UA80976C2 - Processes and materials for production of d-lactic acid in yeast - Google Patents

Processes and materials for production of d-lactic acid in yeast Download PDF

Info

Publication number
UA80976C2
UA80976C2 UA20041210933A UA20041210933A UA80976C2 UA 80976 C2 UA80976 C2 UA 80976C2 UA 20041210933 A UA20041210933 A UA 20041210933A UA 20041210933 A UA20041210933 A UA 20041210933A UA 80976 C2 UA80976 C2 UA 80976C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
gene
lactic acid
promoter
cell according
terminator
Prior art date
Application number
UA20041210933A
Other languages
English (en)
Inventor
Steisey Olson
Original Assignee
Cargill Dow Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cargill Dow Llc filed Critical Cargill Dow Llc
Publication of UA80976C2 publication Critical patent/UA80976C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Опис винаходу
Дана заявка заявляє пріоритет попередньої заявки на |(патент США сер. Моб0/384,333, поданої 30 травня 2 2002р).
Даний винахід був створений за підтримки уряду США згідно з Контрактом Мо ЮЕ-ЕС-36-0005010598 від
Департаменту енергетики. Уряд США має в даному винаході певну частину прав.
Молочна кислота являє собою органічну молекулу, яка може бути одержана шляхом хімічного синтезу або за допомогою процесів ферментації в мікроорганізмах (шляхом біосинтезу). Процеси біосинтезу мають цілий ряд 70 переваг над хімічним синтезом у тому, що стосується вироблення органічних продуктів; це, зокрема, більш висока економічна ефективність процесу, його швидкість, ізомерна чистота і нижча вартість.
О-(або К-)молочна кислота являє собою структурний блок, з якого складаються при їх виготовленні біологічно активні матеріали, включаючи гербіциди і фармацевтичні вироби. Поряд з цим, нові процеси, що знижують вартість Ю-молочної кислоти, дозволяють поширювати її використання на інші сфери ринку хімічної 72 продукції, включаючи, наприклад, пластмаси. О-молочну кислоту можна перетворювати на О-лактид, циклічний конденсат Ю-молочної кислоти, який має широкий діапазон різновидів потенціального застосування, включаючи виготовлення плівок, волокон та інших полімерних виробів. О-лактид може полімеризуватися в полі(ЮО-лактид) (0Б-РГА), полімер, який має властивості, подібні властивостям полі(І -лактиду) (І-РГ А), що використовується в різноманітних прикладних сферах полімерів. Висококристалічний РІА, який сьогодні виробляється фірмою 20 Сагої! Оом/у, як правило, містить І-стереоізомер. Ця високо-іІ - зомерна смола знаходить найбільш загальне застосування на ринку РіА-волокон завдяки її здатності збільшувати міцність волокна щодо розриву, протистояти усадці і підвищувати його робочу температуру до рівня вище температури переходу із високо еластичного стану в склоподібний стан при прикладанні до нього високих напруг. Аналогічних властивостей очікують також від полімерів, що подібним чином є високо-О-ізомерними. Крім того, високо-О-ізомерний полімер с 22 Може бути змішаний з високо-О-зомерним полімером з утворенням стереокомплексу, що має значно вищу Го) температуру плавлення (приблизно, до 2302). Така висока температура плавлення дозволяє використовувати
РІА там, де потребується більш висока термостійкість матеріалу. Однією з можливих сфер застосування таких матеріалів є предмети одягу, де підвищені температури плавлення потребуються для виготовлення тканин, стійких щодо прасувальної обробки. ї-оі 30 О-молочна кислота використовується також як проміжний продукт у хімічній промисловості для виготовлення - гербіцидів і фармацевтичних виробів. Наприклад, Ю-молочна кислота є проміжним продуктом у процесах виготовлення феноксипропіонових і арилоксифеноксипропіонових гербіцидів. б
Відомі процеси біосинтезу у виробництві молочної кислоти мають певні обмеження. Наприклад, природні ав! організми, що є виробниками молочної кислоти, такі, як І асіорасійї, можуть продукувати великі кількості 32 |-молочної кислоти в умовах ферментації. Проте, для ефективного продукування ці організми потребують со складного ферментаційного середовища. Складність ферментаційного середовища підвищує вартість сировинних матеріалів, а також утруднює і робить більш витратним процес відділяння молочної кислоти від цього середовища. Крім того, процеси ферментації, в яких використовуються ці організми, часто наражаються на « інфікування іншими видами, що не продукують молочну кислоту. До сьогоднішнього дня не існувало З7З 70 економічного способу селективного позбавлення таких небажаних штамів. с При використанні зазначених вище організмів величина рН ферментаційного бульйону потрібно підтримувати "з в певних межах, оскільки середовище з низькою рН як в самих бактеріях, так і в бульйоні може інгібувати проліферацію бактерій або викликати загибель клітин. Таке регулювання здійснюється шляхом додавання нейтралізаторів, наприклад, карбонату кальцію у ферментаційний бульйон з утворенням лактату кальцію. Для відновлення молочної кислоти цей лактат кальцію потрібно піддавати обробці сильною, наприклад, сірчаною со кислотою, що з ним реагує, утворюючи молочну кислоту і сульфат кальцію. Отже нездатність цих організмів («в функціонувати за низьких рН спричиняє додаткові витрати на сировинні матеріали і на відходи небажаних побічних продуктів (сульфату кальцію). ї-о В японській заявці Мо2002-136293А фірми Кокаї виведені генетично модифіковані дріжджі, котрі, як -І 50 стверджується авторами, продукують ЮО-молочну кислоту. Ця дріжджова клітина-хазяїн є спеціального типу, що "акумулює" піруват, тобто виробляє значні кількості піруватинту, який більше не піддається метаболізму. с Таким чином, із вищевикладеного ясно, що існує потреба у процесах біосинтезу для вироблення ЮО-молочної кислоти за допомогою організму, який: 1) дозволяв би одержувати молочну кислоту з прийнятними виходом корисного продукту і продуктивністю, 2) потребував би лише спрощеного ферментаційного середовища і 3) 59 дозволяв би використовувати ферментаційне середовище з низькою рН і/або високою температурою, що давало
ГФ) би змогу уникати забруднення, створюваного штамами небажаних мікроорганізмів. т Згідно з одним із аспектів даного винаходу пропонується рекомбінантна дріжджова клітина виду, що у природному стані не акумулює пірувату і містить, принаймні, однин екзогенний О-лактатдегідрогеназний ген, інтегрований в її геном, де ЮО-лакгатдегідрогеназний ген є функціонально зв'язаним з функціональними 60 промоторними і термінаторними послідовностями.
Винаходом також пропонуються рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що кодують ЮО-лактатдегідрогеназний ген, функціонально зв'язаний з функціональними промоторними і термінаторними послідовностями. Рекомбінантні нуклеїнові кислоти за даним винаходом дозволяють експресувати О-лактатдегідрогеназний ген у рекомбінантній дріжджовій клітині. бо Згідно з іншим аспектом даного винаходу пропонується процес вироблення ЮО-молочної кислоти, який включає у себе ферментацію клітини за даним винаходом в умовах, що дозволяють здійснювати біосинтез
О-молочної кислоти.
Трансформовані дріжджові клітини є здатними продукувати ЮО-молочну кислоту з виходом корисного продукту, прийнятним для умов промислового виробництва. Ці клітини добре витримують наявність О-молочної кислоти і можуть продовжувати її ефективне продукування, коли ферментаційний бульйон містить значну концентрацію Ю-молочної кислоти. Це явище с цілком несподіваним, оскільки як І-молочна кислота, так і
О-молочна кислота є схильними до інгібування росту і виживаності деяких мікроорганізмів, див. (ей. Аррі.
Місгоріої. 2002;35(3): 1176-80; Зивсерірійу ої ЕвсПпегіспіа сої 0157 апа поп-0157 ізоЇаїев (о |Іасіайе. 7/0 МеУМШіат Гейсп ЕС, Зіемай ССЗ. Аррі. Епмігоп. Місгоріої. 2002 Зер; 68(9):4676-8) У деяких випадках еукаріотичні і бактеріальні клітини на ЮО-молочну кислоту реагують інакше, ніж на І-молочну кислоту |Огівраїгті
У, Оп М5, Саїтоїї НУ, Меадісіпе (Вайітоге) 1998 Маг; 77(2):73-82, "О-Іасійс асідовів: а геміем/ ої сіїпіса! ргезепіайоп, Біоспетіса! Теайшгевз, апа раїйорпузіоЇодіс теспапізтве;" порівн. І ейсп еї аї, зирга).
Переваги й особливості даного винаходу з більшою ясністю й очевидністю випливають із поданих нижче /5 докладного опису винаходу і прикладів його практичного здійснення.
Фіг.1. Плазмідна карта рМС2, що містить РОК-промотор і САЇ 10-термінатор, обидва із виду 5. сегемівіає.
Фіг.2. Плазмідна карта рМсС4, що містить РОС1-промотор і САЇ 10-термінатор, обидва із виду 5. сегемівіає.
Фіг.За. Карта фрагмента Мої! рестрикції 1.235бт.п.н. (тисяча пар нуклеотидів) послідовності, виведеної із
РСК-ампліфікованої хромосомної ОМА клітин 5. сегемівіде, що містить РОК-промотор і САЇ 10-термінатор (5. сегемівіає) і сайт множинного клонування між промотором і термінатором.
Фіг.30. Карта фрагмента Мої! рестрикції 1.235бт.п.н. (тисяча пар нуклеотидів) послідовності, виведеної із
РСК-ампліфікованої хромосомної ОМА клітин 5. сегемізіае, що містить РОС1-промотор і САЇ 10-термінатор (5. сегемізіае) і сайт множинного клонування між промотором і термінатором.
Фіг4. Плазмідна карта рМкК24, що містить І--(ОН виду В. тедаїйегішт, функціонально зв'язаний з сч дв РОК-промотором і СА! 10-термінатором із виду 5. сегемізіае.
Фіг5. Плазмідна карта рМмК22, що містить маркер стійкості до (3418, функціонально зв'язаний з і)
РОК-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемізіає.
Фіг.6. Плазмідна карта рМС7У, що містить ГОН-ген із виду в. тедаїегішті функціонально зв'язаний з
РОК-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемізіає. Ге зо Фіг.7А-В. А) Плазмідна карта реО21, що містить РОСТІ із клітин К. тагхіапив; і В) плазмідна карта р5о27, що містить З,З3Ко (т.п.н.) фрагмент РОС1-промотора (К. тагхіапив), що містить 5'-ділянку зліва від локусу -
РОСТ; і Фіг.8. Плазмідна карта рО28, що містить делецію на РОС1-кодуючій ділянці, що міститься в плазміді Ге! рзо21, і ген стійкості до (3418, функціонально зв'язаний з РОК-промотором і ЗАМ О-термінатором із клітин 5. сегемівіае. о
Фіг.9. Плазмідна карта рео29, що містить делецію на РОС7-кодуючій ділянці, що міститься в плазміді рео21, со і ген стійкості до зеоцину, функціонально зв'язаний з ТЕР1-промотором і Тсус7-термінатором із клітин 5. сегемівіае (із. РТЕРІ/7ео; Іпмийгодеп).
Фіг.10. Плазмідна карта рР5БІ, що містить ген стійкості до гігроміцину (при) із виду Е Соїї, функціонально зв'язаний з РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемізіае. «
Фіг.11а. Плазмідна карта рУкаЗ, що містить 0-І ОН-ген із виду Г.. пеїмейісив. шщ с Фіг.115. Плазмідна карта рукК44, що містить ЮБ-ЇОН-ген із виду ГГ. Неїмеїйїсиз із сайтами ХбБаї і Ватні й відповідно на 5'- і 3'-кінцях цього гена. «» Фіг.12. Плазмідна карта румкК47, що містить О-ІОН-ген із виду Ї. Пеїмейсиз із РОК-промотором і СА. 70-термінатором із виду 5. сегемівзіає.
Фіг.13. Плазмідна карта рукК48, що містить Б-ЇОН-ген із виду /. Неїмейсиз, функціонально зв'язаний з о РОК-промотором і САЇ 70-термінатором із виду 5. сегемізіае, і прі-ген стійкості до гігроміцину, функціонально зв'язаний з РОС7-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемізіае. о Фіг.14. Плазмідна карта рСАБО, що містить полігенний експресуючий кластер, уставлений між 3- і
Те) 5-фланкуючими ділянками локусу РЮОСІ1 (К. тагхіапив), що містить О-ГОН-ген із виду Ї. Пеїмейісив, функціонально зв'язаний з РОК-промотором і СА 10-термінатором із виду 5. сегемівіає, і при-ген стійкості до
Ше гігроміцину, функціонально зв'язаний з РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемізіае.
Ф Фіг15. Плазмідна карта рмЕк29, що містить (418-маркер стійкості, функціонально зв'язаний з
РОК-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемізіає.
Фіг ба. Плазмідна карта рВНба, що містить 5'-бічну ділянку локусу РОСІ (К. тагхіапив) і окремо - вв (418-ген стійкості, функціонально зв'язаний з РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемівіае.
Фіг.16р5. Плазмідна карта рВН5Ь, що містить бічні ділянки 5'ї 3 локусу РОС1 (К. тагхіапив) і окремо - іФ) с418-ген стійкості, функціонально зв'язаний з РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемівіає. ко Фіг.1бс. Плазмідна карта рВН5с, що містить локус РОСТІ (К. тагхіапив).
Фіг.17. Плазмідна карта рВвВНбЄ, що містить 0-І ОН-ген із І. Пеїмейісив, розташований між 5'- і 3і-фланкуючими бо ділянками локусу РОСІ (К. тагхіапив), і окремо - (3418-ген стійкості, функціонально зв'язаний з
РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором із виду 5. сегемівіає.
Дріжджові клітини за даним винаходом отримуються із видів, які до рекомбінації, здійснюваної у відповідності з даним описом, не акумулюють піруват. Під виразом ї/не акумулюють" пірувату тут мається на увазі те, що дані види не виробляють, принаймні, 10г/л піровиноградної кислоти при культивуванні відповідно б5 до процесу, описаного у Прикладі 5 здійснення Патенту Японії 2000-78996 фірми Кокаї. У загальному випадку дріжджова клітина не акумулює пірувату, коли вона у природному стані містить активний шлях метаболізму, що перетворює піруват на різноманітні продукти метаболізму, такі, як етанол, ацетат або біомаса. Такі дріжджові клітини метаболічно перетворюють піруват настільки швидко, що мала кількість пірувату є наявною усередині клітини в будь-який момент часу, а мала кількість пірувату виділяється секрецією клітини. Кращі дріжджові клітини у природному стані мають один або більше активних піруватдекарбоксилазних (РОС) генів, що продукують піруватдекарбоксилазний білок, який перетворює піруват на етанол. Більш кращими дріжджовими клітинами є такі, що виказують ознаки Крабтри-негативного фенотипу, в якому шлях аеробного метаболізму клітин (дихання і цикл трикарбонових кислот) не інгібується наявністю високої концентрації глюкози. Як приклади підходящих для цього дріжджових клітин можна назвати із родів Сапаїда, Засспаготусев, 7/0 Кісухеготусев, Ріспіа, Напзепиїа. Особливо кращими є клітини із родів Сапаїда і Кіпоухеготусевз. Ще кращими є клітини С. зопогепвів, К. Іасіїв, К. (еготоїіоІегапз і К. тагхіапиз, і найкращими є клітини С зопогепвів і К. тагхіапив.
Рекомбінантні дріжджові клітини за даним винаходом містять, принаймні, один екзогенний 0-ІОН-ген, інтегрований в їхній геном. Іасіорасіййе Пеїмеїйісив, І асіорасійи5 фоппзопії, І асіорасійиз БиЇдапсив,
І асюрасійив аеїргиескії, Іасіобрасійив5 ріапіагит і І асіорасій5 репіозиз є штамами, які мають підходящі
О-лактатдегідрогенази, котрі для застосування згідно з даним винаходом можуть одержуватися, поряд з іншим, за допомогою рекомбінантних методів генної інженерії. Кращим О-лактатдегідрогеназним геном є
Ор-лактатдегідрогеназа клітини |. Неїмеїйсиз. Ця клітина може містити множину екзогенних І ОН-генів, тобто, принаймні, два таких гени, а в кращому варіанті - приблизно 2-10 таких генів, і ще краще - приблизно 2-5 2о таких генів. Включені шляхом інсерції ГОН-гени можуть усі бути однаковими, або ж можуть складатися з двох і більше різних типів І ОН-генів.
Ген, промотор або термінатор вважається "екзогенним" в рамках даного винаходу, якщо (1) його немає усередині геному немодифікованої клітини і (2) він не є гомологічним генетичному матеріалу, наявному в геномі немодифікованої клітини. Ген, термінатор або промотор вважається "нативним" для даного виду дріжджів, якщо сч ов Він (окрім мутацій типу "індивідуальна в індивідуальну", що не впливають на його функції) є всередині геному о даного виду дріжджів.
Екзогенний 0-ЇОН-ген є функціонально зв'язаним з функціональними промоторними і термінаторними послідовностями. Вираз "функціонально зв'язаний" в контексті даного винаходу означає, що промотор або термінатор, про який іде мова, після інтегрування в геном дріжджів керує, відповідно, початком і закінченням Ге зо процесу транскрипції 0-СОН-гена.
Використовуваний тут термін "промотор" означає нетранскрибовану послідовність, яка розташована зліва - (тобто 5) стартового кодона трансляції структурного гена (в загальному випадку на ділянці, приблизно, від 1 Ге! до 10000о.п. краще - від 1 до 500о.п. і ще краще - від 1 до 1000.п.), і керує початком транскрипції структурного гена. Промотор може бути нативним або екзогенним для клітини-хазяїна. Промоторами можуть о бути такі послідовності, що керують експресією генів, залучених до центрального вуглецевого обміну, тобто со гліколітичні промотори або промотори гена циклу трикарбонових кислот. До числа підходящих промоторів належать, наприклад, промотори із дріжджових генів фосфогліцераткінази (РОК), гліцеральдегід-З3-фосфатдегідрогенази (ТОН), піруватдекарбоксилази (РОСТІ), триозофосфатізомерази (ТРІ), енхансерного фактора-1 транскрипції (ТЕБЕ-1), пуринцитозинпермеази (РСРІ З) й алкогольдегідрогенази (АРН), « тощо. Кращими промоторами за даним винаходом є ТЕР-1 (З. сегемівіде), РОК (5. сегемівіде) І РОСТ (5. У с сегемізіае, К. Магхіапив). . У тих випадках практичного здійснення, де потребується інтегрувати 0-І ОН-ген (або гени) в локус-мішень и?» геному дріжджової клітини, промоторна послідовність є гомологічною промоторній послідовності гена, в якому намічена ця інсерція. Таким геном-мішенню в кращому варіанті є піруватдекарбоксилазний (РОС) ген. До числа інших кращих генів-мішеней належать алкогольдегідрогеназа (АСН), оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза (шигаз) і
Го! З-ізопропілмалатдегідрогеназа (Іеи2).
Подібним чином термін "термінатор" означає нетранскрибовану послідовність, яка розташована нижче (тобто о 3) до завершуючого трансляцію кодона структурного гена (в загальному випадку в межах, приблизно, від 1 до
Ге) 1000п.0о., частіше - від 1 до 500п.о. і особливо - в межах 1-100п.0), і керує завершенням транскрипції структурного гена. Термінатор може бути екзогенним або нативним до даного виду дріжджів. Підходящими
Ш- екзогенними термінаторами можуть бути термінатори САЇ 10 ії СУС-1 із 5. сегемізає або інших видів дріжджів.
Ф Як і для промоторів, у деяких варіантах здійснення винаходу дана термінаторна послідовність є гомологічною термінаторній послідовності гена-мішені.
Ген, промотор, термінатор або інший геномний матеріал вважається "гомологічним" іншому геномному матеріалу, якщо він є ідентичним, тобто має принаймні 7595, 8095, 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9690, 9795, 9895 і, приблизно, 9995 ідентичність нуклеотидної послідовності іншому геномному матеріалу, або ж, якщо (Ф) не є ідентичним, то є достатньо подібним йому, тобто зберігає його функцію. Таким чином, генетичний матеріал ка вважається "гомологічним", якщо він містить відмінності, зумовлені, наприклад, точковими мутаціями, делеціями або добавками пар основ за умови, що ці мутації, делеції або добавки не впливають на функції даного бо генетичного матеріалу. У випадку фланкуючих послідовностей гомологія має місце, якщо дана послідовність є достатньо подібною фланкуючій послідовності нативного гена, тобто настількию, що кожна фланкуюча послідовність може входити у взаємодію у поодинокій події кросінговера з фланкуючою послідовністю нативного гена.
Термін "ідентичність" у відповідності із загальноприйнятим його вживанням у даній галузі означає 65 спорідненість між послідовностями двох або більше поліпептидних молекул або двох чи більше молекул нуклеїнових кислот згідно з визначенням шляхом порівняння їхніх послідовностей. При цьому "ідентичність"
також означає ступінь послідовністної спорідненості між молекулами нуклеїнових кислот або поліпептидами залежно від випадку, що розглядається, згідно з визначенням шляхом зіставляння ланцюгів двох чи більше нуклеотидних або двох чи більше амінокислотних послідовностей. "Ідентичність" виміряється відсотком ідентичних збігів між меншими із двох або більше послідовностей з порівняннями пробілів (у разі їх наявності), адресованих специфічною математичною моделлю або комп'ютерною програмою (тобто "алгоритмами").
Термін "подібність" використовується в даній галузі у зв'язку з концепцією, що розглядається, але у протилежність "ідентичності", означає міру спорідненості, що включає у себе як ідентичні збіги, так і збіги 7/0 консервативних заміщень. Якщо дві поліпептидні послідовності мають, наприклад, 10/20 ідентичних амінокислот, а решта їх вся є неконсервативними заміщеннями, то ступінь як ідентичності, так і подібності буде складати 5095. Якщо ж у цьому самому прикладі існує п'ять і більше положень, де є наявними консервативні заміщення, то ступінь ідентичності залишається на рівні 5095, але ступінь подібності буде складати вже 75905 (15/20). Таким чином, у тих випадках, коли існують консервативні заміщення, ступінь подібності між двома поліпептидами буде /5 ВИЩИМ, ніж ступінь ідентичності між цими двома поліпептидами.
Ідентичність і подібність споріднених нуклеїнових кислот і поліпептидів можна легко обчислити за допомогою добре відомих методів. Такі методи описані, наприклад, у (ІСОМРОТАТІОМАЇ МОГЕСИЦІ АК
ВІОГОСУ, (ГезК, А.М., ей), 1988, Охіога Опімегейу Ргезз, Мем ЖМогк; ВІОСОМРИТІМО: ІМЕОКМАТІСЗ АМО
СЕМОМЕ РКОЕСТВ5, (Зтійй, ОЛМУ., ед), 1993, Асадетіс Ргезв, Мем ХогїкК; СОМРИОТЕК АМАЇГ 515 ОЄ БЕООЕМСЕ рАТА, Рай 1, (Огійп, А.М., апа Сгійіп, Н.б., ед»в.), 1994, Нитапа Ргез5, Мем Чегвеу; моп Неїпіє, 0.,
ЗЕОШОЕМСЕ АМАЇ У5ІЗ ІМ МОГЕСОГАК ВІОГОСУ, 1987, Асадетіс Ргезз ЗЕООЕМСЕ АМАЇУ5ІЗ РЕІМЕК, (СтірзКоуУ, М. апа Оемегеих, .)., едв.), 1991, М. (іоскКіоп Ргевзв, Мем/ МогК; Сапіо еї аїЇ., 1988, 5І АМ ..
Аррієа Май., 48:1073 апа Оигріп еї а!., 1998, ВІОГОСІСАЇ ЗЕОШОЄЕМСЕ АМАЇ У5І5, Сатьгідде Опімегейу Ргезві.
Кращими є методи визначення ідентичності, які розраховані на те, щоб давати максимальний збіг між сч ов послідовностями, що аналізуються. Методи визначення ідентичності описані в широкодоступних комп'ютерних програмах. Кращими серед них є методи визначення ідентичності між двома послідовностями, розроблені в і) програмних пакетах СО, включаючи САР |Оемегеих еї аї., 1984, Мисі. Асій. Кев., 12:387; Сепейсв Сотршег
Сгоцр Опімегейу ої Му/ізсопвіп, Мадізоп, УМ, ВГА5БТР, ВІ АБТМ і РАЗТА Ц|АїЇвспші еї аїЇ., 1990, 9. Мої, Віої., 215:403-410). Програма ВІ АЗТХ може бути отримана в Національному центрі біотехнічної інформації (МОВІ) або Ге зо З інших джерел ІВГА5Т Мапиаї! АїЇвспиі еї аі., МСВ/МІМ/МІН Ве(Шезаа, МО 20894; Аїївспиці еї аї., 1990, вирга).
Для визначення ідентичності може використовуватися також добре відомий алгоритм Сміта-Уотермана (Зтіїй -
УУайегтап). Ге!
Деякі схеми порівняння двох амінокислотних або полінуклеотидних послідовностей можуть давати збіг лише короткої ділянки цих двох послідовностей, причому ця невелика ділянка може мати дуже високу послідовністну о ідентичність навіть при незначній спорідненості між цими двома послідовностями повної довжини. Отже, в со деяких випадках практичного здійснення даного винаходу вибраний метод порівняння послідовностей (САР-програма) буде давати порівняння, що охоплює, принаймні, 50 суміжних амінокислот поліпептиду-мішені. В деяких випадках практичного здійснення порівняння може охоплювати, принаймні, 60, 70, 80, 90, 100, 110 або 120 амінокислот поліпептиду-мішені. Якщо полінуклеотиди порівнюються за допомогою САР-програми, то «
Порівняння може охоплювати, принаймні, 100,150 або 200 нуклеотидів, що можуть бути суміжними. з с Наприклад, при використанні алгоритму САР (Сепеїййсв Сотршег Сгоир, Опімегайу ої М/ізсопвіп, Мадівоп, УМ) два поліпептиди, відсоток ідентичності послідовностей яких потребується визначити, порівнюють для ;» оптимального зіставляння їхніх відповідних амінокислот ("інтервал зіставляння", як визначено алгоритмом). У деяких варіантах здійснення винаходу штраф за відкриття пробілу (який обчислюється як помножена на З бередня діагональ; де "середня діагональ" є середнім арифметичним діагоналі використовуваної матриці
Го! порівняння; "діагональ" являє собою підрахунок або число, надане кожному бездоганному збігу амінокислот специфічною матрицею порівняння) і штраф за розширення пробілу (що звичайно складає одну десяту штрафу о за відкриття пробілу), а також матриця порівняння, наприклад, РАМ250О або ВІ ОБИОМ 62 використовуються у со сполученні з алгоритмом. У деяких варіантах здійснення винаходу алгоритмом використовується також 5о стандартна матриця порівняння |(Оаупої еї аї., 1978, АМаз ої Ргоїеіп Зедцепсе апа Зігисійге, 5:345-352
