BRPI0311517B1 - Fermentation process - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE FERMENTAÇÃO".

[001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório dos Estados Unidos n° 60/384.333, depositado em 30 de maio de 2002.

[002] Esta invenção foi feita com suporte do governo dos Estados Unidos sob contrato n° DE-FC-36-00GO10598, concedido pelo Departamento de Energia. O governo dos Estados Unidos tem certos direitos nesta invenção.

[003] O ácido lático tem ampla aplicabilidade industrial incluindo usos em síntese e processamento químicos, produção de cosméticos, farmacêuticos, plásticos e alimento. Processos de escala mais industrial para fabricar ácido lático são processos de fermentação. Várias bactérias de produção de ácido lático têm sido empregadas naqueles processos de fermentação.

[004] Recente pesquisa investigou o uso de cepas de levedura recombinante em processos de fermentação de ácido lático. Levedura recombinante potencialmente pode fornecer diversas vantagens sobre as fermentações bacterianas. Algumas cepas de levedura são mais resistentes às temperaturas mais elevadas. Isto potencialmente provê fermentações de temperatura mais elevada, que podem transladar para taxas mais rápidas de fermentações. Melhor resistência à temperatura elevada pode tornar mais fácil purgar um meio de fermentação de micróbios contaminantes, quando o meio pode simplesmente ser aquecido para uma temperatura na qual as espécies indesejadas morrem porém as espécies desejadas podem tolerar. As bactérias de produção de ácido lático tal como lactobacilos requerem um meio de fermentação complexo a fim de produzir eficientemente. A complexidade do meio de fermentação aumenta os custos de matéria-prima e torna mais difícil e oneroso separar o ácido lático do meio de cultura. O em- prego de levedura recombinante oferece a possibilidade de reduzir custos empregando-se um meio de fermentação simplificado.

[005] Porro e colaboradores têm tentado construir uma levedura de produção de ácido lático inserindo um gene LDH exógeno (lactato desidrogenase) em células de levedura de espécies S. cerevisiae, K. lactic, T. delbrueckii e Z. bailii, e rompendo a via de piruvato natura de célula. Observe Porro e outros, "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic ac-id", Biotechnol. Prog., Maio - Junho de 1995; 11(3): 294-8; Porro e outros, "Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts", App. Environ. Microbiol. Setembro de 1999 : 65(9): 4211-5; Bianchi e outros, "Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene", App. Environ. Microbiol. dezembro de 2001; 67(12 5621-5. Porro foi capaz de produzir uma levedura recombinante que produz ácido lático, porém as cepas não realizaram bem o suficiente para implementação em qualquer processo comercial. Para qualificar para uso em um ambiente industrial, a cepa deve gerar boas produções de ácido lático (isto é, conversão elevada do substrato em ácido lático) e produtividade elevada (isto é, rápido metabolismo do substrato em ácido lático). A levedura preferivelmente é capaz de tolerar um meio de cultura tendo um elevado título de ácido lático.

[006] Mais recentemente, Rajgarhia e colaboradores criaram levedura recombinante que exibe produções e produtividades mais elevada do que aquelas de Porro. Veja, por exemplo, WO 00/71738, WO 02/42471 e PCT/US 02/16223. O trabalho de Rajgarhia como descrito em WO 00/71738 tenta ter vantagem do assim chamado fenótipo "Crabtree negativo" exibido por certas espécies de levedura. O efeito de Crabtree é definido como a ocorrência de metabolismo fermentativo sob condições aeróbicas devido à inibição de consumo de oxigênio por um microorganismo quando cultivado em taxas de crescimento específico elevadas (efeito a longo prazo) ou na presença de concentrações elevadas de glicose (efeito a curto prazo). Os fenótipos negativos Crabtree não exigem este efeito, e são desse modo capazes de consumir oxigênio mesmo na presença de elevadas concentrações de glicose ou em taxas elevadas de crescimento. Desse modo, culturas de microorganismos negativos de Crabtree, em teoria pelo menos, podem ser convertida de uma fase de crescimento para uma fase de fermentação (produção) através da manipulação de suprimento de oxigênio. Na presença de aeração significante, os microorganismos desenvolvem-se para produzir biomassa e C02, visto que sob condições anae-róbicas, as células em vez de fermentar o substrato disponível produzem ácido lático ou outros produtos de fermentação.

