CN1735691A - 利用比氧吸收率作为过程控制的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

在发酵方法中用比氧吸收率(OUR)作为过程控制参数。至少在发酵过程的生产阶段测定OUR，调节过程参数使OUR保持在希望的范围之内。当使用含有已经破坏而不再起作用的天然PDC途径的微生物进行发酵时，本发明特别适用。这类微生物在严格厌氧条件下通常生产较差。通过监测OUR控制的微需氧条件可使微生物的表现得到优化。

Description

利用比氧吸收率作为过程控制的发酵方法
发明背景
本申请要求对2002年5月30提交的美国临时申请号60/384,333的优先权。
本发明得到了美国政府的支持，合同号为DE-FC-36-00GO10598，由能源部资助。美国政府在本发明中有一定的权利。
乳酸具有广泛的工业适用性，包括在化学加工和合成、化妆品、制药、塑料和食品生产中的用途。大多数工业规模的生产乳酸的方法是发酵法。这些发酵方法中使用不同的产乳酸细菌。
最近的研究探索了重组酵母株在乳酸发酵方法中的用途。重组酵母与细菌发酵相比可能有几个优点。一些酵母株更能耐受较高的温度。这可能允许更高温度的发酵，这可以翻译成更快的发酵速度。对高温的更好的耐受性能够使清除发酵培养基的污染微生物变得更加容易，因为能够简单地将培养基加热到不希望的种死亡而希望的种能够耐受的温度。产乳酸细菌，如乳酸杆菌(lactobacilli)，其高效生产需要一种复杂的发酵培养基。发酵培养基的复杂性增加了原料的成本，并且使得从培养基中分离乳酸更加困难和昂贵。使用重组酵母，通过使用一种简化发酵培养基，提供了降低成本的可能性。
Porro及同事构建了一种产乳酸酵母，构建方法是将一种外源LDH(乳酸脱氢酶)基因插入来自酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactic)、T.delbrueckii和Z.bailii种的酵母细胞内，破坏细胞的天然丙酮酸途径。参见Porro等人，“用于生产乳酸的代谢工程酿酒酵母细胞的研发”，Biotechnol.Prog.1995May-Jun；11(3)：294-8；Porro等人，“为了由工程酵母大规模生产乳酸，一种代谢途径的替换”，App.Environ.Microbiol.1999 Sep：65(9)：4211-5；Bianchi等人，“用异源LDH基因转化的丙酮酸利用缺陷的乳酸克鲁维酵母株的高效同型乳酸发酵”，App.Environ.Microbiol.2001 Dec；67(12)5621-5。Porro能够生产一种产乳酸的重组酵母，但是该菌株的表现几乎不足以在任何工业化生产过程中使用。为了获准在工业环境中使用，该菌株必须有良好的乳酸收率(即底物向乳酸的高转化率)和高生产力(即底物向乳酸的快速代谢)。该酵母优选地能够耐受含有高滴度乳酸的培养基。
最近，Rajgarhia及同事生产了比Porro的酵母显示更高收率和生产力的重组酵母。参见，例如WO 00/71738、WO 02/42471和PCT/US02/16223。如WO00/71738所述的Rajgarhia的工作试图利用某些酵母种显示的所谓的“Crabtree阴性”表型。Crabtree效应被定义为：当以高比生长速率培养(长期效应)或在高浓度葡萄糖存在下培养(短期效应)时，由于微生物氧消耗的抑制，在有氧条件下发生发酵性代谢。Crabtree阴性表型不显示这种效应，因此甚至在高浓度葡萄糖存在下或者以高生长速度生长也能够消耗氧气。因此，通过供氧的操作，Crabtree阴性微生物的培养物至少在理论上能够从生长阶段转变为发酵(生产)阶段。当有明显通气时，微生物生长产生生物质和CO2，而在厌氧条件下，细胞变为发酵可以利用的底物，产生乳酸或其它发酵产物。
然而我们发现，在严格厌氧条件下，某些菌株不象希望的一样有效地发酵。例如，对于丙酮酸脱羧酶(PDC)途径缺失或破坏的工程酵母株，事实如此。然而，在乳酸发酵(以及希望的产物不是乙醇的其它发酵)中使用这些工程种是非常希望的，因为PDC途径的破坏减少了产生的乙醇的量。因此，希望提供一种改良的发酵方法，其中在严格厌氧条件下不能有效发酵的菌株能够经济地产生希望的发酵产物。
附图说明
