CN101591690B - 一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法，通过在线检测葡萄糖浓度控制营养的流加，使呼吸商值维持在0.9～1之间，并控制相对恒定的溶解氧，从而达到维持有机酸在低水平的目的，实现重组人干扰素α2b的高密度发酵。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法。
背景技术
我国目前的高密度发酵水平和国外差距较大，发酵后菌体浓度和产物的产量上与国际水平有很大的差异，例如生产重组人生长激素的重组大肠肝菌发酵国内能够达到发酵后菌液OD600在50-60，而国外能够达到120的水平，目的产物的产量国内只有0.4g/L，而国外能够达到1.1g/L的水平。毕赤酵母的高密发酵更有优势，可以在合成培养基中生长到OD值500以上，菌体体积可占到发酵液体积的一半以上。
在高密发酵方面，大肠杆菌是最具代表性和应用最广的宿主系统，重组大肠杆菌的高密度发酵技术在生产实践中得到了广泛应用，并且取得了令人惊喜的成果。但是在该技术实际应用中还存在许多需要解决的问题。其中最为严重的就是培养过程中菌体过早地衰老、自溶和外源基因不能充分表达、比活性较低，这主要是细菌产生的有害的代谢废物对重组菌的抑制作用。比如乙酸是大肠杆菌的主要副产物，它对细菌生长和产物的表达都有抑制作用。乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。一般认为细菌在低比生长速率条件下通过氧化代谢作用产生的能量足以满足合成和异化作用的需求，不会产生乙酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生成途径储备ATP和NADH2。这就产生过多乙酸。目前以重组人干扰素α2b为代表的生化药物在国内发酵罐实际操作中由于发酵过程研究以及数据采集与处理困难，发酵工艺优化的基本思路仍停留在寻求培养基的最优配方和最佳的温度、pH、等的静态调控，其操作步骤繁琐，菌体表达低，菌量少。
重组人干扰素α2b在全自动模块式发酵系统中采用代谢控制发酵的技术正是解决其高密度发酵的关键技术。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法。
(二)技术方案
本发明提供了一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法，它是通过在线检测葡萄糖浓度控制营养的流加，使呼吸商值维持在0.9-1之间。同时，在发酵过程中通过控制相对恒定的溶解氧以维持有机酸的低水平。
本发明所采用的发酵罐是W14900瑞士比欧公司生产的450L全自动发酵罐。所采用的试剂均为普通化学试剂公司购买。乙酸浓度采用离子色谱(美国Dionex公司ICS 1500离子色谱仪，Ionpac AS11HC4×250mm阴离子分析柱和Ionpac AG11 HC4×50mm保护柱，电导检测器检测)检测。葡萄糖浓度采用瑞士比欧公司专用ProcessTRACE1.2在线葡萄糖分析仪检测。目的蛋白测定采用SDS-PAGE法，采用瑞典安发玛西亚公司MINI VE电泳仪。
本发明所述的重组人干扰素α2b的高密度发酵方法包括如下步骤：
(1)按配方称取规定重量的组分；
(2)在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3)用氢氧化钠溶液调PH值至5.0-8.0；
(4)发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(121℃，30分钟)，补料培养基在相应专用玻璃补料瓶内灭菌(115℃，30分钟)。
(5)在接入合适的重组大肠杆菌进行培养；
(6)本发酵工艺采用利用其全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为200-700rpm、起始通气量设为100-500L/min、起始罐压设为0.1-0.5bar，采用计算机控制，将发酵过程全程溶解氧浓度控制在30％-75％之间。将搅拌速度、通气量、罐压通过计算机与溶解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现波动，自动调节搅拌速度、通气量和罐压等参数使溶解氧浓度保持恒定。从而保证了菌体的生长和目的产物的表达。
(7)利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡萄糖分析仪，可随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算出整个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和CO2的释放率(CER)，计算呼吸商(RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼吸商(RQ)值维持在0.9-1之间。从而控制维持乙酸的低水平(2-6g/L)，保证了菌体的生长和目的产物的表达。
(8)对获得菌体进行通用方法处理得到重组人干扰素α2b成品。
(三)有益效果
采用本发明所述的高密度发酵方法，可以在发酵过程中避免或减少乙酸的生成，从而减轻了乙酸的抑制作用，实现重组大肠杆菌高密度生长，提高重组人干扰素α2b蛋白的产率。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 重组人干扰素α2b的高密度发酵
发酵培养基1：蛋白胨6g/L，酵母膏2g/L，葡萄糖0.02％，甘油0.6％，Na2HPO4 11g/L，NaH2PO4 1g/L，KH2 PO4 4g/L，NaCl 2g/L，FeSO4.7H2O0.01g/L，MgSO4.7H2O 0.02g/L，CaCl2 0.001g/L，，VB1 0.01g/L，MnSO4 0.01g/L、甘氨酸0.2g/L、甲硫氨酸0.01g/L。
补料培养基包括：葡萄糖浓度15％，用量1％；甘油浓度45％，用量7％
(1)按上述配方称取100L的组分；
(2)在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3)用氢氧化钠溶液调PH值至5.0-8.0；
(4)发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(121℃，30分钟)，补料培养基在相应专用玻璃补料瓶内灭菌(115℃，30分钟)；
(5)在接入重组大肠杆菌进行培养；
(6)采用利用其全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为200rpm、起始通气量设为100L/min、起始罐压设为0.1bar，采用计算机控制，将发酵过程全程溶解氧浓度控制在35％之间。将搅拌速度、通气量、罐压通过计算机与溶解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现波动，自动调节搅拌速度、通气量和罐压等参数使溶解氧浓度保持恒定。从而保证了菌体的生长和目的产物的表达。