[007] Foi descoberto, entretanto, que certas cepas não fermentam tão eficazmente quanto desejado sob condições estritamente anaeróbicas. Isto é real, por exemplo, em cepas de levedura construídas nas quais a via de descarboxilase de piruvato (PDC) é deletada ou rompida. Entretanto, o uso de tais espécies construídas é de outra maneira altamente desejável em fermentações de ácido lático (bem como outras nas quais o produto desejado não é etanol), quando o rompimento da via de PDC reduz a quantidade de etanol que é produzido. Consequentemente, seria desejável fornecer um processo de fermentação melhorada no qual uma cepa que não fermenta eficazmente sob condições estritamente anaeróbicas possa produzir um produto de fermentação desejado economicamente.

[008] A figura 1 é um gráfico ilustrando o efeito de OUR sobre o consumo de glicose, produção de ácido lático e rendimento para uma certa espécie K. marxianus geneticamente modificada.

[009] A figura 2 é um gráfico ilustrando o efeito de OUR sobre o consumo de glicose, produção de ácido lático e rendimento para outra espécie K. marxianus geneticamente modificada.

[0010] Em um aspecto, esta invenção é um processo de fermentação onde a taxa de absorção de oxigênio é monitorada durante uma fase de produção do processo de fermentação, e pelo menos um parâmetro de operação é controlado em resposta à taxa de absorção de oxigênio medida.

[0011] Em um outro aspecto, esta invenção é método de conduzir um processo de fermentação em um meio de fermentação compreendendo um microorganismo de fermentação, um substrato que é fer-mentável pelo microorganismo, a fermentação exibindo uma quantidade de oxigênio dissolvido (DO) e uma absorção de oxigênio específica (OUR) durante a fermentação, compreendendo a) medir a OUR durante uma fase de produção de uma fermentação; b) ajustar as condições de aeração tal que a OUR seja mantida dentro de uma faixa predeterminada ao mesmo tempo que mantém o DO em menos do que 1% da quantidade de saturação durante a fase de produção da fermentação.

[0012] Em um terceiro aspecto, esta invenção é um processo compreendendo: a) determinar uma faixa ideal de valores OUR no qual um microorganismo de fermentação fermenta um carboidrato em um produto de fermentação desejado; b) desenvolver o microorganismo em um meio compreendendo um carboidrato que a célula é capaz de metabolizar e um ou mais nutrientes, ao mesmo tempo que aerando o meio tal que as células se desenvolvam e se reproduzam, o (DO) no meio seja reduzido para menos do que 1% da quantidade de saturação e as células exibam uma taxa de absorção de oxigênio especifica de pelo menos 10 mmoles de 02/g peso seco de células/hora (mmol 02/gdw/h); e então c) cultivar o microorganismo em um veículo tamponado sob condições de fermentação incluindo condições de microaeração suficiente para prover a cultura com uma taxa de absorção de oxigênio específica (OUR) dentro da faixa ideal.

[0013] Esta invenção é em outro aspecto um processo de fermentação compreendendo: a) desenvolver células de levedura construídas tendo uma via de PDC rompida e um gene exógeno que permite a célula produzir um produto de fermentação desejado em um meio compreendendo um carboidrato que a célula é capaz de metabolizar, ao mesmo tempo que aerando o meio tal que as células se desenvolvam e se reproduzam, a quantidade de oxigênio dissolvido no veículo seja reduzida para menos do que 1% de saturação e as células exibam uma taxa de absorção de oxigênio específica de pelo menos 10 mmoles de 02/g de peso seco de células/hora (mmol 02/gdw/h); e então b) cultivar as células em um meio tamponado sob condições de fermentação incluindo condições de microaeração suficiente para fornecer a cultura com uma taxa de absorção de oxigênio específica (OUR) de cerca de 0,8 a cerca de 3,0 mmoles de 02/gdw/h.