图1是一张图，说明对于一种基因修饰的马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)种，OUR对葡萄糖消耗、乳酸产生和收率的影响。
图2是一张图，说明对于另外一种基因修饰的马克斯克鲁维酵母种，OUR对葡萄糖消耗、乳酸产生和收率的影响。
发明内容
一方面，本发明是一个发酵方法，其中在该发酵过程的生产阶段监测比氧吸收率，根据测定的氧吸收率控制至少一个操作参数。
另一方面，本发明是在一种发酵培养基中进行发酵过程的方法，该培养基含有发酵微生物、可被该微生物发酵的底物，这种发酵在发酵期间显示一定量的溶解氧(DO)和比氧吸收率(OUR)，该方法包括：
a)在发酵的生产阶段测定OUR；
b)调节通气条件，使得在发酵的生产阶段，OUR保持在预定的范围内，而DO保持不到饱和量的1％。
第三方面，本发明是一种方法，其包括：
a)测定一种发酵微生物将碳水化合物发酵为希望的发酵产物时OUR值的最佳范围；
b)在含有细胞能够代谢的碳水化合物和一种或多种养分的培养基中培养该微生物，对该培养基通气，使得细胞生长并繁殖，培养基中的(DO)减少为不到饱和量的1％，细胞显示至少10mmol O2/克细胞干重/小时(mmol O2/gdw/h)的比氧吸收率；然后
c)在发酵条件下，包括在足以使培养物的比氧吸收率(OUR)处于最佳范围内的微需氧条件下，在缓冲培养基中培养该微生物。
另一方面，本发明是一种发酵方法，其包括：
a)在含有细胞能够代谢的碳水化合物的培养基中培养工程化酵母细胞，该细胞具有破坏的PDC途径和可使该细胞产生希望的发酵产物的外源基因，对该培养基通气，使得细胞生长并繁殖，培养基中溶解氧的量减少为不到饱和的1％，细胞显示至少10mmol O2/克细胞干重/小时(mmol O2/gdw/h)的比氧吸收率；然后
b)在发酵条件下，包括在足以使培养物的比氧吸收率(OUR)为约0.8-约3.0mmol O2/gdw/h的微需氧条件下，在缓冲培养基中培养该细胞。
令人惊讶的是，利用氧吸收率作为过程控制参数的微需氧条件可以使发酵过程得到优化，平衡希望的发酵产物的高收率与良好的生产率。能够利用OUR测定建立并控制发酵过程的某些参数，以便在发酵过程的生产阶段保持最佳条件。
OUR是每单位时间每单位生产的微生物干重的耗氧率(O2)。由每单位时间消耗的氧气量，并由此期间的细胞质量方便地计算出OUR。通过测量每单位时间向发酵容器中供应以及从中排出的氧气量方便地得出耗氧量。然后将耗氧量除以培养液中生物质的质量(干重)获得OUR。生物质的重量可如下测量：采样，测定细胞浓度(w/v)，乘以培养液总体积。供氧量能够通过监测通气率直接测量。发酵容器排出的氧气量能够用多种分析方法测量，其中质谱法特别有用。供应的氧与排出的氧之差是细胞消耗的量。将耗氧量除以细胞干重，并除以单位时间，计算出OUR。适当地以mmol O2/克细胞(干重)/小时的单位表示。
在最普通的方面，本发明包括在发酵的生产阶段测定OUR，以及根据测得的OUR值控制至少一个发酵参数。根据测得的OUR控制的参数一般与发酵培养液的通气有关，如通气率、搅拌速率、通气气体的组成成分(例如提高或降低气体中的氧浓度)或影响培养液中微生物的耗氧率的其它参数。
在本发明的一个优选方面，发酵细胞在多种通气条件下培养，根据经验确定具体细胞型的OUR的最佳范围。OUR的最佳范围通常考虑几个因素，其中有三个可能是极为重要的：由发酵底物产生希望的发酵产物的收率(通常以克产物/消耗的克底物表示)，希望的发酵产物的比生产率(通常以产物重量/干细胞重量/单位时间表示)，和底物消耗率(通常以消耗的底物重量/单位时间表示)。在同一通气条件下，这些因素通常不会全是最优化的。例如，底物消耗率有时随OUR的升高而升高，但是收率趋于下降，由此平衡了较快的生产率与较高的收率损失，并且损害了该方法的总体经济性。OUR值最佳范围的确定通常包括平衡速率与收率，以优化该方法的总体经济性。一旦确定希望的OUR值范围，即选择发酵生产阶段的发酵条件，以确定并使OUR保持在该范围内。如前所述，在该过程中测定OUR，并控制一个或多个发酵参数，使OUR保持在该范围内。
