CN100335626C

CN100335626C - 在酵母中生产l－乳酸的方法与材料

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Publication number: CN100335626C
Application number: CNB038172917A
Authority: CN
Inventors: B·豪斯; V·赖格里亚; P·索米宁
Original assignee: Cargill Dow LLC
Current assignee: NatureWorks LLC
Priority date: 2002-05-30
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2023-05-30
Also published as: CN1735683B; WO2003102200A3; US20110229873A1; ES2642928T3; EP2878675A1; DE60315028T2; CA2487116C; EP1513923A2; DK2878675T3; CN101157930A; AU2008202963A1; JP2005528111A; CA2487116A1; AU2003243366B2; CN1688703A; AU2003251381A1; CA2487296A1; ES2290466T3; WO2003102201A2; US20070148748A1

Abstract

一方面，提供了重组酵母，其具有整合到基因组内的多个外源LDH基因，而天然PDC基因保持完整。第二方面，提供了重组酵母，其具有整合到其基因组内天然PDC基因的基因座处的一个外源LDH基因，而该天然PDC基因已经删除。该重组酵母在生产乳酸的发酵方法中有用。

Description

在酵母中生产L-乳酸的方法与材料

本申请要求对2002年5月30提交的美国临时专利申请号60/384,333的优先权。

本发明得到了美国政府的支持，由能源部资助，合同号为DE-FC-36-00GO10598。美国政府在本发明中有一定的权利。

发明背景

乳酸具有广泛的工业适用性，包括在化学加工和合成、化妆品、制药、塑料和食品生产中的用途。大多数工业规模的生产乳酸的方法都是发酵法。这些发酵方法使用不同的产乳酸细菌。

最近的研究探索了重组酵母株在乳酸发酵方法中的用途。重组酵母与细菌发酵相比可能有几个优点。一些酵母株更能耐受较高的温度。这可能允许更高温度的发酵，这可以翻译成更快的发酵速度。对高温的更好的耐受性能够使清除发酵培养基的污染微生物变得更加容易，因为只需将培养基加热到希望的种能够耐受而不希望的种死亡的温度。产乳酸细菌，如乳酸杆菌，其高效生产需要复杂的发酵培养基。发酵培养基的复杂性增加了原料的成本，并且使得从培养基中分离乳酸更加困难且昂贵。使用重组酵母，通过使用简化的发酵培养基，提供了降低成本的可能性。

另外，有些酵母株比产乳酸细菌更能耐受降低的pH条件。这可能是一个非常重要的特征，因为当乳酸产生时，发酵培养基的pH自然下降。在常规方法中，必须使用一种碱，如氢氧化钙或碳酸钙，来缓冲培养基，使其pH约为5-8。它中和酸，形成一种乳酸盐。这种乳酸盐在随后的步骤中必须分开，以便以希望的酸的形式回收乳酸盐。因此，需要缓冲发酵培养基导致增加原材料(缓冲剂，一般是硫酸，用来分解乳酸盐)、其它处理步骤(再生游离酸)和废物(最常见的是盐分解步骤产生的碳酸钙)处理等明显的额外费用。如果发酵能够在低pH下进行，则这些费用能够明显减少。因此，成功开发能够耐受低pH培养基的产乳酸株是非常希望的。

Porro及同事构建了一种产乳酸酵母，构建方法是将一种外源LDH(乳酸脱氢酶)基因插入酿酒酵母(S.cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(K.lactic)、T.delbrueckii和Z.bailii种的酵母细胞内，并破坏细胞的天然丙酮酸途径。参见Porro等人，“用于生产乳酸的代谢工程酿酒酵母细胞的研发”，Biotechnol.Prog.1995 May-Jun；11(3)：294-8；Porro等人，“为了由工程酵母大规模生产乳酸，一种代谢途径的替换”，App.Environ.Microbiol.1999 Sep：65(9)：4211-5；Bianchi等人，“用异源LDH基因转化的丙酮酸利用缺陷的乳酸克鲁维酵母株的高效同型乳酸发酵”，App.Environ.Microbiol.2001 Dec；67(12)5621-5。Porro能够生产一种产乳酸的重组酵母，但是该菌株的表现几乎不足以在任何工业化生产过程中使用。为了获准在工业环境中使用，该菌株必须有良好的乳酸收率(即底物向乳酸的高转化率)和高生产率(即底物向乳酸的快速代谢)。该酵母优选地能够耐受含有高滴度乳酸的培养基。

最近，Rajgarhia及同事生产了比Porro的酵母显示更高收率和生产率的重组酵母。参见，例如WO 00/71738、WO 02/42471和PCT/US02/16223。然而，希望产生收率和/或生产率进一步提高的重组酵母。具体而言，希望产生一种重组酵母株，它在有利于乳酸生产的厌氧和/或微需氧条件下以良好的收率和生产率产生乳酸。

发明概述

一方面，本发明是将外源乳酸脱氢酶基因整合到酵母细胞内的一种方法，其中在整合之前，该细胞在其基因组的一个基因座处具有一个靶定的基因，该方法包括下列步骤：(a)用一种重组核酸转化该细胞，该核酸含有乳酸脱氢酶(LDH)基因、LDH基因上游(即5’)和下游(即3’)的侧翼序列和至少一个选择性标记基因，该侧翼序列与靶定的基因上游和下游的侧翼序列同源，其中LDH基因插入细胞基因组内，与靶定的基因的基因座相邻，(b)通过在选择剂存在下培养转化细胞，获得第一种转化细胞，其含有LDH基因和选择性标记基因，(c)在非选择性培养基中培养所述第一种转化细胞，和(d)由所述第一种转化细胞获得第二种转化细胞，其含有LDH基因，但是删除了选择性标记基因和靶定的基因。在优选的酵母细胞中，靶定的基因有利地是丙酮酸脱羧酶(PDC)、醇脱氢酶(ADH)、乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(ura3)和3-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)。

在本发明的这一方面，选择性标记基因和靶定的基因的删除在一定比例的第一种转化细胞内自发发生。结果，插入的LDH与功能启动子和终止序列有效连接，后者与靶基因的启动子和终止序列同源。

本发明的第二方面是用于转化一个酵母种的细胞的一种重组核酸，它含有至少一个选择性标记和对于该酵母种外源的LDH基因，其与LDH基因上游(5’)和下游(3’)的侧翼序列连接，该侧翼序列分别与对于该酵母种天然的一种基因的上游和下游侧翼序列同源。

本发明的第三方面是一个酵母种的一种重组细胞，其中该酵母种在其基因组的一个基因座处含有一个天然的靶定的基因。该重组细胞含有外源乳酸脱氢酶(LDH)基因，该基因整合到基因组内的靶定的基因位点处，且该靶定的基因已经删除。整合的LDH基因与功能启动子和终止序列有效连接，后者与靶定的基因的启动子和终止序列同源。这些重组酵母细胞在发酵方法中使用时，显示出人意料地高的由碳水化合物底物产生乳酸的收率，以及高生产率。该重组细胞也能够产生高滴度的乳酸。尽管本发明不局限于任何理论，但是认为在天然基因的基因座处插入LDH基因，以及使用如此处所述的天然启动子和终止子，能够使细胞利用现有的基因调节系统，并且使插入的LDH基因起作用。众所周知，当细胞处于厌氧或微需氧发酵条件下时，非常有利于产生乳酸的代谢途径。因此，本发明的第四方面是将碳水化合物发酵为乳酸的一种方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的碳水化合物的培养基中培养产生的细胞。

本发明的第五方面是马克斯克鲁维酵母种的一种细胞，其具有整合到其基因组内的多个外源乳酸脱氢酶基因，每个基因都在功能启动子和终止序列的控制之下，其中该马克斯克鲁维酵母细胞的基因组还含有一个功能丙酮酸脱羧酶基因。令人惊讶的是，使用这种细胞获得极高的乳酸生产率和收率，以及出乎意料地低的乙醇收率，甚至在低pH发酵条件下仍然如此。本发明不局限于任何理论，认为通过使PDC途径保持完整，该细胞能够更好地利用现有的代谢途径使其代谢过程保持平衡，有利于细胞的总体健康和生存力。因此，本发明的第六方面是将碳水化合物发酵为乳酸的一种方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的碳水化合物的培养基中培养所得的细胞。

根据以下某些优选实施方案和权利要求书的更详细描述，本发明的具体的优选实施方案将易于理解。

附图简述

图1是显示pNC2质粒的图。

图2是显示pNC4质粒的图。

图3是显示pVR22质粒的图。

图4是显示pVR29质粒的图。

图5是显示由pPS1质粒和pNC14质粒构建pPS9质粒的图。

图6是显示pVR39质粒的图，其含有瑞士乳杆菌L-LDH基因和G418抗性标记。

图7是显示pVR1质粒的图，其含有瑞士乳杆菌L-LDH编码基因序列、酿酒酵母pTEF1启动子和大肠杆菌EM7启动子。

图8是显示pSO18质粒的图。

图9是显示pSO19质粒的图。

图10是显示pSO20质粒的图。

图11是显示pVR41质粒的图，其含有瑞士乳杆菌L-LDH基因和G418抗性标记。

图12是显示pCA3质粒的图，其含有巨大芽孢杆菌L-LDH基因和G418选择性标记。

图13是显示pVR24质粒的图。

图14是显示pVR38质粒的图，其含有巨大芽孢杆菌L-LDH基因和潮霉素抗性基因。

图15a是显示pBH5a质粒构建的图。

图15b是显示由pVR29和pBH5a质粒构建pBH5b质粒的图。

图16是显示pBH8质粒的图。

图17A和17B是根据本发明的一个方面，可能与外源LDH基因定向整合到酵母染色体内有关的遗传事件的示意图。

发明详述

在本发明的前两个方面，一种外源LDH基因整合到酵母细胞的基因组内，位于靶定的天然基因的基因座处，且该靶定的天然基因已经删除。该外源LDH基因与一个启动子序列和一个终止序列有效连接，这两种序列分别与该靶定的基因的启动子和终止序列同源。

对于本发明，如果一种基因、启动子或终止子(1)未在未修饰细胞的基因组内发现，并且(2)不与未修饰细胞的基因组内存在的遗传物质同源，则认为它们是“外源的”。在此使用时，一种基因、终止子或启动子如果在该酵母种的未修饰细胞的基因组内发现(除了不影响其功能的个体-个体突变之外)，则它们对于该酵母种是“天然的”。

一种基因、启动子、终止子或其它基因组物质，如果在核苷酸序列上与其它遗传物质相同，即具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的同一性，或者如果不同，而是与之足够相似，从而保持其功能，则认为该基因、启动子、终止子或其它基因组物质与其它遗传物质“同源”。因此，甚至如果遗传物质例如由于点突变、碱基对的缺失或添加而含有不同，只要这些突变、缺失或添加不影响该遗传物质的功能，则认为它们是“同源的”。对于侧翼序列，如果该序列与天然基因的侧翼序列足够相似，以致侧翼序列均能够参与与天然基因侧翼序列的单交换事件，则同源性是确定的。

如本领域所知，术语“同一性”是指两种或多种多肽分子或两种或多种核酸分子的序列之间的关系，通过比较它们的序列确定。在本领域中，“同一性”也指核酸分子或多肽之间的序列相关性(relatedness)的程度，视情况不同，根据两种或多种核苷酸串或两种或多种氨基酸序列之间的匹配确定。“同一性”决定两种或多种序列中的较小序列与通过具体数学模型或计算机程序(即“算法”)进行的缺口比对(如果有的话)之间相同匹配的百分比。

术语“相似性”在本领域中用于一种相关的概念，但是与“同一性”不同，“相似性”是指相关性的量度，包括相同的匹配和保守置换匹配。如果两种多肽序列例如有10/20个相同的氨基酸，并且其余的都是非保守置换，则百分同一性和相似性都是50％。如果在同一个实例中，有5个以上的位点是保守置换，则百分同一性仍为50％，但是百分相似性将是75％(15/20)。因此，在保守置换的情况下，两种多肽之间的百分相似性将高于这两种多肽之间的百分同一性。

相关核酸和多肽的同一性和相似性能够用已知的方法容易地计算。这些方法包括但不限于以下所述：《计算分子生物学》(Lesk，A.M.编著)，1988，Oxford University Press，New York；《生物计算：信息学和基因组计划》(Smith，D.W.编著)，1993，Academic Press，New York；《序列数据的计算机分析》，第1部分(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著)，1994，Humana Press，New Jersey；von Heinje，G.，《分子生物学中的序列分析》，1987，Academic Press；《序列分析引物》(Gribskov，M.和Devereux，J.编著)，1991，M.Stockton Press，New York；Carillo等人，1988，SIAMJ.Applied Math.，48：1073；Durbin等人，1998，《生物序列分析》，Cambridge University Press。

确定同一性的优选方法是用来获得所测序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在可以公开获得的计算机程序中描述。测定两种序列之间同一性的优选计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid.Res.，12：387；遗传学计算机小组(Genetics Computer Group)，University of Wisconsin，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.，215：403-410)。BLASTX程序可以从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST手册，Altschul等人.NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul等人，1990，同上)公开获得。也可以利用众所周知的Smith Waterman算法确定同一性。