Ш- стосовно матриці порівняння РАМ 250 і ІНепікої еї аІ., 1992, Ргос. Май. Асад. Зсі ОБА, 89:10915-10919)
Ф стосовно матриці порівняння ВІ О5ИМ 621. У деяких варіантах здійснення винаходу до параметрів порівняння поліпептидних послідовностей включають такі:
Алгоритм: (Меедіетап ега/., 1970, 9. Мої Віо!., 48:443-453);
Матриця порівняння: В ОБИМ 62 ІНепікої еї а/., 1992, зирга);
Штраф за пробіл: 12
Ф) Штраф за довжину пробілу: 4 ка Поріг подібності: 0
З цими параметрами може використовуватися САР-програма. Для порівняння нуклеотидних послідовностей бо до параметрів може включатися штраф за пробіл - 50 і штраф за довжину пробілу - 3, який являє собою З за кожний символ у кожному пробілі. В деяких випадках практичного здійснення винаходу вищеперелічені параметри є параметрами за умовчанням для порівняння поліпептидів (разом з відсутністю штрафу за кінцеві пробіли) за допомогою САР-алгоритму.
Дріжджова клітина може мати різноманітні інші модифікації в її природному геномі. Наприклад, вона може 65 містити різноманітні маркерні гени селекції, більш докладно описані нижче, разом із зв'язаними з ними промоторними і термінаторними послідовностями. Дріжджова клітина може також мати делетований РОС-ген або розрив у РОС-гені. Метод делеції РОС разом з інсерцією 0-ЇОН-гена в локусі РОС-гена більш докладно описаний нижче. Інші методи делеції або переривання РОС-активності описані в |Рогго, "Оемеюртепі ої теїароїїсаПйу епдіпеегеай басспаготусевз сегемівіае сеїв їТог (Ше ргодисіоп ої Іасііїс асій", ВіоФесппої Ргсоад. 1995 Мау-уип; 11(3): 294-8; Рого еї аї., "Керіасетепі ої а теїйароїїс раїймжуау їТог Іагде-зсаіе ргодисіоп ої
Іасіїс асій їйот епдіпеегед уеавзів", Арр. Епмігоп. Мегобіої 1999 Зер:65(9):4211-5; Віапспі еї аї., "ЕНісіепі
Потоїасіїс Тегтепіайоп Бу Кінумеготусевз Іасіїв вігаїйпе деїтесіме іп ругимайїе шігайоп апа (гапзіогтей м/п (пе Ппефегоіодоиз І ОН депе", Арр. Епмігоп. Мегобіо! 2001 Оес; 67(12)5621-5; апа М/о 99/14335).
Рекомбінантні дріжджові клітини за даним винаходом можуть бути приготовані шляхом інсерції 7/0 Нуклеїнокислотного фрагмента, що містить 0-ІОН-ген, функціонально зв'язаний з промоторною послідовністю.
Цей фрагмент, як правило, утворює частину рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що може містити, а в кращому варіанті містить також інші елементи, включаючи: (а) термінаторну послідовність; (Б) один або більше маркерних генів селекції (включаючи асоційовані промотор і термінатор); (с) одну або більше гомологічних фланкуючих послідовностей для інсерції даного фрагмента в особливий локус у геномі клітини-хазяїна; (а) один або більше сайтів рестрикції, які дозволяють зрізати фрагмент з утворенням лінійного фрагмента, що містить
ГОН-ген, його промотори і фланкуючі послідовності, маркерні гени і зв'язані з ним промотори і термінатори, і т.д. для інсерції в геном дріжджової клітини; і/або (є) остову частину. Використовуваний тут термін "рекомбінантна нуклеїнова кислота" означає будь-яку молекулу (наприклад, нуклеїнову кислоту, плазміду або вірус), що використовується для перенесення інформації кодування білка в клітину-хазяїн. Фахівцям добре
Відомі методи трансформування клітин, включаючи електропорацію, кальцій-хлоридний і літій-ацетатний методи.
Використовувані в цих трансформаціях ДНК можуть бути як зрізаними, так і незрізаними особливими ферментами рестрикції.
Використовуваний тут термін "маркерні гени селекції" означає генетичний матеріал, що кодує білок, потрібний для виживання і/або росту клітини-хазяїна, вирощуваної в селективному культуральному середовищі. сч об Типові маркерні гени селекції кодують білки, які: (а) надають стійкості до антибіотиків та інших токсинів, наприклад, до зеоцину (ген 85п бБіе із клітин ЗігеріоаПоїеіїспив Піпдивіапив), 5418 (ген із Тп903 стійкості до і) канаміцину), гігроміцину (ген із | Е. сої стійкості до аміноглікозидних антибіотиків), амбіциліну, тетрацикліну або канаміцину для клітин-хазяїнів; (Б) доповнюють ауксотрофні дефіцити клітини і/або постачають критичні живильні речовини, недоступні із простих середовищ, такі, як амінокислотний дефіцит лейцину (ген Ге зо 1 еч2 із К. тагхіапив); або цгаЗ-ген із К. тагхіапив, що дає урацил оротидин-5'і-фосфатдекарбоксилаза-негативним клітинам. До числа кращих маркерів селекції належать, - наприклад, ген стійкості до зеоцину, ген стійкості до (3418 і ген стійкості до гігроміцину. Ге!
Остові частини створюють звичайно із доступних для придбання дріжджових векторів.
Підходящі процеси трансформування дріжджових клітин для інсерції екзогенного І ОН-гена (описані в УУМО о 00/71738А1 і МО 02/42471А1). Ці процеси можуть у загальному випадку застосовуватися для створення со рекомбінантних дріжджових клітин за даним винаходом із заміщенням описаних у зазначених заявках
Г-СОН-генів 0-Г ОН-геном.
Використовуваний тут термін "трансформування" або "трансформація" означає зміну в генетичних характеристиках клітини, а клітина є "трансформованою", коли вона внаслідок її модифікації містить нову « Нуклеїнову кислоту. Так, клітина є трансформованою, якщо вона є генетично модифікованою із її природного Ше) с стану. Наприклад, після трансфекції трансформуюча ДНК у кращому варіанті рекомбінує з клітинною геномною
ДНК шляхом фізичного інтегрування в хромосому цієї клітини. В альтернативному варіанті нуклеїнова кислота ;» може, принаймні, тимчасово (тобто в межах 48-06 годин клітинної трансформації) підтримуватися як епісомний елемент без її реплікації, або ж може незалежно відтворюватися як плазміда. Клітина вважається стабільно трансформованою, якщо дана ДНК інтегрована в дану хромосому і відтворюється при діленні клітини.
Го! Використовуваний тут термін "трансфекція" означає поглинання чужорідної або екзогенної ДНК клітиною, а клітина вважається "трансфікованою", якщо під її мембрану введена екзогенна ДНК. Відомі численні методи о трансфекції, наприклад |Сгапат еї аї., 1973, Мігоїюду 52:456; Затьгоок еї аі., 2001, МО! ЕСОГ АК СІ ОМІМО, А
Ге) ГАВОКАТОКУ МАМОАГ, Соїд 5ргіпу Нагбог І арогафгіеєв; Юамів еї аі., 1986, ВАБІС МЕТНОЮЗ ІМ МОГ ГЕС АК
ВІОГОСУ, ЕїІвеміег; Спи еї аї., 1981, Сепе 13:197). Ці та інші подібні методи можуть використовуватися для - введення одного і більше видів екзогенних ДНК у підходящі клітини-хазяїни.
Ф Множину 0-І ОН-генів можна інтегрувати шляхом проведення множини трансформацій. Поряд з цим можна конструювати рекомбінантну нуклеїнову кислоту, що містить множину 0-І ОН-генів, що дозволяє, таким чином, інтегрувати множину 0-І ОН-генів за одну стадію.
Особливо цікавим при цьому є процес трансформування, спрямований на інсерцію О-ІОН-гена в локусі цільового гена природного походження. Цільовим є будь-який ген, котрий потребується замістити І ОН-геном. (Ф, Кращим цільовим геном є піруватдекарбоксилазний ген, оскільки заміщення його розриває конкурентний шлях, ка що продукує етанол. Крім того, піруватий ген є схильним до активного поводження в дріжджових видах. Отже, інсерція І ОН-гена в геном під контролем РОС-промоторів і термінаторів буде з великою імовірністю продукувати бо Мутант, що добре експресує І ОН. Іншими кращими цільовими генами є АОН, І ец2 і Огаз.
У кращому варіанті дріжджові клітини за даним винаходом трансформуються рекомбінантними нуклеїновими кислотами за даним винаходом, а селекція їх проводиться шляхом вирощування в селективному середовищі, в якому маркер селекції в рекомбінантній нуклеїновій кислоті дозволяє здійснювати переважне вирощування трансформантів. Трансформовані клітини після селекції вирощуються в неселективних умовах. Вирощування в 65 цих умовах дозволяє отримувати рекомбінантні дріжджові клітини, що мають екзогенний 0-І ОН-ген, який містить рекомбінантну нуклеїнову кислоту, інтегровану в генетичний локус цільового гена в дріжджовій хромосомі.
Отримані у відповідності з процесами за даним винаходом ці клітини мають делетований цільовий ген і інтегрований екзогенний 0-І ОН-ген, уставлений у локус цільового гена так, що він є функціонально зв'язаний і перебуває під транскрипційним контролем послідовностей регулювання експресії (таких, як промоторні і термінаторні послідовності) цільового гена. Якщо цільовим є РОС-ген, то клітини, в котрих відбувається делеція РОС, втрачають здатність добре рости в анаеробних умовах. Таким чином, колонії ідентифікованих і селектованих клітин можуть піддаватися селекції шляхом створення для них анаеробних умов. Колонії, що не ростуть, ідентифікуються при цьому як такі, в котрих відбулася делеція РОС. Подібним чином, цільове інтегрування в будь-який інший цільовий ген може ідентифікуватися фенотипом, асоційованим з делецією 7/0 Кожного із цільових генів.
Дріжджова клітина, що отримується в результаті проведення описаного вище процесу, не містить цільового гена і містить екзогенний 0-І ОН-ген, інтегрований в її геном у локусі цільового гена. Цей 0-ІЇ ОН-ген перебуває під транскрипційним контролем промоторної послідовності і термінаторної послідовності, що є гомологічними промоторній і термінаторній послідовностям цільового гена.
Промоторною і термінаторною послідовностями 0-І ОН-ази можуть бути послідовності, що були наявними у фланкуючих послідовностях, які містилися в рекомбінантній нуклеїновій кислоті, використовуваній для трансформування клітини, або ж можуть бути такі, що від самого початку були наявними в геномі клітини в сайті інтегрування. Можливо також, що термінатор цільового гена буде утримуватися з делецією термінаторної послідовності, що була наявною у векторі інтегрування.
Фланкуюча послідовність може безпосередньо прилягати до 0-І ОН-гена або відділятися від нього проміжною послідовністю чи проміжними парами основ, наприклад, інтервалом 1-1000п.о., а краще - 1-100п.о. Фланкуючі послідовності, використовувані в рекомбінантних нуклеїнових кислотах за даним винаходом, у кращому варіанті є гомологічними відповідним фланкуючим послідовностям цільового гена. Довжина типових фланкуючих послідовностей складає, приблизно, від 50 до 4000п.о., у кращому варіанті - приблизно від 100 до 2000п.о. і в сч особливо кращому варіанті - приблизно 1200п.о. Фланкуючі послідовності у кращому варіанті містять промоторну (термінаторну у випадку правої фланкуючої послідовності) послідовність, гомологічну відповідній послідовності і) цільового гена.
У кращих варіантах здійснення винаходу фланкуючі послідовності є гомологічними і містять, відповідно, промоторні і термінаторні послідовності для нативних дріжджів. У найкращому варіанті здійснення винаходу Ге зо Інтегрування рекомбінантної нуклеїнової кислоти в локус цільового гена у хромосомній ДНК дріжджового геному дає екзогенний 0-ЇОН-ген, кодований тим самим таким чином, щоб підпадати під транскрипційний контроль - регуляторних послідовностей експресії нативного гена, що містять вищезазначені фланкуючі послідовності. Ге!
Підхожі фланкуючі послідовності можуть бути отримані шляхом ідентифікації наміченого сайта інтегрування в геномі дріжджової клітини, клонування послідовностей, що фланкують цей сайт (використовуючи будь-який із о підходящих методів) і прикріплення цих послідовностей до бажаного положення в рекомбінантній нуклеїновій со кислоті.
У кращому варіанті здійснення винаходу рекомбінантна нуклеїнова кислота, крім того, включає у себе один чи більше маркерних генів селекції, які у більш кращому варіанті перебувають під транскрипційним контролем їхніх власних промоторних і термінаторних послідовностей. У цьому варіанті здійснення промоторні і « термінаторні послідовності для маркерних генів не є промоторними і термінаторними послідовностями для з с цільового гена. Маркерні гени селекції та їхні відповідні промотори і термінатори в кращому варіанті не переривають послідовності "ліва фланкуюча послідовність - ГОН-ген -права фланкуюча послідовність" ;» рекомбінантної нуклеїнової кислоти. Маркерні гени селекції та відповідні промотори і термінатори в кращому варіанті розташовані на ділянці від лівого (5!) положення рекомбінантної нуклеїнової кислоти до лівої фланкуючої послідовності. (ее) Цільовим геном є будь-який ген, котрий потребується замінити на ГОН-ген. Кращим цільовим геном є піруватдекарбоксилазний ген, оскільки його заміщення перериває конкурентний шлях продукування етанолу. о Крім того, піруватний ген є схильним до того, щоб бути активним у дріжджових видах. Отже, інсерція І ОН-гена в (Се) геном під контролем РОС-промоторів і термінаторів з великою імовірністю буде давати мутант, що добре експресує ГОон. Кращими цільовими генами, крім того, є алкогольдегідрогеназа (АОН), 7 оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза (шигаз) і 3-ізопропілмалатдегідрогеназа (Іеи2).
ФО Отримувана в результаті цього дріжджова клітина не містить цільового гена, але містить екзогенний р-ІОН-ген, інтегрований в її геном у локусі цільового гена. 0-І ОН-ген перебуває при цьому під транскрипційним контролем промоторної послідовності і термінаторної послідовності, які є гомологічними, відповідно, Ппромоторній і термінаторній послідовностям цільового гена.
У цьому варіанті здійснення винаходу промоторною і термінаторною послідовностями І ОН-ази можуть бути
Ф, послідовності, що були наявними в рекомбінантній нуклеїновій кислоті, котра використовувалася для ко трансформування клітини, або ж можуть бути ті послідовності, що від самого початку були наявними в геномі клітини в сайті інтегрування. Після першої події кросінговера вставлений 0-І ОН-ген є функціонально зв'язаним бо З промоторною і термінаторною послідовностями, що були наявними в інтеграційному векторі. Після другої події кросінговера одна з цих послідовностей, промоторна чи термінаторна, або обидві ці послідовності можуть бути заміщені нативними РОС-промотором і/або РОС-термінатором. Наприклад, нативний РОС-промотор може утримуватися з делецією промоторної послідовності, що одержала інтеграційний вектор. Можливо також, що нативний РОС-термінатор буде утримуватися з делеціюєю термінаторної послідовності, що була наявною в 65 інтеграційному векторі.
Трансформована дріжджова клітина за даним винаходом може використовуватися для продукування
ЮОЮ-молочної кислоти із цукрів у ферментаційному процесі. У кращому варіанті ця клітина не містить функціонуючого І-І ОН-гена, або ж якщо такий І-І ОН-ген у ній міститься, то його активність є такою, що принаймні 9095, краще - принаймні 9595, ще краще - принаймні 99,095 і ще краще - принаймні 99,595 молочної
Кислоти, ЩО виробляється цією клітиною, є О-ізомером.
Ферментація може здійснюватися за будь-яким підходящим процесом. Як правило, дріжджова клітина забезпечується вуглеводом, здатним метаболічно перетворюватися на піруват, і для неї створюються умови, в яких відбувається процес ферментації. Ферментаційне середовище містить також живильні речовини (такі, як джерела азоту, фосфору, сірки, слідові кількості мінералів і т.д.), що підтримують життєздатність клітин. 70 Вуглеводи, котрі можуть використовуватися в цьому процесі, залежать від конкретної клітини-хазяїна і того, чи модифікована ця клітина-хазяїн для здійснення метаболічного перетворення даного вуглеводу на піруват. Кращими при цьому є: гексозні цукри, такі, як глюкоза і фруктоза; олігомери глюкози, такі, як мальтоза, ізомальтоза, мальтотриоза, крохмаль і цукроза, мальтодекстрини і ксилоза (пентозний цукор). Менш прийнятними є такі вуглеводи, як галактоза, маноза й арабіноза.
Температуру в процесі ферментації можна встановлювати в межах від кімнатної, у кращому варіанті - приблизно від 302С, ще краще - приблизно від 359С до приблизно 552С, краще - приблизно до 502С і ще краще - приблизно до 452. Максимальна температура процесу залежить певною мірою від конкретної клітини-хазяїна.
Якщо клітиною хазяїном є, наприклад, К. тагхіапив, то рекомбінантна клітина може витримувати відносно високі температури (порядку від 40 до 502С і особливо до 4522). юІнший кращий вид клітини-хазяїна, С. зопогепвів, здатний витримувати температури, приблизно, до 409С. Така висока температурна стійкість дозволяє здійснювати процес ферментації при таких високих температурах (зменшуючи тим самим витрати на охолодження) без значних втрат продуктивності. Іншою перевагою, що дає хороша толерантність до високих температур, є те, що у випадку забруднення ферментаційного середовища небажаними мікроорганізмами ці мікроорганізми в багатьох випадках можуть бути селективно вбиті нагрівом ферментаційного середовища до С температури 402С і більше, а в особливих випадках - до 4592С і більше, не завдаючи значної шкоди бажаним (5) клітинам за даним винаходом.
Під час ферментації концентрація клітин у ферментаційному середовищі, звичайно, лежить у межах, приблизно, 1-150, у кращому варіанті - приблизно 3-10, а в ще кращому - приблизно 3-6 г сухих клітин на літр ферментаційного середовища. |се)
Під час фази продукування в процесі ферментації в деяких випадках може потребуватися культивування їч- скоріше в мікроазеробних, ніж у жорстко анаеробних умовах. Оптимальні умови аерації можуть встановлюватися для кожного мікроорганізму шляхом вимірювання питомого поглинання кисню (ОК: охудеп иріаКе гаїе) і (о) корелювання цієї величини з виходом продукту, швидкістю споживання субстрату і швидкістю вироблення о бажаного продукту ферментації. В багатьох випадках величини виходу продукту і зазначених швидкостей оптимізуються в заданому діапазоні величин ОК. У випадку дріжджів, що мають РОС-розрив, оптимальні (ее) величини ОШК лежать у межах, приблизно, від 0,8 до З,5ммоль О/суха маса клітин/година. ОШК визначає собою швидкість, з якою кисень споживається клітинами в процесі ферментації, і виражається в мілімолях або грамах кисню відносно сухої маси клітин за одиницю часу, тобто, наприклад, ммоль О»о/суха маса клітин/година. «
Споживання кисню визначають, звичайно, шляхом вимірювання кількості кисню, введеного у ферментаційне середовище, і кількості кисню, видаленого із цього ферментаційного середовища. Вимірювання ОШК можуть т с служити основою для регулювання умов аерації (а саме швидкості введення газу, перемішування, пропорції ч кисню в аераційному газі і т.д.) під час стадії продукування в процесі ферментації з метою підтримання ни величини ОК в межах, оптимальних для даного організму. Водночас концентрація розчиненого кисню у ферментаційному бульйоні підтримується на рівні менше 195 від рівня насиченості, і особливо - на рівні менше 1Омкмоль О5/л. В особливо кращому варіанті стадію росту в процесі ферментації проводять таким чином, щоб (ее) концентрація розчиненого кисню в бульйоні була знижена до рівня менше 1095 від рівня насичення і особливо - о до рівня менше ТОмкмоль О5/л у певному інтервалі часу, наприклад, в інтервалі 15-90 хвилин перед початком стадії продукування (тобто шляхом переключення аеробних умов на стадії росту на мікроаеробні умови на стадії іс), продукування). - 20 Під час вироблення Ю-молочної кислоти величина рН ферментаційного середовища має тенденцію до падіння, якщо до середовища не додається основа для нейтралізації всієї або частини кислоти, що утворюється.
І) В одному з варіантів здійснення такого ферментаційного процесу до ферментаційного бульйону для підтримання його рН у бажаних межах, звичайно, від 5,0 до 8,0 і особливо в межах, приблизно, від 5,5 до 7,5 уводять нейтралізатор, такий, як карбонат кальцію, гідроксид кальцію, карбонат натрію, гідроксид натрію, аміак, 22 гідроксид амонію і т.п. Коли додається така основа, утворюється відповідна сіль молочної кислоти - лактат.
Ге! Отже відновлення молочної кислоти потребує регенерації вільної молочної кислоти. Звичайно, це здійснюється шляхом відділяння клітин і підкислення ферментаційного бульйону сильною кислотою, якою можуть бути, ко наприклад, сірчана кислота. Утворювану при цьому побічну сіль (у випадку застосування, як нейтралізатора, солі кальцію, а як підкислювача - сірчаної кислоти такою сіллю є сульфат кальцію) відділяють від молочної 60 кислоти. Після цього молочну кислоту відновлюють за допомогою таких процесів, як екстрагування рідких речовин рідинами, дистиляція, абсорбція і т.д., описаних, наприклад, у (Т.В. МісКгоу, МоІ.3, Спаріег 38 ої
Сотргепепзіме Віоїесппоіоду, (ей. М. Моо-ЖМоцпо), Регдатоп, Охіога, 1985; К. Баца, еї аі,, РЕМ5 Місгорбіо|.
Кем., 1995; 16:221-231; Ц.5. Раїфепі Мо.4,275,234, 4,771,001, 5,132,456, 5,420,304, 5,510,526, 5,641,406, 5,831,122, Міжнародна патентна заявка Мо: МУХО 93/00440). 65 В альтернативному варіанті величині рН ферментаційного середовища може бути дозволено падати у міру продукування молочної кислоти клітинами. У цьому випадку, в результаті продукування молочної кислоти. рн ферментаційного середовища може потрапляти в інтервал, приблизно, від 1,5 до 5,0, у кращому варіанті - приблизно від 1,5 до 4,2, у ще кращому - приблизно від 1,5 до 3,86 (рКа молочної кислоти) і в найкращому - приблизно від 2,0 до нижче, ніж 3,86. Проведення процесу ферментації в цьому режимі може давати декілька переваг за умови забезпечення бажаних рівнів продуктивності і виходу продукту. Такий підхід дозволяє знизити або виключити повністю витрати на нейтралізатор. Якщо рН ферментаційного середовища (наприкінці процесу ферментації) падає нижче рКа молочної кислоти, то молочна кислота буде існувати, головним чином, у кислотній формі. Це дозволяє виключити із процесу стадію підкислення, запроваджуючи цим економію на додаткових стадіях процесу, витратах на підкислення і витратах на виведення відходів у формі побічних сольових 7/0 продуктів. Таким чином, запропонований процес у кращому варіанті передбачає продовження ферментації доти, поки рН ферментаційного бульйону не впаде нижче рівня 3,86. Молочна кислота може бути відділена від такого ферментаційного бульйону за допомогою процесів, описаних, наприклад, у (МО 99/19290)1.
Толерантність даної клітини до середовища з низькою рН дає ще один механізм позбавлення забруднення небажаними мікроорганізмами. Для цього в культурі, що містить клітини за даним винаходом, можуть бути 7/5 бтворені умови зниженої рН, де рН буде складати, приблизно, від 1,5 до 4,2, у кращому варіанті - приблизно від 2,0 до 3,86 протягом часу, достатнього для ліквідації забруднюючих мікроорганізмів, що не є стійкими до кислот.
Для застосування в промислових процесах рекомбінантні дріжджі за даним винаходом повинні мати декілька певних характеристик. Ці дріжджі повинні перетворювати значну відносну частину вуглеводу на молочну кислоту (тобто забезпечувати високий вихід продукту). Вони повинні також володіти високою питомою продуктивністю, тобто виробляти велику кількість молочної кислоти на масу клітин за одиницю часу. Дріжджі повинні також переносити умови рН у ферментаційному бульйоні нижче, приблизно, 5,0, у кращому варіанті - від 1,5 до 42 і, особливо, від 2,0 до 3,86, забезпечуючи при цьому високий вихід продукту і високу продуктивність. Бажано також, щоб клітина була толерантною до високих концентрацій ЮО-молочної кислоти і/або солей ЮО-молочної сч об Кислоти при величинах рН у межах 5,0-8,0, краще - в межах від 1,5 до 5,0, ще краще - в межах від 1,5 до 4,2, і найкраще - в межах від 2,0 до 3,86. Остання з цих властивостей дозволяє використовувати в процесі і) ферментації високі початкові концентрації вуглеводу.
У загальному випадку є бажаним, щоб процес ферментації, в якому використовуються рекомбінантні клітини за даним винаходом, забезпечував усі або деякі з таких параметрів: «о зо А - Вихід, принаймні, 30, у кращому варіанті - принаймні 40, у ще кращому - принаймні 60, і в найкращому - принаймні 75г молочної кислоти на грам вуглеводу. -
Теоретичний вихід процесу становить 10095, але на практиці він обмежується величиною, приблизно, 9890 б (г/г).
В - Питома продуктивність - принаймні 0,1, у кращому варіанті - принаймні 0,3, ще краще - принаймні 0,4, о і найкраще - принаймні 0,5г ЮО-молочної кислоти на грам клітин за годину. Питому продуктивність бажано мати со якомога вищою.
С - Титр (максимальна концентрація ЮО-молочної кислоти) принаймні 15г/л ферментаційного середовища, краще - принаймні 20г/л, ще краще - принаймні 40г/л, і найкраще - принаймні 8Ог/л, до 150г/л, і ще краще - приблизно до 120г/л ферментаційного середовища. Температура ферментаційного середовища деякою мірою «