[0014] Surpreendentemente, o uso de condições de microaeração empregando-se as taxas de absorção de oxigênio como um parâmetro de controle de processo permite que o processo de fermentação seja otimizado, equilibrando rendimentos elevados para o produto de fermentação desejado com boas taxas de produção. As medições de OUR podem ser empregadas para estabelecer e controlar certos parâmetros do processo de fermentação a fim de manter as condições ideais durante uma fase de produção de um processo de fermentação.

[0015] A OUR é a taxa de consumo de oxigênio (02) por peso seco unitário do microorganismo de produção por tempo unitário. A OUR é convenientemente determinada a partir da quantidade de oxigênio que é consumida por tempo unitário, e da massa das células durante aquele período de tempo. O consumo de oxigênio é convenientemente determinado medindo-se a quantidade de oxigênio suprido para e removido do vaso de fermentação por tempo unitário. A OUR é então determinada dividindo-se o consumo de oxigênio pela massa (peso seco) da biomassa no caldo. O peso de biomassa pode ser determinado pegando-se uma amostra e avaliando-se a concentração de célula (peso/volume total) e multiplicando-se o volume total do caldo. A quantidade de oxigênio suprido pode ser honestamente medida monitorando-se as taxas de aeração. A quantidade de oxigênio deixando o vaso de fermentação pode ser medida empregando-se vários métodos analíticos, dos quais a espectroscopia de massa é particularmente útil. A diferença entre o oxigênio suprido e o oxigênio removido é a quantidade consumida pelas células. A OUR é calculada dividindo-se o consumo de oxigênio pelo peso seco das células e pelo tempo unitário. Ela é convenientemente expressa em unidades de mmol de 02 / gramas de células (peso seco)/hora.

[0016] Em seu aspecto mais geral, a invenção envolve medir a OUR durante a fase de produção de uma fermentação, e controlar pelo menos um parâmetro da fermentação em resposta aos valores de OUR medido. O parâmetro que é controlado em resposta à OUR medida tipicamente será relacionado com a aeração do caldo de fermentação, tal como taxas de aeração, taxas de agitação, composição de gás de aeração (aumentando ou diminuindo a concentração de oxigênio no gás, por exemplo), ou algum outro parâmetro que afete a taxa à qual os microorganismos consomem oxigênio.

[0017] Em um aspecto preferido da invenção, as células de fermentação são cultivadas sob várias condições de aeração para empi-ricamente estabelecer uma faixa ideal de OUR para o tipo particular de célula. A faixa de OUR que é ideal geralmente levará em conta diversos fatores, dos quais três tendem a ser superiores: rendimento do produto de fermentação desejado do substrato de fermentação (usualmente expresso em gramas do produto / gramas do substrato consumido), produtividade específica do produto de fermentação desejado (usualmente expresso em peso do produto / peso seco, peso de célula / tempo unitário) e taxas de consumo de substrato (usualmente expressas em peso do substrato consumido / tempo unitário). Estes fatores não são usualmente todos otimizados sob as mesma condições de aeração. Por exemplo, as taxas de consumo de substrato algumas vezes aumentam com o aumento da OUR, porém as produções tendem a cair, desse modo contrabalançando as taxas de produção mais rápidas com as perdas de produção maiores e ferindo as economias gerais do processo. O estabelecimento de uma faixa ideal de valores de OUR geralmente envolverá equilibrar as taxas com produção para otimizar as economias gerais do processo. Uma vez que uma faixa desejada de valores de OUR é estabelecida, as condições de fermentação são selecionadas em uma fase de produção de uma fermentação para estabelecer e manter a OUR dentro daquela faixa. Como anteriormente, OUR é medida durante o processo e um ou mais parâmetros de fermentação são controlados de modo que a OUR seja mantida dentro da faixa.