用于比对两种氨基酸或多核苷酸序列的某些算法可以使两个序列只有一个短区匹配，这个小比对区可能具有极高的序列同一性，尽管这两个全长序列之间没有明显的关系。因此，在某些实施方案中，选择的比对方法(GAP程序)将使比对覆盖靶多肽的至少50个连续氨基酸。在某些实施方案中，这种比对能够包含靶多肽的至少60、70、80、90、100、110或120个氨基酸。如果利用GAP比对多核苷酸，则这种比对能够覆盖至少约100、150或200个核苷酸，它们可能是连续的。

例如，利用计算机算法GAP(遗传学计算机小组，University ofWisconsin，Madison，WI)，比对将要测定百分序列同一性的两种多肽的各自氨基酸的最佳匹配(“匹配范围”，取决于算法)。在某些实施方案中，开放空位罚分(计算为平均对角线的三倍；其中“平均对角线”是使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过具体比对矩阵归属每个完美氨基酸匹配的得分或数字)和延伸空位罚分(通常为开放空位罚分的十分之一)，以及比较矩阵，如PAM250或BLOSUM 62，与该算法一起使用。在某些实施方案中，该算法也使用一种标准比较矩阵(关于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等人，1978，Atlas of Protein Sequence andStructure，5：345-352；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：10915-10919)。

在某些实施方案中，一种多肽序列比较的参数包括下列参数：

算法：Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.，48：443-453；

比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff等人，1992，同上；

空位罚分：12

空位长度罚分：4

相似性阈值：0

GAP程序可以使用上述参数。对于核苷酸序列，参数可能包括50的空位罚分和3的空位长度罚分，每个空位中每个符号的罚分为3。在某些实施方案中，为了利用GAP算法进行多肽比较(末端空位无罚分)，上述参数是缺省参数。

“侧翼序列”是一种基因的上游(即5’)或下游(即3’)的碱基对序列。侧翼序列可以与该基因直接相邻，或者与该基因分开一段适中的碱基对序列，如1-1000个，优选地1-100个碱基对。本发明的重组核酸中使用的侧翼序列与靶基因的相应侧翼序列同源。侧翼序列的长度足以使其参与与天然基因的相应侧翼序列的单交换事件。有用的侧翼序列的长度为约50-约4000个碱基对，优选地约100-约2000个碱基对，特别是可达约1200个碱基对。上游侧翼序列优选地含有靶基因的一个启动子，下游侧翼序列优选地含有一个终止序列。

在优选实施方案中，侧翼序列分别与天然酵母的启动子和终止序列同源或者包含后者。最优选地，重组核酸向酵母基因组染色体DNA中靶基因的基因座内的整合使得它们编码的外源LDH基因处于包含该侧翼序列的天然基因表达调节序列的转录控制之下。

如此处所用的术语“启动子”是指未转录的序列，它位于一种结构基因的翻译起始密码子的上游(即5′)(通常在约1-1000bp以内，优选地在1-500bp以内，特别是1-100bp以内)，控制一种结构基因的转录起始，或者以其它方式控制该基因的转录。

类似地，术语“终止子”是指未转录的序列，它位于一种结构基因的翻译终止密码子的下游(即3′)(通常在约1-1000bp以内，更一般地在1-500个碱基对以内，特别是在1-100个碱基对以内)，控制该结构基因的转录终止，或者以其它方式控制该基因的转录。

在本发明内，视情况而定，如果一种启动子或终止子在整合到酵母基因组内后起作用，控制一种结构基因(例如LDH基因或选择性标记基因)的转录，则该结构基因与该启动子或终止子“有效连接”。

如此处所用的术语“转化”是指细胞遗传特征的一种变化，当一种细胞被修饰而含有新的核酸时，该细胞被转化。因此，当一种细胞由其天然状态遗传修饰时，该细胞被转化。例如，在转染后，转化的DNA优选地通过物理整合到细胞染色体内与细胞基因组DNA重组。此外，至少是瞬时地(即在细胞转化48-96小时内)，核酸能够作为一种附加体元件短暂保持，而不复制，或者可以作为质粒独立地复制。当DNA整合到染色体内并且随着细胞分裂而复制时，则认为该细胞已经被稳定地转化。

术语“转染”用来指细胞摄取外来或外源DNA，当外源DNA被导入细胞膜内时，该细胞被“转染”。本领域公知大量转染技术。参见，例如：Graham等人，1973，Virology 52：456；Sambrook等人，2001，《分子克隆，实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratories；Davis等人，1986，《分子生物学基本方法》，Elsevier；Chu等人，1981，Gene 13：197。这些技术能够用来将一种或多种外源DNA种导入适当的宿主细胞内。

根据本发明第一方面的方法，产生一种重组核酸，其含有与侧翼序列连接的一个外源LDH基因和至少一种选择性标记。术语“重组核酸”在此是指用来向宿主细胞内转移蛋白质编码信息的任何分子(例如核酸片段、质粒或病毒)。合适的侧翼序列能够如下获得：确定目标整合位点，如酵母细胞基因组中的靶基因，获得位于该位点侧翼的序列(使用任何一种适当的方法，包括但不限于化学合成、重组遗传技术或体外扩增)，将这些序列掺入重组核酸中希望的位点处(例如，通过共价连接分别位于LDH编码序列5’和3’的侧翼序列)。然后利用任何适当的转化技术，用该重组核酸转化酵母细胞。这样获得细胞，其中至少一个含有LDH基因的重组核酸片段整合到酵母细胞的基因组内。

该重组核酸包含一个或多个选择性标记基因，它们更优选地处于其自身启动子和终止序列的转录控制之下。标记基因的启动子和终止序列优选地不与靶基因的启动子和终止序列同源。选择性标记基因及其各自的启动子和终止子优选地不打断上游侧翼序列-LDH基因-下游侧翼序列的序列。选择性标记基因及其各自的启动子和终止子优选地位于载体上LDH启动子序列(和其它侧翼序列，如果存在的话)的上游(5’)。

在生产本发明的重组核酸和细胞中以及在实施本发明的方法中有用的含有LDH基因的优选酵母种包括：瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidolactici)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombii)、米根霉(Rhizopus oryzae)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。具体而言，能够分离含有适当L-乳酸脱氢酶基因的菌株，用来生产本发明的重组核酸。两种优选的L-乳酸脱氢酶基因是瑞士乳杆菌和巨大芽孢杆菌L-乳酸脱氢酶。

典型的选择性标记基因编码的蛋白质(a)为宿主细胞提供对抗生素或其它毒素如zeocin(印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的ble博来霉素抗性基因)、G418(Tn903的卡那霉素抗性基因)、潮霉素(来自大肠杆菌的氨基糖甙类抗生素抗性基因)、氨苄青霉素、四环素或卡那霉素的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷，如亮氨酸缺陷(Leu2)；或(c)提供无法从简单培养基中获得的重要养分，例如ura3。优选的选择性标记包括Zeocin抗性基因、G418抗性基因和潮霉素抗性基因等非限制性实例。

本发明的重组核酸也可以含有一个或多个限制性酶切位点，它们可以使该分子被酶切，形成含有LDH基因、启动子和侧翼序列、标记基因和有关启动子和终止子等的线性片段，用于向酵母细胞的基因组内插入。

本发明的重组核酸还可以含有一个骨架部分。骨架部分有利地含有复制起点(在酵母或细菌中有效，允许产生有用的量的核酸)和其它有用的特征，方便地由可商品获得的酵母载体获得。

用本发明的重组核酸转化酵母细胞。转化细胞的方法在本领域中公知，可包括如电穿孔、基于氯化钙或乙酸锂的方法等非限制性实例。转化中使用的本发明的重组核酸能够在使用前用具体限制性内切酶消化，或者不消化。因为LDH基因的侧翼序列显示与位于靶基因侧翼的序列高度同源，上游侧翼序列/LDH基因/下游侧翼序列片段的插入可能在靶基因的基因座处发生。

靶基因是希望用LDH基因替换的任何基因。一种优选的靶基因是丙酮酸脱羧酶基因，因为替换该基因可破坏产生乙醇的一个竞争途径。另外，丙酮酸基因在酵母种中倾向于具有活性，因此在PDC启动子和终止子控制下向基因组内插入LDH基因有助于产生一种良好地表达LDH的突变体。其它优选的靶基因有ADH、Leu2和Ura3。

由于用本发明的重组核酸转化酵母细胞，通过在针对选择性标记的选择性培养基中培养选择的重组细胞，并且在非选择性条件下进一步培养选择的转化子，获得含有外源LDH基因的重组酵母细胞，该基因中含有整合到酵母染色体靶基因的基因座内的重组核酸。如根据本发明的方法获得的，这些细胞已经删除了靶基因，并且整合的外源D-LDH基因插入靶基因的基因座内，使其与靶基因的表达控制序列(如启动子和终止序列)有效连接，并且处于后者的转录控制下。当靶基因是一种PDC基因时，发生PDC删除的细胞在厌氧条件下不能良好地生长。因此，通过暴露于厌氧条件下能够筛选鉴定并选择的细胞的菌落。不能生长的菌落被鉴定为已经发生PDC删除的菌落。类似地，根据与每种靶基因缺失有关的表型能够鉴定向其它任何靶基因内的定向整合。

图17A和17B显示可以产生这种结果的遗传事件的示意图。如图17B所示，选择性标记基因能够与靶基因的删除一起自发地删除。筛选选择性标记基因已经删除的转化子是优选的，因为具有某些特性，如耐药性提高的遗传工程酵母细胞可能产生不希望的环境危险。

产生的酵母细胞丢失了靶基因，含有整合到酵母细胞基因组内，位于靶基因的基因座处的一个外源D-LDH基因。LDH基因处于一个启动子序列和一个终止序列的转录控制下，这两个序列与靶基因的启动子和终止序列同源。

如图17B所见，LDH启动子和终止序列可以是在用来转化细胞的重组核酸所含侧翼序列中存在的序列，或者可以是最初存在于细胞基因组整合位点处的序列。靶基因的终止子保留而整合载体中存在的终止序列缺失也是可能的。

适于在本发明的第一和第二方面进行转化的酵母细胞包括来自下列属的酵母细胞：假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)。优选不能积累丙酮酸(盐)，即可将丙酮酸(盐)自然代谢为乙醇或其它代谢产物的酵母细胞。来自假丝酵母属和克鲁维酵母属的细胞是特别优选的。特别优选的细胞是C.sonorensis和马克斯克鲁维酵母。

本发明第五方面的细胞是马克斯克鲁维酵母种的重组细胞。这些细胞一般通过略微不同的转化方法制备，但是上述方法是合适的，只要靶基因不是PDC基因。在此情况下，重组核酸并非用于在酵母细胞的天然PDC基因的基因座处定向插入。因此，用来转化细胞的载体一般不含与酵母细胞的天然PDC基因的侧翼序列高度同源的侧翼序列。

第五方面的细胞一般通过两次或多次转化制备，每次引入一个拷贝的LDH基因。然而，也能够构建含有多个LDH基因的重组核酸，从而使得多个LDH基因能够一步插入。因此，用来转化细胞的一个或多个载体含有一个或多个LDH基因，每个均与一个启动子和一个终止子有效连接。如前所述，该一个或多个重组核酸也可以含有多个标记基因，每一个均处于启动子和终止序列的控制之下，它们优选地不是对于酵母细胞天然的PDC启动子和终止序列。

合适的LDH基因包括以上关于本发明的前三个方面所述的基因。优选瑞士乳杆菌L-LDH和巨大芽孢杆菌基因L-LDH基因。用多个LDH基因，即至少两个这样的基因，优选地约2-10个这样的基因，更优选地2-5个这样的基因转化这些细胞。插入的LDH基因可以全部是相同的基因，或者可以由两种或多种不同类型的LDH基因(即来自一个以上的种的基因)组成。优选含有两个或多个拷贝的瑞士乳杆菌L-LDH基因的重组酵母细胞，含有两个或多个拷贝的巨大芽孢杆菌L-LDH基因的重组酵母细胞，以及含有瑞士乳杆菌和巨大芽孢杆菌L-LDH基因各至少一个拷贝的重组酵母细胞。

在形成第五方面的细胞中供LDH使用的适当启动子包括用于酵母基因磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)(来自马克斯克鲁维酵母以外的种)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、转录增强因子-1(TEF)、嘌呤-胞嘧啶通透酶(PCPL3)和醇脱氢酶(ADH)的启动子。本发明优选的启动子包括酿酒酵母PGK启动子和酿酒酵母PDC1启动子。

合适的终止子包括来自酿酒酵母或其它酵母种的GAL10和CYC-1终止子。

合适的选择性标记如本发明前三方面所述。

当以多个步骤进行转化时，细胞首先用至少含有一个LDH基因的第一种载体转化。然后通常利用存在选择性标记产生的特性，筛选成功转化的细胞。成功的转化子然后另外转化一次或多次，直到获得最终的细胞，其含有希望的数量和类型的外源LDH基因。

转化的本发明的酵母细胞可用于利用一种发酵方法由碳水化合物生产乳酸。发酵能够用任何适当的发酵方法进行。这些细胞一般使用一种含有能够被该细胞代谢为丙酮酸(盐)的碳水化合物的发酵培养基，并且暴露于可以发生发酵的条件下。发酵培养基也含有提高细胞生存力的养分(如氮、磷、硫、痕量无机物等的来源)。