Впливає на верхній край легко досяжних титрів, оскільки висококонцентровані розчини молочної кислоти (тобто пла) с вище, ніж приблизно 150г/л) мають схильність до того, щоб ставати дуже в'язкими або приймати гелеподібну форму при температурах нижче, ніж приблизно 359С. Отже, застосування більш високої температури ;» ферментації, наприклад, у межах, приблизно, 35-50 дозволяє на більш високі титри без утворення гелю або небажаного підвищення в'язкості розчину.
Рекомбінантні клітини за даним винаходом продемонстрували вихід корисного продукту в межах, приблизно, (ее) 92-98965, об'ємну продуктивність 1,5-2,2г/л/год. і титри 81-90г/л в умовах нейтрального (рн, О-8,0) ферментаційного середовища на глюкозі. У ферментаційних середовищах з низькими рН, де допускалася о можливість зниження рН до рівня, приблизно, 3,0, клітини за даним винаходом показували вихід порядку 80595 і (Се) більше, і титри в межах 1,2-3,Зг/л. Ці результати в усіх випадках були отримані без оптимізації умов ферментації.
Крім того, процес ферментації згідно з даним винаходом у кращому варіанті забезпечує високу об'ємну і продуктивність. Об'ємна продуктивність виражається в кількості продукту, виробленого на одиницю об'єму б ферментаційного середовища за одиницю часу і вимірюється в грамах продукту на літр середовища за годину.
Бажаними є такі величини об'ємної продуктивності: принаймні, 1,5г/л/год., у кращому варіанті - принаймні 2,0г/л/год. і в ще кращому - принаймні 2,5г/л/год. При кращих значеннях густини клітин до 3-6бг клітин на літр Фферментаційного середовища максимальні значення продуктивності досягають, приблизно, 5,Ог/л/год., а в більш типових випадках - приблизно 4,0г/л/год. При цьому проводити процес ферментації дуже бажано так, щоб ці о величини об'ємної продуктивності досягалися при величинах рН середовища і/або температури в межах, іме) зазначених у попередньому абзаці.
Молочна кислота, вироблена згідно з даним винаходом, може використовуватися для одержання лактиду, бо циклічного ангідриду із двох молекул молочної кислоти. Залежно від стереоізомеру молочної кислоти цей лактид може бути ЮО-лактидом (утвореним із двох молекул Ю-молочної кислоти), І -лактидом (утвореним із двох молекул
Ї-молочної кислоти) або 0-І-лактидом (утвореним із однієї молекули І-молочної кислоти і однієї молекули
ОЮ-молочної кислоти). Підходящим процесом для одержання лактиду із молочної кислоти є процес полімеризації-деполімеризації, описаний у (патентні США Мо5,142,023 (Сгибег еї аї)|. 65 Лактид, у свою чергу, являє собою дуже корисну сировину як мономер для одержання полілактидних полімерів (РГА) і співполімерів. Підходящі процеси для цього описані, наприклад, у (патенті США Мо5,142,023
(сгибег еї аЇ)). Кращими РІ А-продуктами є стійкі при плавленні полімери, описані в |(патенті США Мо5,338,822 (Сгибег еї аї)). РІ А-полімери можуть бути напівкристалічними або аморфними.
Нижче розглянуто приклади, що ілюструють деякі варіанти практичного здійснення даного винаходу і не
Несуть з собою будь-яких обмежень щодо його об'єму та ідеї.
Приклади
Приклад ТА. Конструювання рМС2-плазмщи експресії на основі РОК-промотора із виду 5. сегемівіае і рС4-плазмщи експреси на основі РОС1-промотора із виду 5. сегемізіає.
Плазміда рМС2 експресії (Фіг.1) була створена шляхом комбінування РоОК-промотора із виду 5. сегемівзіає і 7/0 ЗАЇЛ10-термінатора із виду 5. сегемівіде на остовому векторі РОЕМ5А т) (Рготеда, Умівсопвіп). РОК-промотор і
САЇ 70-термінатор із 5. сегемізвіае були розділені полілінкерною ділянкою з сайтами рестрикції Хра!, ЕсокК/ і
Ватні для інсерції особливих генів для їх експреси між дріжджовими промотором і термінатором.
При цьому використовувався РОК1-промотор із виду З. сегемівіае, що мав такі послідовності (ЗЕС ІЮ Мо.1):
Безососсосос: ятОобототто состАтТОоСАТ ТАДРІТЕТР ТеТгТеЄтТе 715 ПТ ЕТУТАТТАА ССТТААТЕТЕ ТАУГТТАСДТ ТертеАСТІС лАСТСАЛВАЄ
МСАРАСАТАТ 0 ТАТААСАТСТ АЕттТАЄТОСТ вАКВСАСОТО ОСТ: бАбАААеААА ТТАССОТВС ТСОТОАТИО
ШТтОСТАТтЕ ДТУТОСАВСТТ бсАДТТТОВТ САСАСАКОКА ОТОСТАВОВ сч
ТАБОДСАТОЄ ТАТВАТеСОЄ АСТОТОАТОТ
АтТОбІВІвАЄ ЖАБААСЬОЮС УТ ТСЯСА САТ ПТОТААСВАА Ф зо ВОбеТеЗтІ ТАБТТТАЄТА. ОААОСТОБТО ААДСТТАСАТ ТТАСАТАТАТ ща
ВТАКАЄТТВС АТАВАТТОЄТ СААТОСААВА ААТАСАТАТТ ТОбТОТтНО (22)
МАКТТВОТАЄ ЕТРВААЕТ ОтйЄАНОЄ ет. БРАВ. о
Він був отриманий як фрагмент рестрикції із плазміди РВЕМО04. Іншим чином він може бути приготований шляхом РСкК-ампліфікації (РСК: полімеразно-ланцюгова реакція), використовуючи як матрицю хромосомну ДНК із виду 5. сегемізіде і праймери, розроблені на основі послідовності: «
Використовуваний вАМО-термінатор із виду 5. сегемізіде мав таку послідовність:
В'БТАСАТАСАТ ТОАТОСТАТЄ ААТОСАОАВА АСТОБАДАВА тТтетеотАВОСЄ" - с стодаАсття ФБОостосАає ЖТТатетАєть вАТТТТЄСТО
Із» ЖІГООСАБС ПАСТАТОСТ ТСТТОААААТ АТОСАСТОТА ТАТ СБИВ
ЧТО ГААЖТВ БАДСАСАТАЄ АТСТОСТОТА ТААСБАВТТТ 0 ТАПЕСТАТТЕ 4-5 МЯКВАТТТЄ еАОТІОАеТе ЖТААЛАЄТеХ СОЛЮОДОСОЛАТ ТТОСТОАСАТ со М АВОБАСОЄ: ААГТаТІТАЄ ДАФШТТОТОТО ТАСОДОСАТО СДОЛСАТОКА, о ААКТТОААНА ТотАТООААА. ЗАТАТОСАЄЯ ОТАОСАЛОАА ОДАТАТАЮВСЯ; со шоБАввовсоє АРПАТИОв ттабвозчева БО Кого),
Ця послідовність була отримана як фрагмент рестрикції із плазміди рРВЕМО04. ІНншИМ чином вона може бути
Ш- створена шляхом РСкК-ампліфікації, використовуючи як матрицю хромосомну ДНК із виду 5. сегемівіае і
Ф праймери, спроектовані на основі послідовності:
Був сконструйований і використаний як загальний вектор експресії полігенний експресуючий кластер, що містив плазміду рМС4, на основі РОС1-промотора і САЇ 10-термінатора із 5. сегемівідае. Під контролем цього дв промотора було експресовано багато маркерних генів. Плазміда рМсСа4 показана на Фіг.2.
Остовом плазміди рМСА4 є РОЕМ5А( т (Рготеда Согрогайоп; Мадізоп, УМ). РОС1-промотор із 5. сегемівіае був
Ф) РСК-ампліфікований при використанні праймерів РАРОСОВ1 (5-ССА ТСОо АТА АСА АОС ТСА ТОС ААА сАО-3; ка ЗЕО ІЮО Мо:3) Її РЕЕРОСАБ2 (5-ОСТ СТА САТ ТО АСТ ОТО ТТА ТТТ ТОСОо-3 5ЕО ІЮ Мо:4) і при використанні як матриці хромосомної ДНК із штаму 5У5098 5. сегемізіае. Було проведено 30 циклів термоциклування по хв. при 6о 949С, 1хв. при 569С, їхв. при 7290 і наступним завершальним інкубуванням протягом 7хв. при 72 С, використовуючи ДНК-полімеразу РішТигро (Зігагадепе).
САЇ 10-термінатор із виду 5. сегемізвідае був одержаний так, як описано вище. Послідовностями ЗЕО ІЮ МО 41 (Фіг.ЗА) і ЗВ 5ЕО ІО МО 42 (Фіг.3В) відображений фрагмент, що містить РОК1-промотор і САЇ 10-термінатор із сайтами мультиклонування і РОС1-промотор і САЇ 10-термінатор із сайтами мультиклонування. 65 Приклад 18. Конструювання плазміди рУК24, що містить І-ЇОН із В. Медаїегішт, під контролем РОК1 -промотора із 5. сегемівіає.
ДНК штаму В. тедайїепит, яка кодує І-І ОН-ген, була виділена таким чином. Штам В. тедаїепит був отриманий від Американської колекції типових культур (АТСС номер доступу 6458) і вирощувався в стандартних умовах. Геномна ДНК була очищена від цих клітин за допомогою набору "Еазу-ОМА" фірми Іпмігодеп згідно з протоколом виробника. Праймери були сконструйовані на основі послідовності, наявної в Генбанку для І-І ОН із штаму В. тедагепит (СепрапкК, номер доступу М22305). РСОК-реакції ампліфікації проводилися при використанні буферу І! Перкіна-Гльмера (Регкіп ЕІтег) (1,5мММ МосСіІ») і полімерази АтріїТтад Соїд. Кожне реакційне середовище містило геномну ДНК із В. тедагепит у концентрації бнг/мкл, один із чотирьох аМТР у концентрації 0,2мМ і один із двох праймерів ампліфікації ВМ1270, ВМ179 у концентрації 1мкМ. Зазначені праймери мали такі 70 послідовності:
ВМ1270: У-ССТ САО ТОС АСО ТСА ТТА ТТО-3; 5ЕО 10 Мо:5 і
ВМ179: 5-ТСА АОС ТАТ ТТА ТТ ТО ТТАС-3; 5ЕО Ір Мо:б.
Реакції проводили в таких умовах термоциклування: початкове інкубування протягом 1Охв. при 95 2С, після чого йшли 35 циклів по ЗОс при 95922, ЗОс при 502 і бос при 7220. Утворюваний у результаті цього процесу міцний фрагмент (1100п.0о.) очищали і відділяли за допомогою електрофорезу на агарозному гелі, клонували і секвенували. Отримувану послідовність можна було транслювати в поліпептид, що демонстрував чудову гомологію по відношенню до відомих генів, що кодують Г-ГОН (наприклад, під номером доступу М22305 в
Генбанку).
Кодуюча послідовність для І ОН-кодуючого гена штаму В. тедайепит була функціонально зв'язана з промотором із фосфогліцераткіназного (РОК) гена і транскрипційним термінатором із САЇ 10-гена, обидва із дріжджових клітин 5. сегемізідае. На основі цієї послідовності були розроблені два олігонуклеотидні праймери,
Втеодб і Втед3",, для введення сайтів рестрикції на кінцях кодуючої послідовності цього гена:
Втеду: 5-5СТ СТА САТ ОДА ААС АСА АТТ ТАб АСС-3У; ЗЕО Ю Мо:7 і
Втед3" 5-АТОО АТС СТІ АСА САА ААС СТО ТОТ СОС-3; ЗЕО Ю Мо:В. с 29 Ця реакція ампліфікації проводилася при зазначених вище концентраціях аМТР і праймера і при використанні (У полімерази Ріш Тигро (Зігаїадепе) у буфері виробника. Термоциклування проводили в режимі з початковою інкубацією протягом Зхв. при 952С, після чого йшли 20 циклів по ЗОс при 9522, ЗОс при 509С і бос при 729С |і завершальна інкубація протягом УОхв. при 72 2С. Продукт гідролізувався ферментами рестрикції Хваї і Ватні і со лігувався у сайти хбраї і ВатНі рМС2-плазмщи. Внаслідок цього лігування РОК-промотор і САЇ 10 ставали функціонально зв'язаними з В. тедагепит І ОН-кодуючою послідовністю, ідентифікованою як руУкаа4 (Фіг.4). -
Приклад 1С. Конструювання рук22-плазміди, що заховує кластер стійкості до (3418, функціонально зв'язаний Ф з РОС1-промотором і САЇ -10-термійатором із штаму 5. сегемізіае
Маркер стійкості до 5418 був клонований під контролем РОС1-промотора із штаму 5. сегемівідае, і отримані («З генетично модифіковані конструкції були позначені як рУК22 (Фіг.5). У цій плазміди САЇ 10-термінатор із 5. со сегемізіде використовувався як термінатор для гена стійкості до (05418. Ген стійкості до 05418 був ампліфікований шляхом полімеразно-ланцюгової реакції при використанні полімерази Рі Тигро (бігаїадепе) з праймерами 5-ОСТ СТА САТ САС ССА ТАТ ТСА АСО ОбБА ААС (5 б-фрагмент; ЗЕО ІО Мо:9) і 5-АТО САТ ССТ
ТАС ААА ААС ТСА ТСО АОС АТС (3 бС-фрагмент; ЗЕО ІЮ Мо:10) і плазмідою рРІСЯК (Іпмігодеп, Сагізрайд, СА) як « дю матрицею. Термоциклування проводили в режимі з початковим інкубуванням реакційного середовища протягом - бхв. при 959 з наступними 35 циклами по ЗОс при 9592С, ЗОс при 499С, 2хв. при 729С, після чого йшло с завершальне інкубування протягом 1Охв. при 72 С. Продукт РСК-ампліфікації гідролізувався ферментами :з» Ватні ї Хвраї, 821п.о. фрагмент виділявся і піддавався лігуванню в 4303п.о. фрагмент Ватні і Хваї! плазміди ріМС2. Отримувана в результаті плазміда мала РОК-промотор і САЇ 10-термінатор, функціонально зв'язані з
Геном стійкості до (3418 під назвою руУкК22, що схематично показаний на Фіг.5. о Приклад 10. Конструювання плазміди рМС7 для експресії І-ЇОН-гена із виду Васіїйив5 тедаїйегішт на реплікуючій плазміді рКОІ. о Плазміда рМС7 (Фігб) була сконструйована таким чином. Кластер експресії що містив В. о тедайїепит-І ОН-ген, був відділений від рУК24 як фрагмент Мої! під транскрипційним контролем РОК-промотора і
САЇ 10-термінатора (5. сегемівіае) і лігований у плазміду рІМСЗ, зрізану фрагментом Мої, з утворенням - плазміди рМС7. Плазміда рМОСЗ була сконструйована шляхом лігування всієї рКО1-плазміди (МУезоіомузКі-І оимеї
Ф его аі, Мопсопмепіопа! УМеазвів іп Віоїесппоїоду; "Кішшжшеготусез Іасіїв", рр.139-201; Ко еа.;
Зргіпдег-Мегпіад, Вегійп, 1996), лінеаризованої Зриї в унікальний сайт Зрпи1 плазміди рТЕРІ/7ео (Іпмігодеп).
Структура рМСЗ-плазміди показана на Фіг.
Приклад 1Е. Конструювання штаму МСЗ9 виду Кісумеготусез тагхіапив
Плазміда рЯМС7 була трансформована в К.тагхіапиз (штам СО21) за допомогою стандартних методів для (Ф. одержання рекомбінантного штаму МСЗ39, який мав В. тедаїйегішт І-ІОН-ген на багатократно реплікуючій ко рКОІ-плазміді.
Приклад 1Р. Конструювання плазмід реоО28 і реО29 для розривання РОС1-векторів розривання во За допомогою праймерів 5О-М2 5-СТТ ССА ТС САС САС ОТО АС САСІ - 37 5ЕО. ІЮ Мо:11 і 50-М1 55-СТС САС САТ ОТО БАС САС-3; ЗЕО. 10.Мо:12 була сконструйована плазміда реоО21. Як матриця при цьому використовувалася геномна ДНК із виду К. тагхіапиз (штам СО21), а описані вище праймери використовувалися за допомогою звичайних РСК-методик. У результаті був одержаний 5,5КБ (тис.п.о.) фрагмент, що містив
РОС1-ген із К. тагхіапиз разом з промотором, термінатором і великою ділянкою на лівому і правому кінцях гена. 65 Цей 5,5К5 фрагмент був клонований у плазміду рСКІ! (Іпмйгодеп), у результаті чого була отримана плазміда рзо21 (Фіг.7а). Плазміда рО27 (Фіг.75) була синтезована шляхом РСК-ампліфікації 3,3КЬ РОС1-фрагмента
(РОС1-гена, промотора) із рО21, використовуючи праймери ЗО-МА 5-ЗАА СОА ААС ОАА СТТ СТО ТО-3, 5ЕО
ІО Мо:13, і 50О-М5 5-СТТ ОА АСТ ТСТ ТОТ САС ТО-3, 5ЕО ІЮ Мо:14, за допомогою звичайних РСК-методик.
Утворюваний у результаті фрагмент очищали і виділяли шляхом гель-електрофорезу і після цього лігували в - плазміду РСКН (Іпмігодеп), отримуючи плазміду реО27.
Плазміда реО28 (Фіг.8) була сконструйована шляхом гідролізу плазміди реО27, заховання РОСТІ і делеції за допомогою Врзі 417п.о. із РОС1-кодуючої ділянки. Утворювані в результаті нуклеотидні звиси були заповнені
ДНК-полімеразою Ріи (Зігаїадепе). Цей фрагмент (приблизно 2,9КБ) був лігований у Ріи-дефосфорильований на кінцях фрагмент Мої! із РУК22 (Приклад 1С), що містив РОК-промотор 5. сегемівіае і ген стійкості до 5418, за 7/0 яким йшов САЇ 10-термінатор із 5. сегемівіае.
Подібним чином плазміда рзоО29 (Фіг.9) була сконструйована шляхом гідролізу плазміди реО27 ферментом
ВЬзі для делецій 417п.о. із РОС1-кодуючої ділянки. Нуклеотидні звиси були заповнені ДНК-полімеразою Рій ОМА (Зігабадепе). Цей фрагмент був лігований у Ріи-дефосфорильований фрагмент ХпоЇ/Хра! із ртТЕБ1/7ео (Іпуйгодеп), що містив 5. сегемізіде ТЕР7-промотор і ген стійкості до зеоцину, за яким йшов 5. сегемізіае 75 СУС1-термінатор.
Ці конструкції були приготовані з метою розробки різноманітних інтеграційних кластерів, що можуть застосовуватися у створенні штамів К. тагхіапиз, які мають рас1-нульовий генотип, з різними інтегрованими генами селекції. Трансформанти спочатку були добрані для перевірки інсерції даної конструкції в локусі РОС7, а після цього піддані скринінгу за їхньою нездатністю виробляти етанол і нездатністю рости в анаеробних 2о умовах. Кращою подією рекомбінації є подвійний кросінговер у РОСІ1 на геномі. Проте, може відбуватися як поодинока, так і подвійна подія рекомбінації, або ж навіть подія ДНК-інсерційного мутагенезу.
Приклад 10. Трансформування і селекція К. тагхіапиз для рас1і-нульового генотипу, використовуючи
Рас-фенотип: конструювання штамів СО181, СО186, СО214, 20215, 20216, 20217, Сб0218, 20219, 60220 і со221. с
Як хазяїн трансформування був вибраний штам МСЗ39, оскільки він містить плазміду рРМС7 в хазяїні як реплікуючу плазміду, що містить І-І ОН на рКкО1-остові, наявність якого може підвищувати імовірність делеції в о
РОСТІ |(Спеп ХУ, еї аІ., Си. Сепеї, 1989 Аца; 16(2):95-81.
Штам МСЗ39 вирощували протягом ночі в ХРО-середовищі із селекцією на зеоцин (Іпмйгодеп) 10Омкг/мл з метою утримання плазміди рМС7, а трансформування проводили за таким протоколом хімічного Ге) трансформування дріжджів. Клітини вирощувалися протягом ночі в хмл УРО-середовища при температурі 302 і струшуванні з частотою 250о0о6./хв. Культуру розбавляли 5ХОмл УРО-середовища до початкової оптичної густини т
ОбБоо приблизно 0,2. Після цього культуру вирощували при 302С і струшуванні в режимі 250об./хв. довеличини щФд)
ОбБбоо, приблизно, 3,0. Далі клітини збирали шляхом центрифугування зі швидкістю 2500об./хв. протягом 5Ххв. і повторно суспендували в 5О0мл стерильної води. Клітини збирали шляхом центрифугування при 2500об./хв. о протягом 5бхв. Цикл повторного суспендування і центрифугування проводили ще один раз. Після цього клітинний (се) осад повторно суспендували в 1,0мл розчину ТОмММ Ттіз. рН7У,5, їмММ ЕОТА, 20мМ ацетату літію, рН7,5. У пробірку мікроцентрифуги додавали: 4,Омкг лінійного реО28 ДНК-фрагмента, зрізаного Засі/Аро!, що містив маркер селекції (3418 і фланкуючу РОС1-ділянку, 25мкл носійної ДНК (Соіеце, 1Омг/мкл, обробленої піском), і « до суміші при інтенсивному перемішуванні добавляли 500мкл приготованих клітин штаму МСЗ39. Після цього добавляли Змл 4095 РЕС, 10мМ Ттгіз, рН7,5, їмММ ЕОТА, 20мМ ацетату літію, рН7,5, і суміш інтенсивно - с перемішували. Далі суміш інкубували протягом ЗОхв. при 302С у стані струшування з частотою 250о6б./хв. По ч завершенню інкубування до суміші добавляли ЗбОмкл ЮОМ5О і перемішували її перевертанням пробірок. Після » цього клітини піддавали обробці температурним шоком при 4292 протягом 15 хвилин, а потім швидким охолодженням на льоду протягом З хвилин. Клітини осаджували центрифугуванням протягом 10с зі швидкістю 14000об./хв., а супернатант видаляли. Далі клітини повторно суспендували в їмл УРО. Після цього клітинам бо давали можливість відновитися шляхом інкубування протягом 4 годин при 302 у стані струшування з частотою о 250об./хв. По завершенню періоду відновлення клітини знову осаджували центрифугуванням, а супернатант видаляли. Одразу після цього клітини знов суспендували в остаточному об'ємі, приблизно, 50Омкл і, МРО-середовища. Аліквоту (2Омкл) клітинної суспензії висаджували на одну селекційну чашку, а аліквоти по -і 20 100мкл висаджувалися на 6 інших селекційних чашок. Висаджені клітини піддавали інкубуванню при температурі 302 до появи ознак росту колоній. щи Чашки, що використовувалися в цьому трансформуванні, містили ЗО0Омкг/мл селекційної субстанції (5418).
Трансформанти, що виросли на цих первинних чашках, висаджувалися плямами на вторинні чашки з такою ж концентрацією селекційної субстанції. Колонії що росли на вторинних чашках, піддавалися скринінгу 29 РСК-реакцією за звичайними методами для інтеграції подій на РОС1, використовуючи 3'-праймер справа і зовні
ГФ) фрагмента інтеграції (504549 5-ССА ТСС БДАА БАА ТС ЗАТ СТО-3; 5ЕО ІЮ Мо:15) і 5і''праймер, що лежав усередині гена стійкості до 5418 (50285 5-СТТ СС АТС СТА ТО ААС ТОС-3; ЕС І Мо:16). За о результатами РСкК-аналізу лише одна із 200 колоній була позитивною. Для підтвердження наявності інтактних
РОСІ дикого типу проводили додатковий РСК-аналіз за звичайними РСК-методиками при використанні 60 РОС1-праймерів, націлених на делетований ВрзіІ-фрагмент із рвОо27-плазміди (-502740 5У-САА БОС ТО АД
ТТО АСТ ОА-3 ЗЕО ІЮ Мо:17 і -502444 5У-СТ ССА ТСТ БАА АТС САС АС-375ЕО ІЮО Мо:18).
Один позитивний трансформант відділялли поодинокою колонією і використовували для вироблення гліцеринового штаму, який був ідентифікований як СО181. Цей штам позбавляли рМС7-плазмщи шляхом культивування без селекційного тиску з подальшим висіванням культивованих клітин на чашки з УРО-агаром, що бо містили 5418 (З0Омкг/мл). Чотири колони відбирали й тестували на чутливість до зеоцину і недостатність вироблення І-молочної кислоти. Всі чотири колонії показували чутливість до зеоцину і втрачали здатність продукувати І-молочну кислоту. Була вибрана одна з колоній, що використовувалася для продукування гліцеринового штаму і була ідентифікована як СО186.
Для створення штаму К. тагхіапиз з РОС-фенотипом (що не продукує етанол і не росте в анаеробних умовах) було необхідно провести ще одне трансформування СО186. Штам СО186 був трансформований за описаним вище протоколом з 6б,8мкг лінеаризованого ДНК-фрагмента реО29, зрізаного ферментами МпеїішиМої, що містили маркер селекції на зеоцин і делецію на РОС1-ділянці.
Утворені в результаті трансформанти були висіяні на чашки з УРО-агаром, що містили ЗО0Омкг/мл зеоцину. 7/0 Трансформанти, які вирощувалися на цих первинних чашках, були висіяні плямами на вторинні чашки з
ЗООмкг/мл 5418 і ЗООмкг/мл зеоцину. Колонії, що росли на цих вторинних чашках, були піддані скринінгу на інтегрування в РОС1-локусі за допомогою РСК-реакції, що було піддано тестуванню на відсутність РОС1 дикого типу, за допомогою праймерів, наявних на делетованому ЗБзіІ-фрагменті із плазмід реО27, -502740 5-ЗАА СОС
ТО САА ТО АСТ ОА-3, ЗЕО ІЮ Мо:17; 502444 У-ЗСТ ССА ТСТ САДА АТС дО АО-3"7 ЗЕО ІЮ Мо:18.
У восьми колоніях була встановлена наявність делецій у РОС1. Це було перевірено за допомогою
РСкК-аналізу, який показав наявність очікуваної делеції із РОСІ дикого типу їі РОС-фенотипу (нездатність виробляти етанол і рости в анаеробних умовах). Із цих восьми трансформантів були відділені поодинокі колонії і введені в колекцію культур Сагой! ЮОом Сииге соПесіоп. Ці вісім РОС7-нульових штамів К. тагхіапив5 одержали назви СО214, 20215, 20216, 20217, 20218, 20219, 20220 ії СО0221. Штам СО215 був підданий випробуванням на вироблення етанолу шляхом інокуляції колонії в Хомл УРО-середовища у 250мл шейк-колбі.
Культуру інкубували при температурі 302С в умовах струшування з частотою 7О0об./хв. Аналіз методом рідинної хроматографії високого розрізнення (НРІ С) зразків цієї культури не виявляв наявності етанолу.
Приклад 1Н. Конструювання плазміди рРЗІ, що функціонально зв'язує ген стійкості до гігроміцину з
РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором виду 5. сегемізіає. с
Рекомбінантну нуклеїнову кислоту, що надає трансформованим дріжджовим клітинам стійкості до гігроміцину, дозволяючи цим проводити селекцію трансформантів дріжджових клітин, що містять рекомбінантну о нуклеїнокислотну конструкцію, яка кодує білок, придатний до синтезу органічного продукту, готували таким чином. Маркер стійкості до гігроміцину (при виду ЕЕ. соїї) клонували під транскрипційним контролем
РОС1-промотора виду Засспаготусез сегемівіае. Ге)
Ген при із клітин ЕЕ. Соїї, що надає стійкості до гсгігроміцину В, піддавали РеК-ампліфікації, використовуючи праймери ЗНУСХВА1 (5-ААО СТО ТАС АТО АДА ААО ССТ ОАА СТО АС-3; 5ЕО ІЮ Мо:19) і -
З'НХОВАМНІ (5-СОС ОСА ТСС СТА ТО СТІ ТОС ССТ СО АС-3; ЗЕО ІЮ Мо:20) і як матриці - плазміди Ге»! рКЇ Мехзо |Маснй еї аї., 1994, Си. Сепеї 25, 567-570; КаїЇдатіа еї аіІ., заявка на патент США Мо:10/154,460, подана 23 травня 2002р.|, включені тут в усій їхній повноті шляхом посилання. Ген при може бути також - з5 одержаний при використанні таких самих праймерів з хромосомною ДНК виду Е. соїї як матрицею. Ге)
Термоциклування проводилося за такою програмою: 30 циклів по їхв. при 942, хв. при 562С, Зхв. при 7290 і наступне за цим остаточне інкубування протягом 7хв. при 722С, використовуючи ДНК-полімеразу Ріи Тигро ОМА (Зігаїадепе). РСОК-продукт був відділений шляхом електрофорезу на 0,895 агарозному гелі і складався із 1026п.0. «
РСК-продукт був підданий гідролізу ферментами Хваї і Ватні і лігований у зрізану ферментами Хваї і Ватні плазміду рРМС4 з одержанням плазміди рР51 (Фіг.10). - с Приклад 11. Конструювання плазміди рУка43З, що містить ГІ. Пеїмейісиз 0-І ОН а 0-ОН була відділена від штаму Іасіорасійй5 Пеїмейсиз таким чином. Клітини Іасіорасійи5 Пеїмейісив "» були отримані від Американської колекції типових культур (АТСС, номер доступу 10797) і вирощувалися в стандартних умовах. Геномну ДНК очищали від цих клітин за таким протоколом. 1. Одну колонію або 5мкл із гліцеринового маточного розчину бактерій молочної кислоти використовували (ее) для інокуляції 2х50мл стерильного МК5-бульйону в 250мл стерильних колбах. Культуру вирощували в умовах о перемішування зі швидкістю 17О0об./хв. при температурі 372С протягом 48 годин. 2. Культуру переносили у 5Омл стерильні пробірки із синіми кришками і піддавали центрифугуванню зі (се) швидкістю ЗО00боб./хв. протягом 10 хвилин. Клітинний осад піддавали повторному суспендуванню в 50мл 12,595 -1 50 мас/об, розчину сахарози і знову піддавали центрифугуванню зі швидкістю З000об./хв. протягом 10 хвилин. Після цього осади повторно суспендували і об'єднували в 5мл 12,595 мас/об, сахарози в 5Омл стерильних пробірках, 4) закритих синіми кришками, фірми Раїсоп (каталог. Мо29050). До клітинної суспензії додавали 5мл розчину ТЕ5 (ТЕ5: 10мМ Ттіз (рН8,0), 5О0ММ ЕОТА (рна,0), 5омМ Масі, стерильний профільтрований). Далі додавали ще б5мл 2590 мас/об, розчину сахарози, і суміш перемішували. Після цього до суспензії додавали порошок лізоциму (ЗО0Омг), і все це інтенсивно перемішували. Після достатньо ретельного перемішування до суміші до суміші о додали 25мкл розчину мутанолізину (вихідна концентрація 2,2мг/мл). Суспензію інкубували протягом ночі (приблизно 10-12 годин) при 3720. ко 3. Після нічного інкубування додавали 2,5мл 2095 розчину ЗОЗ (додецилсульфату натрію) і 168мкл розчину протеїнази К (концентрація маточного розчину 28мг/1,4мл). Уміст пробірки перемішували шляхом перевертання, 60 але без струшування. Далі пробірку інкубували при 502 протягом 1 години. По витіканню цього часу в мембранній речовині клітин з'явилися розриви, і розчин став напівпрозорим. До розчину додали Масі у кількості, достатній для концентрації 0,15 М. Далі розчин ретельно перемішали шляхом перевертання. 4. Розчин переносили до 50мл пробірки Окриджа (Сакгідде) (ВесКтап Іпзігитепів Іпс., Раю А, СА) або, в іншому варіанті, розділяли по двох пробірках і піддавали обробці однаковим об'ємом суміші фенолу, бо хлороформу та ізоамілового спирту (25:24:1). Далі суміш перемішували і піддавали центрифугуванню зі швидкістю 10000об./хв. протягом 10 хвилин.