[0018] Durante esta fase de produção, a concentração de oxigênio dissolvido é mantida em aproximadamente zero, o que reflete a condição de que as células estão consumindo oxigênio em aproximadamente a mesma taxa na qual ela está tornando-se dissolvida dentro do caldo de fermentação. A concentração de oxigênio dissolvido durante a fase de produção é geralmente menor do que 1% da quantidade de saturação (isto é, a quantidade máxima que pode ser dissolvida no caldo sob as condições de temperatura e pressão que são emprega- das). Tipicamente, os conteúdos de oxigênio dissolvido de menos do que cerca de 10 pmoles/L, mais preferivelmente menos do que cerca de 5 pmoles/L, são adequados. Mais preferivelmente, o conteúdo de oxigênio dissolvido é essencialmente zero. O oxigênio dissolvido é convenientemente medido empregando-se um eletrodo de oxigênio com uma membrana permeável a gás (eletrodo Clark), tal como aquela fabricada por Ingold e vendida por B. Braun sob os números de peças 33182418 ou 33182400. A operação em conteúdos de oxigênio dissolvido abaixo do limite de detecção de instrumentos tal como estes é considerado refletir uma concentração de oxigênio dissolvido de aproximadamente zero para os propósitos desta invenção.

[0019] Em um aspecto especialmente preferido desta invenção, um microorganismo é cultivado sob condições de crescimento diferente e produção. Na fase de crescimento, o microorganismo é desenvolvido aerobicamente. As células são desenvolvidas em um meio de cultura que contém água, um carboidrato que a célula pode metabolizar no caldo de crescimento e as fases de produção, e vários nutrientes como descrito mais totalmente abaixo. As condições de aeração são selecionadas tal que (1) as células exibem uma taxa de absorção de oxigênio específica (OUR) de pelo menos 10 mmoles de 02 / gdw/h e (2) ao final da fase de desenvolvimento, a concentração de oxigênio dissolvido (DO) no meio de cultura é reduzida para menos do que 1% da quantidade de saturação ao mesmo tempo que mantendo uma OUR de pelo menos 10 mmoles de 02/gdw/h. A OUR é preferivelmente pelo menos 15 e mais preferivelmente pelo menos 18 mmoles de 02/gdw/h. Durante a fase de crescimento, a OUR é mais preferivelmente tão elevada quanto as células podem gerar. A OUR máxima portanto dependerá um pouco da célula de levedura particular construída que é empregada. Em geral, a OUR máxima é esperada ser em torno de 20 a 30 mmoles de 02/gdw/h. As células de K. marxianus tendo um rompimento de PDC e gene LDH exógeno tendem a exibir uma OUR máxima na faixa de cerca de 20-22 mmoles de 02/gdw/h.

[0020] O DO pode ser e preferivelmente é acima de zero durante a maior parte da fase de crescimento, contanto que seja reduzida para aproximadamente zero ao final da fase. Desse modo, um excesso de oxigênio sobre aquele requerido para manter a OUR requerida pode ser introduzido no meio de cultura durante a maior parte da fase de crescimento, particularmente durante o período durante o qual as células experimentam crescimento exponencial. Quando a absorção de oxigênio total aumenta durante a fase de desenvolvimento quando as células se reproduzem e a biomassa acumula-se, a quantidade total de oxigênio requerida para manter uma OUR constante aumentará. Entretanto, por que a DO pode ser positiva antes do final da fase de crescimento, um meio preferido de condução da aeração é suprir um excesso do oxigênio requerido ao início e durante o estágio exponencial da fase de desenvolvimento. Quando a biomassa acumula-se, o oxigênio total consumido pelas células aumenta até o ponto onde o oxigênio suprido intimamente compara-se àquele consumido pelas células, e o DO cai como um resultado. As condições de aeração constantes podem portanto ser empregadas durante a fase de desenvolvimento, se aquelas condições forem selecionadas tal que o DO cai para zero com a OUR requerida quando a quantidade desejada de biomassa foi produzida. Alternativamente, as condições de aeração podem ser variadas durante a fase de desenvolvimento, contanto que a OUR seja mantida e o DO torne-se aproximadamente zero ao final da fase de desenvolvimento.