能够使用的具体碳水化合物取决于具体的宿主细胞，以及该宿主细胞是否工程改造为能够将任何一种具体碳水化合物代谢为丙酮酸(盐)。优选己糖，如葡萄糖和果糖，葡萄糖寡聚体，如麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、淀粉和蔗糖，麦芽糊精和木糖(一种戊糖)。次优选的碳水化合物包括半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。

发酵过程中的温度可以是从大约室温，更优选地从大约30℃，更优选地从大约35℃，到大约55℃，更优选地大约50℃，更优选地大约45℃。最高温度在一定程度上取决于具体的宿主细胞。例如，当宿主细胞是马克斯克鲁维酵母时，(本发明任一方面的)重组细胞能够耐受相对较高的温度(如40℃以上，可达50℃，特别是可达45℃)。另外一个优选的宿主种是C.sonorensis，它能够耐受可达约40℃的温度。这一温度范围提供了在较高温度下进行发酵的可能性(从而降低了冷却成本)，而没有明显的生产率损失。良好的高温耐受的另一个优点是，如果发酵被一种不希望的微生物污染，则在许多情况下，能够通过将发酵培养基加热到40℃或以上，特别是45℃或以上，选择性地杀死这种不希望的微生物，而不会明显损伤本发明的重组细胞。

在发酵过程中，发酵培养基中的细胞浓度一般是约1-150克干细胞/升发酵培养基，优选地约3-10克干细胞/升发酵培养基，更优选地约3-6克干细胞/升发酵培养基。

在发酵的生产阶段，在某些情况下优选地可以微需氧操作，而不是严格厌氧操作。能够为每种微生物建立最佳通气条件，方法是测量氧吸收比速度(OUR)，并将该速度与收率、底物消耗率和希望的发酵产物的生产率相关联。在许多情况下，在具体OUR范围内优化收率和生产率。对于含有PDC破坏的酵母，最佳OUR值倾向于在约0.8-约3.5mmol O₂/干重细胞/小时的范围内。OUR是指发酵过程中细胞消耗氧气的速度，表示为每单位时间每细胞干重的氧气单位(摩尔或克)，如mmol O₂/干重细胞/小时。通过测量向发酵中导入的氧气以及从发酵中排出的氧气，可以方便地测定耗氧量。为了使OUR保持在对于具体生物最佳的范围内，能够利用OUR测量作为在发酵的生产阶段控制通气条件(特别是通气速度、搅拌、通气气体中氧的比例等)的基础。同时培养液中溶解氧的浓度保持在不到饱和量的1％，特别是不到10微摩尔O₂/L。在一个特别优选的方法中，进行发酵的生长阶段，使得培养液中溶解氧的浓度减少至不到饱和量的1％，特别是不到10微摩尔O₂/L，保持一段时间，如大约15-90分钟，之后开始生产阶段(即从生长阶段的需氧条件转换为生产阶段的微需氧条件)。

当生产乳酸时，发酵培养基的pH趋于降低，除非加入一种碱来中和形成的全部或部分酸。在发酵方法的一个实施方案中，向培养液中加入一种中和剂，如碳酸钙、氢氧化钙、碳酸钠、氢氧化钠、氨、氢氧化铵等，使pH保持在希望的范围内，一般是约5.0-约8.0，特别是约5.5-约7.5。当加入这种碱时，形成相应的乳酸盐。因此，乳酸的回收包括再生游离乳酸。实现方法一般包括分离细胞，并用一种强酸(如硫酸)酸化发酵培养液。形成一种盐副产物(如果一种钙盐是中和剂，硫酸是酸化剂，则为石膏)，它与乳酸分离。然后通过如液液提取、蒸馏、吸附等技术回收乳酸，如下所述：T.B.Vickroy，《综合生物技术》，第3卷，第38章(M.Moo-Young编著)，Pergamon，Oxford，1985；R.Datta等人，FEMS Microbiol.Rev.，1995；16：221-231；美国专利号4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122和国际专利申请号WO 93/00440。

此外，细胞产生乳酸也可以使发酵pH降低。因此，由于乳酸的产生，发酵培养液的pH可以处于约1.5-约5.0，优选地约1.5-约4.2，更优选地约1.5-约3.86(乳酸的pKa)，特别是约2.0-不到3.86的范围内。如果达到可以接受的生产率和收率，则这样进行发酵可能具有几个好处。中和剂的成本降低或消除。如果发酵pH(在发酵结束时)低于乳酸的pKa，则乳酸主要以酸的形式存在。这可以取消酸化步骤，从而可以省略额外的加工步骤，节约了酸化成本和盐副产物的处理成本。因此，一种特别优选的方法包括继续发酵，直到发酵培养液的pH下降到3.86以下。能够利用如WO 99/19290公开的方法，从获得的发酵培养液中分离乳酸。

细胞耐受低pH环境的能力提供了另外一种机制，通过这种机制能够清除不希望的微生物的污染。可以将含有本发明的细胞的培养物置于降低的pH条件下，如约1.5-4.2，优选地约2.0-3.86的pH，保持足以杀死不耐酸的污染微生物的一段时间。

为了在商业上有用，本发明的重组酵母应当显示几个特征。该酵母应当能够将相当比例的碳水化合物转化为乳酸(即产生高产量的产物)。这些酵母细胞应当显示高比生产率，即每单位时间每细胞重量产生大量的乳酸。这些酵母细胞优选地能够耐受低于约5.0、优选地约1.5-4.2、特别是2.0-3.86的发酵pH，而在这些条件下达到良好的收率和生产率。在5.0-8.0的pH值，优选地1.5-5.0、优选地1.5-4.2、特别是2.0-3.86的pH值下，这些细胞优选地也能耐受高浓度的乳酸。这最后一个特性可以使该发酵方法使用高浓度的起始碳水化合物。

通常希望使用本发明的重组细胞的发酵方法具有下列某些或全部特征：

A.收率至少为30克乳酸/克碳水化合物，优选地至少40克乳酸/克碳水化合物，更优选地至少60克乳酸/克碳水化合物，更优选地至少75克乳酸/克碳水化合物。希望的理论收率为100％，但是收率的实际上限约为95％。

B.比生产率至少为0.1，优选地至少0.3，更优选地至少约0.4，特别是至少约0.5克乳酸/克细胞/小时。比生产率希望尽可能高。

C.滴度(乳酸的最大浓度)至少为15克/升发酵培养基，优选地至少20g/L，更优选地至少40g/L，更优选地至少80g/L，可达150g/L，优选地可达约120g/L。发酵培养基的温度在一定程度上影响容易达到的滴度的最大范围，因为高度浓缩的乳酸溶液(即高于约150g/L)在低于约35℃的温度下倾向于变得极为粘稠或者成为凝胶。使用较高的发酵温度，如约35-50℃，可以获得更高的滴度，而不会凝胶化或有不当的粘性发生(build-up)。

已经发现，当对葡萄糖进行中性(pH 5.0-8.0)发酵时，本发明第三方面的细胞可以达到85-95％的收率，0.5-2g/g/小时的比生产率，和80-120g/L的滴度。在使pH降至约2.8-3.0的低pH发酵时，发现本发明第三方面的细胞达到75-81％或更高的收率，和0.1-0.4g/g/小时的比生产率和14-40g/L的滴度。在所有情况下，不需优化发酵条件即可获得这些结果。

已经发现，对葡萄糖进行中性pH(5.0-8.0)发酵时，本发明第五方面的细胞(含有多个拷贝的外源LDH基因，并且含有一个完整的天然PDC基因)达到40％以上的收率，0.4-0.9g/g/小时的比生产率，和40-75g/L的滴度。对葡萄糖进行低pH(终pH为2.8-3.0)发酵时，本发明第五方面的细胞达到30％以上的收率，0.3-0.5g/g/小时的比生产率，和20-35g/L的滴度。因此，第五方面的细胞保持在低pH条件下良好发酵的能力。如前所述，不需优化发酵条件即可获得这些结果。

另外，本发明的发酵方法优选地达到高容积生产率。“容积生产率”表示为每单位时间每单位体积发酵培养基产生的产物量，一般是克产物/升培养基/小时。至少1.5g/L/小时，优选地至少2.0g/L/小时，更优选地至少2.5g/L/小时的容积生产率是希望的。在可达3-6克细胞/升发酵培养基的优选细胞密度时，最大生产率趋于可达约5.0g/L/小时，更一般地可达约4.0g/L/小时。非常优选的是进行发酵，使得当培养基的pH、温度或这两者都处于上段所述范围内时，达到这些容积生产率。

根据本发明生产的乳酸可以用来生产丙交酯，即两个乳酸分子的一种环酐。根据乳酸的立体异构体不同，丙交酯可以是D-丙交酯(由两个D-乳酸分子组成)、L-丙交酯(由两个L-乳酸分子组成)或D-L-丙交酯(由L-乳酸和D-乳酸分子各一个组成)。由乳酸生产丙交酯的一种适当的方法是通过聚合/解聚方法，如授予Gruber等人的USP 5,142,023所述。

丙交酯又特别可以作为一种单体用来生产聚丙交酯聚合物(PLA)和共聚物。制备这些聚合物的方法在授予Gruber等人的USP 5,142,023中也有描述。优选的PLA产物是如授予Gruber等人的USP 5,338,822所述的熔解稳定的聚合物。PLA可以是半晶体或非晶体。

下列实施例用来说明本发明的某些实施方案，并非限制其范围或精神。

实施例1A：基于酿酒酵母ScPGK1启动子的表达载体pNC2和基于酿酒酵母PDC1启动子的pNC4的构建

表达载体pNC2(图1)通过在pGEM5Z(+)(Promega，Wisconsin)骨架载体上组合酿酒酵母ScPGK1启动子和酿酒酵母GAL10终止子产生。酿酒酵母ScPGK1启动子和ScGAL10终止子由一个多接头区隔开，该接头区含有限制酶切位点XbaI、EcoRI和BamHI，用于在酵母启动子与终止子之间插入将要表达的具体基因。

使用的酿酒酵母ScPGK1启动子含有下列序列(SEQ ID No.1)

5’-GCGGCCGCGG ATCGCTCTTC CGCTATCGAT TAATTTTTTT TTCTTTCCTC

TTTTTATTAA CCTTAATTTT TATTTTAGAT TCCTGACTTC AACTCAAGAC

GCACAGATAT TATAACATCT GCACAATAGG CATTTGCAAG AATTACTCGT

GAGTAAGGAA AGAGTGAGGA ACTATCGCAT ACCTGCATTT

AAAGATGCCG

ATTTGGGCGC GAATCCTTTA TTTTGGCTTC ACCCTCATAC TATTATCAGG

GCCAGAAAAA GGAAGTGTTT CCCTCCTTCT TGAATTGATG TTACCCTCAT

AAAGCACGTG GCCTCTTATC GAGAAAGAAA TTACCGTCGC TCGTGATTTG

TTTGCAAAAA GAACAAAACT GAAAAAACCC AGACACGCTC GACTTCCTGT

CTTCCTATTG ATTGCAGCTT CCAATTTCGT CACACAACAA GGTCCTAGCG

ACGGCTCACA GGTTTTGTAA CAAGCAATCG AAGGTTCTGG

AATGGCGGGA

AAGGGTTTAG TACCACATGC TATGATGCCC ACTGTGATCT CCAGAGCAAA

GTTCGTTCGA TCGTACTGTT ACTCTCTCTC TTTCAAACAG AATTGTCCGA

ATCGTGTGAC AACAACAGCC TGTTCTCACA CACTCTTTTC TTCTAACCAA

GGGGGTGGTT TAGTTTAGTA GAACCTCGTG AAACTTACAT TTACATATAT

ATAAACTTGC ATAAATTGGT CAATGCAAGA AATACATATT TGGTCTTTTC

TAATTCGTAG TTTTTCAAGT TCTTAGATGC TTTCTTTTTC TCTTTTTTAC

AGATCATCAA GGAAGTAATT ATCTACTTTT TACAACAAAT CTAGAATT-3′

该序列作为来自被命名为pBFY004的专利质粒的一条限制酶切片段获得。此外，也能够以酿酒酵母染色体DNA为模板，使用根据SEQID NO：1设计的引物，通过PCR扩增获得。

使用的酿酒酵母GAL10终止子含有下列序列(SEQ ID NO：2)：

5’-GTAGATACAT TGATGCTATC AATCCAGAGA ACTGGAAAGA TTGTGTAGCC

TTGAAAAACG GTGAAACTTA CGGGTCCAAG ATTGTCTACA GATTTTCCTG

ATTTGCCAGC TTACTATCCT TCTTGAAAAT ATGCACTCTA TATCTTTTAG

TTCTTAATTG CAACACATAG ATTTGCTGTA TAACGAATTT TATGCTATTT

TTTAAATTTG GAGTTCAGTG ATAAAAGTGT CACAGCGAAT TTCCTCACAT

GTAGGGACCG AATTGTTTAC AAGTTCTCTG TACCACCATG GAGACATCAA

AAATTGAAAA TCTATGGAAA GATATGGACG GTAGCAACAA GAATATAGCA

CGAGCCGCGG ATTTATTTCG TTACGC-3’

该序列作为被命名为pBFY004的专利质粒的一条限制酶切片段获得。此外，也能够以酿酒酵母染色体DNA为模板，使用根据SEQ IDNO：2设计的引物，通过PCR扩增获得。