在该生产阶段，溶解氧的浓度大约保持在零，这反映了细胞消耗氧的条件，其速率与溶解于发酵培养液中的速率大致相同。生产阶段溶解氧的浓度通常不到饱和量(即在使用的温度和压力条件下能够溶解于培养液中的最大量)的1％。一般而言，不到约10μmol/L，更优选地不到约5μmol/L的溶解氧含量是合适的。最优选地，溶解氧含量基本为零。方便地用含有透气膜的氧电极(Clark电极)测量溶解氧，如Ingold生产的和B Braun所售，货号为33182418或33182400。对于本发明，溶解氧含量低于仪器检测限度时的操作(如这些所述)被认为反映溶解氧浓度约为零。
在本发明的一个特别优选的方面，在不同的生长和生产条件下培养微生物。在生长阶段，该微生物需氧生长。这些细胞在一种培养基中生长，该培养基含有水，和在生长和生产阶段细胞都能够代谢的碳水化合物，以及如下文更全面地描述的不同养分。选择通气条件，使得(1)细胞显示至少10mmol O2/gdw/h的比氧吸收率(OUR)，(2)在生长阶段结束时，培养基中溶解氧(DO)的浓度减少至不到饱和量的1％，而OUR保持在至少10mmol O2/gdw/h。OUR优选地至少为15mmol O2/gdw/h，更优选地至少为18mmol O2/gdw/h。在生长阶段中，OUR最优选地高至细胞能够产生的水平。因此最大OUR一定程度上取决于使用的具体工程酵母细胞。通常，预计最大OUR为约20-30mmol O2/gdw/h。具有PDC破坏和外源LDH基因的马克斯克鲁维酵母细胞趋于显示约20-22mmol O2/gdw/h的最大OUR。
在生产阶段的大部分时间里，DO可以是并且优选地是大于零，只要在该阶段结束时它降至接近零。因此，在生长阶段的大部分时间里，特别是在细胞经历指数生长的期间，可以向培养基内导入比保持需要的OUR所需过量的氧气。随着细胞繁殖和生物质积累，生长阶段的总氧吸收率也提高，保持恒定OUR所需的氧气总量将提高。然而，因为在生长阶段结束前DO可能是积极的，进行通气的一种优选方法是在生长阶段开始时和指数期期间供应比所需过量的氧气。由于生物质积累，细胞消耗的总氧量增加到供应的氧气与细胞消耗的氧气非常匹配的量，结果DO下降。因此在生长阶段能够采用不变的通气条件，如果选择这些条件使得当产生希望的量的生物质时，DO下降为零，并且有需要的OUR。此外，在生长阶段通气条件也可能变化，只要在生长阶段结束时OUR保持并且DO接近零。
一旦DO下降到接近零，并且产生希望的量的生物质，优选地在转换到生产阶段之前使这些通气条件(OUR至少为10mmol O2/gdw/h，DO等于0)保持一段时间。适当的时间是约15分钟-2小时，优选的时间是约30-90分钟。最优选的时间是约45-75分钟。如果该生物太快地转换到生产阶段，则细胞倾向于表现较差的生产率。如果这些通气条件保持太长，则细胞倾向于表现出较差的希望的发酵产物收率以及较差的生产率。
通过改变通气条件使培养转换到生产阶段。在生产阶段，选择微需氧条件，使OUR保持在如上所述的预定范围之内。为了促进总体细胞生活力和健康，一些微生物似乎需要代谢少量氧气。这些生物的例子包括具有PDC破坏的基因工程化酵母，特别是具有外源基因的酵母，该外源基因使它们能够产生一种具体的发酵产物。在完全厌氧条件下，这些细胞显示的底物消耗率和发酵产物产量通常极低。另外，希望的发酵产物的收率也遭受损失。在微需氧条件下，在取决于具体菌株的某些OUR值时，细胞能够更快速地代谢底物。这导致底物消耗率和希望的发酵产物的产量提高。然而，当耗氧量升高超过某一数值时，希望的产物的收率下降，因为很多底物被转化为二氧化碳。另外，当OUR升高超过某一数值时，生产率趋于平缓，甚至下降，因此生产率提高不能补偿收率的损失。因此，在生产阶段使OUR保持在特定范围内可使其达到经济上最佳的收率与生产率的平衡。
OUR的最佳值一定程度上取决于具体的生物，但是OUR范围通常为约0.8-约3mmol O2/gdw/h。一种具体生物的最佳OUR值可根据经验容易地确定。OUR范围的一个优选的下限是约1.0mmol O2/gdw/h，更优选地约1.2mmol O2/gdw/h。OUR范围的一个优选的上限是约2.5mmol O2/gdw/h，更优选地约2.0mmol O2/gdw/h。
培养物显示的OUR主要取决于微生物本身和通气条件。通气条件影响溶解于培养基中、从而可被该生物利用的氧气的量。对于一种指定生物，以下情况有助于提高OUR：(1)提高供氧率，和(2)小氧气泡的形成(以提高氧分子向液相的物质传递)。通过喷射和/或搅拌容易实现小气泡的形成。