[0021] Uma vez que o DO cai para aproximadamente zero e a quantidade desejada de biomassa foi produzida, é preferido manter aquelas condições de aeração (a OUR pelo menos 10 mmoles 02/gdw/h e DO igual a zero) durante um período de tempo antes de mudar para a fase de produção. Um período adequado de tempo adequado é em torno de 15 minutos a 2 horas e um período de tempo preferido é em torno de 30 a 90 minutos. Um período de tempo mais preferido é em torno de 45 a 75 minutos. Se o organismo é mudado para a fase de produção muito rapidamente, as células tendem a exibir taxas de produção fracas. Se estas condições de aeração são mantidas durante muito tempo, as células tendem a exibir produções inferiores para o produto de fermentação desejado bem como taxas de produção inferiores.

[0022] A cultura é transferida para a fase de produção através de uma mudança nas condições de aeração. Na fase de produção, as condições de microaeração são selecionadas tal que a OUR seja mantida dentro de uma alteração predeterminada, como acima descrito. Alguns microorganismos parecem necessitar metabolizar uma pequena quantidade de oxigênio a fim de promover a vitalidade e saúde celular total. Exemplos de tais organismos incluem levedura geneticamente construída tendo um rompimento de PDC, particularmente aquelas tendo um gene exógeno que as possibilite produzir um produto de fermentação particular. Em condições totalmente anaeróbicas, as taxas de consumo de substrato e produção de produto de fermentação exibidas por estas células são usualmente muito baixas. Além disso, as produções do produto de fermentação desejado sofrem. Sob condições microaeróbicas, em certos valores OUR que dependem da cepa particular, as células são capazes de metabolizar o substrato muito mais rapidamente. Isto resulta em taxas aumentadas de consumo de substrato e produção do produto de fermentação desejado. Entretanto, quando os aumentos de consumo de oxigênio ultrapassa um certo valor, as produções para o produto desejado diminuem quanto mais do substrato for convertido em dióxido de carbono. Além disso, as taxas de produção tendem a nivelarem-se ou mesmo diminuírem quando os aumentos de OUR ultrapassam um certo valor, para que as perdas de produção não sejam compensadas pelas taxas aumentadas. Consequentemente, manter a OUR dentro de certas faixas durante a fase de produção permite alguém obter um equilíbrio economicamente ideal de produções e taxas de produção.

[0023] O valor ideal de OUR depende um pouco do organismo particular, embora em geral, a faixa de OUR seja de cerca de 0,8 a cerca de 3 mmoles de 02/gdw/h. Os valores de OUR ideais para um organismo particular são facilmente determinados empiricamente. Uma extremidade inferior preferida da faixa de OUR é em torno de 1,0 mmol de 02/gdw/h e mais preferivelmente cerca de 1,2 mmol de 02/gdw/h. Uma extremidade superior da faixa de OUR é em torno de 2,5 mmoles de 02/gdw/h, mais preferivelmente em torno de 2,0 mmoles de 02/gdw/h.

[0024] A OUR exibida por uma cultura depende largamente do próprio microorganismo e as condições de aeração. As condições de aeração afetam a quantidade de oxigênio que torna-se dissolvido no meio de cultura e desse modo torna-se disponível para o organismo. Para um dado organismo, a OUR aumentada é favorecida por (1) aumento da taxa na qual o oxigênio é suprido e (2) a formação de pequenas borbulhas de oxigênio (para melhorar a transferência de massa de moléculas de oxigênio dentro da fase líquida. A formação de pequenas borbulhas é facilmente obtida através de purga e/ou agitação.