构建载体pNC4，其含有基于酿酒酵母PDC1启动子和ScGAL10终止子的表达盒，用该质粒作为一种通用表达载体。pNC4载体在图2中显示。

pNC4的载体骨架是pGEM5Z(+)(Promega Corporation；Madison，WI)。以来源于酿酒酵母GY5098株的染色体DNA为模板(ATCC4005098)，使用引物PSPDCS1(5′-CCA TCG ATA ACA AGC TCATGCAAA GAG-3′；SEQ ID No：3)和PSPDCAS2(5′-GCT CTA GATTTG ACT GTGTTA TTT TGCG-3′；SEQ ID No：4)，PCR扩增酿酒酵母PDC1启动子。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)进行热循环：94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，最后72℃温育7min。

酿酒酵母GAL10终止子如上所述获得。图2a(SEQ ID No：37)和2b(SEQ ID No：38)显示了含有ScPGK1启动子和ScGAL10终止子以及多克隆位点，和含有ScPDC1启动子和ScGAL10终止子以及多克隆位点的片段。

实施例1B：pVR22载体的构建，其含有与酿酒酵母PDC1启动子和ScGAL10终止子有效连接的G418抗性基因

克隆G418抗性标记(一种细菌neo^R基因)，将其置于酿酒酵母PDC1启动子的转录控制下；这些构建体被命名为pVR22(图3)。以质粒pPIC9K(Invitrogen，Carlsbad，CA)为模板，使用引物5′-GCT CTAGAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC(5′G片段；SEQ ID No：5)和5′-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC(3′G片段；SEQ ID No：6)，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，PCR扩增G418抗性基因。热循环如下进行：开始时反应混合物95℃温育5min，然后95℃30sec，49℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃温育10min。PCR产物用BamHI和XbaI消化，分离到一条821bp的片段，将其与pNC2的4303bp的BamHI-XbaI片段连接(实施例1A)。获得的质粒(pVR22；图3)含有与G418抗性基因有效连接的ScPGK1启动子和ScGAL10终止子。

实施例1C：pVR29质粒的构建，其含有与酿酒酵母ScPGK1启动子和ScGAL10终止子(pVR29)功能连接的G418抗性基因

将G418抗性标记(pVR22；实施例1B)克隆到pNC2(实施例1A)内，该构建体被命名为pVR29(图4)。用酿酒酵母ScPGK1启动子和酿酒酵母GAL10终止子表达该G418抗性基因。以质粒pVR22(实施例1B)为模板，使用引物5′-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGAAAC(5′G片段；SEQ.ID NO：5)和5′-ATG GAT CCT TAG AAA AACTCA TCG AGC ATC(3′G片段；SEQ.ID NO：6)，用Pfu聚合酶(Stratagene，Madison，WI)PCR扩增该G418抗性基因。此外，质粒pPIC9K(Invitrogen，Carlsbad，CA)也能够作为模板。热循环如下进行：开始时反应混合物95℃温育5min，然后95℃30sec，49℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃温育10min。PCR产物用BamHI和XbaI消化，分离一条821bp的片段，将其与pNC2的4303bpBamHI-XbaI片段连接。产生的质粒pVR29(图4)含有与G418抗性基因有效连接的ScPGK1启动子和ScGAL10终止子。

实施例1D：质粒pPS1(潮霉素抗性盒)、pNC14(Lh-L-LDH表达盒)和pPS9(用于向基因组内整合Lh-L-LDH的载体，用于生产L-乳酸，使用潮霉素抗性作为选择性标记)的构建

制备一种重组核酸，它使转化的酵母细胞具有潮霉素抗性，从而允许筛选含有一种重组核酸构建体的酵母细胞转化子，该构建体编码可用于合成乳酸的蛋白质。能够利用载体pPS9(图5)，通过选择潮霉素抗性，将瑞士乳杆菌L-LDH基因整合到酵母基因组内。

克隆潮霉素抗性标记(大肠杆菌hph)，使其处于酿酒酵母PDC1(丙酮酸脱羧酶)启动子的转录控制下。以质粒pRLMex30为模板，使用引物5′HYGXBA1(5′-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT GAA CTCAC-3′；SEQ ID No：7)和3′HYGBAMH1(5′-CGC GGA TCC CTA TTCCTT TGC CCT CGG AC-3′；SEQ ID No：8)，PCR扩增提供潮霉素B抗性的大肠杆菌hph基因(Mach等人.1994，Curr.Genet.25，567-570；Rajgarhia等人，美国专利申请号10/154,360，2002年5月23日提交，在此全文引用作为参考)。也能够以大肠杆菌染色体DNA为模板，使用相同的引物，获得hph基因。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)进行热循环：94℃1min，56℃1min，72℃3min，共30个循环，最后72℃温育7min。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，分离到1026bp的产物。该1026bp片段然后用XbaI和BamHI消化，将其连接到含有酿酒酵母ScPDC1启动子和ScGAL10终止子的pNC4(实施例1A)的XbaI-BamHI片段内，产生质粒pPS1(图5)。

克隆编码L-乳酸脱氢酶的瑞士乳杆菌L-LDH基因，使其处于酿酒酵母ScPDC1启动子的转录控制下。以质粒pSO20(实施例1H；图10)为模板，使用引物PS15S(5′-GCT CTA GAA TTA TGG CAA GAGAGG AAAAAC-3′；SEQ.ID NO.9)和PS16AS(5′-CGG GAT CCT CATTGA CGA ACC TTAACG-3′；SEQ.ID NO.10)，PCR扩增编码L-乳酸脱氢酶的瑞士乳杆菌L-LDH基因。此外，也能够以瑞士乳杆菌染色体DNA为模板，使用相同的引物，获得LDH基因。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)进行热循环：94℃1min，56℃1min，72℃3min，共30个循环，最后72℃温育7min。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离990bp的产物。PCR产物用XbaI和BamHI消化，将其连接到XbaI和BamHI消化的载体pNC2中(实施例1A)，产生质粒pNC14(图5)。pNC14用SalI和BsaHI消化，产生LhLDH表达盒。分离该LhLDH表达盒，将其连接到pPS1的SalI-ClaI片段内，产生质粒pPS9(图5)。

实施例1E：PVR39质粒的构建，其含有瑞士乳杆菌L-LDH基因和G418标记

pPS9(实施例1H；图5)用SphI消化，用河虾碱性磷酸酶(RocheDiagnostics，Indiahapolis，IN)按照厂商所述方案去磷酸化，产生含有瑞士乳杆菌LDH表达盒的片段。pVR29(实施例1C；图4)用SphI消化，利用0.8％琼脂糖凝胶分离含有G418抗性基因盒的2048bp片段。连接这些片段，获得的质粒pVR39(图6)含有彼此相邻的瑞士乳杆菌L-LDH基因和G418抗性基因标记(图6)。

实施例1F：pHES和pSEH质粒的构建

按照PCT申请PCT/US/44041所述，用0.5μg质粒pGAD424(如Chien等人，1991，Proe.Natl Acad.Sci.USA 88：9578-9582所述)构建pHES和pSEH质粒，用限制性内切酶HindIII消化。消化的混合物在TBE缓冲液(Biorad，USA)中通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离。然后如Sambrook等人(1989，《分子克隆》，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Plainview，NY)所述，从凝胶中纯化5.9kbp片段。设计含有多个限制性内切酶识别位点的92bp合成寡聚物的互补对。第一个被命名为“fwd HES”oligo，含有下列序列：5′-CCCAAGCTTGAATTCCCCGG GGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATC TACTAGTGCG GCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTG GG-3′(SEQ.ID NO：11)。第二个被命名为“comp(SO1)(CMA2)hes”oligo，含有下列序列：5′-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGA CTCGAGGCGG CCGCACTAGTAGATCTACGC GTGGTACCCT GCAGGGATCC CCCGGGGAATTCAAGCTTG GG-3′(SEQ.ID NO：12)。通过将两种oligos在水浴中煮沸10分钟(100℃)，并逐渐冷却到室温，使500nmoles两种互补寡聚物彼此退火。双链92bp DNA用HindIII消化，将其与HindIII消化的pGAD424(Clontech，USA)的5.9kbp片段连接。如Sambrook等人(同上)所述，通过电穿孔，用连接混合物转化大肠杆菌DH10B(electromaxcells，Life Technologies，Rockville，MD)。将重组大肠杆菌接种于Luria-Bertani培养基平板(Difco，USA)上，利用100μg/ml氨苄青霉素(Sigma Chemicals，USA)筛选含有该质粒的细胞。从氨苄青霉素抗性大肠杆菌克隆中筛选质粒DNA，获得两种质粒pHES和pSEH。这两种质粒在载体上多克隆位点-合成双链寡聚物相对于醇脱氢酶启动子(ADH1)的方向上不同。

实施例1G：含有瑞士乳杆菌L-LDH的pVR1质粒的构建，用于进一步构建pSO20和pPS9

瑞士乳杆菌L-LDH如下所述分离。瑞士乳杆菌细胞从美国模式培养物保藏中心获得(ATCC保藏号10797)，并在标准条件下生长。然后使用下列方案从这些细胞中纯化基因组DNA：

用来自细菌甘油贮存液的单菌落(或5mL)接种两个250mL无菌摇瓶，其中各含有50mL无菌MRS培养液(Difco，USA)。培养物在37℃和170rpm充分搅拌下培养48小时。将培养物转移到50mL无菌蓝帽试管中，以3000rpm离心10分钟。将沉淀悬浮于50mL 12.5％w/v蔗糖溶液中，再次以3000rpm离心10分钟。将新形成的沉淀在50mL无菌蓝帽试管中重悬浮于5mL 12.5％w/v蔗糖中。向试管中加入5mLTES溶液(200ml TES：2ml 1.0M Tris(pH 8.0)，[10mM Tris(pH 8.0)]，20ml 500mM EDTA(pH 8.0)，[50mM EDTA(pH 8.0)]，0.584g NaCl[50mM NaCl]，使用前过滤除菌)。向试管中加入12.5％w/v蔗糖溶液，混合。加入300mg溶菌酶粉末(Sigma Chemicals，USA)，混合物以2000rpm振荡1分钟。向混合物中加入25μL变溶菌素溶液(Sigma)(浓度为2.2mg/mL)，该混合物在37℃下温育过夜(～10-12小时)。

向混合物中加入2.5mL 20％SDS溶液(Biorad，USA)和168μL蛋白酶K溶液(浓度＝28mg/1.4mL)(Sigma)，获得的混合物通过颠倒混合，在50℃下温育1小时。细胞膜物质较好地破裂，溶液变为半透明。在试管中用NaCl稀释该混合物，达到0.15M的浓度。

将该混合物转移到一个50mL Oakridge管中，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液处理。振荡获得的混合物，以10,000rpm离心10分钟。将水层转移到一个清洁的Oakridge管中，加入等体积的氯仿。然后充分振荡该混合物，以5000rpm离心10分钟。将水层吸到一个新试管中，加入25μL RNAse(100mg/mL)，颠倒混合。获得的混合物在37℃下温育15分钟。

沿试管壁向混合物中加入2.5倍体积的EtOH，但是不混合。收集在界面处形成的DNA，在70％EtOH中洗涤，混合物以10000rpm离心10分钟。在底部形成的沉淀是DNA，使其风干，在微量离心管中重悬浮于10mM Tris-HCl，pH 8.5中。该混合物在试管中50℃温育，直到DNA进入溶液(～2-3小时)。

根据Genbank中可以获得的瑞士乳杆菌L-LDH的序列(Genbank保藏号Z81318)设计引物。使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，WI，USA)进行PCR扩增。每个反应体系含有浓度为500ng的瑞士乳杆菌基因组DNA，浓度各为0.2mM的4种dNTP，和浓度各为1μM的扩增引物SO22 5′-CCG GGA TCC ATG GCA AGA GAG GAA AAA CCTC(SEQ.ID NO.13)和SO23 5′-CCA AGA TCT TTA TTG ACG AACCTT AAC GCC AG(SEQ.ID NO.14)。热循环如下进行：开始时95℃温育10min，随后95℃30sec，41℃30sec，72℃60sec，共35个循环。利用常规方法凝胶纯化该反应产生的990bp片段，用限制性内切酶BamHI和BglII消化，然后将其克隆到BamHI和BglII消化的pHES(实施例1F)中，产生质粒pLhLDH-HES。获得的序列能够被翻译为一种多肽，该多肽显示与Genbank中已知的瑞士乳杆菌L-LDH编码基因序列(保藏号Z81318)有极高的同源性。

设计其它引物，以在瑞士乳杆菌L-LD基因的5’端和3’端分别引入NcoI和DraIII限制酶切位点。使用Pfu聚合酶(Stratagene，Wisconsin，USA)进行PCR扩增反应。每个反应体系含有浓度为5ng的pLH-LDH/HES，浓度各为0.2mM的4种dNTP，和浓度各为1μM的扩增引物VR1 5′-ATC CAT GGC AAG TAT TAC GGA TAA GGATCA CCAA(SEQ.ID NO.15)和VR2 5′-ATC ACG AAG TGT CACGTA CGG GTT TCG ATG TC(SEQ.ID NO.16)。热循环如下进行：开始时95℃温育10min，随后95℃30sec，55℃30sec，72℃60sec，共35个循环。利用常规方法凝胶纯化该反应产生的982bp片段，用NcoI和DraIII限制性内切酶消化，将其克隆到NcoI和DraIII消化的pTEF1/Zeo(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，产生的质粒pVR1(图7)证实含有瑞士乳杆菌L-LDH编码基因序列，处于酿酒酵母pTEF1启动子控制下。存在大肠杆菌EM7启动子，但是它不是本发明的整合载体的一个必要成分。