5. Водний супернатант видаляли в чисту пробірку Окриджа, і до нього добавляли такий самий об'єм хлороформу. Утворений розчин перемішували струшуванням і піддавали центрифугуванню зі швидкістю 5О00боб./хв. протягом 10 хвилин. 6. Супернатант відбирали сифоном і поміщали у чисту пробірку. До цього супернатанту додавали 25мМкл
РНК-ази (вихідна концентрація 100Омг/мл), і суміш перемішували шляхом перевертання пробірки. Далі пробірку інкубували при 372 протягом 15 хвилин. Для швидкого розкладання РНК у пробірку з надлишком додали
ДНК-азу без РНК-ази. 7. Нарешті, до суміші шляхом обережного зливання уздовж стінки пробірки додавали 2,5 об'єми ЕН. Шар 7/0 ЕН не змішувався з умістом пробірки. ДНК, що утворювалася на поверхні розділу рідин, відбирали скляною піпеткою і промивали в 7095 ЕН. Далі ДНК сушили на відкритому повітрі і повторно суспендували у 10ММ
Ттів-НСІ, рнН8,5 (буферний розчин для елюювання в більшості наборів Оіадеп) у пробірці для мікрофугування.
Після цього пробірку інкубували при 502С доти, аж поки ДНК не виходила в розчин.
Праймери були сконструйовані на основі наявної в Генбанку послідовності для О-І ОН із штаму Г. Ппеїмейісив 75 (Сепрапк, номер доступу 1107604 або Хб66723 (ЗЕО ОО Мо.43)). Використовуючи полімеразу Ріш Тигро (Зігаїадепе, УМІ, ОБА), були проведені реакції РСК-ампліфікації. Кожне реакційне середовище містило геномну
ДНК із І Пеїмейісиз в концентрації 5ООнг, один із чотирьох ДМТР в концентрації 0,2мММ і один із праймерів ампліфікації МК150 5-56 ТоОо АТТ ТАТ САС ААА ОТ ТТ ОСТтТТ-3 ЗЕО ІО Мо.21) і МК153 5У-ААТ ТАА ААС
ТО То То ТС АДА ОСА АСТ-3; 5ЕО ІЮО Мо.22) в концентрації тмкМ. Реакції проводили в такому режимі циклування: початкове інкубування протягом 1Охв. при 952С, слідом за цим 35 циклів по З0с при 952, З0с при 5190 і бОс при 7220. Міцний фрагмент продукту із 1027п.о. очищали в гелі за звичайними методиками і ТА клонували у вектор РСК-Вішпії для топоклонування (Іпийгодеп, Сагізрад, СА). Утворювану в результаті плазміду під назвою рУК4З (показану на Фіг.11а) піддавали секвенуванню. Отриману послідовність можна було транслювати в поліпептид, що демонстрував чудову гомологію з відомими послідовностями 0-ЇОН-кодуючих с генів І. пемейсиз у Генбанку (номера доступу ШО7604 або Х66723). о
Приклад 1. Конструювання плазміди руУкК47, що містить |. Пеїмейісив 0-І ОН, під контролем РОК1-промотора ії САЇ 10-термінатора із клітин 5. сегемівіае.
Були сконструйовані праймери для введення сайтів Хваї і Ватні у 5' і 3' кінці О-ГОН-гена для клонування в плазміду рМС2. Були проведені РСВ-реакції ампліфікації, використовуючи полімеразу Рі Тигро (Зігаїадепе, Ф
МУізсопвіп, ОБА). Кожне реакційне середовище містило руУкК4аЗ (заховання |. Пеїмейсив О-І СХ) (5нг), один із їч- чотирьох 4 амМТР з концентрацією 0,2мМ і один із праймерів ампліфікації МК165 5-СОТ СТА САТ ТТА ТОА САА дос ТТ ТОСт-3; 5ЕО ІЮ Мо.23 і МК166 5-СО САТ ССТ ТАА ААС ТТО ТТ ТО ТТ АА-3; БОЮ Мо24з3з ФІ концентрацією 1мкМм. Реакції проводили в такому режимі циклування: початкове інкубування протягом 1Охв. при о 9592, слідом за цим 35 циклів по ЗОс при 952С, ЗОс при 55922 і б0с при 7220. Утворюваний міцний фрагмент
Зо продукту завдовжки 1035п.о. очищали гелем за звичайними методиками і піддавали ТА-клонуванню, со використовуючи вектор для топоклонування РСК-Вішипій (Іпмйгодеп, Сагізрад, СА). Утворювану в результаті плазміду, що отримала назву рук44 (Фіг.115), піддавали секвенуванню. Цю послідовність можна було транслювати в поліпептид, що виказував чудову гомологію з відомим 0-ІЇ ОМуУ-кодуючим геном із виду Г. Неїмейісив « і мав сайти Хваї і Ватні на 5 і 3' кінцях 0-І ОН-гена.
Плазміду рМОС2 піддавали гідролізу ферментами ХбраІ і Ватні. Фосфатні 5-кінці лінеаризованої о) с рМсС2-плазміди дефосфорилювали за допомогою лужної фосфатази дрібних ракоподібних (Коспе Оіадпозіїсв, "» БА) згідно з протоколом виробника. Конструкцію руУкК44 також піддавали гідролізу ферментами Хваї і Ватні, і " утворюваний в результаті цього 1 Неїмейсиз 0--ОН-ген завдовжки 1027п.о. відділяли шляхом гель-електрофорезу (0,895 агарозний гель). Ці два фрагменти лігували, і утворену в результаті плазміду під назвою рукКаА7 (Фіг.4) піддавали секвенуванню. Плазміда рук47 має РОК-промотор і САЇ 10-термінатор із виду бо 5. сегемізіде, функціонально зв'язані (тобто транскрипційно активні в дріжджовій клітині) з 0-І ОН-геном із. о Неїмейісив, як показано на Фіг.12 (ЗЕО ІЮ МО 43). се) - 50 42)
Ф) іме) 60 б5
Послідовність 0-І ОН-гена: 5-АТСАСААЛАООСТТТТТОСТТАСОСТАТТСОДАААСАСОСААСААССАТТСТТОААТСААТОоС
ААСОААОСТСАСАДОСАТАТСОАТОТТОАТТАСАСТОАТАААСТТТТОАСТОСТОАААСТ
ОССТААССТАОСТААОООТОСТОАСОСТОТ ТОП ОТТТАССААСААТТАСАСТАСАСТОСА
САТАСТСТТСААОСТТТАССАСАСОСТОСССТААСТААСАТОТСАТТАСОТААСОТТОСТ
СТТСАСААСАТТОАТАТОСАСААООСТААССААТТАОСТТТОСАААТТАССААТОТТОСТ
СТТТАСТСАССААДАСОСТАТТОСТОААСАТОСТОСТАТТСАСОСТОСАСОТОСТАТТАСОТ то СААСАСААОСОСАТОСАСОААААСАТООСТАААСОСТОАСТТАСОТТОСОСАССААСТАТС
ООССОТСААСТТООТОАССААСТТОТСОСТОТТОТТОСТАСТОСТСАСАТТОСТСААСТА
ТІТАТОССТАТТАТОСААОСТТТСООТОСАААОСТТАТТОСТТАСОАТАТСТТСААСААС
ССАСААСТТОААДАСААОООТТАСТАСОТТОАСТСАСТТОАСОАСТТОТАСААОСААОСТ
ОСАТОТААТТТСАСТТСАСОТАССАСАТОТТССАССТААСОТТСАСАТОАТСААСОАСААО
ТСААТСОСТОДААТОДААСАСООСОСТТОТААТТОТАААСТОСТСАССТОСТОВАСТТОТТ
САСАСТОАСОСТОТААТССОТООТТТОБАСТСАСОСААСАТСТТОООСЕСОСТТАТОСАТ
АСТТАСОААСАСОААСТТОСТОТАТТТААСААОБАТТООСААООТАААСААТТСССАСАС
720 ААССОААООСАСАСТТААТТОАТСОТССАДАССТАТТОСТААСТОСАСАСАССОССТТС
ТАСАСТАСТСАСОСТОТАСОТААСАТООСТТОТТААСОСАТТСААСААСААСТТОАДАСТТА
АТСААСООСОАААДАСССАСАТТСТОСАСТТОСААСААСААСААСААОТТТТАА -- 3 с
Приклад 1К. Конструювання плазміди руУкК48, що містить О-І ОН-ген із І. Пеїмейісив і суміжний з ним маркер стійкості до гігроміцину. і)
Плазміду рР51 піддавали гідролізу ферментом Зрії. Фрагмент завдовжки 2259п.0о., що містив ген стійкості до гігроміцину, був експресований під контролем РОС1-промотора і АЇ 10-термінатора із клітин 5. сегемівіає і відділений шляхом електрофорезу на 0,895 агарозному гелі. Плазміду рУК47 гідролізували ферментом РН, і «я зо 5-фосфатні кінці лінеаризованої плазміди дефосфорилювали лужною фосфатазою дрібних ракоподібних (Коспе
Оіадповіїсв, США) згідно з протоколом виробника. Ці два фрагменти зшивали, і утворена в результаті плазміду, - яка одержала назву руУкК48, піддавали секвенуванню (Фіг.13). Ця плазміда містить О-ІОН-ген із виду Її. Ге!
Неїмейісиз і суміжні один до одного кластери маркера стійкості до гігроміцину.
Приклад 1. Уведення ДНК, що кодує 0-І ОН-ген із клітин І. пПеїмейсив, шляхом випадкового інтегрування в о
Зв ГеНнОМ К. тагхіапив. со
Фрагмент завдовжки 4540п.о., що містив кластер І. Неїмейсиз 0-ГОН: НРН-ген стійкості, відділяли від плазміди руУкК48 шляхом гідролізу плазміду ферментами 55 і Ара. Цей фрагмент використовували для трансформування рад -нульового мутанта Кісумеготусевз тагхіапиз (СО215; див. Приклади 1Е, 10) згідно з описаним нижче протоколом електропорації. «
Однією колонією К. тагхіапиз інокулювали 50мл УРО-середовища, що містило 10г/л дріжджового екстракту, ств) с 20г/л пептону, 20г/л глюкози і 295 агару) у 250мл шейк-колбі бічного качання до оптичної густини ОЮ оо. 0,1. . Культуру вирощували протягом 16бгод. при температурі 302С з частотою струшування 250об./хв. до остаточної «» ООБоо 10. Клітини із тТОмл культури збирали шляхом центрифугування й один раз промивали буфером для електропорації (ЕВ: 1ОмММ Ттіз-СІ, 270мММ сахарози, 1мМ Масі», рН7,5). Далі клітини повторно суспендували у буфері для інкубування (ІВ: УРО х25мМ ОТТ, 20ММ НЕРЕЗБ, рНВ,0) та інкубували при температурі 30 С. з (оо) частотою струшування 250об./хв. протягом 30 хвилин. Після цього клітини збирали шляхом центрифугування і о один раз промивали буфером для електропорації. Далі клітини повторно суспендували в їмл буферу для електропорації, і 40Омкл цих клітин переносили до 0,4см кювети для електропорації (ВіоКай; Негсціев, СА). (Се) До кювети додавали 2мкг 5вП/АраІ-фрагмента завдовжки 4540п.о. із рук48-плазміди, і клітини піддавали електропорації з параметрами 1,8кВ, 1000Ом, 25мкФ. Після цього клітини переносили до їмл УРО-середовища в і БОмл пробірці Фалькона із загвинчуваною кришкою й інкубували при 302 з частотою струшування 250о6./хв. 4) протягом 4 годин, після чого проводили селективне засівання на 2ООмкг/мл гігроміцину, що містив
МХРО-середовище. Трансформанти вирощували при 372С протягом З днів. Трансформанти, що були стійкими до гігроміцину, повторно висівали штрихами на свіжі селективні чашки, що містили 200мкг/мл.
РСоК-аналіз о Перевірку інтегрування даного фрагмента в геном СО21 клітин К. тагхіапиз здійснювали за допомогою двох наборів РСК-праймерів. їмо) 1. Один набір праймерів був сконструйований у розрахунку на гомологію з О-ЇОН-геном із штаму Г.
Неїмейісив, а реверс-праймер - на гомологію з геном стійкості до гігроміцину. Праймери МК161 5-АСТ То тот 60 АТТ ТАА САА 0-3; ЗЕО ІО Мо.25 і МК142 5-51 АСА ССС ТОТ ОСА СО СО дО АТО-3; 5ЕО ІЮ Мо.26 були сконструйовані для ампліфікації 1748п.о. продукту між О-ГОН-геном із клітин | Пеїмейісив і геном стійкості до гігроміцину в штамах, що мали цей кластер і не повинні були ампліфікувати будь-який фрагмент у штамах, що не мали цього кластера. Термоциклування проводили на колоніях трансформанту, використовуючи
ДНК-полімеразу Тад (Сіадеп, США), в такій послідовності: початкове інкубування реакційної суміші протягом б5 2хв. при 942С, 35 циклів по ЗОс при 942С, ЗОс при 432С, Зхв. при 7220 і остаточне інкубування протягом 7хв. при 7296.
2. Другий набір праймерів був спроектований у розрахунку на гомологію з РОК-промоторною ділянкою, а реверс-праймер - на гомологію з 0-І ОН-геном із І. пеїмейсив. Праймери МК173 5-5СОо АСОо ОСТ САС дос ТТ
То-3, 5ЕО ІЮ Мо.27, і МК170 5-СТТ ОТО ТО АСО ТАА ТАС АСО ТОС АОС-3, 5ЕО ІЮ Мо.28, були спроектовані
Для ампліфікування 0,75КЬ (750п.0.) продукту між РОК-промотором і 0-ЇОН-геном із клітин | Пеїмейісив у штамах, які мали цей кластер, і відсутності ампліфікування будь-якого фрагмента у штамах, які не мали цього кластера. Термоциклування проводили з колоніями трансформанту, використовуючи ДНК-полімеразу Тад (Сіадеп, США) в режимі з початковим інкубуванням реакційної суміші протягом 2хв. при 942С, наступними за цим
З5 циклами по ЗОс при 942, ЗОс при 552С, їхв. при 722С і остаточним інкубуванням протягом 7хв. при 72 26. 70 Дев'ятнадцять серед аналізованих трансформантів дали очікувані РСК-продукти.
Ферментативний і газохроматографічний (5О аналізи Ю-молочної кислоти Оптична чистота Ю-молочної кислоти, виробленої трансформантами, визначалася за допомогою набору для детектування Ю-молочної кислоти фірми Воепгіпдег Маппйейт (Коспе Оіадповіїсї, США). Проведений за протоколом виробника аналіз показав, що шість із дев'ятнадцяти трансформантів продукували 095 І -молочної кислоти.
Газохроматографічний (С) аналіз супернатанту від трансформантів показав, що дані штами виробляли більше 9995 Ю-молочної кислоти.
Методика бсС-аналізу
Розділяння і кількісну оцінку "О" і "І" енантіомерів молочної кислоти проводили методом хіральної газової хроматографії. Використовувана методика включала у себе каталізований основою гідроліз зразків у метанолі з 2о наступним за цим підкислюванням сірчаною кислотою для каталізу естерифікації, та слідом за цим - екстрагування метиллактатних енантіомерів у дихлорметан. Після цього органічний шар піддавали газохроматографічному (5С) аналізу, використовуючи полум'я-іонізаційний детектор (РІО: Пйате іопігайноп дебесіог) (НеулЛей Раскага 6890, інжектор з розщепленням і без розщеплення, встановлений в режим розщеплення, автоінжекція і РІО-детектор). Енантіомери метиллактату розділяли на хіральній капілярній колонці Га (капілярна колонка Д-ЮОех 325, ЗОм х внутр. діаметр 0,25мм, товщина плівки 0,25мкм, Зиреїсо., Мо24308). Дана методика дозволяла отримувати нормований відносний відсоток "Ю" і "|" молочної кислоти. о
Зразки для (ЗС-аналізу готували шляхом навішування певної кількості зразка (1,000г) у 20мл скляну пробірку, до якої додавали 4мл метанолу. Пробірку закривали кришкою і повільно додавали 15Омкл концентрованої сірчаної кислоти. Після цього пробірку поміщали на 10 хвилин у мішалку з нагрівом Кеаїі-(Пегт (Се) при температурі 6520. Далі до пробірки додавали іонізовану воду (мл) і потім їОмл дихлорметану. Пробірку м закривали кришкою і інтенсивно струшували. Далі за допомогою пластмасового шприца з фільтром і трубчатим наконечником видаляли частину донного органічного шару, а решту донного органічного шару переносили до /-/Ф) 2мл зС-пляшечки для впорскування в зС-хроматограф. о
Приклад 1М. Вироблення ЮО-молочної кислоти в шейк-колбах з культуральними середовищами на ХРО з глюкозою клітинами К. тагхіапиз із захованим у них О-ГОН-геном штаму Г/. Пеїмейсив, інтегрованим угеному с буферизованих умовах.
Використовувалися шість трансформантів під назвами СО554, СО555, СО556, СО0557, СО558 і СО559, що виробляли оптично чисту ЮО-молочну кислоту. Ці штами культивувалися в 250мл шейк-колбах бічного качання, « що містили Хомл УРО-середовища, доповненого 100г/л глюкози, і засівалися із чашок з УРО-агаром. Культури вирощували протягом 16 годин при 302С у режимі струшування з частотою 250об./хв. до оптичної густини ОО во - с 0,1. Як тільки кількість глюкози в колбі ставала залишковою, а ріст клітин виходив на експоненціальну фазу, ч продукт культивації в кількості 4г/л еквіваленту сухої маси клітин, збирали шляхом центрифугування і повторно » суспендували у 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили ббмл УРО-середовища, доповненого приблизно 100г/л глюкози і 55г/л СаСО». Культури витримували при 302С і 70об./хв. Через різні інтервали часу відбирали зразки культури, і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур аналізували на глюкозу, О-лактат, бо піруват і етанол методом НРІ С-хроматографії (описаний нижче). о Методика НРІ С-аналізу
В НРІ С-аналізі, що застосовувався в описаних нижче експериментах, використовувалася колонка Віо-Кай ісе) для швидкого кислотного аналізу, об'єднана з колонкою Келех для швидкого аналізу фруктів, кожна з яких -І 20 містила стиролдивінілбензольну смолу у водневій формі. Кількісний аналіз органічних компонентів здійснювали за допомогою детектора індексу заломлення, об'єднаного з ультрафіолетовим детектором на 22Онм, 0 використовуючи як внутрішній еталон ізомасляну кислоту. Зразки готували шляхом навантаження відомої їх кількості і розбавлення їх при наявності внутрішнього еталону. Приготований таким чином розчин упорскували в
НРІ С-установку і проводили кількісний аналіз за відомими методиками. оо В описаних умовах культивування штами СО554, СО555, СО556, СО557, СО558, СО559 продукували більше
Ф! 9996 ОЮ-молочної кислоти з корисним виходом 92-9895 на основі глюкози, причому титр Ю-молочної кислоти лежав у межах 82-90г/л, а об'ємна продуктивність перевищувала 2,2г/л/год. при температурі 3020. ді Приклад 2А. Конструювання штамів з делеціями РОС1-кодуючої послідовності і 0-І ОН-тейом із клітин Ї.
Пеїмейісив, інтегрованим у локус РОС1 методом заміщення в одну стадію. 60 Була сконструйована плазміда рСАБбО шляхом лігування 4700п.о. МооМІМ/Раі! фрагмента із плазміди рукав (Приклад 1К) в остов плазміди рРВНОс (описаної в Прикладі ЗВ, Фіг.1бс), зрізаної ферментами Мвсі і загАЇ.
Фрагмент руУк48 містив 0-І ОН-ген із І. Нпеїмейісив, слимульований РОК-промотором із 5. сегемізіаеє, і наступну за ним послідовність (ЗА! 10 із 5. сегемізіде завершення транскрипції. Цей полігенний експресуючий кластер є суміжним з геном стійкості до гігроміцину (прі), що стимулюється РОС1-промотором із 5. сегемізіде з наступним бо за ним СА10-термінатором (5. сегемізіде). Фрагмент руК48 був лігований в остов рВН5с, що генерує плазміду рСАБО, в котрій конструкція 0-ІОН:при фланкована послідовностями безпосередньо зліва і справа локусу РОС1 із К. тагхіапиз (Фіг.14).
Плазміда рСАБО була піддана гідролізу ферментами ЗБ апа Взекі! для створення фрагмента завдовжки 6272п.о. Частина 2,5мкг цього фрагмента була відділена й очищена шляхом гель-електрофорезу для використання в трансформуванні. К. тагхіапиз (СО21) дикого типу був трансформований цим очищеним фрагментом згідно з протоколом електропорації, описаним у Прикладі 1М. Трансформовані клітини були висіяні на чашки для селекції з УРО-середовищем, що містили 150мкг/мл гігроміцину для добору клітин, які містили чи то випадкове інтегрування фрагмента рСАБбО у геном, чи то гомологічне заміщення цим фрагментом РОС1 7/0 локусу дикого типу. Через З дні культивування при З302С колонії були відділені і висіяні штрихами на свіже
УРО-середовище з 15Омкг/мл гігроміцину для підтвердження фенотипу.
Колонії були піддані РСК-аналізу з метою ідентифікації тих з них, що містили гомологічне заміщення локусу
РОСІі дикого типу фрагментом рСАБО. Клітини були повторно суспендовані в РСК-реакційному середовищі з метою приготування матричної ДНК. Для ампліфікації 3'і-кінця при-гена був приготований 5'і--праймер осСА85 75 З-ББА ССО АТО ОСТ То ТАС АА-У, ЗЕО ІЮ Мо.29. Для ампліфікації послідовності справа від локусу РОСТ із
К. тагхіапиз був сконструйований 3'і- праймер оСА8О 5-ТСОо СТТ АСС ТСОо СТА САС дА-3" 5ЕО ІЮО Мо.30, якого не було в конструкції РСА5БО. В ампліфікаційному аналізі як зонд для цільової послідовності використовувалася
Тад-полімераза (Оіадеп), а умови РСК-реакції були такими: стадія початкового плавлення при 9592 протягом 10хв., після цього 40 циклів ампліфікації по ЗОс при 952С, ЗОс при 552 і Зхв. при 722С, слідом за чим 1Охв. при 20. 7296.
Трансформовані клітини, що мали подію гомологічного заміщення, генерували 2500п.о. РСК-продукту.
Випадкові події інтеграції не генерували РСК-продукт з праймерами оСАВ5 і оСА80. Штами від СЮО597 до СОб6О1 були позитивними щодо цього 2500п.о. РСК-продукту.
Приклад 28. Вироблення О-молочної кислоти в комплексному СасСо з3-буферизованому середовищі в СМ мікроаеробних шейк-колбах з культурами К. тагхіапив, що містили одну копію 0-І ОН, інтегровану в локус РОС1 (5) методом заміщення в одну стадію.
Було проведено порівняння растА:!Їй-0--ОН штаму СО587 (із Прикладу ЗЕ), утвореного в результаті події двостадійного заміщення, з растА:їй-0--ОН штамами СО597, СО599 і СОбО0О, створеними шляхом події заміщення в одну стадію (із Прикладу 2А) для визначення того, чи продукують ці штами подібні між собою титри (Се) молочної кислоти незалежно від методу їх створення. м
Була створена біомаса в шейк-колбах бічного качання шляхом вирощування протягом ночі при 37 ес і частоті струшування 225об./хв. у середовищі УРО-100г/л глюкози і 450г/л СаСОз. Із цих шейк-колб з вирощеною /-Ф) протягом ночі біомасою 2г/л сухої маси клітин було інокульовано в колби для виробляння продукту. о
Застосовувалися такі умови продукування: середовище МРО Ж-100г/л глюкози і ї-50Ог/л СасСо 3з у режимі струшування з частотою 70об./хв. у шейк-колбах бічного качання при 35 оС. Зразки відбирали з різними 99 інтервалами часу: біомасу і СаСОз видаляли шляхом фільтрації, а фільтрати піддавали аналізу на глюкозу, лактат, ЕЮН і піруват за допомогою НРІ С-хроматографії (Приклад 1М).
Через 54 години штами СО587, СО589 і СО590 спожили 85-88г/л глюкози, виробивши 81г/л лактату і 2,5г/л « пірувату. Ці титри лактату представляли лактатний вихід 92-9595 на глюкозі і об'ємну продуктивність більше 1,5г/л за годину в мікроаеробних умовах. Дані результати свідчать про те, що О-І ОН-трансформанти здатні о) с продукувати ЮО-молочну кислоту. Ферментативний аналіз молочної кислоти, виробленої цими штамами, показав, "» що така молочна кислота більш ніж на 9995 є енантіомерно чистою Ю-молочною кислотою. " Наведені результати показують, що О0-ЇОН-трансформанти (20597, СО599 і СОбО00), створені методом генного заміщення в одну стадію, здатні виробляти О-молочну кислоту подібно штаму СО587 з двостадійним заміщенням. бо Приклад ЗА. Конструювання плазміди руУкК29, що має ген стійкості до (3418, функціонально зв'язаний з о РОК-промотором і САГ. 10-термінатором із 5. сегемізіае (РрУК29).
Маркер стійкості до (3418 (рУкК22; Приклад 1С) був клонований у рМС2 (Приклад 1А), і ця конструкція була се) позначена як руУкК29 (Фіг.15). Для експресії гена стійкості до (3418 використовувалися РОК-промотор 5. -І 20 сегемівіде і вЛМО-термінатор 5. сегемізіае Ген стійкості до 5418 був РСК-ампліфікований при використанні
Ріш-полімерази (Зігаїадепе, Мадізоп, МУ!) з праймерами 5-СО0Т СТА САТ САО ССА ТАТ ТСА АСО ОА ААС м, (5О-фрагмент; ЗЕО. ІЮ МО.9) і У-АТО САТ ССТ ТАС ААА ААС ТСА ТО АОС АТС (3О-фрагмент; ЗЕО. ІЮ
МО.10) ії як матриці - плазміди рУК22 (Приклад 1С). В альтернативному варіанті як матрицю можна використовувати також плазміду рРІСОК (Іпмігодеп, Сагізрад, СА). Термоциклування проводили в такому режимі: го початкове інкубування реакційної суміші протягом 5хв. при 952С, після цього 35 циклів по ЗОс при 9520, ЗОс при
ГФ) 49900 і 2хв. при 7290 і остаточне інкубування протягом 1Охв. при 72 «С. РСК-продукт піддавали гідролізу ферментами Ватні і Храї, і 821п.0о. фрагмент був виділений і лігований у 4303п.о. ВатНі-ХраІ-фрагмент о плазміди рМС2. Утворювана в результаті плазміда руУкг9 (Фіг.15) містила РОК-промотор і САЇ 10-термінатор, функціонально зв'язані (тобто транскрипційно активні в дріжджовій клітині) з геном стійкості до 5418. 60 Приклад ЗВ. Плазміда для цільового інтегрування ДНК у РОС1-локус штаму К. тагхіапив
Послідовність ДНК, що фланкує РОС1-ген клітин К. тагхіапиз була клонована у плазміду РУК29 (Приклад ЗА,
Фіг.15) з утворенням рекомбінантної нуклеїнової кислоти для спрямованого інтегрування ДНК у локусі РОСТІ.
Отримана в результаті конструкція була позначена як рВНба (Фіг.1б6А). Конструкція рВН5ба містить сайт рестрикції ЗБІЇ, який дозволяє клонованим генам бути оперативно зв'язаними з РОС1-промотором. бо Фрагмент ДНК завдовжки 1254п.0о. безпосередньо зліва від РОС1 був ампліфікований шляхом РСкК-реакції з праймерами 5-САА САА СОТ АСС ССТ СТО ТАА АСТ ТОА АСА-3(5'-бік 5; 5ЕО ІЮ Мо.31) і 5-СТА АТТ ССТ ОСА
СОТ ОСА АТТ АТТ ТОос ТТ оО-3(5-бік 3; ЗЕО І Мо.32) і плазмідою рО21 (Фіг.7В, Приклад 1РЕ) у ролі матриці. Термоциклування проводили в такому режимі: початкове інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 942С, далі 35 циклів по ЗОс при 942, ЗОс при 552С і 1,5хв. при 722С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 7хв. при 72 9С. РСК-продукт завдовжки 1254п.о. був шляхом електрофорезу відділений на 0,8 агарозному гелі та ізольований. РСОК-продукт і плазміда руК29 (Фіг.15а) були піддані гідролізу ферментами Крпі і ЗБ. Пдролізований РСК-продукт був лігований у 5067п.о. плазміду рМК29 з одержанням плазміди рВН5ба завдовжки 6315п.о. (Фіг.11 А). Отримувана в результаті плазміда містила ген стійкості до 5418, функціонально 70 зв'язаний з РОС1-промотором і СА 10-термінатором із клітин 5. сегемівіде, і 1240п.о. фрагмент ДНК, гомологічний до ДНК безпосередньо зліва від РОС1-гена.
Фрагмент ДНК завдовжки 535п.о. безпосередньо справа від РОСІ1 був РСК-ампліфікований з праймерами 5-ССА АОС ССТ ОСА ОБА БдО ОА САО САТ ААДА ОА-3(3-бік 5; ЗЕО ІЮО Мо.33) і 5-СТО СТА АСО СОТ ОтТА