[0025] Exemplos de taxas de aeração durante a fase de crescimento são em torno de pelo menos 0,2 volume de ar/volume de meio de fermentação/minuto (vvm), preferivelmente de cerca de 0,3 a cerca de 2 vvm, ainda mais preferivelmente em torno de 0,4 a cerca de 1 vvm. Na fase de produção, volumes de cerca de 0,01 a cerca de 0,1 vvm, preferivelmente em torno de 0,02 a cerca de 0,75 vvm, especialmente em torno de 0,02 a cerca de 0,5 wm são geralmente adequa- dos. Se o oxigênio é empregado como o gás de aeração, os volumes serão proporcionalmente menores. A aeração é preferivelmente feita sob condições tais como purga que promove a formação de finas borbulhas de gás. A agitação é preferivelmente mantida, particularmente quando valores elevados de OUR são desejados. Tipicamente, as taxas de aeração e condições de agitação são selecionadas juntas a fim de obter a OUR desejada.

[0026] Quando o produto de fermentação é um ácido, o meio de cultura é tamponado durante a fase de produção para que o pH seja mantido em uma faixa de cerca de 5,0 a cerca de 9,0, preferivelmente em torno de 5,5 a cerca de 7,0. Os agentes de tamponamento adequados são materiais básicos que neutralizam o ácido lático quando ele é formado, e incluem, por exemplo, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de potássio, carbonato de sódio, carbonato de amônio, amônia, hidróxido de amônio e similares. Em geral, aqueles agentes de tamponamento que foram empregados em processos de fermentação são também adequados aqui.

[0027] Outras condições de fermentação, tais como temperatura, densidade celular, seleção de substrato(s), seleção de nutrientes, e similares não são consideradas serem críticas para a invenção e são geralmente selecionadas para fornecer um processo econômico. As temperaturas durante cada das fases de desenvolvimento e a fase de produção podem variar de acima da temperatura de congelamento do meio de cultura para acima de 50°C, embora a temperatura ideal vá depender um pouco do microorganismo particular. Uma temperatura preferida, particularmente durante a fase de produção, é de cerca de 30 a 45°C. Quando a célula é um K. marxianus construído, ela pode tolerar temperaturas relativamente elevadas (tais como acima de 40°C e até 50°C, especialmente té 45°C). Outra espécie preferida de célula, C. sonorensis, pode tolerar temperaturas até cerca de 40°C. Esta faixa de temperatura provê a possibilidade de conduzir a fermentação em tais temperaturas mais elevadas (desse modo reduzindo os custos de resfriamento) sem uma perda significante de produtividade. Outra vantagem fornecida pela boa tolerância à temperatura elevada é que se a fermentação tornar-se contaminada com um microorganismo indese-jado, em muitos casos o microorganismo indesejado pode ser seletivamente morto por aquecimento do meio de fermentação para 40°C ou mais, especialmente 45°C ou mais, sem significantemente prejudicar as células desejadas da invenção.

[0028] Durante a fase de produção, a concentração de células no meio de fermentação é tipicamente na faixa de cerca de 1 -150, preferivelmente em torno de 3 a 10, ainda mais preferivelmente em torno de 3 a 6 g de células secas/litro de meio de fermentação.

[0029] Os carboidratos particulares que são empregados dependem da célula hospedeira particular, e se a célula hospedeira for construída para metabolizar qualquer carboidrato particular em piruvato. Os açúcares de hexose tais como glicose, frutose, oligômeros de glicose tais como maltose, isomaltose, maltotriose, amido e maltodextrinas são os preferidos. No caso de açúcares oligoméricos, pode ser necessário adicionar enzimas ao caldo de fermentação a fim de digerir estes para o açúcar monomérico. Um exemplo de um açúcar de pentose adequado é a xilose. A glicose é a mais preferida.