实施例1H：质粒pSO20的构建，其用于在马克斯克鲁维酵母中表达瑞士乳杆菌L-LDH质粒

质粒pSO20如下构建：将BamHI(NEB)消化的、河虾碱性磷酸酶处理的(Roche Diagnostics，USA)pUC19质粒(Life Technologies，USA)与消化pVRl(实施例1F)获得的含有瑞士乳杆菌L-LDH基因+相邻的启动子和终止序列的BamHI片段相连接。产生的质粒为pSO18(图8)。然后用SphI消化pSO18，与pSPHI构建体(Chen等人，1986，“来自酵母果蝇克鲁维酵母(Kluyveromyces drosophilarum)的环形质粒pKD1的序列组织”，Nucleic acids Res.14：4471-4481)的含有pKD1骨架的SphI片段相连接，产生质粒pSO19(图9)。

pTEF1/Zeo(Invitrogen，Inc)用XhoI/XbaI消化，产生酿酒酵母TEF1启动子、Zeocin抗性基因和酿酒酵母GAL10终止子。该1195bp片段的末端然后用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，Madison，WI)补平。构建体pSO19用AatII消化，用Pfu DNA聚合酶产生平端，用河虾碱性磷酸酶处理获得的片段。然后将该9.3kbp与含有酿酒酵母TEF1启动子、Zeocin抗性基因和酿酒酵母GAL10终止子的1195bp pTEF/Zeo片段相连接。产生的构建体是pSO20(图10)。

实施例1I：通过转化的DNA向马克斯克鲁维酵母基因组内的随机整合，瑞士乳杆菌L-LDH基因的引入

通过用SstI和ApaI消化pVR39，从该质粒中分离含有瑞士乳杆菌L-LDH:G418抗性基因盒的4.28kbp片段。用0.8％琼脂糖凝胶分离该片段，利用如下所述的电穿孔方案，用该片段转化马克斯克鲁维酵母(CD21)：

用马克斯克鲁维酵母的一个单菌落接种50mL YPD培养基(在250mL带挡板的摇瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和20g/L葡萄糖，至OD600＝0.1)。培养物在30℃和250rpm下温育16小时，直到终OD600＝10。从10mL培养物中离心收集细胞，用电穿孔缓冲液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl₂，pH 7.5)洗涤一次。然后将细胞重悬浮于温育缓冲液(YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下温育30分钟。离心收集细胞，用电穿孔缓冲液洗涤一次，将其重悬浮于1mL电穿孔缓冲液中。然后将400μL细胞转移到一个0.4cm的电穿孔杯(BioRad；USA)中。

用SstI和ApaI消化pVR39，将2μg获得的4.3kbp片段加入杯中。然后这些细胞以1.8kV，1000Ω，25μF电穿孔。将细胞转移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下温育4小时，之后选择性接种于含有300μg/mL G418的YPD上。这些转化子在37℃下生长3天。将G418抗性转化子在含有300μg/mL G418的新鲜选择平板上重新划线。

使用与瑞士乳杆菌L-LDH基因同源的PCR引物和与G418抗性基因同源的反向引物证实该片段向马克斯克鲁维酵母基因组内的整合。

VR146 5′-GCT GAG TAC CCA GAT TGT AAGGATG-3′(SEQ.ID NO.17)和VR143 5′CTG CCA GCG CAT CAA CAA TAT TTTCAC-3′(SEQ.ID NO.18)用来在含有该盒的菌株中扩增位于瑞士乳杆菌L-LDH与G418抗性基因之间的2.3kb的产物。在不含该盒的菌株中，这些引物不能扩增任何片段。

使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)对转化子菌落进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，53℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。分析的10个转化子产生预期的2.3kb PCR产物。使用可与作为探针的瑞士乳杆菌L-LDH基因杂交的10个菌株的基因组DNA进行Southern印迹分析，所分析的10个转化子中有2个显示适当的带型，与来自pVR39的一个拷贝的瑞士乳杆菌L-LDH基因的整合相一致。两个菌株中的一个被鉴定为CD484。

实施例1J：通过转化的DNA向马克斯克鲁维酵母基因组内的随机整合，另外一个拷贝的瑞士乳杆菌L-LDH基因的导入

通过用SstI和ApaI消化pPS9，从该质粒中分离含有瑞士乳杆菌L-LDH:HPH抗性基因盒的4.7kbp片段。用0.8％琼脂糖凝胶分离该片段，通过电穿孔用来转化马克斯克鲁维酵母CD484：

用马克斯克鲁维酵母CD484的一个单菌落接种50mL YPD培养基(在250mL带挡板的摇瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和20g/L葡萄糖和2％琼脂，至OD₆₀₀＝0.1)。培养物在30℃和250rpm下温育16小时，至终OD₆₀₀＝10。从10mL培养物中离心收集细胞，用电穿孔缓冲液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl₂，pH 7.5)洗涤一次。然后将细胞重悬浮于温育缓冲液(YPD+25mM DTT，20mMHEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下温育30分钟。离心收集细胞，用电穿孔缓冲液洗涤一次，将其重悬浮于1mL电穿孔缓冲液中。然后将400μL细胞转移到一个0.4cm的电穿孔杯(BioRad；USA)中。

用SstI和ApaI消化pPS9，将5μg获得的4.7kbp片段加入杯中。然后这些细胞以1.8kV，1000Ω，25μF电穿孔。将电穿孔的细胞转移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下温育4小时，之后选择性接种于含有200μg/mL潮霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的YPD上。潮霉素抗性转化子在37℃下生长3天。将这些转化子在含有300μg/mL G418的新鲜选择平板上重新划线，以确保该菌株含有两种抗性基因。

使用与瑞士乳杆菌L-LDH基因同源的PCR引物以及与潮霉素抗性基因同源的反向引物，证实瑞士乳杆菌L-LDH:G418盒的新4.7kbp片段的整合。VR146(SEQ ID NO.17)和VR142 5′-GTG ACA CCC TGTGCA CGG CGG GAG ATG-3′(SEQ.ID NO.19)用来在含有该盒的菌株中扩增位于瑞士乳杆菌L-LDH与潮霉素抗性基因之间的2.3kb产物。在不含该盒的菌株中，这些引物不能扩增任何片段。

使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，53℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。使用上述PCR分析的4个转化子产生预期的1.76kb PCR产物。

利用与瑞士乳杆菌L-LDH基因同源的PCR引物以及与G418抗性基因同源的反向引物，证实来自马克斯克鲁维酵母CD484的4288bp瑞士乳杆菌L-LDH:G418基因的存在。VR146(SEQ ID NO.17)和VR143(SEQ.ID NO.18)用来在含有该盒的菌株中扩增位于瑞士乳杆菌L-LDH与G418抗性基因之间的2.3kb产物。在不含该盒的菌株中，这些引物不能扩增任何片段。

使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，53℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。所有4个菌株都产生预期的2.3kb PCR产物。

与瑞士乳杆菌L-LDH探针杂交的菌株基因组DNA的Southern印迹分析证明，对于G418和潮霉素盒产生阳性PCR结果的4个转化子也含有插入基因组内的两个拷贝的瑞士乳杆菌L-LDH基因。该菌株被鉴定为马克斯克鲁维酵母CD492，进一步分析L-乳酸的产生。

实施例1K：摇瓶培养物在YPD+葡萄糖培养基中的L-乳酸产生

重组菌株CD492在一个250mL带挡板的摇瓶中培养，其中含有补充了100g/L葡萄糖的50mL YPD。来自于YPD琼脂平板的细胞在30℃和250rpm下温育16小时，至OD₆₀₀＝0.1。然后利用YSI分析检测摇瓶的残余葡萄糖，以确保细胞处于指数生长期。离心收集4g/L细胞干重(“gcdw”)当量，将其重悬浮于一个250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了约100g/L葡萄糖和55g/L CaCO₃的50mL YPD。该培养物然后在30℃和70rpm下温育。在0、12、24小时的时间间隔后采样。通过过滤从样品中除去细胞，通过HPLC分析上清液的葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸盐和乙醇。在这些条件下，CD492株产生对映体纯度大于99％的L-乳酸。终滴度为69g/L。容积生产率为3.6g/L/小时。

为了比较，CD 484株(实施例1)在相同条件下培养。与CD492所见相比，L-乳酸产量较低，乙醇产量较高。

实施例1L：摇瓶培养物在YPD+葡萄糖培养基中的L-乳酸产生

492株在一个250mL带挡板的摇瓶中培养，其中含有补充了100g/L葡萄糖的50mL YPD。细胞接种到摇瓶中，至OD₆₀₀＝0.1，摇瓶在30℃和250rpm下温育16小时。终pH＜3.1。然后利用YSI分析检测摇瓶的残余葡萄糖，以确保细胞处于指数生长期。离心收集4g/L细胞干重当量，将其重悬浮于一个250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了约25g/L葡萄糖的50mL YPD。培养物然后在30℃和70rpm下温育。以不同时间间隔采样，过滤除去细胞。通过HPLC分析培养上清液的葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸(盐)和乙醇。

产生的L-乳酸对映体纯度大于99％。L-乳酸滴度为15g/L，容积生产率为2g/L/hr。当在相同条件下检测CD484株时，乳酸产量较低，而乙醇产量较高。

在一个不同的实验中，含有100mL YPD+100g/L葡萄糖的一个500mL带挡板的摇瓶接种CD492株，至OD₆₀₀＝0.1。摇瓶在37℃和250rpm下培养约16小时。在确保细胞处于指数生长期后，收集4g/L细胞干重当量。将细胞沉淀重悬浮于50mL YPD+40g/L葡萄糖中，将其转移到一个250mL带挡板的摇瓶中。该摇瓶置于37℃和70rpm下。在生物质生长结束时，以及进入生产阶段0、15、18.5、23小时，直到所有葡萄糖消耗光，采样进行HPLC分析。在生产开始和结束时测量pH。终pH为3.00+/-0.06。

CD 492株在15-23小时内消耗葡萄糖。在生产结束时(当葡萄糖完全消耗光时)采样进行游离酸分析，并分析总乳酸、乙酸盐、乙醇和丙酮酸盐。CD492株产生32g/L游离乳酸、32g/L乙醇和各＜1g/L的乙酸盐和丙酮酸盐。游离乳酸为32g/L。在所有情况下，在发酵结束时，质子化形式的酸的百分比至少为97％。基于葡萄糖的乳酸收率为59％。

在类似的条件下评价CD 484株。它产生26-28g/L游离乳酸，基于葡萄糖的收率为46-58％。

实施例2A：pVR24质粒的构建，其含有巨大芽孢杆菌L-LDH，用于在酿酒酵母ScPGK1启动子控制下表达L-LDH

编码L-LDH基因的巨大芽孢杆菌DNA如下分离。巨大芽孢杆菌从美国模式培养物保藏中心获得(ATCC保藏号6458)，在标准条件下培养。使用Invitrogen的“Easy-DNA”试剂盒，按照厂商方案，从这些细胞中纯化基因组DNA。以可从Genbank获得的巨大芽孢杆菌L-LDH的序列(Genbank保藏号M22305)为基础设计引物。使用Perkin Elmer缓冲液II(1.5mM MgCl₂)和AmpliTaq Gold聚合酶进行PCR扩增反应。每个反应体系含有浓度为6ng/μL的巨大芽孢杆菌基因组DNA、浓度各为0.2mM的4种dNTP和浓度各为1μM的两种扩增引物BM1270和BM179：

(5’-CCT GAG TCC ACG TCA TTA TTC-3’；SEQ.ID NO.20)

(5’-TGA AGC TAT TTA TTC TTG TTAC-3’；SEQ.ID NO.21)

热循环如下进行：开始时95℃温育10min，随后95℃30sec，50℃30sec，72℃60sec，共35个循环。利用常规方法凝胶纯化该反应产生的1100bp片段，克隆，测序。获得的序列能够被翻译为一种多肽，该多肽显示与已知L-LDH编码基因的同源性，其中两种序列之间的同源程度至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大约99％的序列同一性。

巨大芽孢杆菌LDH的编码序列与来自质粒pNC2(实施例1A)的酿酒酵母ScPGK1启动子和ScGAL10转录终止子有效连接。两种寡核苷酸引物，被命名为Bmeg5′和Bmeg3′，用来在该基因的编码序列的末端引入限制酶切位点：(5′-GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TACACC-3；SEQ ID No：22)和(5-ATGG ATC CTT ACA CAA AAG CTCTGT CGC-3′；SEQ ID No：23)。

使用上述dNTP和引物浓度，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，在厂商提供的缓冲液中进行扩增反应。热循环如下进行：开始时反应混合物95℃温育3min，随后95℃30sec，50℃30sec，72℃60sec，共20个循环，最后72℃温育9min。产物用限制性内切酶XbaI和BamHI消化，然后将其连接到质粒pNC2(实施例1A)的XbaI和BamHI片段内。这种连接产生质粒pVR24，其含有与巨大芽孢杆菌LDH编码序列有效连接的ScPGK1启动子和ScGAL10终止子(图12)。