(7)利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡萄糖分析仪，可随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算出整个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和CO2的释放率(CER)，计算呼吸商(RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼吸商(RQ)值维持在0.9-1之间。获得含重组人干扰素α2b的菌体1962g，发酵液乙酸含量＜3克/L，经检测菌体目的蛋白(重组人干扰素α2b)表达量34.46％。
(8)对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素α2b成品。
实施例2：重组人干扰素α2b的高密度发酵
发酵培养基2：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖0.5％，甘油1％，Na 2HPO4 15g/L，NaH2PO4 4g/L，KH2 PO4 6g/L，NaCl 3g/L，FeSO4.7H2O0.5g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.02g/L，，VB1 0.03g/L，MnSO4 0.05g/L、甘氨酸0.5g/L、甲硫氨酸0.06g/L。
本发明所采用的补料培养基包括：葡萄糖浓度35％，用量5％；甘油浓度25％，用量2％
(1)按上述配方称取100L的组分；
(2)在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3)用氢氧化钠溶液调PH值至5.0-8.0；
(4)发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(121℃，30分钟)，补料培养基在相应专用玻璃补料瓶内灭菌(115℃，30分钟)。
(5)在接入重组大肠杆菌进行培养，升到42℃培养；
(6)采用全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为250rpm、起始通气量设为250L/min、起始罐压设为0.2bar，采用计算机控制，将发酵过程全程溶解氧浓度控制在25％之间。将搅拌速度、通气量、罐压通过计算机与溶解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现波动，自动调节搅拌速度、通气量和罐压等参数使溶解氧浓度保持恒定。从而保证了菌体的生长和目的产物的表达。
(7)利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡萄糖分析仪，可随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算出整个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和CO2的释放率(CER)，计算呼吸商(RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼吸商(RQ)值维持在0.91之间。获得含重组人干扰素α2b的菌体2063g，发酵液乙酸含量＜2.5克/L，经检测菌体目的蛋白(重组人干扰素α2b)表达量38.17％。
(8)对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素α2b成品。
实施例3：重组人干扰素α2b的高密度发酵
发酵培养基3：蛋白胨18g/L，酵母膏8g/L，葡萄糖2％，甘油4％，Na2HPO4 27g/L，NaH2PO4 7.5g/L，KH2 PO4 6.5g/L，NaC16.5g/L，FeSO4.7H2O0.08g/L，MgSO4.7H2O 1.2g/L，CaCl2 0.01g/L，，VB1 0.1g/L，MnSO4 0.1gg/L、甘氨酸1.2g/L、甲硫氨酸0.1g g/L。
本发明所采用的补料培养基包括：葡萄糖浓度50％，用量8％；甘油浓度15％，用量4％。
(1)按上述配方称取100L的组分；
(2)在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3)用氢氧化钠溶液调PH值至5.0-8.0；
(4)发酵培养基在相应容积的发酵罐内灭菌(121℃，30分钟)，补料培养基在相应专用玻璃补料瓶内灭菌(115℃，30分钟)；
(5)在接入合适的重组大肠杆菌进行培养，升到43℃；
(6)采用其全自动发酵监控系统，将起始搅拌速度设为300rpm、起始通气量设为400L/min、起始罐压设为0.3bar，采用计算机控制，将发酵过程全程溶解氧浓度控制在45％之间。将搅拌速度、通气量、罐压通过计算机与溶解氧浓度自动关联，当溶解氧浓度出现波动，自动调节搅拌速度、通气量和罐压等参数使溶解氧浓度保持恒定。
(7)利用瑞士比欧公司全自动发酵系统的在线尾气监测系统和在线葡萄糖分析仪，随时测定尾气中氧和二氧化碳浓度，利用随机专用软件计算出整个发酵过程中的二氧化碳释放率(CER)和CO2的释放率(CER)，计算呼吸商(RQ)，同时通过在线检测葡萄糖浓度，自动控制葡萄糖补料速度，使呼吸商(RQ)值维持在0.9-1之间。获得含重组人干扰素α2b的菌体1643g，发酵液乙酸含量＜3.5克/L，经检测菌体目的蛋白(重组人干扰素α2b)表达量33.27％。
(8)对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素α2b成品。
实施例4对照实验
发酵培养基4：蛋白胨10g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖4％，NaC15g/L，
本发明所述的重组人干扰素α2b的高密度发酵培养基配制方法包括如下步骤：
(1)按上述配方称取100L的组分；
(2)在规定数量的纯化水溶液中溶解；
(3)用氢氧化钠溶液调PH值至7.0；
(4)在相应容积的发酵罐内灭菌(121℃，30分钟)。
(5)在接入重组大肠杆菌进行培养，获得含重组人干扰素α2b的菌体1035g，发酵液乙酸含量＞5克/L，经检测菌体目的蛋白(重组人干扰素α2b)表达量25.14％。
(6)对获得菌体进行洗涤、裂解、复性、提纯等处理得到重组人干扰素α2b成品。
Claims (2)
1. 一种重组人干扰素α2b的高密度发酵方法，其特征在于通过在线检测葡萄糖浓度控制营养的流加，使呼吸商值维持在0.9～1之间。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于在发酵过程中通过控制相对恒定的溶解氧以维持有机酸的低水平。
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