САА ТТ ОТО ОАА САД-3 (3-бік 3: 5ЕО ІЮ Мо.34), використовуючи як матрицю плазміду реО21 (Фіг.7А). 75 Термоциклування проводили в такому порядку: початкове інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 942С, після цього 35 циклів ампліфікації по ЗОс при 942, ЗОс при 552С і 45 с при 722С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 4хв. при 722. РСК-продукт був відділений методом електрофорезу на 0,895 агарозному гелі, і був відділений 535п.о. продукт. РСОК-продукт був підданий гідролізу ферментами ЗБ і Міші. Фрагмент завдовжки 529п.о. був лігований з фрагментом ЗБІ-Міш! плазміди рВНб5ба з утворенням плазміди рвВнН5Б. Плазміда рВН5БЬ містила 1200п.о. ДНК безпосередньо зліва і 500п.о. ДНК безпосередньо справа від РОСТІ з унікальним сайтом ЗБІЇ, розташованим між фланкуючими послідовностями РОСІ, включаючи також маркер стійкості до 418, що піддається селекції, функціонально зв'язаний з РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором із клітин 5. сегемізіде. Ця плазміда схематично показана на Фіг.16р.
Частина локусу РОС1 (К. тагхіапиз) була також клонована у продажну плазміду риОС19 (Іпийгодеп) для с створення рРВН5с таким чином. Плазміду рО21 піддавали гідролізу ферментами МНпе | і Мае І, ії 3339п.о. о фрагмент ДНК, що містив 486п.о. ДНК безпосередньо зліва від РОСТІ, повну послідовність РОСТІ і 1157п.о. ДНК безпосередньо справа від РОСІ, був виділений методом електрофорезу на 0,895 агарозному гелі. Плазміда рисС19 піддавалася гідролізу ферментами Хбра! і Маеї, і 2452п.о. фрагмент ДНК був виділений методом електрофорезу на 0,895 агарозному гелі. Гідролізована плазміда рОС19 і локус РОСІ були зшиті разом, Ф утворюючи 5791п.о. плазміду рВН5с, яка схематично зображена на Фіг.16бс. їч-
Приклад ЗС. Плазміда для спрямованого інтегрування 0-І ОН-гена із І. пеїмейсив у локус РОСТІ із штаму К. тагхіапив. (22) р-ГОН-ген із плазміди рмК48 (Приклад 1К) був клонований у сайт ЗБ плазміди рВН5Ь для створення о рекомбінантної нуклеїнової кислоти, здатної інтегрувати 0-І ОН у локус РОС1 штаму К. тагхіапиз і експресувати
Б-ГОН під контролем ендогенних РОС1-промотора і термінатора. с 0р-ГОН-ген був РСК-ампліфікований при використанні праймерів 5-ТТТ ТТА ССТ ОСА ОС ТАС АТТ ТАТ
САС ААА (0-3 (10-0-ГОН 57 ЗЕБЕО ІО Мо. 35) і 5-ТСТ АСС ССТ ОСА ОбА ААА СТІ ОТ СТ ОТ СА-3 (п-0-ГОН 3 5ЕО ІО Мо.36) і плазміди рУк47 (Приклад 1.)) у ролі матриці. Термоциклування проводили в такому « порядку: 30 циклів по ЗОс при 942, З0Ос при 552С, 1,5хв. при 722С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 4хв. при 7292 у безперебійній РСЕ-установці (Ерісепіге, Мадізоп, УМ). РСЕ-продукт відділяли методом о) с електрофорезу на 0,895 агарозному гелі, отримуючи продукт завдовжки 1028п.о. РСК-продукт піддавали "з гідролізу ферментом ЗБИ і зшивали з 6844п.о. ЗБІІ-гідролізованою рВН5р-плазмідою з утворенням 7872п.0. " плазміди рВНб. Плазміда рВНЄ містила 0-І ОН-ген, функціонально зв'язаний з РОС1-промотором і термінатором, а також з маркером стійкості до (3418, функціонально зв'язаним з РОС1-промотором і САЇ 10-термінатором 5. сегемівіде. Плазміда рВНЄ схематично зображена на Фіг.17. со Приклад З0. Інтегрування плазміди рВНЄ у локус РОСІ, створення штаму СО588 штаму К. тагхіапив о Плазміда рВНб для інтегрування, що містила 0-І ОН, була трансформована в К. тагхіапиз (СО21) дикого типу. Плазміда була повністю інтегрована в локус РОС1 шляхом початкової одиночної гомологічної рекомбінації і, між фланкуючою РОСТІ ДНК безпосередньо зліва від 0-І ОН-гена плазміди рВНЄ і ДНК безпосередньо справа від -і 250 РОСІ1-гена на хромосомі. Утворюваний у результаті штам містив копію РОСІ дикого типу, а також одну копію рВНе, інтегровану в локус РОСТІ. щи Штам СО021 використовувався для інокуляції ХОмл УРО середовища, доповненого 100г/л глюкози в 250мл шейк-колбі бічного качання до оптичної густини ОО воо 0,1. Культуру вирощували протягом 1бгод. при 302 і частоті струшування 250об./хв. до остаточної ОО оо 12. Клітини із 1Омл культури збирали шляхом 29 центрифугування і один раз промивали буфером для електропорації (ЕВ: 10мММ Ттіз-СІ, 270мМ цукрози, 1мМ
ГФ) Масі», рН7,5). Клітини повторно суспендували у буфері для інкубування (ХРО «25мМ ОТТ, 20мММ НЕРЕЗ, рНВ,0) юю та інкубували при температурі 302С з частотою струшування 250об./хв. протягом ЗОхв. Клітини збирали шляхом центрифугування й один раз промивали буфером для електропорації. Далі клітини знов суспендували в Тмл буферу для електропорації, і 4О0мкл цієї суспензії переносили до 0,4см кювети для електропорації. До цієї ж 60 кювети додавали 12мкг незрізаної рВНб-плазміди в загальному об'ємі 5Омкл, і клітини піддавали електропорації з параметрами 1,8кВ, 1000Ом, 25мкФ. Далі клітини переносили до їмл УРО-середовища в 5Омл пробірці
Фальконе із загвинчуваною кришкою та інкубували при температурі 309 з частотою струшування 250об./хв. протягом 4 годин, і після цього селективно висівали на УРО-середовище, що містило ЗООмкг/мл (418.
Трансформанти вирощували при 372С протягом 2 днів. Трансформанти, що росли, були висіяні штрихами на 65 свіжі чашки для селекції.
Перевірка на правильність проведення інтегрування плазміди рВНб у локус РОСІ1 шляхом одиничної гомологічної рекомбінації між рланкуючою РОС1 ОМА безпосередньо зліва від О-І ОН-гена плазміди рВНб і ДНК безпосередньо справа від РОС1-гена на хромосомі К. тагхіапиз проводили при використанні праймерів 5-ААО
САС САА БОС СТІ САА САС-3 (РОСТІ хромосома 5; ЗЕО ІЮ Мо.37) і 5-СТТ сто То АСо ТАА ТАС АСо Тос
АсС-3У (0-І ОН 3; 5ЕО ІО Мо.38), спроектованих на ампліфікацію 2700п.о. продукту між хромосомною ДНК зліва від РОС7-гена і зовні гомології, інкорпорованої у рВНб, і О-ОН-геном. Термоциклування проводили шляхом інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 942, далі 35 циклів по ЗОс при 942, ЗОс при 5590 і Зхв. при 7292С, за чим йшло остаточне інкубування протягом 7хв. при 7220. Сім із десяти проаналізованих трансформантів 70 дали очікуваний 2700п.о. РСК-продукт. Два продукти РСК-аналізу з праймерами, розрахованими на ампліфікацію РОС1-локусу, 5-СОС ААА САА ААО СТО САС АСО-3 (РОСТІ 5; ЗЕО ІЮО Мо. 39) і 5-ССС АТА СОС
ТТА ТАА ТСС ССС-3 (РОС1 37 5ЕО ІЮ Мо. 40), мали смугу завдовжки 1700п.о., що відповідала РОСТ, і смугу завдовжки 1000п.о., що відповідала СБ-І ОН. Термоциклування проводили шляхом інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 942С, далі 35 циклів ампліфікації по ЗОс при 942С, ЗОс при 5520 і 2хв. при 7290 і остаточне 75 інкубування протягом бхв. при 72 С. Для подальшої перевірки події інтеграції однієї копії був застосований аналіз методом Саузерн-блотінгу із зондом, розрахованим на детектування гена стійкості до 5418. Один із семи проаналізованих трансформантів показав правильний характер покресленості, що узгоджувався з інтегруванням однієї копії РВНЄ. Штам з однією копією рВНбЄ, розташованою в локусі РОСТ, згідно з результатами РСкК-аналізу й аналізу методом Саузерн-блотінгу був позначений як СО588.
Подані результаті показують, що спрямоване інтегрування трансформованої ДНК рВвнЄ у локус РОС1 штаму
СО21 із К. тагхіапиз дикого типу відбулося шляхом однієї гомологічної рекомбінації між промоторними послідовностями РОСТІ. Ці результати також підтверджують те, що плазміда рВНЄ є наявною в єдиній копії в штамі СО588.
Приклад ЗЕ. Втрата остову плазміди рВНб і РОС1-гена зі штаму СО588, створення штамів СО587, СО589 і Ге
СО590 (5)
Штам СО588 був розведений на неселективному середовищі для декількох циклів вирощування з метою проведення другої гомологічної рекомбінації між РОС1-термінаторними послідовностями інтегрованої рВНЄ і нативним РОС1-термінатором. Результатом другої події гомологічної рекомбінації в термінаторних послідовностях став штам, в якому РОС1-ген був заміщений на 0-І ОН-ген. Цей штам не містив маркерногогена «(0 стійкості до 5418 через втрату гена разом із геном РОС1, що відбувається внаслідок другої події рекомбінації. м
Утворюваний у результаті цього штам, у якому РОС1 заміщений на 0Б-ГОН, демонстрував (3418-чутливий фенотип поряд з відсутністю анаеробного росту. (о)
Штам СО588 висіювали на чашки з УРО-агаром і вирощували протягом ночі при температурі 372С. Мазок о колоній був перенесений до свіжих чашок з УРО-агаром. Цю процедуру повторяли чотири рази. Після п'ятого циклу неселективного вирощування на чашках з УРО-агаром шість 250мл шейк-колб бічного качання, що містили г) по 5Омл середовища УРО, доповненого 100г/л глюкози і 42г/л СаСО»з, були інокульовані клітинами СО588 із п'яти циклів неселективного висівання до оптичної густини ОО воо 0,1. Вирощування в шейк-колбах тривало 16 год. при 302 з частотою струшування 250об./хв. Після цього культури розбавили і використовували для « засівання поодиноких колоній на чашках з УРО-агаром. Крім того, по одному мазку колоній із чашок п'яти циклів неселективного вирощування було суспендовано в їмл РВ5 (забуференого фосфатом сольового розчину), після о) с чого суспензії розбавили і використовували для засівання поодиноких колоній на чашках з УРО-агаром. "» Поодинокі колонії, отримувані внаслідок проведення цих циклів засівання, висівали на УРО-агар і поміщали в " анаеробну камеру. Через 2 дні інкубування при температурі 372С анаеробну камеру відкривали, і помічали колонії, що росли в анаеробних умовах. Після цього чашки інкубували ще 1 день при 372С. Далі колонії, що росли в аеробних умовах, але не росли в анаеробних умовах, переносили до трьох однакових чашок для бо скринінгу. Чашками для даних умов скринінгу були: чашки з УРО (аеробні), чашки з ХРО (анаеробні) і чашки з ав | ХРО, до яких було добавлено З0Омкг/мл 5418. Були ідентифіковані З трансформанти бажаного фенотипу, що мали чутливість до 5418 і не росли в анаеробних умовах. Ці трансформанти були позначені як СО587, СО589 і шо СОБоО. -і 20 Підтвердження заміщення РОСТІ на 0-І ОН було одержане за допомогою праймерів 5-СОС ААА САА ААДО
СТО САС АСОС-3 (РОСІ1 5; 5ЕО ІЮО Мо.39) і 9-ССС АТА СОС ТТА ТАА ТОС ССС-3У (РОС1 37 5ЕО ІЮО Мо.40), щи розроблених для ампліфікації локусу РОС1, використовуючи в ролі матриць хромосомні ДНК зі штамів СО587, сор589 ії СО590. Термоциклування проводили в такому режимі: початкове інкубування реакційної суміші протягом 2хв. при 942С, після цього 35 циклів по ЗО с при 942С, ЗО с при 559С, 2хв. при 722С, за чим йшло остаточне 99 інкубування протягом 5хв. при 7220. Хромосомні ДНК від усіх трьох штамів давали один 1100п.о. РСК-продукт,
ГФ) що відповідав 0-І ОН. Аналіз методом Саузерн-блотінгу із зондом, спроектованим для гібридизації з геном (3418, 7 показав відсутність гена 5418. Крім того, Саузерн-блотінг із зондом для ділянки, що кодує РОСТІ, не показав ніяких смуг. Зонди, спроектовані для гібридизації з ділянками безпосередньо зліва і справа від РОСІ, давали смуги, розміри яких узгоджувалися із заміщенням РОСТІ на 0-І ОН. 60 Ці результати свідчать про те, що РОСМ-ген разом з остовом плазміди рВНбЄ , що містив маркер стійкості до 418, функціонально зв'язаний з РОС (-промотором і САЇ 10-термінатором із 5. сегемізвіае, були втрачені із хромосоми клітини СО588 внаслідок другої події гомологічної рекомбінації, що відбувалася між двома
РОСІ1-термінаторами, наявними в локусі РОС1 клітини СО588. Зазначена друга подія рекомбінації приводила до утворення штаму, в якому саме РОС1-ген був заміщений на 0-І ОН-ген з боковими 5БІЇ -сайтами. бо Приклад ЗЕ. Продукування ЮО-молочної кислоти в комплексному Сасо з-буферизованому середовищі в поміщених в мікродзеробні шейк-колби культурах К. тагхіапиз з однією копією 0-І ОН, інтегрованої в локус РОС1
Штам СО588 з Рась І -0-Г ОН і штами СО587, СО589 і СО590 з Рас- І п-0-І ОН культивували протягом 16бгод. при 3092 і частоті струшування 250о0б./хв в 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили 5Омл МРО, доповненого 100г/л глюкози і 50г/л СаСО»з, з наступною інокуляцією до оптичної густини ОО вро 0,1 із чашок з
МУРО-агаром. Після засвідчення того, що в колбах залишилися тільки невеликі кількості глюкози і що клітини вийшли на експоненціальну фазу росту, було зібрано 4г/л еквіваленту сухої маси клітин шляхом центрифугування і повторно суспендувано в 250мл шейк-колбах бічного качання, що містили 5Омл МУРО, доповненого 100г/л глюкози і 5Ог/л СаСОз. Культури витримувалися при 302С з частотою струшування 7Ооб./хв. 70 Через різні інтервали часу із культур відбирали зразки, і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур аналізували на глюкозу, лактат, піруват і етанол за допомогою НРІ С-аналізу (описаного у Прикладі 1М).
Через 23год. Рас- ГП-0-ГОН штам СО588 спожив 127г/л глюкози і виробив ЗЗг/л лактату, З7г/л етанолу і
О0,2г/л пірувату. Рас- Г0-0-ГОН штами СО587, СО589 і СО590 спожили 40-43г/л глюкози і виробили 36-39г/л лактату і 1,0-1,3г/л пірувату.
Через 54год. штами СО587, СО589 і СО590 спожили 85-88г/л глюкози і виробили 81г/л лактату і 2,5г/л пірувату. Ці титри лактату відповідали 92-9595 виходу лактату на глюкозі і об'ємній продуктивності більше 1,5г/л/год. протягом виробничої фази в мікродзеробних умовах. Через 54год. внаслідок високих рівнів ЮО-лактату, виробленого в культурах, утворився нерозчинний кальцій-лактатний осад, що перешкоджав подальшому аналізу. Ферментативний і газохроматографічний аналізи згідно з Прикладом 1Ї показали, що більше 99905 виробленого лактату становив Ю-лактат. В культурах СО587, СОБ589 і СО590, що узгоджувалися із заміщенням
РОСТІ на ІОН, наявності етанолу не виявлялося.
Наведені результати показують, що 0-ІЇ ОН-трансформанти здатні виробляти ЮО-молочну кислоту. Вироблення молочної кислоти функціональним РОСІ давало приблизно однакові кількості молочної кислоти й етанолу, демонструючи те, що 0-І ОН здатний конкурувати з природним РОСТІ за піруват. Заміщення РОСТІ на С-ІОНіз сч штаму. І. Пеїмейсиз удвічі збільшує титр молочної кислоти, приводячи в результаті до підвищення титрів і виходів продукту з наближенням їх до теоретичного максимуму. Крім того, ці штами не виробляють етанол, що о свідчить про заміщення в них РОС1 на 0Б-ГОН. Ферментативний аналіз молочної кислоти, виробленої цими штамами, показує, що ця молочна кислота є більш ніж на 9995 енантіомерно чистою ЮО-молочною кислотою.
Приклад 30. Вироблення О-молочної кислоти при високих температурах у комплексному Ге) СасСО»з-буферизованому середовищі в мікрозаеробних шейк-колбах з культурами із штамів К. тагхіапив
Штам СО21 К. тагхіапив дикого типу, РОС І п-0-ЇОН штам СО588 і Рас- І 1-0-ГОН штами СО558 і СО587 - інокулювали в чашки з УРО-агаром (ОЮОсоо 0,1) і вирощували протягом 1бгод. при 332С у 250мл шейк-колбах д) бічного качання з частотою 250об./хв., що містили 5Омл УРО, доповненого 100г/л глюкози і 50г/л СаСО»з. Після визначення того, що в колбах залишилися невеликі кількості глюкози і що клітини вийшли на експоненціальну о фазу росту, збирали шляхом центрифугування 4г/л еквіваленту сухої маси клітин і повторно суспендували в (се) 25О0мл шейк-колбах бічного качання, що містили 5Хомл РО, доповненого 100г/л глюкози і 50Ог/л СаСО». Культури вирощували в різних температурних умовах - 372С, 422 і 502 при частоті струшування 7О0об./хв. З певними інтервалами часу із культур відбирали зразки і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур « аналізували на глюкозу, лактат, піруват, ацетат, гліцерин і етанол шляхом НРІС-хроматографії (згідно з
Прикладом 1М). - с Через 23 год. РОС 1-0-ГОН штам СО588, процес ферментації якого відбувався при температурі 37 2С, ч спожив 115,5г/л глюкози і виробив 16,2г/л лактату, 37,бг/л етанолу, 7,бг/л гліцерину, 2,бг/л ацетату і 0,2г/л » пірувату. Через 47 год. ферментації при 372С РОС- 1 -0-ГОН штами СО558 і СО587 спожили 99-105г/л глюкози і виробили 90-99г/л лактату, 2,7-3,5г/л пірувату і 1,2-1,4г/л ацетату. У протилежність цьому, штам СО21 дикого типу спожив 115,бг/л глюкози і виробив принциповий для нього продукт - етанол (43,5г/л) і малу кількість бо лактату (1,7г/л). о Через 23 год. РОС 1-0-ГОН штам СО588, процес ферментації якого відбувався при температурі 42 ес, спожив 115,5г/л глюкози і виробив 12,8г/л лактату, 34,7г/л етанолу, 6б,9г/л гліцерину, З,Ог/л ацетату і О,Зг/л і, пірувату. Через 47год. ферментації при 429 РОС- 11-0-/ОН штами СО558 і СО587 спожили 8О0г/л глюкози і -і 20 виробили 75г/л лактату, 2,5г/л етанолу і 1,2-1,4г/л ацетату. У протилежність цьому, штам СО21 дикого типу спожив 115,5г/л глюкози і виробив принциповий для нього продукт - етанол (39,7г/л) і малу кількість лактату щи (1,Ог/л).
Через 47год. РОС. І 1-0--ОН штам СО588, процес ферментації якого відбувався при температурі 50 2С, спожив 49,бг/л глюкози і виробив 6б,8г/л лактату, 9,5г/л етанолу, 4,5г/л гліцерину і 1,8г/л ацетату. Через 47 99 год. ферментації при 502 РОС- 10-0-(ОН штами СО558 і СО587 спожили 15г/л глюкози і виробили 100г/л
ГФ) лактату, 1,2-1,4г/л пірувату і 1,6-1,/7г/л ацетату. У протилежність цьому, штам СО21 дикого типу спожив 7 70,5г/л глюкози і виробив принциповий для нього продукт - етанол (13,бг/л) і малу кількість лактату (0,5г/л).
Наведені результати показують, що трансформанти О-(їапяе- здатні виробляти О-молочну кислоту при температурах до 502С. За даними ферментативного аналізу молочна кислота, вироблена цими штамами, є бо більш ніж на 9995 енантіомерно чистою Ю-молочною кислотою. Хоча загальне споживання глюкози і вихід лактатного продукту зі зростанням температури в цих штамах зменшується, вихід лактату із глюкози у РОС-
Гп-0-ГОН штамів СО558 і СО587 залишається в межах 88-100905.
Приклад ЗН. Вироблення О-молочної кислоти в небуферизованому комплексному середовищі в в5 мікроаеробних шейк-колбах з культурами К. тагхіапиз з однією копією /. Пеїмейсиз О-ІОН, інтегрованою в хромосому, штами.
Штам СО21 К. тагхіапив дикого типу, РОС І п-0-ЇОН штам СО588 і Рас- І 1-0-ГОН штами СО558 і СО587 інокулювали в чашки з УРО-агаром (ООвоо 0,1) і вирощували протягом 16 год. при 302С у 250мл шейк-колбах бічного качання з частотою 250об./хв., що містили бОмл УРО, доповненого додатковими 100г/л глюкози. Після визначення того, що в колбах залишилися невеликі кількості глюкози і що клітини вийшли на експоненціальну фазу росту, збирали шляхом центрифугування 4г/л еквіваленту сухої маси клітин і повторно суспендували в 25О0мл шейк-колбах бічного качання, що містили 5ХОмл УРО, доповненого двома порціями 40г/л глюкози. Культури витримували при 372С і частоті струшування 7О0об./хв. З певними інтервалами часу із культур відбирали зразки і клітини видаляли шляхом фільтрації. Супернатант культур аналізували на глюкозу, лактат, піруват, ацетат, 70 гліцерин і етанол шляхом НРІ С-хроматографії.
Через 23год. РОС І п-0-І ОН штам СО588 спожив 58,9г/л глюкози і виробив 0,9г/л лактату, 0,2г/л пірувату, 2,бг/л гліцерину, О,бг/л ацетату. Величина рН остаточної культури складала 4,6. Головним продуктом цього ферментаційного процесу був етанол у кількості 24-24,7г/л. Через 23 год. РОС- І п-О-І ОН штами СО558 і СО587 спожили 4,1г/л глюкози і виробили 2,5г/л лактату, 1,0г/л пірвату, О,вг/л гліцерину і О4г/л ацетату. Величина 75 РН остаточної культури штамів СО558 і СО587 лежала в межах 3,31-3,65. Головним продуктом цих процесів ферментації був лактат, кількість якого лежала в межах 1,2-33г/л. Штам СО21 дикого типу спожив 58,9г/л глюкози протягом 23 годин і виробив, головним чином, етанол (12,8-20,4г/л) і малу кількість лактату (1,2-1,3г/л), а його остаточна величина рН становила 4,65.
Наведені результати показують, що трансформанти О-І ап виробляють Ю-молочну кислоту при величинах рН 3,31 і вище. Ферментативний аналіз молочної кислоти, виробленої цими штамами, показав, що вона більш ніж на 9995 є енантіомерно чистою ЮО-молочною кислотою.
Приклад ЗІ. Вироблення Ю-молочної кислоти із О-ксилози в штамах
Три генетично модифіковані штами К. тагхіапиз були піддані випробуванням на вироблення Ю-молочної кислоти із О-ксилози у порівнянні зі штамом СО21 (дикого типу) і серед них штам СО558 (з випадковим чином су інтегрованим 0-І ОН-геном із виду Г. Пеїмейсиз з нульовим умістом РОСІ1), штам СО587 (РОСІ:ЇН-0-Г ОН) і штам
СО588 (що містив О-ЇОН-ген із виду | Пеїмеїйісив). Наведені нижче результати показують, що ці генетично і) модифіковані штами здатні виробляти ЮО-молочну кислоту із безглюкозного субстрату.
Клітини штамів СЮО21, СО558, СО587 і СО588 вирощувалися в чашках з УРО-20г/л Ю-ксилозного агару і використовувалися для інокуляції їЇ00мл культурального середовища, що містило 20г/л дріжджового екстракту, Ге) 1ООг/л пептону, 17г/л СаСоО»з і 5Ог/л О-ксилози в шейк-колбах бічного качання. Інокульовані шейк-колби інкубували при 3592 з частотою струшування 250об./хв. Протягом цього процесу із колб відбирали зразки і т виміряли їхню оптичну густину ОЮ боонм з метою моніторингу росту культури і споживання цукру. Приблизно (Ге) через 36 годин клітини збирали шляхом центрифугування і визначали суху масу клітин (СОМУ: сеїЇ агу меїдно кожної культури. У здвоєних шейк-колбах бічного качання, що містили 20г/л дріжджового екстракту, 10г/л о пептону і 5бг/л Ю-ксилози, додавали З3,0г/л СОМУ клітин кожного штаму. Колби інкубували при 359С з частотою (00 струшування 7О0об./хв. Через різні інтервали часу протягом інкубування із колб відбирали зразки для
НРІ С-аналізу і кількісного аналізу складу середовища на глюкозу, Ю-лактат, ксилітол і етанол.
Головним органічним компонентом, що вироблявся штамами СО558 і СО587, була ЮО-молочна кислота, титр « якої в середньому досягав 13,7г/кг. Це відповідало виходу ЮО-молочної кислоти із ЮО-глюкози, приблизно, 33905.
Головним органічним компонентом продукту, що вироблявся штамом СО21, був ксилітот, кількість якого в - с середньому досягала 25,0г/кг. Це відповідало приблизно 5095 виходу ксилітолу із Ю-глюкози. Головним и органічним компонентом продукту, що вироблявся штамом СО588, був ксилітот, кількість якого в середньому ,» досягала 19,6бг/кг. Це відповідало приблизно 4495 середньому виходу ксилітолу із Ю-ксилози. НРІ С-аналіз не виявив наявності гліцерину, цитрату, пірувату, сукцинату та ацетату в продуктах будь-якого з інших штамів.
Приклад 4. Плазміди для експресії О-ЇОН-гена із виду В. теда(егішт і для цільового інтегрування (ее) трансформованої ДНК в локус РОС1 о Плазміди, що містили Ю-ГОН-ген із В. Медаїегішт для цільового інтегрування в локус РОС1-гена із С
Зопогепвзіз були приготовані таким чином. се) Плазміду рМіІ257 (Сапаіїда) лінеаризували ферментом Мсої, і 5-звиси були частково наповнені -1 50 ДНК-полімеразою І, фрагментом Кленова і сумішшю аАТР, астР, і аТТР, за винятком аСТР, із реакційного розчину. Після цього шляхом обробки нуклеазою квасолі золотистої це однониткове розширення видалили. Далі 4) ДНК гідролізували ферментом Ватні, і з 0,895 агарозного гелю після електрофоретичного розділяння виділили фрагмент завдовжки 9200п.0о. Із геномної ДНК штаму В. тедаїйегішт була утворена плазміда рУк47 (Приклад 1), що містила 0-І ОН-ген із В. Медайетгішт. Ця плазміда показана на Фіг.12. Із плазміди РУК47 ферментом Хьа) був ексцизований 1023п.о. фрагмент, що містив І ОН-ген із В. Медаїегішт, і гідролізований з наступним наповненням о 5-звисів ДНК-полімеразою, фрагментом Кленова і всіма чотирма аМТР, і гідролізований ферментом Ватні. 9200п.о. МсоЇї (дефосфорильований)-ВатнНі-фрагмент із рРМІ257 і 976бп.о. їмо) ХьаїЇ(дефосфорильований)-БатНІ-фрагмент із руУкК47 були зшиті, внаслідок чого була утворена плазміда, позначена рМІХХХ, як показано на Фіг.18. Плазміда РМІЮО містить послідовно С зопогепзіз РОС1-промотор, С. бо вопогепзіз РОК1-промотор, функціонально зв'язаний з 5. сегемівіде МЕЇ 5-геном, С. зопогепзів РОК1-промотор, функціонально зв'язаний з В. тедайегішт О-ІОН-геном, і С. зопогепзіз РОС1-термінатор. Плазміду РММОО гідролізували ферментом Мої! для ексцизії 7300п.о. фрагмента, що містив кластери експресії МЕІ5 і ІОН, фланковані 5- і 3З-діллнками РОСІ. Цей 7500п.о. фрагмент використовували для трансформування С.
Зопогепзіз (Сапаїда), і трансформанти були піддані скринінгу на чашках з МРО, доповненого Х-о-да! в б5 концентрації 40мкг/мл. Трансформанти вирощували на чашках з УРО-агаром, доповненим Х-а-здаї! (40мкг/мл).
Цілком зрозуміло, що викладене вище ілюструє деякі конкретні варіанти здійснення даного винаходу і жодним чином не виключає будь-яких модифікацій або альтернатив, еквівалентних їм і охоплюваним ідеєю та об'ємом даного винаходу, окресленими наведеною нижче Формулою винаходу.
Всі цитовані тут першоджерела включені в даний опис в усій їхній повноті шляхом посилання.