实施例2B：编码巨大芽孢杆菌L-LDH的G418抗性标记质粒(pCA3)

修饰从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得的G418抗生素选择性标记，将其与来自酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因启动子和一个转录终止子有效连接。在构建该构建体中，制备下列寡核苷酸，用来从含有G418抗性基因插入片段的质粒中扩增编码序列。两种oligo-寡核苷酸引物G5′和G3′根据该序列设计，用来在该基因编码序列的末端引入限制酶切位点：

5′-AAA TCT AGA TGA GCC ATA TTCAAC GGGA-3′；(SEQ.IDNo.24)和5′-CCG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGCAT3′；(SEQ.ID No.25)。

使用G5′和G3′引物和所有4种dNTP和Pfu Turbo聚合酶，PCR扩增来自pPIC9K载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)的G418抗性基因。使用上述dNTP和引物浓度，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，在厂商提供的缓冲液中进行扩增反应。热循环如下进行：开始时反应混合物95℃温育3min，随后95℃30sec，50℃30sec，72℃60sec，共30个循环，最后72℃温育9min。产物用限制性内切酶XbaI和BamHI消化，然后将其连接到质粒pNC4(实施例1A)的XbaI和BamHI位点内。

将与酿酒酵母ScPGK1启动子和ScGAL10终止子有效连接的巨大芽孢杆菌LDH基因引入该载体中，位于G418基因ScGAL10终止子的3’末端的SphI位点处，产生质粒pCA3(图13)。

实施例2C：pVR38质粒的构建，其含有巨大芽孢杆菌LDH基因和潮霉素抗性标记

pVR24(实施例2A)用SphI消化，并用河虾碱性磷酸酶(RocheDiagnostics，Indianapolis USA)按照厂商所述方案去磷酸化，产生含有巨大芽孢杆菌LDH表达盒的片段。pPSl(实施例1D)用SphI消化，利用0.8％琼脂糖凝胶分离含有潮霉素抗性基因盒的2259bp片段，将其与去磷酸化的pVR24连接。产生的质粒pVR38(图14)含有彼此相邻的巨大芽孢杆菌L-LDH基因和潮霉素抗性基因标记。

实施例2D：通过转化的DNA向马克斯克鲁维酵母基因组内的随机整合，巨大芽孢杆菌LDH基因的引入

通过用SstI和ApaI消化pCA3，从该质粒中分离含有巨大芽孢杆菌L-LDH:G418抗性基因盒的4.2kbp片段。用0.8％琼脂糖凝胶分离该片段，利用如下所述的电穿孔方案，用该片段转化马克斯克鲁维酵母(CD21)。

用马克斯克鲁维酵母的一个单菌落接种50mL YPD培养基(在250mL带挡板的摇瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，和2％琼脂，至OD₆₀₀＝0.1)。培养物在30℃和250rpm下温育16小时，至终OD₆₀₀＝10。从10mL培养物中离心收集细胞，用电穿孔缓冲液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl₂，pH 7.5)洗涤一次。然后将细胞重悬浮于温育缓冲液(YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下温育30分钟。然后离心收集细胞，用电穿孔缓冲液洗涤一次。然后将细胞重悬浮于1mL电穿孔缓冲液中，将400μL细胞转移到一个0.4cm的电穿孔杯(BioRad；USA)中。

将2μg来自pCA3的4.2kbp SstI/ApaI片段加入杯中，这些细胞以1.8kV，1000Ω，25μF电穿孔。然后将细胞转移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下温育4小时，之后选择性接种于含有300μg/mL G418的YPD上。这些转化子在37℃下生长3天。将G418抗性转化子在含有300μg/mL G418的新鲜选择平板上重新划线。

使用与巨大芽孢杆菌L-LDH基因同源的PCR引物和与G418抗性基因同源的反向引物证实该片段向马克斯克鲁维酵母基因组内的整合。BmLDH3 5′-GTA CGC ATT ACC AAG GCT ATT TTA GAT-3′(SEQ.ID NO.26)和VR143(SEQ.ID NO.18)用来在含有该盒的菌株中扩增位于巨大芽孢杆菌L-LDH与G418抗性基因之间的1.8kb产物。在不含该盒的菌株中，这些引物不能扩增任何片段。

使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)对转化子菌落进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，53℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。PCR分析的10个转化子中有7个产生预期的1.8kb PCR产物。利用来自7个菌株的基因组DNA与作为探针的巨大芽孢杆菌L-LDH基因的Southern印迹杂交，所分析的7个PCR阳性转化子中有2个显示适当的带型，与来自pCA3的一个拷贝的巨大芽孢杆菌L-LDH基因的整合相一致。两个菌株中的一个被鉴定为CD162。

实施例2E：通过转化的DNA向马克斯克鲁维酵母基因组内的随机整合，另外一个拷贝的巨大芽孢杆菌LDH基因的导入

通过用SstI和ApaI消化pVR38，从该质粒中分离含有巨大芽孢杆菌L-LDH:HPH抗性基因盒的4.5kbp片段。用0.8％琼脂糖凝胶分离该片段，通过电穿孔用来转化马克斯克鲁维酵母CD162株。

用马克斯克鲁维酵母CD162的一个单菌落接种50mL YPD培养基(在250mL带挡板的摇瓶中含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，和20g/L葡萄糖和2％琼脂，至OD₆₀₀＝0.1)。培养物在30℃和250rpm下温育16小时，至终OD₆₀₀＝10。从10mL培养物中离心收集细胞，用电穿孔缓冲液(10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl₂，pH 7.5)洗涤一次。然后将细胞重悬浮于温育缓冲液(YPD+25mM DTT，20mMHEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下温育30分钟。离心收集细胞，用电穿孔缓冲液洗涤一次，将其重悬浮于1mL电穿孔缓冲液中。然后将一等份(400μL)细胞转移到一个0.4cm的电穿孔杯(BioRad；USA)中。

用SstI和ApaI消化pVR38，将5μg获得的4.5kbp片段加入电穿孔杯中。然后这些细胞以1.8kV，1000Ω，25μF电穿孔。将电穿孔的细胞转移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下温育4小时，之后选择性接种于含有200μg/mL潮霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的YPD上。这些转化子在37℃下生长3天。将潮霉素抗性转化子在含有300μg/mL G418的新鲜选择平板上重新划线，以确保该菌株含有两种抗性基因。

使用与巨大芽孢杆菌L-LDH基因同源的PCR引物和与潮霉素抗性基因同源的反向引物证实含有巨大芽孢杆菌L-LDH:HPH盒的新4.5kbp片段的整合。BmLDH3(SEQ.ID NO.26)和VR142(SEQ.ID NO.19)用来在含有该盒的菌株中扩增位于巨大芽孢杆菌L-LDH与潮霉素抗性基因之间的1.76kb产物。在不含该盒的菌株中，这些引物不能扩增任何片段。

使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)对转化子菌落进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，53℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。使用上述PCR法分析的9个转化子产生预期的1.76kb PCR产物。

使用与巨大芽孢杆菌L-LDH基因同源的PCR引物以及与G418抗性基因同源的反向引物证实马克斯克鲁维酵母CD162株中已经存在的4.2kbp巨大芽孢杆菌L-LDH:G418基因的存在。BmLDH3(SEQ.ID NO.26)和VR143(SEQ.ID NO.18)用来在含有该盒的菌株中扩增位于巨大芽孢杆菌L-LDH与G418抗性基因之间的1.8kb产物。在不含该盒的菌株中，这些引物不能扩增任何片段。

使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)对转化子菌落进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，53℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。所有9个菌株都产生预期的1.8kb PCR产物。来自这些菌株的基因组DNA与作为探针的巨大芽孢杆菌LDH杂交的Southern印迹分析表明，对于G418和潮霉素盒产生阳性PCR结果的9个转化子中有7个也含有插入基因组内的两个拷贝的巨大芽孢杆菌L-LDH基因。这些菌株中的一个被鉴定为CD355。

实施例2F：摇瓶培养物在YPD+葡萄糖培养基中的L-乳酸产生

重组菌株CD492以实施例1K所述的通用方法培养。在这些条件下，CD355株产生对映体纯度大于99％的L-乳酸。终滴度为52g/L。容积生产率为1.5g/L/小时。

为了比较，CD 162株在相同条件下培养。与CD162所见相比，L-乳酸产量较低，乙醇产量较高。

实施例2G：摇瓶培养物在YPD+葡萄糖培养基中的L-乳酸产生

355株在一个250mL带挡板的摇瓶中培养，其中含有补充了100g/L葡萄糖的50mL YPD。这些细胞接种到摇瓶中，至OD₆₀₀＝0.1，摇瓶在30℃和250rpm下温育16小时。终pH＜3.1。然后利用YSI分析检测摇瓶的残余葡萄糖，以确保细胞处于指数生长期。然后离心收集4g/L细胞干重当量，将其重悬浮于一个250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了约25g/L葡萄糖的50mL YPD。培养物然后在30℃和70rpm下温育。以不同时间间隔采样，过滤除去细胞。通过HPLC分析培养上清液的葡萄糖、乳酸(盐)、丙酮酸(盐)和乙醇。

产生的L-乳酸对映体纯度大于99％。L-乳酸滴度为12g/L，容积生产率为1.9g/L/小时。当在相同条件下检测CD162株时，乳酸产量较低，而乙醇产量较高。

实施例3A：pBH5a/b质粒的构建，其用于将DNA定向整合到马克斯克鲁维酵母PDC1基因座内

将位于马克斯克鲁维酵母丙酮酸脱羧酶(KmPDC1)基因侧翼的DNA克隆到载体pVR29(实施例1C)内，产生一种载体，用于在KmPDC1基因座处进行定向DNA整合。产生的构建体被命名为pBH5b(图15)。克隆到pBH5b的SbfI限制酶切位点内的一个基因与马克斯克鲁维酵母启动子和终止子有效连接。

以质粒pSO21为模板，使用引物5′-Flank5′：5′-CAA GAA GGTACC CCT CTC TAA ACT TGA ACA-3′(SEQ.ID NO.27)和5′-Flank3′：5′-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTTGG-3′(SEQ.ID NO.28)，PCR扩增位于马克斯克鲁维酵母PDC1直接上游的DNA的1254bp片段。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，共35个循环，最后72℃温育7min。用0.8％琼脂糖凝胶分离1254bp PCR产物。该PCR产物和pVR29质粒(实施例1C)均用KpnI和SbfI消化。消化的PCR产物与5067bp pVR29片段连接，产生6315bp pBH5a(图15)。pBH5a质粒含有与酿酒酵母ScPDC1启动子和ScGAL10终止子有效连接的G418抗性基因，和与马克斯克鲁维酵母PDC1基因直接上游的DNA同源的DNA的1240bp片段。

以质粒pSO21为模板，使用引物3′-Flank 5′：5′-CCA AGC CCTGCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3′(SEQ.ID NO.29)和3′-Flank3′：5′-CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAACAA-3′(SEQ.ID NO.30)，PCR扩增位于马克斯克鲁维酵母PDC1直接下游的DNA的535bp片段。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，共35个循环，最后72℃温育4min。用0.8％琼脂糖凝胶分离PCR产物，分离到535bp的产物。529bp PCR产物用SbfI和MluI消化，该片段与pBH5a的SbfI-MluI片段连接，产生质粒pBH5b(图15)。pBH5b质粒含有位于马克斯克鲁维酵母PDC1基因直接上游的1.2kb DNA和直接下游的0.5kb DNA，在侧翼PDC1序列之间有一个唯一的SbfI位点，以及与酿酒酵母ScPDC1启动子和ScGAL10终止子有效连接的选择性G418抗性标记。

实施例3B：pBH8质粒的构建，其用于将瑞士乳杆菌L-LDH基因定向整合到马克斯克鲁维酵母的KmPDC1基因座内

将来自瑞士乳杆菌的L-乳酸脱氢酶基因克隆到pBH5b(实施例3A)的SbfI位点内，产生一种载体，该载体能够将瑞士乳杆菌L-LDH整合到马克斯克鲁维酵母的KmPDC1基因座内，并且使用内源马克斯克鲁维酵母KmPDC1启动子和终止子表达瑞士乳杆菌L-LDH。

以pPS9(实施例1D)为模板，使用引物L-LDH 5′：5′-ACA AATCCT GCA GGA TGG CAA GAG AGG AAA AA-3′(SEQ.ID NO.31)和L-LDH 3′：5′-TAT CTA CCT GCA GGT CAT TGA CGA ACC TTAAC-3′(SEQ.ID NO.32)，PCR扩增瑞士乳杆菌L-LDH基因。使用Failsafe PCR系统(Epicentre，Madison，WI)进行热循环：94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，共30个循环，最后72℃温育4min。用0.8％琼脂糖凝胶分离971bp PCR产物。PCR产物用SbfI消化，将其与SbfI消化的pBH5b的6844bp片段连接，产生7824bp质粒pBH8(图16)。pBH8含有与马克斯克鲁维酵母KmPDC1启动子和终止子有效连接的瑞士乳杆菌L-LDH基因，以及与酿酒酵母ScPDC1启动子和ScGAL10终止子有效连接的G418抗性标记。