生长阶段通气率的例子有至少约0.2的空气体积/发酵培养基体积/分钟(vvm)，优选地约0.3-约2vvm，更优选地约0.4-约1vvm。在生产阶段，约0.01-约0.1vvm，优选地约0.02-约0.75vvm，特别是约0.02-约0.5vvm的体积通常是合适的。如果用氧气作为通气气体，体积将成比例减少。通气优选地在促进小气泡形成的条件(如喷射)下进行。优选地持续搅拌，特别是当希望获得高OUR值时。一般而言，为了获得希望的OUR，同时选择通气率和搅拌条件。
当发酵产物是一种酸时，在生产阶段缓冲该培养基，使其pH保持在约5.0-约9.0，优选地约5.5-约7.0。适当的缓冲剂是可中和形成的乳酸的碱性物质，包括，例如：氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨、氢氧化铵等。常规发酵方法中使用的缓冲剂在此通常也是合适的。
其它发酵条件，如温度、细胞密度、底物选择、养分选择等，被认为对于本发明而言不是关键的，通常选择它们以提供一种经济的方法。生长阶段和生产阶段的温度可以是从培养基的冷冻温度以上至约50℃，但是最佳温度一定程度上取决于具体的微生物。优选的温度，特别是在生产阶段，是约30-45℃。当细胞是一种工程马克斯克鲁维酵母时，它能够耐受相对高温(如40℃以上，可达50℃，特别是可达45℃)。另一个优选细胞种是C.sonorensis，能够耐受可达约40℃的温度。该温度范围提供了在较高温度下进行发酵的可能性(从而降低了冷却成本)，而没有明显的生产率损失。良好的高温耐受的另一个优点是，如果发酵被一种不希望的微生物污染，则在许多情况下，能够通过加热发酵培养基到40℃或以上，特别是45℃或以上，选择性地杀死这种不希望的微生物，而不会明显损伤本发明希望的细胞。
在生产阶段，发酵培养基中的细胞浓度一般是约1-150，优选地约3-10，更优选地约3-6克干细胞/升发酵培养基。
使用的具体碳水化合物取决于具体的宿主细胞，以及该宿主细胞是否已经工程改造成可将任何具体碳水化合物代谢为丙酮酸。优选己糖，如葡萄糖、果糖、葡萄糖寡聚体，如麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、淀粉和麦芽糊精。对于寡聚糖，为了将其消化为单体糖，可能必须向发酵培养液中加入酶。适当的戊糖的一个例子是木糖。葡萄糖是最优选的。
在缓冲发酵中，酸性发酵产物(如乳酸)被中和，它们形成相应的乳酸盐。因此酸的回收包括再生游离酸。这一般如下进行：除去细胞，用一种强酸(如硫酸)酸化发酵培养液。形成一种盐副产物(当一种钙盐作为中和剂且硫酸作为酸化剂时，是石膏)，将其与酸分离。然后通过如液液抽提、蒸馏、吸附等技术回收酸，如T.B.Vickroy，《生物技术综述(Comprehensive Biotechnology)》(M.Moo-Young编著)，第三卷，第38章，Pergamon，Oxford，1985；R.Datta等人，FEMS Microbiol.Rev.，1995；16：221-231；美国专利号4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122，以及国际专利申请号WO 93/00440所述。
该培养基一般含有具体细胞所需的养分，包括氮源(如氨基酸、蛋白质、无机氮源，如氨或铵盐，等等)，和多种维生素、矿物质等。
本发明的方法能够连续、分批进行或者所述方式的一些组合。
本发明的方法中使用的微生物是以下任何一种微生物：其(1)可将碳水化合物发酵为希望的发酵产物，(2)在微需氧条件下比在严格厌氧条件下更有效地发酵。特别重要的细胞是某些基因工程化酵母细胞，其特征在于具有：(1)破坏的PDC途径，和(2)至少一种功能外源基因，该基因使细胞能够产生希望的发酵产物。这些合适的工程酵母细胞在下列文献中描述，例如：Porro等人，“用于生产乳酸的代谢工程酿酒酵母细胞的研发”，Biotechnol.Prog.1995May-Jun；11(3)：294-8；Porro等人，“为了由工程酵母大规模生产乳酸，一种代谢途径的替换”，App.Environ.Microbiol.1999 Sep：65(9)：4211-5；Bianchi等人，“用异源LDH基因转化的丙酮酸利用缺陷的乳酸克鲁维酵母株的高效同型乳酸发酵”，App.Environ.Microbiol.2001 Dec；67(12)5621-5；WO 00/71738、WO02/42471、PCT/US02/16223和2002年5月30日提交的美国临时申请号60/384,333。优选地该细胞也显示Crabtree阴性表型，以便在通气条件下在高浓度葡萄糖存在下以高比生长速率呼吸并生长。