Claims (27)

Формула винаходу
1. Рекомбінантна дріжджова клітина виду, що в природному стані не акумулює піруват, яка містить принаймні 70 один екзогенний ЮО-лактатдегідрогеназний ген, інтегрований в її геном, яка відрізняється тим, що цей О-лактатдегідрогеназний ген функціонально зв'язаний з функціональними промоторними і термінаторними послідовностями.
2. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що вона є з роду Сапаїда або Кісулеготусезв.
3. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 2, яка відрізняється тим, що вона є з виду С. зопогепзіз або К. тагхіапив.
4. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначена промоторна послідовність є принаймні на 90 95 гомологічною промотору, що є нативним для зазначених видів дріжджів.
5. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 4, яка відрізняється тим, що зазначена термінаторна послідовність го є принаймні на 90 95 гомологічною термінатору, що є нативним для зазначених видів дріжджів.
6. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 4, яка відрізняється тим, що зазначені види дріжджів містять нативний РОС-ген, який має нативний РОС-промотор, і що зазначена промоторна послідовність є принаймні на 90 96 гомологічною нативному РОС-промотору.
7. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. б, яка відрізняється тим, що зазначений нативний РОС-ген має сч 25 нативний РОС-термінатор, а зазначена термінаторна послідовність є принаймні на 90 95 гомологічною нативному РОС-термінатору. (о)
8. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 7, яка відрізняється тим, що зазначений нативний РОС-ген є делетований.
9. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що зазначені види дріжджів містять со зо нативний РОС-ген і що цей нативний РОС-ген є делетований.
10. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 1, яка відрізняється тим, що нуклеотидна послідовність кодує і - О-лактатдегідрогеназний білок із видів І асіорасій5 Пеїмейіси5, І асіорасійи5 |оппзопії, І асіорасіїи5 о риїЇдагісив, І асіорасіїиз аеїргиескії, | асіорасійив ріапіагит і І асіюобасійив8 репіовив.
11. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 10, яка відрізняється тим, що промотор є із виду дріжджів із | «в) з5 РОДУ Кісулхеготусез або Засспаготусев. со
12. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 11, яка відрізняється тим, що промотор є із виду Кісумеготусевз тагхіапив.
13. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 11, яка відрізняється тим, що промотор є із виду Засспаготусевз сегемівіає. «
14. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 71, яка відрізняється тим, що вона виявляє знижену з с РОС-активність.
15. Рекомбінантна дріжджова клітина за п. 8, яка відрізняється тим, що 0-І ОН-ген інтегрований в локусі :з» делетованого РОС-гена.
16. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини за п. 1 в умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений о зазначеною клітиною.
17. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини зап. 8 в о умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений о зазначеною клітиною.
18. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини зап. 9 в - умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений Ф зазначеною клітиною.
19. Процес ферментації вуглеводу на молочну кислоту, який включає у себе культивування клітини за п. 14 в умовах ферментації в середовищі, що містить вуглевод, який може бути ферментативно перетворений Зазначеною клітиною.
20. Процес за будь-яким з пп. 16, 17, 18 або 19, який, крім того, включає у себе стадію перетворення (Ф) принаймні частини молочної кислоти на лактид. ГІ
21. Процес за п. 20, який відрізняється тим, що він включає у себе, крім того, стадію полімеризації лактиду з утворенням полілактидного полімеру або співполімеру. во
22. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняється тим, що він включає у себе культивування клітини за п. 1 в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно перетворений цією клітиною.
23. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняється тим, що він включає у себе культивування клітини за п. 8 в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно 65 перетворений цією клітиною.
24. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняється тим, що він включає у себе культивування клітини за п. У в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно перетворений цією клітиною.
25. Процес вироблення молочної кислоти, який відрізняється тим, що він включає у себе культивування клітини за п. 14 в умовах ферментації у середовищі, що містить цукор, який може бути ферментативно перетворений цією клітиною.
26. Процес за будь-яким з пп. 22, 23, 24, 25, який, крім того, включає у себе стадію перетворення принаймні частини молочної кислоти на лактид.
27. Процес за п. 26, який відрізняється тим, що він включає у себе, крім того, стадію полімеризації /о лактиду з утворенням полілактидного полімеру або співполімеру. с щі 6) (Се) ча (о) «в) г) -
с . и? (ее) («в) се) - 50 4) іме) 60 б5
UA20041210933A 2002-05-30 2003-05-30 Processes and materials for production of d-lactic acid in yeast UA80976C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38433302P 2002-05-30 2002-05-30
PCT/US2003/017310 WO2003102201A2 (en) 2002-05-30 2003-05-30 Methods and materials for the production of d-lactic acid in yeast