实施例3C：通过pBH8向KmPDC1基因座内的整合，马克斯克鲁维酵母CD606株的构建

用pBH8质粒(实施例3B)转化野生型马克斯克鲁维酵母。将整个pBH8质粒整合到CD21的KmPDC1基因座内，位于pBH8的瑞士乳杆菌L-LDH基因直接上游的侧翼KmPDC1 DNA与马克斯克鲁维酵母染色体上KmPDC1基因直接上游的DNA之间。产生的菌株被命名为CD606，含有野生型拷贝的KmPDC1以及在KmPDC1基因座处整合的一个拷贝的pBH8。

在一个250mL带挡板的摇瓶中，用CD21接种补充了100g/L葡萄糖的50mL YPD培养基(含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖和2％琼脂)，至OD₆₀₀＝0.1。培养物在30℃和250rpm下温育16小时，至终OD₆₀₀＝12。从10mL培养物中离心收集细胞，用电穿孔缓冲液(电穿孔缓冲液：10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl₂，pH 7.5)洗涤一次。然后将细胞重悬浮于温育缓冲液(YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH 8.0)中，在30℃和250rpm下温育30分钟。离心收集细胞，用电穿孔缓冲液洗涤一次，将其重悬浮于1mL电穿孔缓冲液中。然后将一等份(400μL)细胞转移到一个0.4cm的电穿孔杯中。将总体积为50μL的12μg未酶切的pBH8加入杯中，这些细胞以1.8kV，1000Ω，25μF电穿孔。将电穿孔的细胞转移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下温育4小时，之后选择性接种于含有300μg/mL G418的YPD上。这些转化子在37℃下温育2天，在新鲜选择平板上重新划线。

pBH8向位于pBH8的瑞士乳杆菌L-LDH基因直接上游的侧翼KmPDC1 DNA与马克斯克鲁维酵母染色体上KmPDC1基因直接上游的DNA之间的KmPDC1基因座内的适当整合，用引物PDC1染色体5′：5′-AAG CAC CAA GGC CTT CAA CAG-3′(SEQ.ID No.33)和L-LDH 3′：5′-TCG ATA TCG CTA AGG AAC GCG-3′(SEQ.ID NO.34)证实。这些引物用来扩增2.7kb产物，其位于KmPDC1基因上游且掺入pBH8中的同源区之外的染色体DNA与瑞士乳杆菌L-LDH基因之间。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。PCR分析的10个转化子中有4个产生预期的2.7kb PCR产物。

使用用来扩增KmPDC1基因座的引物PDC1 5′5′-CGC AAA GAAAAG CTC CAC ACC-3′(SEQ.ID NO.35)和PDC1 3′5′-CCC ATACGC TTA TAA TCC CCC-3′(；SEQ.ID NO.36)进行PCR，产生两种产物。一种产物是对应于马克斯克鲁维酵母PDC1的1.7kb片段，第二种产物是对应于瑞士乳杆菌L-LDH的1.0kb片段。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃温育5min。使用G418抗性基因编码区作为探针，通过Southern印迹分析进一步证实单拷贝整合。所分析的3个转化子中有1个显示与一个pBH8拷贝整合相一致的适当带型。通过PCR和Southern分析证实，在KmPDC1基因座处含有一个pBH8拷贝的菌株，被命名为CD606。

这些结果表明，转化的pBH8DNA向CD21的KmPDC1基因座内的定向整合在KmPDC1启动子序列之间发生。

实施例3D：由马克斯克鲁维酵母CD606株构建CD607株和CD608株

CD606在非选择性培养基上繁殖数轮，以利于靶PDC1基因的删除。分离一种菌株，其中KmPDC1基因已经被替换为瑞士乳杆菌L-LDH基因。该菌株也不含G418抗性标记基因，显示G418敏感表型，通过在G418存在下的生长抑制得到证实；neo^R基因的丢失通过Southern印迹分析证实。另外，该菌株也不能够厌氧生长。

将CD606接种于YPD琼脂平板上，在37℃下培养过夜约16小时。将一个菌落拭子转移到新鲜的YPD琼脂平板上。该过程重复4次。在YPD琼脂平板上进行第5轮非选择性培养后，由第5轮非选择性生长的CD606平板接种6个250mL带挡板的摇瓶，至OD₆₀₀＝0.1，摇瓶中含有补充了100g/L葡萄糖和42g/L CaCO₃的50mL YPD。摇瓶在30℃和250rpm下温育16小时。然后通过将豌豆大小的菌落拭子连续稀释到PBS(磷酸缓冲液)中，稀释培养物。豌豆大小的菌落拭子的最初悬液在1ml PBS中的10-5、10-6、10-7稀释液在YPD琼脂平板上使用。

将在YPD平板上第5轮非选择性生长的另外一个菌落拭子悬浮于1mL PBS(磷酸缓冲液；137mN NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄ pH 7.4)中，随后稀释，用单菌落接种YPD琼脂平板。将单菌落接种于YPD琼脂上，置于一个厌氧培养室[Becton Dickinson，“GasPak System”，使用三个气囊]中，按照厂商说明使用。在37℃下生长2天后，打开厌氧培养室，标记厌氧生长的菌落。平板在37℃下再温育一天。将需氧而不是厌氧生长的菌落转移到三份平板上进行筛选。使用的筛选条件是需氧YPD平板、厌氧YPD平板和补充了300μg/mLG418的YPD平板。鉴定了两个转化子，其具有希望的G418敏感表型，不能厌氧生长，被命名为CD607和CD608。

使用引物PDC1 5′(SEQ.ID NO.35)和PDC1 3′(SEQ.ID NO.36)证实KmPDC1被瑞士乳杆菌L-LDH的替换。以来自CD607和CD608的DNA为模板，用这些引物扩增PDC1基因座。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃温育5min。两个菌株的染色体DNA产生对应于瑞士乳杆菌L-LDH的1.0kb PCR产物。使用用来杂交G418基因的G418基因的完整编码区作为探针进行Southern印迹分析，表明PCR产物不含G418基因。使用KmPDC1编码探针的Southern分析显示没有条带，表明没有用来杂交KmPDC1直接上游和下游区域的KmPDC1编码序列探针。使用的探针是与PDC1基因直接上游和下游的染色体区域同源的DNA片段。用寡聚体5′探针＝CA110和CA111；3′探针＝CA112和CA113经PCR扩增探针，产生大小与KmPDC1被瑞士乳杆菌L-LDH置换相一致的条带。

这些结果表明，CD606的染色体中丢失了KmPDC1基因以及含有与酿酒酵母ScPDC1启动子和ScGAL10终止子连接的G418抗性标记的pBH8质粒骨架，产生一种菌株，其中KmPDC1基因被侧翼为SbfI位点的瑞士乳杆菌L-LDH基因准确替换。

实施例3E：CD607在复杂CaCO₃缓冲培养基中的L-乳酸产生

CD607株在一个250mL带挡板的摇瓶中培养，其中含有补充了100g/L葡萄糖和50g/L CaCO₃的50mL YPD培养基，由YPD琼脂平板接种至OD₆₀₀＝0.1，之后在30℃和250rpm下培养16小时。在确定摇瓶中含有残余葡萄糖，因此细胞处于指数生长期后，离心收集4g/L细胞干重当量，将其重悬浮于一个250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了100g/L葡萄糖和50g/L CaCO₃的50mL YPD。培养物在30℃和70rpm下温育(48小时)。在不同时间(0、8、24、48小时间隔)采样，过滤除去细胞。通过HPLC分析培养上清液的葡萄糖、乳酸(盐)、丙酮酸(盐)和乙醇。

24小时后，CD607株消耗了59-61g/L葡萄糖，产生58-60g/L乳酸(盐)和0.3g/L丙酮酸(盐)。48小时后，CD607株消耗了101-104g/L葡萄糖，产生了94-99g/L乳酸(盐)和0.4g/L丙酮酸(盐)。这些乳酸滴度代表微需氧生产阶段基于葡萄糖的90-98％的乳酸收率，和大于2.1g/L/hr的容积生产率。48小时后，由于培养物中产生高水平的乳酸盐，形成一种不可溶的乳酸钙沉淀(“结块”)，妨碍了进一步的分析。乳酸盐酶分析显示，乳酸(盐)是对映体纯度大于99％的L-乳酸(盐)。在CD607的培养物中未检测到乙醇，因此表明只有一个拷贝的PDC1被一个L-LDH替换。

与之相比，CD 606株(含有PDC基因和瑞士乳杆菌L-LDH基因)在相同发酵条件下消耗了124g/L葡萄糖，产生83g/L乳酸(盐)、20g/L乙醇和0.2g/L丙酮酸(盐)。

实施例3F：在不添加缓冲剂的复杂培养基中，游离L-乳酸的产生

CD607株在一个250mL带挡板的摇瓶中培养，其中含有补充了100g/L葡萄糖的50mL YPD培养基，由YPD琼脂平板接种至OD₆₀₀＝0.1，之后在30℃和250rpm下培养16小时。在确定摇瓶中含有残余葡萄糖，因此细胞处于指数生长期后，离心收集2g/L细胞干重当量，将其重悬浮于一个250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了另外40g/L葡萄糖的50mL YPD。培养物在30℃和70rpm下温育(72小时)。在不同时间(在开始生产后0、24、47、72小时)采样。通过HPLC分析培养样品的葡萄糖、乳酸(盐)(总和游离酸)、丙酮酸(盐)、甘油、乙酸(盐)和乙醇。在生产开始和结束时测定pH。

72小时后，CD607株消耗了10.8g/L葡萄糖，产生9.1g/L乳酸(盐)、0.5g/L乙酸(盐)和1.2g/L丙酮酸(盐)。这些乳酸滴度代表微需氧生产阶段基于葡萄糖的84％的乳酸收率，和大于0.1g/L/hr的容积生产率。乳酸(盐)酶分析显示，乳酸(盐)是对映体纯度大于99％的L-乳酸(盐)。在CD607株的培养物中未检测到乙醇。另外，也未检测到甘油。在生产阶段，由于有机酸的产生，培养液的pH由6.50降为3.05。通过HPLC测定游离乳酸(质子化乳酸)，发现9.1g/L游离乳酸，表明CD607产生的所有乳酸基本上都是质子化形式。

应当理解，上述公开内容强调了本发明的某些具体实施方案，与之相当的所有修饰和改变都在如权利要求书所述的本发明的精神和范围之内。此处引用的所有参考文献均全文引用作为参考。