“破坏的”是指天然PDC途径已经改变，使得PDC途径的功能至少减少90％。破坏可以如下实现：改变该途径(或者与该途径有关的一个或多个基因)，使其功能减少或消失，或者去除该途径起作用所需的一个或多个基因。一种优选的细胞存在PDC基因的缺失。
一种优选的外源基因是乳酸脱氢酶(LDH)基因。该基因优选地整合到细胞基因组内。工程化酵母细胞可能含有一个拷贝或多个拷贝的外源LDH基因。它可能含有两个或多个不同的外源LDH基因。在一个特别优选的实施方案中，该基因整合到细胞基因组内已经缺失的天然PDC基因处。在特别优选的实施方案中，LDH基因位于有效启动和终止序列的功能控制下，该序列与该细胞天然的启动和终止序列(特别是PDC启动和终止序列)至少90％同源。这些优选的和特别优选的细胞在2002年5月30日提交的美国临时申请号60/384,333中更全面地描述，在此引用作为参考。
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidolactici)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、Kluyveromycesthermotolerans、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombii)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)是含有适当的L-乳酸脱氢酶基因的菌株，它们能够克隆以用于生产工程化酵母。两种优选的L-乳酸脱氢酶基因是瑞士乳杆菌和巨大芽孢杆菌L-乳酸脱氢酶。瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)是含有适当的D-乳酸脱氢酶的菌株，它们能够克隆以用于工程化酵母。一种优选的D-乳酸脱氢酶是瑞士乳杆菌D-乳酸脱氢酶。
为了商业使用，工程化细胞应当显示几个特征。该酵母应当能够将相当比例的碳水化合物转化为希望的发酵产物(即产生高收率的产物)。它应当显示高比生产率，即每单位时间每细胞重量产生大量发酵产物。优选地该细胞也耐受高浓度的发酵产物。这最后一个特性可以允许该发酵方法使用高浓度的起始碳水化合物。
通常希望本发明的发酵方法具有下列特征中的一部分或全部：
A.收率至少为每克底物30，优选地至少40，更优选地至少60，更优选地至少75克发酵产物。希望的理论收率是100％，但是收率的实际极限约为98％。
B.比生产率至少为0.1，优选地至少0.3，更优选地至少约0.4，特别是至少约0.5克发酵产物/克细胞/小时。比生产率希望尽可能的高。
C.滴度(发酵产物的最大浓度)至少为15克/升发酵培养基，优选地至少20g/L，更优选地至少40g/L，再更优选地至少80g/L，可达150g/L，优选地可达约120g/L。对于乳酸，发酵培养基的温度略微影响易于获得的滴度的上限，因为高度浓缩的乳酸溶液(即高于约150g/l)在约35℃以下时倾向于成为极粘稠的或凝胶。使用较高的发酵温度，例如约35-50℃，可以获得更高的滴度，而不会凝胶化或有不当的粘性发生(build-up)。
另外，本发明的发酵方法优选地达到高体积生产率(volumeproductivity)。体积生产率表示为每单位时间每单位体积发酵培养基产生的产物量，一般是克产物/升培养基/小时。至少1.5g/L/小时，优选地至少2.0g/L/小时，更优选地至少2.5g/L/小时的体积生产率是希望的。在可达3-6克细胞/升发酵培养基的优选细胞密度时，最大生产率倾向于可达约5.0g/L/小时，更一般地可达约4.0g/L/小时。非常优选的是进行发酵，使得当培养基pH、温度或这两者处于上段所述范围内时，达到这些体积生产率。