[0030] Em uma fermentação tamponada, os produtos de fermentação acídicos tais como ácido lático são neutralizados quando eles são formados para o sal de lactato correspondente. A recuperação do ácido portanto envolve regenerar o ácido livre. Isto é tipicamente feito removendo-se as células e acidulando o caldo de fermentação com um ácido forte tal como ácido sulfúrico. Um subproduto de sal é formado (gesso no caso onde o sal de cálcio é o agente de neutralização e ο ácido sulfúrico é o agente de acidulação), que é separado do ácido. O ácido é então recuperado através de técnicas tais como extração líquido-líquido, destilação, absorção, etc., tais como são descritas em T. B. Vickroy, Vol. 3, Capitulo 38 de Comprehensive Biotechno-loav. (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, e outros, FEMS Microbiol. Rev,, 1995; 16: 221-231; Patentes dos Estados Unidos nos 4.275.234, 4.771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406 e 5.831.122, e Pedido de Patente Internacional n° WO 93/00440.

[0031] O meio de cultura tipicamente conterá nutrientes como requerido pela célula particular, incluindo uma fonte de nitrogênio (tal como proteínas de amínoácidos, fontes de nitrogênio inorgânico, tal como amônia ou sais de amônio, e similares), e várias vitaminas, minerais e similares.

[0032] O processo da invenção pode ser conduzido continuamente, em batelada, ou alguma combinação destes.

[0033] O microorganismo empregado no processo da invenção é qualquer que (1) fermente um carboidrato para um produto de fermentação desejado e (2) fermente mais eficazmente na presença de condições microaeróbicas do que em condições rigorosamente anaeróbicas. As células de interesse particular são certas céiuias de levedura geneticamente construídas caracterizadas por ter (1) uma via PDC rompida e (2) pelo menos um gene exógeno funcional que possibilite a célula produzir o produto de fermentação desejado. As células de levedura construídas são descritas, por exemplo, em Porro e outros, "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic acid", Biotechnol. Prog. maio-junho de 1995; 11(3): 294-8; Porro e outros, "Replacement of a meta boi ic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts", App. Environ. Microbiol. 1999, setembro: 65(9): 4211 -5; Bianchi e oul· ros, "Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactis strains defective in pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene", App. Environ. Microbiol. dezembro de 2001; 67(12) 56215; WO 00/71738, WO 02/42471, PCT/US02/16223, e Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n° 60/384.333, depositado em 30 de maio de 2002. A célula também preferivelmente exibe o fenótipo negativo de Crabtree, para que ela respire e cresça sob condições de aera-ção na presença de concentrações elevadas de glicose e em taxas de desenvolvimento específicas elevadas.

[0034] Por "rompido", entende-se que uma via de PDC nativa foi alterada de modo que a função da via de PDC seja reduzida em pelo menos 90%. O rompimento pode ser obtido alterando-se a via (ou um ou mais genes associados com a via) de modo que sua função seja reduzida ou eliminada, ou removendo um ou mais genes requeridos para a via funcionar. Uma célula preferida tem uma deleção de um gene de PDC.

[0035] Um gene exógeno preferido é um gene de lactato desidro-genase (LDH). O gene é preferivelmente integrado no genoma da célula. A célula de levedura construída pode ter uma única cópia ou múltiplas cópias do gene de LDH exógeno. Ela pode conter dois ou mais genes de LDH exógeno diferentes. Em uma modalidade especialmente preferida, o gene é integrado no genoma da célula na localização de um gene de PDC nativo, que é deletado. Em uma modalidade especialmente preferida, o gene de LDH está sob o controle funcional de promotor operativo e sequências terminadoras que são pelo menos 90% homólogas às sequências promotoras e terminadoras (particularmente sequências promotoras e terminadoras de PDC) que são nativas para a célula. Estas células preferidas e especialmente preferidas são descritas mais totalmente no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n° 60/384.333, depositado em 30 de maio de 2002, e incorporado aqui por referência.