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA80976C2 true UA80976C2 (en) 2007-11-26

Family

ID=29712012

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA20041210933A UA80976C2 (en) 2002-05-30 2003-05-30 Processes and materials for production of d-lactic acid in yeast
UA20041210932A UA88437C2 (uk) 2002-05-30 2003-05-30 Процес ферментації за участю генетично модифікованих дріжджів та спосіб здійснення ферментації

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA20041210932A UA88437C2 (uk) 2002-05-30 2003-05-30 Процес ферментації за участю генетично модифікованих дріжджів та спосіб здійснення ферментації

Country Status (15)

Country Link
US (7) US7534597B2 (uk)
EP (4) EP2878675B1 (uk)
JP (4) JP2005528112A (uk)
CN (4) CN101157930A (uk)
AT (1) ATE367436T1 (uk)
AU (4) AU2003243366B2 (uk)
BR (4) BR0311452A (uk)
CA (3) CA2487116C (uk)
DE (1) DE60315028T2 (uk)
DK (1) DK2878675T3 (uk)
ES (3) ES2529254T3 (uk)
PT (1) PT1513923E (uk)
UA (2) UA80976C2 (uk)
WO (3) WO2003102200A2 (uk)
ZA (3) ZA200409530B (uk)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2553563C2 (ru) * 2009-06-03 2015-06-20 Торэй Индастриз, Инк. Полипептид, обладающий активностью d-лактатдегидрогеназы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способ получения d-молочной кислоты