根据本发明产生的乳酸可用于生产丙交酯，即两个乳酸分子组成的一种环酐。根据乳酸的立体异构体不同，丙交酯可以是D-丙交酯(由两个D-乳酸分子组成)、L-丙交酯(由两个L-乳酸分子组成)或D-L-丙交酯(由每种L-乳酸和D-乳酸分子之一组成)。由乳酸生产丙交酯的一种适当的方法是通过聚合/解聚方法，如授予Gruber等人的USP 5,142,023所述。
丙交酯又特别可以用作生产聚交酯聚合物(PLA)和共聚物的单体。制备这些聚合物的方法在授予Gruber等人的USP 5,142,023中也有描述。优选的PLA产物是如授予Gruber等人的USP 5,338,822所述的融解稳定的聚合物。PLA可以是半晶体或非晶体的。
下列实施例用来说明本发明的某些实施方案，并非限制其范围或精神。除非另外说明，所有份数和百分比都是根据重量。
                        实施例1
一种工程酵母细胞，被称为CD 587，其接种原液在一个250ml摇瓶中制备，瓶中含有100ml CaCO3缓冲的(42g/l)酵母提取物(10g/l)-蛋白胨(20g/l)培养基，以及100g/l葡萄糖。在OD600＝10时，离心收集细胞，随后将其重悬浮于15％(w/v)甘油溶液中，以1.5mL等份贮存于-80℃。
细胞CD 587是一种马克斯克鲁维酵母细胞，其PDC基因已经缺失，一种外源瑞士乳杆菌D-LDH基因整合到其基因组内缺失PDC基因的位点处，受天然PDC启动和终止序列的控制。细胞CD 587及其制备在2002年5月30日提交的美国临时申请号60/384,333中更全面地描述。
通过用一份1.5mL甘油原液接种3L发酵罐，开始生长阶段，使初始OD600＝0.05。通过以800转/分的恒定搅拌速度以1.5L/min(0.5vvm)的流速连续喷射空气，生长阶段需氧进行。继续培养，直到DO减少至空气饱和的5％。这符合废气中恒定的CO2浓度。通过监测供应的空气量并利用质谱法分析废气中的氧，测定OUR。在生长阶段，OUR约为20.8±2.5mmol O2/gdw/小时。在这些条件下，OUR受细胞代谢可以利用的氧的能力所限制。最终的细胞密度约为4g/L。
一旦DO达到零，通气条件即保持1小时，之后开始生产阶段。通过将气流速度瞬时转换为0.1L/min(0.033vvm)，并降低搅拌速度至500转/分，开始生产阶段。通气条件的这种改变使生产阶段的OUR＝1.5±0.1mmol O2/gdw/小时，DO＝0。继续发酵约60小时。定期采样进行HPLC/IC/GC-MS分析，测定葡萄糖消耗率、乳酸盐产率和乳酸盐收率。生产阶段的结果如表1所示。
                                                          表1
  最大乳酸滴度   106±3.1g/kg
  葡萄糖消耗率   1.2±0.05g/gdw/h
  乳酸生产率   1.1±0.04g/gdw/h
  乳酸收率(生产阶段)   0.92±0.03克乳酸/克葡萄糖
  ％回收的碳(生产阶段)   99％±3.0
  乳酸的光学纯度   ＞99.9
该实施例重复数次，在生产阶段改变通气条件，以使连续实验中的OUR值达到约1.2、2.2、2.8、3.0和3.2。结果在图1中显示。如图1所示，随着OUR在1.2-3.0范围内升高，收率(曲线1)稳定是显著地下降，在OUR为3.2时在进一步显著降低之前可见升高(可能且反常地)。当氧气越来越多地可以利用时，这种收率的降低与细胞呼吸的增强一致。在1.2-约2.2的OUR范围内乳酸盐生产率(曲线3)略微升高，然后在OUR升高到2.8时在升高之前下降。然而，在OUR值为3或更高时，由于收率损失增加，提高生产率的好处丧失。当OUR由1.2升高到2.8时，葡萄糖利用率(曲线2)略微升高，在OUR高于3.0时，由于快速细胞呼吸，其大大提高。图2的数据提示，对于该菌株，最佳OUR值处于约0.8-2.2的范围内，特别是约1.0-约1.5。
                      实施例2