序列表

<110>Cargill Dow Polymers LLC

Hause，Ben

Rajgarhia，Vineet

Suominen，Pirkko

<120>在酵母中生产L-乳酸的方法和材料

<130>00-1237-p

<150>US 60/384,333

<151>2002-05-30

<160>38

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>848

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>1

gcggccgcgg atcgctcttc cgctatcgat taattttttt ttctttcctc tttttattaa 60

ccttaatttt tattttagat tcctgacttc aactcaagac gcacagatat tataacatct 120

gcacaatagg catttgcaag aattactcgt gagtaaggaa agagtgagga actatcgcat 180

acctgcattt aaagatgccg atttgggcgc gaatccttta ttttggcttc accctcatac 240

tattatcagg gccagaaaaa ggaagtgttt ccctccttct tgaattgatg ttaccctcat 300

aaagcacgtg gcctcttatc gagaaagaaa ttaccgtcgc tcgtgatttg tttgcaaaaa 360

gaacaaaact gaaaaaaccc agacacgctc gacttcctgt cttcctattg attgcagctt 420

ccaatttcgt cacacaacaa ggtcctagcg acggctcaca ggttttgtaa caagcaatcg 480

aaggttctgg aatggcggga aagggtttag taccacatgc tatgatgccc actgtgatct 540

ccagagcaaa gttcgttcga tcgtactgtt actctctctc tttcaaacag aattgtccga 600

atcgtgtgac aacaacagcc tgttctcaca cactcttttc ttctaaccaa gggggtggtt 660

tagtttagta gaacctcgtg aaacttacat ttacatatat ataaacttgc ataaattggt 720

caatgcaaga aatacatatt tggtcttttc taattcgtag tttttcaagt tcttagatgc 780

tttctttttc tcttttttac agatcatcaa ggaagtaatt atctactttt tacaacaaat 840

ctagaatt 848

<210>2

<211>376

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>2

gtagatacat tgatgctatc aatccagaga actggaaaga ttgtgtagcc ttgaaaaacg 60

gtgaaactta cgggtccaag attgtctaca gattttcctg atttgccagc ttactatcct 120

tcttgaaaat atgcactcta tatcttttag ttcttaattg caacacatag atttgctgta 180

taacgaattt tatgctattt tttaaatttg gagttcagtg ataaaagtgt cacagcgaat 240

ttcctcacat gtagggaccg aattgtttac aagttctctg taccaccatg gagacatcaa 300

aaattgaaaa tctatggaaa gatatggacg gtagcaacaa gaatatagca cgagccgcgg 360

atttatttcg ttacgc 376

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PSPDCS1引物

<400>3

ccatcgataa caagctcatg caaagag 27

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PSPDCAS2引物

<400>4

gctctagatt tgactgtgtt attttgcg 28

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′G片段引物

<400>5

gctctagatg agccatattc aacgggaaac 30

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′G片段引物

<400>6

atggatcctt agaaaaactc atcgagcatc 30

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′HYGXBA1引物

<400>7

aagctctaga tgaaaaagcc tgaactcac 29

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′HYGBAMH1引物

<400>8

cgcggatccc tattcctttg ccctcggac 29

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PS15S引物

<400>9

gctctagaat tatggcaaga gaggaaaaac 30

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PS16AS引物

<400>10

cgggatcctc attgacgaac cttaacg 27

<210>11

<211>92

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>fwd HES寡

<400>11

cccaagcttg aattccccgg gggatccctg cagggtacca cgcgtagatc tactagtgcg 60

gccgcctcga gtctagaggg cccaagcttg gg 92

<210>12

<211>91

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>[SO1][CMA2]寡

<400>12

ccaagcttgg gccctctaga ctcgaggcgg ccgcactagt agatctacgc gtggtaccct 60

gcagggatcc cccggggaat tcaagcttgg g 91

<210>13

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO22引物

<400>13

ccgggatcca tggcaagaga ggaaaaacct c 31

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO23引物

<400>14

ccaagatctt tattgacgaa ccttaacgcc ag 32

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR1引物

<400>15

atccatggca agtattacgg ataaggatca ccaa 34

<210>16

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR2引物

<400>16

atcacgaagt gtcacgtacg ggtttcgatg tc 32

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR146引物

<400>17

gctgactacc cagattgtaa ggatg 25

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>VR143引物

<400>18

ctgccagcgc atcaacaata ttttcac 27

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR142引物

<400>19

ctgccagcgc atcaacaata ttttcac 27

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>BM1270引物

<400>20

cctgagtcca cgtcattatt c 21

<210>21

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>BM179引物

<400>21

tgaagctatt tattcttgtt ac 22

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Bmeg5′引物

<400>22

gctctagatg aaaacacaat ttacacc 27

<210>23

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Bmeg3′引物

<400>23

atggatcctt acacaaaagc tctgtcgc 28

<210>24

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G5′引物

<400>24

aaatctagat gagccatatt caacggga 28

<210>25

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G3′引物

<400>25

ccggatcctt agaaaaactc atcgagcat 29

<210>26

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>BmLDH3引物

<400>26

gtacgcatta ccaaggctat tttagat 27

<210>27

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′-侧翼5′引物

<400>27

caagaaggta cccctctcta aacttgaaca 30

<210>28

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′-侧翼3′引物

<400>28

gtaattcctg caggtgcaat tatttggttt gg 32

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′-侧翼5′引物

<400>29

ccaagccctg caggagaggg agaggataaa ga 32

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′-侧翼 3′引物

<400>30

ctcgtaacgc gtgtacaagt tgtggaacaa 30

<210>31

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1-LDH 5′引物

<400>31

acaaatcctg caggatggca agagaggaaa aa 32

<210>32

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1-LDH 3′引物

<400>32

tatctacctg caggtcattg acgaacctta ac 32

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1引物

<400>33

aagcaccaag gccttcaaca g 21

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1-LDH 3′引物

<400>34

tcgatatcgc taaggaacgc g 21

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1 5′引物

<400>35

cgcaaagaaa agctccacac c 21

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1 3′引物

<400>36

cccatacgct tataatcccc c 21

<210>37

<211>1235

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>37

ggccgcggat cgctcttccg ctatcgatta attttttttt ctttcctctt tttattaacc 60

ttaattttta ttttagattc ctgacttcaa ctcaagacgc acagatatta taacatctgc 120

acaataggca tttgcaagaa ttactcgtga gtaaggaaag agtgaggaac tatcgcatac 180

ctgcatttaa agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt ttggcttcac cctcatacta 240

ttatcagggc cagaaaaagg aagtgtttcc ctccttcttg aattgatgtt accctcataa 300

agcacgtggc ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc gtgatttgtt tgcaaaaaga 360

acaaaactga aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct tcctattgat tgcagcttcc 420

aatttcgtca cacaacaagg tcctagcgac ggctcacagg ttttgtaaca agcaatcgaa 480

ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta tgatgcccac tgtgatctcc 540

agagcaaagt tcgttcgatc gtactgttac tctctctctt tcaaacagaa ttgtccgaat 600

cgtgtgacaa caacagcctg ttctcacaca ctcttttctt ctaaccaagg gggtggttta 660

gtttagtaga acctcgtgaa acttacattt acatatatat aaacttgcat aaattggtca 720

atgcaagaaa tacatatttg gtcttttcta attcgtagtt tttcaagttc ttagatgctt 780

tctttttctc ttttttacag atcatcaagg aagtaattat ctacttttta caacaaatct 840

agaattcgga tccggtagat acattgatgc tatcaatcaa gagaactgga aagattgtgt 900

aaccttgaaa aacggtgaaa cttacgggtc caagaccctc tacagatttt cctgatttgc 960

cagcttacta tccttcttga aaatatgcac tctatatctt ttagttctta attgcaacac 1020

atagatttgc tgtataacga attttatgct attttttaaa tttggagttc agtgataaaa 1080

gtgtcacagc gaatttcctc acatgtagga ccgaattgtt tacaagttct ctgtaccacc 1140

atggagacat caaagattga aaatctatgg aaagatatgg acggtagcaa caagaatata 1200

gcacgagccg cggatttatt tcgttacgca tgcgc 1235

<210>38

<211>1314

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>38

ggccgcggat cgctcttccg ctatcgataa caagctcatg caaagaggtg gtacccgcac 60

gccgaaatgc atgcaagtaa cctattcaaa gtaatatctc atacatgttt catgagggta 120

acaacatgcg actgggtgag catatgttcc gctgatgtga tgtgcaagat aaacaagcaa 180

ggcagaaact aacttcttct tcatgtaata aacacacccc gcgtttattt acctatctct 240

aaacttcaac accttatatc ataactaata tttcttgaga taagcacact gcacccatac 300

cttccttaaa aacgtagctt ccagtttttg gtggttccgg cttccttccc gattccgccc 360

gctaaacgca tatttttgtt gcctggtggc atttgcaaaa tgcataacct atgcatttaa 420

aagattatgt atgctcttct gacttttcgt gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat 480

ttatgaattt gagaacaatt ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcaatcaa 540

ttgaggattt tatgcaaata tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt acttttcttc 600

ataattgcat aatattgtcc gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt gatctacttg 660

ctatcgttca acaccacctt attttctaac tatttttttt ttagctcatt tgaatcagct 720

tatggtgatg gcacattttt gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaaaaaa 780

atatataaac aaggctcttt cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt 840

ttcatatttc ttgtcatatt cctttctcaa ttattatttt ctactcataa cctcacgcaa 900

aataacacag tcaaatctag aattcggatc cggtagatac attgatgcta tcaatccaga 960

gaactggaaa gattgtgtag ccttgaaaaa cggtgaaact tacgggtcca agattgtcta 1020

cagattttcc tgatttgcca gcttactatc cttcttgaaa atatgcactc tatatctttt 1080

agttcttaat tgcaacacat agatttgctg tataacgaat tttatgctat tttttaaatt 1140

tggagttcag tgataaaagt gtcacagcga atttcctcac atgtagggac cgaattgttt 1200

acaagttctc tgtaccacca tggagacatc aaaaattgaa aatctatgga aagatatgga 1260

cggtagcaac aagaatatag cacgagccgc ggatttattt cgttacgcat gcgc 1314

Claims

1.一种用于转化酵母种的细胞之重组核酸，其包含与LDH基因上游和下游侧翼序列共价连接的对于该酵母种而言外源的LDH基因，该侧翼序列分别与对于该酵母种天然的靶基因的上游和下游侧翼序列同源，并且含有至少一个选择性标记，其中所述靶基因是丙酮酸脱羧酶基因。

2.权利要求1的重组核酸，其中所述LDH基因上游的侧翼序列包括与靶基因启动子序列同源的启动子序列，该LDH基因下游的侧翼序列包括靶基因的终止序列。

3.权利要求2的重组核酸，其中所述选择性标记与启动子和终止序列有效连接。

4.权利要求3的重组核酸，其中所述选择性标记不打断上游侧翼序列、LDH基因和下游侧翼序列的序列。

5.权利要求1的重组核酸，其中所述外源乳酸脱氢酶基因来自于瑞士乳杆菌(L.helveticus)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。

6.含有权利要求1的重组核酸的酵母种的重组细胞，其中该酵母种在其基因组的基因座内含有靶基因，其中所述靶基因是丙酮酸脱羧酶基因，该细胞具有整合到其基因组内的外源乳酸脱氢酶基因，其处于靶基因的启动子和终止序列的功能部分的转录控制之下，LDH基因在靶基因的基因座处整合，而该靶基因被从细胞基因组中删除。

7.权利要求6的细胞，它是酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)或Yamadazyma之一的一个种。

8.权利要求7的细胞，其中所述酵母种是马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、乳酸克鲁维酵母(K.lactics)或C.sonorensis。

9.权利要求6的细胞，其中乳酸脱氢酶基因来源于瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌。

10.一种将外源乳酸脱氢酶基因整合到细胞内的方法，其中在整合之前，该细胞在其基因组的基因座处含有一个靶基因，其中所述靶基因是丙酮酸脱氢酶基因，该方法包括下列步骤：(a)用根据权利要求1的重组核酸转化该细胞，该核酸具有乳酸脱氢酶(LDH)基因、LDH基因上游和下游的侧翼序列和至少一个选择性标记基因，该侧翼序列与靶基因上游和下游的侧翼序列同源，使得LDH基因在单交换事件中插入该细胞的基因组内，与靶基因的基因座相邻，(b)选择含有LDH基因和选择性标记基因的第一种转化子，(c)非选择性培养所述第一种转化子，和(d)在所述第一种转化子中选择含有LDH基因但是删除了选择性标记基因和靶基因的第二种转化子。

11.权利要求10的方法，其中所述LDH基因上游的侧翼序列包括与靶基因的启动子序列同源的启动子序列，并且该LDH基因下游的侧翼序列包括靶基因的终止序列。

12.权利要求10的方法，其中所述载体还包含与启动子和终止序列有效连接的标记基因。

13.权利要求12的方法，其中与标记基因有效连接的启动子和终止序列对于该酵母菌株而言不是天然的。

14.马克斯克鲁维酵母种的根据权利要求6的重组细胞，其具有整合到其基因组内的多个外源乳酸脱氢酶基因，各自处于功能启动子和终止序列的控制之下，其中该马克斯克鲁维酵母细胞的基因组还含有功能丙酮酸脱羧酶基因。

15.权利要求14的细胞，其中所述功能丙酮酸脱羧酶基因对于马克斯克鲁维酵母而言是天然的。

16.权利要求15的细胞，其中所述功能丙酮酸脱羧酶基因是PDC1基因。

17.权利要求16的细胞，其中所述外源乳酸脱氢酶基因来源于瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌。

18.权利要求17的细胞，其含有多个拷贝的来源于瑞士乳杆菌的乳酸脱氢酶基因。

19.权利要求17的细胞，其含有来源于巨大芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因的多个拷贝。

20.权利要求17的细胞，其含有来源于瑞士乳杆菌的乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝和来源于巨大芽孢杆菌的乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝。

21.权利要求18的细胞，其中乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝处于TEF1启动子的转录控制之下。

22.权利要求19的细胞，其中乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝处于TEF1启动子的转录控制之下。

23.权利要求18的细胞，其中乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝处于PGK启动子的转录控制之下。

24.权利要求19的细胞，其中乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝处于PGK启动子的转录控制之下。

25.权利要求18的细胞，其中乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝处于GAL10终止子的转录控制之下。

26.权利要求19的细胞，其中乳酸脱氢酶基因的至少一个拷贝处于GAL10终止子的转录控制之下。

27.权利要求20的细胞，其中至少一个乳酸脱氢酶基因处于TEF1启动子的转录控制之下。

28.权利要求20的细胞，其中至少一个乳酸脱氢酶基因处于PGK启动子的转录控制之下。

29.权利要求20的细胞，其中至少一个乳酸脱氢酶基因处于GAL10终止子的转录控制之下。

30.一种将糖发酵为乳酸的方法，其包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的糖的培养基中培养权利要求6的细胞。

31.权利要求30的方法，其中在整个发酵过程中，培养基的pH保持在pH5-pH8的范围内。

32.权利要求30的方法，其中在发酵过程中由于细胞产生乳酸，培养基的pH降到2.5-5.0。

33.权利要求31的方法，其中在发酵过程中由于细胞产生乳酸，培养基的pH降至2.5-3.8。

34.权利要求30的方法，它还包括将至少一部分乳酸转化为与丙交酯的步骤。

35.权利要求34的方法，它还包括聚合丙交酯形成聚丙交酯聚合物或共聚物的步骤。

36.一种将糖发酵为乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的糖的培养基中培养权利要求14的细胞。

37.权利要求36的方法，其中在整个发酵过程中，培养基的pH保持在pH5-pH8的范围内。

38.权利要求36的方法，其中在发酵过程中由于细胞产生乳酸，培养基的pH降至2.5-5.0。

39.权利要求38的方法，其中在发酵过程中由于细胞产生乳酸，培养基的pH降至2.5-3.8。