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1294728B1 (it) * 1997-09-12 1999-04-12 Biopolo S C A R L Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico
US20070031950A1 (en) * 1998-09-11 2007-02-08 Winkler Aaron A Production of D-lactic acid with yeast
US7141410B2 (en) * 2000-11-22 2006-11-28 Natureworks Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of Candida species
BR0311452A (pt) 2002-05-30 2005-03-29 Cargill Dow Llc Processos e materiais para a produção de ácido lático em levedura
EP1626979B1 (en) 2003-05-02 2012-06-06 Cargill, Incorporated Genetically modified yeast species and fermentation processes using genetically modified yeast
JP4460876B2 (ja) * 2003-11-07 2010-05-12 株式会社豊田中央研究所 有機酸存在下におけるプロモーター及びその利用
US20050112737A1 (en) * 2003-11-20 2005-05-26 A. E. Staley Manufacturing Co. Lactic acid producing yeast
JP4806904B2 (ja) * 2004-07-09 2011-11-02 トヨタ自動車株式会社 乳酸生産方法
JP2006296377A (ja) * 2005-04-25 2006-11-02 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 有機酸生産用形質転換体
AU2006291566A1 (en) 2005-06-02 2007-03-22 Cargill, Inc. Genetically modified yeast of the species issatchenkia orientalis and closely related species and fermentation processes using same
PL2305826T3 (pl) 2005-08-10 2016-10-31 Materiały i sposoby do wydajnej produkcji kwasu mlekowego
JP4692173B2 (ja) * 2005-09-13 2011-06-01 東レ株式会社 Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド、これをコードする遺伝子およびｄ−乳酸の製造方法
US7718405B2 (en) * 2005-09-19 2010-05-18 American Air Liquide, Inc. Use of pure oxygen in viscous fermentation processes
CA2623751A1 (en) 2005-09-22 2007-04-05 Tate & Lyle Ingredients Americas, Inc. Improved strains for the production of organic acids
EP2147976B1 (en) * 2005-10-14 2014-07-23 Toray Industries, Inc. Yeast and method of producing L-lactic acid
WO2007117282A2 (en) 2005-11-23 2007-10-18 Natureworks Llc Lactic acid-producing yeast cells having nonfunctional l-or d-lactate: ferricytochrome c oxidoreductase gene
WO2007085443A2 (en) 2006-01-24 2007-08-02 Purac Biochem Bv Genetic modification of homolactic thermophilic bacilli
CA2645361A1 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Cargill Inc. Yeast cells having disrupted pathway from dihydroxyacetone phosphate to glycerol
JP5320692B2 (ja) * 2006-06-28 2013-10-23 東レ株式会社 酵母及びｌ−乳酸の製造方法
US20080064076A1 (en) * 2006-09-11 2008-03-13 Saucedo Victor M Dissolved Oxygen Profile to Increase Fermentation Productivity and Economics
JP5141126B2 (ja) * 2006-09-26 2013-02-13 東レ株式会社 連続発酵によるｄ−乳酸の製造方法
MX2009004659A (es) * 2006-10-31 2009-05-22 Metabolic Explorer Sa Procedimiento para la produccion biologica de 1,3-propanodiol a partir de glicerina con un alto rendimiento.
WO2008052596A1 (en) * 2006-10-31 2008-05-08 Metabolic Explorer Process for the biological production of n-butanol with high yield
CN101743310A (zh) 2006-12-07 2010-06-16 麻省理工学院 全局转录机器的改造
JP5130826B2 (ja) * 2007-03-28 2013-01-30 東レ株式会社 連続発酵による乳酸の製造方法
JP2008283917A (ja) * 2007-05-18 2008-11-27 Toray Ind Inc 乳酸の製造方法
DK2217711T3 (en) 2007-09-20 2015-09-14 Amyris Inc Production of isoprenoids
JP5532919B2 (ja) * 2007-12-07 2014-06-25 東レ株式会社 乳酸脱水素酵素発現カセット、形質転換酵母および乳酸の製造方法
EP2235193B1 (en) 2007-12-23 2015-11-25 GEVO, Inc. Yeast organism producing isobutanol at a high yield
US8455239B2 (en) 2007-12-23 2013-06-04 Gevo, Inc. Yeast organism producing isobutanol at a high yield
EP2238098A4 (en) 2007-12-27 2016-06-01 Gevo Inc RECOVERING HIGHER ALCOHOLS IN DILUTED AQUEOUS SOLUTIONS
CN101939439B (zh) * 2008-02-04 2014-08-06 东丽株式会社 通过连续发酵实施的乳酸的制造方法
US20090235951A1 (en) * 2008-03-18 2009-09-24 Legrande W E Environmentally Responsible Dental Floss and Packaging
JP4963488B2 (ja) * 2008-04-23 2012-06-27 トヨタ自動車株式会社 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法
CA2730595C (en) * 2008-07-08 2014-12-16 Dsm Ip Assets B.V. Low ph dicarboxylic acid production
KR101613754B1 (ko) 2008-10-03 2016-04-19 메타볼릭 익스플로러 강하 막, 와이프드 막, 박막 또는 단경로 증발기를 사용한 발효 브로쓰로부터의 알콜의 정제 방법
JPWO2010084972A1 (ja) * 2009-01-23 2012-07-19 株式会社アグリバイオインダストリ Ｄ−乳酸の製造方法および乳酸においてｄ−乳酸の光学純度または対糖収率を高める方法
CN102482689A (zh) * 2009-06-26 2012-05-30 格沃股份有限公司 从稀水溶液回收高级醇
WO2011003034A2 (en) 2009-07-02 2011-01-06 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
CN102471787B (zh) * 2009-07-28 2016-01-20 三井化学株式会社 乳酸制造方法
CN102575235B (zh) 2009-07-30 2015-05-20 代谢探索者公司 用于通过发酵生产生物化学品的突变甲基乙二醛合酶(mgs)
US9783834B2 (en) 2009-08-27 2017-10-10 Dsm Ip Assets B.V. Dicarboxylic acid fermentation process
CN102596866A (zh) * 2009-10-06 2012-07-18 格沃股份有限公司 将可再生异丁醇选择性转化为对二甲苯的整体工艺
WO2011131667A1 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Cell suitable for fermentation of a mixed sugar composition
US9012190B2 (en) 2011-06-15 2015-04-21 Butamax Advanced Biofuels Llc Use of thiamine and nicotine adenine dinucleotide for butanol production
CA2807102C (en) 2010-07-31 2018-08-21 Myriant Corporation Improved fermentation process for the production of organic acids
WO2012049170A2 (en) 2010-10-13 2012-04-19 Dsm Ip Assets B.V. Pentose and glucose fermenting yeast cell
WO2012071470A2 (en) 2010-11-22 2012-05-31 Cargill, Incorporated Compositions and methods for increased ethanol titer from biomass
CA2818499A1 (en) 2010-11-22 2012-06-07 Novozymes, Inc. Compositions and methods for 3-hydroxypropionic acid production
WO2012103261A2 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Finley Kenneth R Compositions and methods for succinate production
CN103649306B (zh) * 2011-03-29 2015-07-01 雀巢产品技术援助有限公司 在d乳酸生产中有缺陷以及具有改善的免疫特征的约氏乳杆菌菌株cncm i-1225的天然衍生物
GB2505148B8 (en) 2011-04-07 2016-12-07 Virdia Ltd Lignocellulose conversion processes and products
EP2697252B1 (en) 2011-04-11 2016-08-10 Cargill, Incorporated Compositions and methods for increased ethanol production from biomass
AR086471A1 (es) 2011-04-22 2013-12-18 Dsm Ip Assets Bv Celula de levadura capaz de convertir azucares que incluyen arabinosa y xilosa
US8728798B2 (en) 2011-05-03 2014-05-20 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
US8343752B2 (en) 2011-05-03 2013-01-01 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
CN102285664B (zh) * 2011-05-27 2013-06-19 广西崇左市湘桂糖业有限公司 模拟移动床分离l-乳酸和d-乳酸专用分子筛及其制备方法
WO2013022070A1 (ja) * 2011-08-11 2013-02-14 三井化学株式会社 連続培養によるイソプロピルアルコール製造方法
WO2013112939A2 (en) * 2012-01-25 2013-08-01 Cargill, Incorporated Methods for succinate production
US20150010899A1 (en) * 2012-02-22 2015-01-08 Novozymes A/S Advanced fermentation control
FR2988733B1 (fr) * 2012-03-27 2016-02-05 Carbios Microorganisme recombinant
KR101438882B1 (ko) * 2012-04-24 2014-09-05 씨제이제일제당 (주) 신규한 ｄ형 젖산 생산균주
US9493851B2 (en) 2012-05-03 2016-11-15 Virdia, Inc. Methods for treating lignocellulosic materials
SG11201407183SA (en) 2012-05-03 2014-12-30 Virdia Ltd Methods for treating lignocellulosic materials
KR101576186B1 (ko) * 2012-06-26 2015-12-10 한국생명공학연구원 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도
EP2877568B1 (en) 2012-07-25 2021-04-28 Cargill, Incorporated Yeast cells having reductive tca pathway from pyruvate to succinate and overexpressing an exogenous nad(p)+ transhydrogenase enzyme
WO2014043591A1 (en) * 2012-09-14 2014-03-20 Myriant Corporation Production of organic acids by fermentation at low ph
PL2909305T3 (pl) 2012-10-16 2019-06-28 Dsm Ip Assets B.V. Komórki o ulepszonej konwersji pentozy
BR112015010139A2 (pt) 2012-11-07 2017-07-11 Dsm Ip Assets Bv propagação de levedura com ph controlado
WO2014076232A2 (en) 2012-11-19 2014-05-22 Novozymes A/S Isopropanol production by recombinant hosts using an hmg-coa intermediate
BR112015012409A2 (pt) 2012-11-30 2017-09-12 Novozymes Inc célula recombinante de levedura, e, método de produção de 3-hp
CA2914641A1 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Calysta, Inc. Compositions and methods for biological production of lactate from c1 compounds using lactate dehydrogenase transformants
WO2015017721A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Novozymes A/S 3-hydroxypropionic acid production by recombinant yeasts expressing an insect aspartate 1-decarboxylase
CA2936850A1 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Calysta, Inc. Carbohydrate-enriched recombinant microorganisms
KR20150096019A (ko) * 2014-02-13 2015-08-24 삼성전자주식회사 유전자 조작 효율이 향상된 효모 세포 및 그의 용도
US9593350B2 (en) 2014-02-14 2017-03-14 Samsung Electronics Co., Ltd. Lactate dehydrogenase mutant, polynucleotide coding for the mutant, yeast cell including the polynucleotide, method of preparing the mutant, and method of producing the lactate using the same
JP6183263B2 (ja) * 2014-03-28 2017-08-23 王子ホールディングス株式会社 Ｄ−乳酸の精製のための工程が改良されたｄ−乳酸の製造方法
PT3143075T (pt) 2014-05-16 2022-08-12 Carbios Processo de reciclagem de artigos de plástico pet mistos
WO2016012429A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Dsm Ip Assets B.V. Yeast cell with improved pentose transport
KR102245298B1 (ko) 2014-09-05 2021-04-27 삼성전자주식회사 증가된 edc 활성을 갖고 락테이트 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하는 방법, 그를 제조하는 방법, 및 그를 사용하여 락테이트를 생산하는 방법
US10214754B2 (en) 2014-10-10 2019-02-26 Jmtc Enzyme Corporation Transformant and its production process, and method for producing lactic acid
DK3209771T3 (da) 2014-10-21 2021-01-11 Carbios Polypeptid med en polyester-nedbrydende aktivitet og anvendelser deraf
US10465214B2 (en) 2014-11-20 2019-11-05 Full Cycle Bioplastics Llc Producing resins from organic waste products
JP6711278B2 (ja) * 2014-11-28 2020-06-17 味の素株式会社 イソプレノイド化合物の製造方法
EP3233995B1 (en) 2014-12-19 2023-08-09 Carbios Plastic compound and preparation process
WO2016100910A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novozymes A/S Recombinant host cells for the production of 3-hydroxypropionic acid
SE538899C2 (en) 2015-02-03 2017-01-31 Stora Enso Oyj Method for treating lignocellulosic materials
WO2016138303A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Novozymes A/S Mutant host cells for the production of 3-hydroxypropionic acid
US10508269B2 (en) 2015-03-13 2019-12-17 Carbios Polypeptide having a polyester degrading activity and uses thereof
JP2018526969A (ja) 2015-06-04 2018-09-20 バイオアンバー インコーポレイテッドＢｉｏａｍｂｅｒ Ｉｎｃ． 官能基化アルファ置換アクリレートおよびｃ４ジカルボキシレートのバイオベース産生
JP6907132B2 (ja) 2015-06-12 2021-07-21 キャルビオスＣａｒｂｉｏｓ 生分解性ポリエステル組成物及びその使用
WO2017035270A1 (en) 2015-08-24 2017-03-02 Novozymes A/S Beta-alanine aminotransferases for the production of 3-hydroxypropionic acid
WO2017108577A1 (en) 2015-12-21 2017-06-29 Carbios Recombinant yeast cells producing polylactic acid and uses thereof
WO2017198786A1 (en) 2016-05-19 2017-11-23 Carbios A process for degrading plastic products
CN109689864B (zh) 2016-07-13 2023-04-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 苹果酸脱氢酶
JP2020506702A (ja) 2017-02-02 2020-03-05 カーギル インコーポレイテッド Ｃ６−ｃ１０脂肪酸誘導体を生成する遺伝子組み換え細胞
US11718820B2 (en) 2017-08-17 2023-08-08 Cargill, Incorporated Genetically modified haploid Issatchenkia orientalis
WO2019159011A2 (en) * 2018-02-16 2019-08-22 Ptt Global Chemical Public Company Limited Microorganisms and processes for lactic acid production
WO2019191761A1 (en) * 2018-03-30 2019-10-03 Invista North America S.A.R.L. Method for controlling dissolved oxygen concentration in a continuous aerobic fermentation
CN111886345B (zh) 2018-03-30 2023-09-15 英威达纺织（英国）有限公司 高氢气利用率和气体再循环
KR102140596B1 (ko) 2018-04-17 2020-08-04 에스케이이노베이션 주식회사 유기산 내성 효모 유래 신규 프로모터 및 이를 이용한 목적유전자의 발현방법
KR102140597B1 (ko) 2018-04-17 2020-08-03 에스케이이노베이션 주식회사 에탄올 생산 경로가 억제된 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
US11702680B2 (en) 2018-05-02 2023-07-18 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Materials and methods for controlling PHA biosynthesis in PHA-generating species of the genera Ralstonia or Cupriavidus and organisms related thereto
EP3788148A1 (en) 2018-05-02 2021-03-10 INVISTA Textiles (U.K.) Limited Materials and methods for maximizing biosynthesis through alteration of pyruvate-acetyl-coa-tca balance in species of the genera ralstonia and cupriavidus and organisms related thereto
TWI719317B (zh) * 2018-06-13 2021-02-21 遠東新世紀股份有限公司 用於生產乳酸的方法
CN109097293B (zh) * 2018-07-13 2021-10-26 广东利世康低碳科技有限公司 一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母
KR20200040017A (ko) 2018-10-08 2020-04-17 에스케이이노베이션 주식회사 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
WO2020110300A1 (ja) 2018-11-30 2020-06-04 株式会社Ｃｏ２資源化研究所 乳酸を生成するヒドロゲノフィラス属細菌形質転換体
US20220290109A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Utilization Of Carbon Dioxide Institute Co., Ltd. A Recombinant of Hydrogenophilus Bacterium Producing Lactic Acid
US12018245B2 (en) * 2019-08-19 2024-06-25 Ptt Global Chemical Public Company Limited Yeast having improvement of lactic acid tolerance and use thereof
TWI730383B (zh) * 2019-08-21 2021-06-11 遠東新世紀股份有限公司 重組型假絲酵母菌菌株及其製備方法與用途
KR20210041903A (ko) 2019-10-08 2021-04-16 에스케이이노베이션 주식회사 락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
KR20210158676A (ko) 2020-06-24 2021-12-31 에스케이이노베이션 주식회사 젖산 생산능이 증가된 재조합 내산성 효모
RU2752896C1 (ru) * 2020-12-04 2021-08-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) Штамм дрожжей Schizosaccharomyces pombe, продуцирующий L-молочную кислоту, содержащий в составе хромосомы гены трех различных гетерологичных лактатдегидрогеназ
KR102287114B1 (ko) * 2021-01-25 2021-08-06 씨제이제일제당 주식회사 신규한 사이토신 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
WO2022241027A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 Lygos, Inc. Recombinant host cells and methods for producing l-lactic acid
CN113430127B (zh) * 2021-07-07 2024-01-12 江南大学 一种产l-乳酸的重组菌及其应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3384553A (en) * 1965-04-08 1968-05-21 Ceskoslovenska Akademie Ved Method and equipment for aerobic fermentation on liquid culture mediums
IL39710A (en) 1972-06-19 1975-04-25 Imi Inst For Res & Dev Recovery of acids from aqueous solutions by solvent extraction
US4064015A (en) * 1975-05-12 1977-12-20 New Brunswick Scientific Co., Inc. Control of biosynthesis in submerged culture
US4771001A (en) 1986-03-27 1988-09-13 Neurex Corp. Production of lactic acid by continuous fermentation using an inexpensive raw material and a simplified method of lactic acid purification
US5210296A (en) 1990-11-19 1993-05-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Recovery of lactate esters and lactic acid from fermentation broth
US5132456A (en) 1991-05-07 1992-07-21 The Regents Of The University Of California Sorption of carboxylic acid from carboxylic salt solutions at PHS close to or above the pKa of the acid, with regeneration with an aqueous solution of ammonia or low-molecular-weight alkylamine
JP3012377B2 (ja) * 1991-10-11 2000-02-21 名糖産業株式会社 低耐熱性プロテアーゼとその関連物及びその生産法
US5247059A (en) * 1992-01-24 1993-09-21 Cargill, Incorporated Continuous process for the manufacture of a purified lactide from esters of lactic acid
US5142023A (en) 1992-01-24 1992-08-25 Cargill, Incorporated Continuous process for manufacture of lactide polymers with controlled optical purity
US5420304A (en) 1992-03-19 1995-05-30 Biopak Technology, Ltd. Method to produce cyclic esters
FR2693463B1 (fr) * 1992-07-08 1994-09-02 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisation.
US5338822A (en) 1992-10-02 1994-08-16 Cargill, Incorporated Melt-stable lactide polymer composition and process for manufacture thereof
AT398982B (de) 1993-02-18 1995-02-27 Vogelbusch Gmbh Verfahren zur abtrennung und reinigung von milchsäure
US5510526A (en) 1993-06-29 1996-04-23 Cargill, Incorporated Lactic acid production, separation and/or recovery process
IL109003A (en) 1994-03-16 1999-09-22 Yissum Res Dev Co Process and extractant composition for extracting water-soluble carboxylic and mineral acids
JPH08173170A (ja) * 1994-05-25 1996-07-09 Kirin Brewery Co Ltd キャンディダ・ユティリス酵母の形質転換系、およびそれによる異種遺伝子の発現
ATE365805T1 (de) * 1997-05-03 2007-07-15 Nestle Sa Herstellung von l(+)-lactat
IT1294728B1 (it) * 1997-09-12 1999-04-12 Biopolo S C A R L Ceppi di lievito per la riproduzione di acido lattico
US6229046B1 (en) * 1997-10-14 2001-05-08 Cargill, Incorported Lactic acid processing methods arrangements and products
US6046002A (en) * 1998-01-05 2000-04-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Highly parallel and sensitive method for identifying drugs and drug targets
WO2000029604A1 (en) * 1998-11-18 2000-05-25 The University Of Akron Production of biological materials by simultaneous aerobic and anaerobic respiration
CA2374482C (en) * 1999-05-21 2012-09-18 Cargill Dow Llc Methods and materials for the synthesis of organic products
US6268189B1 (en) * 2000-03-24 2001-07-31 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Fungal lactate dehydrogenase gene and constructs for the expression thereof
JP2002136293A (ja) * 2000-08-23 2002-05-14 Toray Ind Inc 微生物およびｄ−乳酸の製造方法
AU3944002A (en) * 2000-11-03 2002-05-27 Genentech Inc Metabolic rate shifts in fermentations expressing recombinant proteins
CN1955299A (zh) * 2000-11-22 2007-05-02 内特尔沃克公司 合成有机产物的方法和材料
US7141410B2 (en) * 2000-11-22 2006-11-28 Natureworks Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of Candida species
KR100426990B1 (ko) * 2001-06-27 2004-04-13 삼성전자주식회사 외부의 코드에 따라 프로그래머블하게 기준 전압을 발생시키는 기준 전압 발생 회로
EP1484407B1 (en) * 2002-03-11 2011-10-26 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Method of controlling ethanol production and mass production of lactic acid and transformant therefor
BR0311452A (pt) 2002-05-30 2005-03-29 Cargill Dow Llc Processos e materiais para a produção de ácido lático em levedura
BRPI0410550A (pt) * 2003-05-22 2006-06-20 Toyota Motor Co Ltd dna que codifica uma proteìna que tem atividade de d-lactano desidrogenase e seus usos

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2553563C2 (ru) * 2009-06-03 2015-06-20 Торэй Индастриз, Инк. Полипептид, обладающий активностью d-лактатдегидрогеназы, полинуклеотид, кодирующий этот полипептид, и способ получения d-молочной кислоты

Also Published As

Publication number Publication date
EP1513939A2 (en) 2005-03-16
US8828707B2 (en) 2014-09-09
ES2290466T3 (es) 2008-02-16
AU2008202963A1 (en) 2008-07-31
BRPI0311517A2 (pt) 2016-06-28
CN1735683A (zh) 2006-02-15
BR0311453A (pt) 2005-03-29
EP1513940A4 (en) 2006-10-25
US20070148748A1 (en) 2007-06-28
DE60315028T2 (de) 2008-04-10
US20040029256A1 (en) 2004-02-12
US20140377794A1 (en) 2014-12-25
CA2487116A1 (en) 2003-12-11
BRPI0311517B1 (pt) 2017-06-27
JP2005528111A (ja) 2005-09-22
CA2487116C (en) 2012-02-21
CN1735691B (zh) 2010-05-26
WO2003102201A2 (en) 2003-12-11
CN1688703A (zh) 2005-10-26
US7534597B2 (en) 2009-05-19
WO2003102152A3 (en) 2004-02-12
AU2003240481B2 (en) 2008-01-10
AU2003243366B2 (en) 2008-01-24
AU2003243366A1 (en) 2003-12-19
CN100335626C (zh) 2007-09-05
AU2003251381A1 (en) 2003-12-19
CA2487296A1 (en) 2003-12-11
JP2005528112A (ja) 2005-09-22
EP1513940A2 (en) 2005-03-16
EP1513923A4 (en) 2006-05-10
CN101157930A (zh) 2008-04-09
CN1735683B (zh) 2010-05-26
CN1735691A (zh) 2006-02-15
JP2009000124A (ja) 2009-01-08
PT1513923E (pt) 2007-10-24
EP2878675A1 (en) 2015-06-03
UA88437C2 (uk) 2009-10-26
WO2003102200A3 (en) 2004-11-04
JP2005528106A (ja) 2005-09-22
ZA200409530B (en) 2005-05-31
EP1513923B1 (en) 2007-07-18
BR0311452A (pt) 2005-03-29
DK2878675T3 (en) 2017-10-23
ES2529254T3 (es) 2015-02-18
WO2003102200A2 (en) 2003-12-11
AU2003251381B2 (en) 2008-04-03
US9428776B2 (en) 2016-08-30
DE60315028D1 (de) 2007-08-30
JP4318638B2 (ja) 2009-08-26
EP1513939A4 (en) 2012-08-01
AU2003240481A1 (en) 2003-12-19
ES2642928T3 (es) 2017-11-20
CA2488196A1 (en) 2003-12-11
ZA200409531B (en) 2005-11-23
US7939298B2 (en) 2011-05-10
WO2003102201A3 (en) 2004-03-18
US7232664B2 (en) 2007-06-19
WO2003102152A2 (en) 2003-12-11
EP1513923A2 (en) 2005-03-16
EP2878675B1 (en) 2017-07-19
US20100137551A1 (en) 2010-06-03
ZA200409529B (en) 2005-06-23
US20110229873A1 (en) 2011-09-22
EP1513939B1 (en) 2014-12-31
AU2003240481B8 (en) 2008-03-20
US20030228671A1 (en) 2003-12-11
US20040043444A1 (en) 2004-03-04
ATE367436T1 (de) 2007-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA80976C2 (en) Processes and materials for production of d-lactic acid in yeast
CN109402158B (zh) 一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法
US20210254031A1 (en) Engineered strain for producing allulose and derivatives thereof, method for construction therefor and use thereof
Zhang et al. Enhancing fructooligosaccharides production by genetic improvement of the industrial fungus Aspergillus niger ATCC 20611
KR101511639B1 (ko) 재조합 미생물 및 이의 사용 방법
CN104508136A (zh) 重组微生物及其用途
KR20150068925A (ko) 변형된 미생물 및 이를 사용하여 부타디엔을 만드는 방법
CN108676766B (zh) 基因修饰的应用及其获得的菌株
EA025990B1 (ru) Полипептиды с оксидоредуктазной активностью и их применение
KR102345898B1 (ko) 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
JP2020501595A (ja) キシリトールを生産するメチニコビア種
CN117645967A (zh) 一种适用于高密度发酵产酶的枯草芽孢杆菌底盘细胞
CN116064345A (zh) 高效生产岩藻糖基乳糖的无抗基因工程菌及其应用
US10995123B2 (en) Pyruvate transporter
CN112126615B (zh) 一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN107223152B (zh) 具有改变的一氧化碳脱氢酶(codh)活性的遗传工程细菌
KR20220096752A (ko) 푸코오스 전이효소를 발현하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 2’-푸코실락토오스 제조방법
KR102320074B1 (ko) 재조합 미생물의 생산 방법
CN107299074B (zh) 甲酸脱氢酶工程菌株的构建方法及应用
KR20180124782A (ko) 바이오매스에서 유래한 탄소원의 고성능 대사를 위한 신규 미생물 균주
KR102683624B1 (ko) 기능적 dna 서열의 안정화된 카피 수를 갖는 미생물 및 관련 방법
CN103757048A (zh) 无抗药基因的酵母-细菌穿梭载体的构建和应用
US20180094268A1 (en) Novel promoter and use thereof
CN110468091B (zh) 微生物及其用途
KR20210045752A (ko) 1,3-부탄다이올 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도