使用一种被称为CD 558的菌株重复实施例1数次。CD 558株是一种马克斯克鲁维酵母细胞，其PDC基因已经缺失。它含有随机整合到其基因组内的一种外源瑞士乳杆菌D-LDH基因。该LDH基因在一个酿酒酵母PGK-1启动子和酿酒酵母Gal-10终止序列的控制之下。在每次实验中，生长阶段的OUR约为20.5mmol O2/gdw/小时。为了改变OUR，通过控制喷射和搅拌速度，生产阶段的通气条件在不同实验之间不同。不同实验的OUR值约为0.6、1.4、1.7和2.2。在OUR为1.7的生产阶段，结果如表2所示：
                                                           表2
  最大乳酸滴度   111g/kg
  葡萄糖消耗率   0.94g/gdw/h
  乳酸生产率   0.83g/gdw/h
  乳酸收率(生产阶段)   0.89克乳酸/克葡萄糖
  ％回收的碳(生产阶段)   95.6
  乳酸的光学纯度   ＞99.9
图2说明改变OUR如何影响生产率和收率。对于该菌株，乳酸收率(曲线1)显示对0.7-2.2范围内的OUR的极强依赖性，当OUR约为1.4时达到最大值。乳酸盐生产率(曲线3)类似地在该OUR值时达到峰值。葡萄糖消耗率(曲线2)升高，直到OUR约为2.2，然后变平。对于该菌株，图2的数据提示最佳OUR为约1-约1.7，特别是约1.2-1.5。
                       实施例3
实施例1重复三次。第一次实验(3A)如实施例1所述进行，不同之处在于生产阶段的OUR是2.1mmol O2/gdw/h。在第二次实验中(3B)，当生长阶段的DO达到零时，立即将培养转换到生产阶段。在与实施例3A相同的通气条件下，OUR为1.8mmol O2/gdw/h。在第三次实验中(3C)，在DO达到零之后，在生长阶段结束时继续通气1.5小时以上，在与实施例3A相同的通气条件下，生产阶段的OUR为1.4mmolO2/gdw/h。结果总结于表3中。
                                                            表3
  性质                          实施例号
  3A   3B   3C
  保持时间，DO＝0   1小时   0   ＞1.5小时
  OUR，生产阶段(mmol/gdw/h)   2.1   1.8   1.4
  最大乳酸滴度(g/kg)   112.3   84   94
  葡萄糖消耗率(g/gdw/h)   1.22   1.06   0.40
  乳酸生产率(g/gdw/h)   1.20   0.93   0.32
  乳酸收率(生产阶段，g/g)   0.89   0.84   0.79
  ％回收的碳(生产阶段)   105   104.3   98
  光学纯度(％)   ＞99.9   ＞99.9   ＞99.9
在生产过程中在指定通气条件下，OUR是微生物代谢活性的一个指标。当保持时间为零或者超过1.5小时(相对于1小时保持时间之后)时OUR降低，这表明该微生物在这些条件下不是很好地起作用。这也反映在葡萄糖消耗、乳酸盐产量和收率的下降。
                        实施例4
使用补充160g/l葡萄糖的缓冲(pH5.5)无机培养基，酵母细胞CD587的接种原液在一个14升实验室生物反应器中需氧培养。在以5升/分钟的速度搅拌下通过喷射空气进行通气。最初生长阶段的DO开始时为100％，在循环过程中降至20％。OUR保持在约20mmol O2/gdw/h。当OD600＝10时，将4升培养液转移到一个240升的生产规模的发酵罐中，其中含有另外220升补充了170g/l葡萄糖的培养基。该细胞进一步在42℃、pH5.5及需氧条件下生长约8小时。在此期间，DO由初始值100降为零。通过以15升/分钟通气，使OUR保持在20mmolO2/gdw/h。培养物在DO＝0的情况下保持1小时。然后通过减少通气，使OUR为1.5-1.7mmol O2/gdw/h，将培养物转换到生产阶段。根据需要添加另外一种缓冲剂(Ca(OH)2)，使pH保持在5.5±0.1。在生产阶段DO保持在0％。葡萄糖在30小时内耗尽，得到乳酸盐滴度为114g/kg。生长阶段的平均比葡萄糖消耗率为1.1g/g DW.h-1。平均比乳酸生产率为0.8g/g DW.h-1，生产率为0.76克乳酸/克葡萄糖，总收率(包括生长阶段)为0.67克乳酸/克葡萄糖。

