間後に行つ
た。
結 果 HPC分析の為に、醗酵器中の肉汁試料を遠心分離（10〜1
5.000xg,15分）によつて採集してから細菌を３〜５容量
の緩衝性グアニジン（8M）の塩酸グアニジン、50mMのグ
リシン水酸化ナトリウム（pH9.8）及び5mMの還元グルタ
チオン）中に再懸濁した。得られた懸濁液を20〜30分間
放置した後、SDT−1810型TeK−Mar組織ミキサーで15〜2
0秒間ホモゲナイズした。不溶性細胞破片を上記と同様
に遠心分離で取り除いた後、清澄なBGH抽出物をHPLCで
アツセイした。
上記の過程を実際に３回行つた結果が下記の如くであつ
た。
△９（Ser）BGH用の醗酵培地の最終アツセイ：高性能液
体クロマトグラフイー（HPLC）を用いた １細胞当り７×106分子のBGHの表現レベル
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の方法で用いることのできるBGH表現
ベクターである、プラスミドPL−mu−△９（Ser）BGHの
顕著な特色を表わす説明図、第２図は、本発明の方法で
BGH産生を調節するのに使用される温度感受性リプレツ
サを記号化している、プラスミドpcI857の顕著な特色を
表わす説明図である。

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ｉ）λファージプロモーターオペレータ
    ーの調節下にウシ成長ホルモンの表現を指示する表現ベ
    クターと温度感受性リプレッサー蛋白λcI857の表現を
    指示する表現ベクターを含有する形質転換E.Coli株を水
    性醗酵培地に接種し； （ii）その間に栄養素を醗酵培地中に供給し、培地中に
    溶存する酸素濃度を約20〜60％飽和し、そして培地の温
    度をリプレッサー蛋白λcI857が活性である温度に維持
    しながら、醗酵培地中の形質転換株を初期培養し； （iii）醗酵培地の細胞密度A550が50〜60に達した時に
    栄養素を醗酵培地に供給し、次に醗酵培地の温度を少な
    くとも約42℃まで上げて温度感受性リプレッサー蛋白λ
    cI857を不活性化し、それによりその間にウシ成長ホル
    モンが産生する誘導期を開始し； （iv）その間にさらに栄養素を醗酵培地中に供給し、温
    度を約38〜41℃まで下げて培地中の溶存酸素濃度を約10
    〜40％飽和に維持しながら誘導期を残りの期間、形質転
    換株を培養し続け；そして （ｖ）このようにして産生したウシ成長ホルモンを形質
    転換細胞から回収する工程を包含する、ウシ成長ホルモ
    ンを産生する方法。
  2. 【請求項２】初期培養期の間温度を約28℃に維持する特
    許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】リプレッサー蛋白の不活化に引き続き温度
    を約40℃に低下させてから誘導期の残りの期間中40℃に
    維持する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】初期培養期間中培地中の溶存酸素の濃度を
    約50％飽和に維持する特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】初期培養期が約23時間から約25時間にわた
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  6. 【請求項６】初期培養期が約24時間である特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  7. 【請求項７】誘導期が約７〜８時間の期間である特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】第９番目のＮ末端アミノ酸まで欠失してお
    り１つのセリン残基をＮ−末端に有するウシ成長ホルモ
    ンの生物学的活性フラグメントを形質転換株が生成する
    特許請求の範囲第１項記載の方法。
  9. 【請求項９】形質転換株がE.Coli HB101（PL−mu−△
    ９（Ser）BGHとpcI857）;ATCC53030である特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】接種後約16、24並び29時間に栄養素を分
    割して醗酵培地に供給する特許請求の範囲第１項記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】接種後16並び24時間に醗酵培地１当り
    約45〜60グラムの栄養素を培地に加え、接種後約29時間
    に醗酵培地１当り20〜25グラムの栄養素を培地に加え
    ると共に、当該栄養素が約等重量のグリセロールと酵素
    的カゼイン加水分解産物よりなる特許請求の範囲第10項
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】醗酵物中の細胞密度A550が30〜35に達し
    た時に栄養素の第一分割醗酵培地に添加し、細胞密度A
    550が50〜60に達した時に栄養素の第２分割を添加し、
    細胞密度A550が90〜100に達した時に栄養素の第３分割
    を添加する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】各栄養素分割が約等重量の酵素的カゼイ
    ン加水分解産物とグリセロールとからなる特許請求の範
    囲第12項記載の方法。
  14. 【請求項１４】１の醗酵培地に対して第１及び第２の
    栄養素を約45〜60グラムと第３の栄養素分割を20〜25グ
    ラム添加する特許請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】初期培養期の間、１分間につき１容量液
    体当り0.8〜1.2容量（STP）の速度で循環する空気を供
    給し、醗酵培地を100ガロンの醗酵倍地当り約0.5〜2.0
    馬力の出力を有する撹拌器で約1.000rpmの回転数で機械
    的に撹拌することによって溶存酸素濃度を維持する特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】循環する空気を、１分間につき１容量の
    液体当り約1.0容量の速度で供給する特許請求の範囲第1
    5項記載の方法。
  17. 【請求項１７】当該誘導期の間の溶解酸素濃度を、醗酵
    物中に供給する空気に酸素を添加することによって10〜
    40％飽和に維持する特許請求の範囲第１項記載の方法。
  18. 【請求項１８】誘導期の間、１分間につき１容量液体当
    り約0.8〜1.2容量の速度で酸素混合循環空気を醗酵物に
    供給し、醗酵培地を100ガロンの醗酵培地当り約0.5〜2.
    0馬力の出力を有する撹拌器で約1.200rpmの回転数で機
    械的に撹拌することによって溶解酸素濃度を維持する特
    許請求の範囲第17項記載の方法。
  19. 【請求項１９】循環する空気を、１分間につき１容量当
    り約1.0容量の速度で醗酵物に供給する特許請求の範囲
    第18項記載の方法。
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