Claims (30)

1.一种发酵方法，其中微生物发酵发酵底物，在发酵过程的生产阶段监测比氧吸收率，并且根据测得的氧吸收率控制至少一个操作参数。
2.权利要求1的方法，其中溶解氧浓度保持在不到饱和量的1％。
3.权利要求2的方法，其中操作参数是选自通气率、搅拌速度和通气气体组成中的一个或多个。
4.权利要求2的方法，其中所述微生物是一种基因工程化酵母，其天然PDC途径已经破坏。
5.权利要求4的方法，其中所述微生物具有至少一种功能外源基因，该基因使细胞能够产生希望的发酵产物。
6.权利要求5的方法，其中所述外源基因是乳酸脱氢酶基因。
7.权利要求6的方法，其中所述微生物属于假丝酵母属或克鲁维酵母属。
8.一种在发酵培养基中进行发酵过程的方法，该培养基含有发酵微生物，和可被该微生物发酵的底物，其中所述发酵液含有一定量的溶解氧(DO)，这种发酵显示一定的比氧吸收率(OUR)，该方法包括：
a)在发酵的生产阶段测定OUR；
b)调节通气条件，使得在发酵的生产阶段，OUR保持在预定的范围内，而DO保持在不到饱和的1％。
9.权利要求8的方法，其中步骤b)中的OUR保持在约0.8-约3.0mmol O2/gdw/h的范围内，DO保持在不到10μmol O2/L。
10.权利要求9的方法，其中所述微生物是一种显示Crabtree阴性表型的酵母细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述酵母细胞属于克鲁维酵母属或假丝酵母属。
12.权利要求11的方法，其中所述酵母细胞具有破坏的PDC途径和至少一种功能外源基因，该基因使得该细胞能够产生希望的发酵产物。
13.权利要求12的方法，其中所述外源基因是乳酸脱氢酶基因。
14.权利要求8的方法，其中所述底物包括己糖。
15.权利要求14的方法，其中所述己糖包括葡萄糖。
16.一种方法，其包括：
a)测定一种微生物将碳水化合物发酵为希望的发酵产物时OUR值的最佳范围；
b)在含有微生物能够代谢的碳水化合物和一种或多种养分的培养基中培养工程化酵母细胞，对该培养基通气，使细胞生长并繁殖，该培养基中溶解氧的浓度下降为不到饱和的1％，而细胞显示至少10mmolO2/克细胞干重/小时(mmol O2/gdw/h)的比氧吸收率；然后
c)在发酵条件下，包括在足以使培养物的比氧吸收率(OUR)处于最佳范围内的微需氧条件下，在缓冲培养基中培养该细胞。
17.权利要求9的方法，其中所述微生物是显示Crabtree阴性表型的酵母细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述酵母细胞属于克鲁维酵母属或假丝酵母属。
19.权利要求18的方法，其中所述酵母细胞具有破坏的PDC途径和至少一种功能外源基因，该基因使得该细胞能够产生希望的发酵产物。
20.权利要求19的方法，其中所述外源基因是乳酸脱氢酶基因。
21.权利要求16的方法，其中步骤a)中的OUR至少为18mmolO2/gdw/h。
22.权利要求21的方法，其中所述碳水化合物包括己糖。
23.权利要求22的方法，其中所述己糖包括葡萄糖。
24.一种发酵方法，其包括：
a)在含有细胞能够代谢的碳水化合物的培养基中培养工程化酵母细胞，该细胞具有破坏的PDC途径和可使细胞产生希望的发酵产物的外源基因，对该培养基通气，使细胞生长并繁殖，该培养基中的溶解氧张力降为零，而细胞显示至少10mmol O2/克细胞干重/小时(mmolO2/gdw/h)的比氧吸收率；然后
b)在发酵条件下，包括在足以使培养物的比氧吸收率(OUR)为约0.8-约3.0mmol O2/gdw/h的微需氧条件下，在缓冲培养基中培养该细胞。
25.权利要求24的方法，其中所述酵母细胞是Crabtree阴性表型。
26.权利要求25的方法，其中所述外源基因是乳酸脱氢酶(LDH)基因。
27.权利要求26的方法，其中所述酵母细胞属于克鲁维酵母属或假丝酵母属。
28.权利要求24的方法，其中步骤a)中的OUR至少为18mmolO2/gdw/h。
29.权利要求24的方法，其中所述碳水化合物包括己糖。
30.权利要求28的方法，其中所述己糖包括葡萄糖。
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