[0036] Lactobacillus helveticus, Pediococcus acidolactici, Lactobacillus casei, Kluyveromyces thermotolerans, Torulaspora delbrueckii, Schizosaccharomyces pombii e B. megaterium são linhagens que têm genes de L-lactato desidrogenase que podem ser clonados para uso em produção da levedura em construção. Dois genes de L-lactato desidrogenase preferidos são L-lactato de desidrogenase de L. helveticus e B. megaterium. Os Lactobacillus helveticus, Lactobacillus john-sonii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus pentosus são cepas que têm D-lactato desi-drogenases adequadas que podem ser clonadas para uso na levedura construída. Um gene de D-lactato desidrogenase preferido é D-lactato desidrogenase de L. Helveticus.

[0037] Para ser comercialmente útil, a célula construída deve exibir diversas características. A levedura deve converter uma proporção significante do carboidrato no produto de fermentação desejado (isto é, produz um rendimento elevado de produto). Ela deve exibir uma produtividade específica elevada, isto é, produzir uma quantidade elevada de produto de fermentação por peso de célula por tempo unitário. A célula é preferivelmente também tolerante a concentrações elevadas do produto de fermentação. Esta última propriedade permite o processo de fermentação empregar concentrações elevadas do carboidrato de partida.

[0038] Em geral, é desejável que o processo de fermentação da invenção forneça algum ou todos os seguintes aspectos : [0039] Um rendimento de pelo menos 30, preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente pelo menos 60, ainda mais preferivelmente pelo menos 75 gramas de produto de fermentação por grama de substrato. A produção desejada teórica é de 100%, porém limites práticos sobre rendimentos são em torno de 98%.

[0040] Uma produtividade específica de pelo menos 0,1, preferivelmente pelo menos 0,3, mais preferivelmente pelo menos cerca de 0,4 , especialmente pelo menos cerca de 0,5 grama de produto de fermentação/grama de células/hora. Produtividades específicas são desejavelmente tão elevadas quanto possível.

[0041] Um título (concentração máxima de produto de fermentação) de pelo menos 15 gramas/litro de meio de fermentação, preferivelmente pelo menos 20 g/L, mais preferivelmente pelo menos 40 g/L, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 g/L, até 150 g/L, preferivelmente até cerca de 120 g/L. No caso de ácido lático, a temperatura do meio de fermentação afeta a extremidade elevada de títulos facilmente obteníveis um pouco, quando soluções de ácido lático altamente concentradas (isto é, acima de cerca de 150 g/litro) tendem a tornar-se muito viscosas ou gel em temperaturas abaixo de cerca de 35°C. O emprego de uma temperatura de fermentação, tal como de cerca de 35 - 50°C, permite títulos mais elevados sem gelificação ou formação de viscosidade indevida.

[0042] Além disso, o processo de fermentação da invenção preferivelmente obtém uma produtividade de volume elevada. A produtividade de volume é expressa como quantidade de produto produzido por volume unitário de meio de fermentação por tempo unitário, tipicamente grama de produto/litro de meio/hora de tempo. As produtividades de volume de pelo menos 1,5 g/L/h, preferivelmente pelo menos 2,0 g/L/h, mais preferivelmente pelo menos 2,5 g/L/h são desejáveis. Em densidades celulares preferidas de até 3-6 células/litro de meio de fermentação, as produtividades máximas tendem até cerca de 5,0 g/L/h, e mais tipicamente até cerca de 4,0 g/L/h. É altamente preferido conduzir a fermentação de modo que estas produtividades de volume são obtidas quando o pH do meio, temperatura, ou ambos incluem-se nas faixas descritas no parágrafo precedente.

[0043] O ácido lático produzido de acordo com a invenção é útil para produzir lactídeo, um anidrido cíclico de duas moléculas de ácido lático. Dependendo do estereoisômero do ácido lático, o lactídeo pode ser D-lactídeo (feito de duas moléculas de ácido D-lático), L-lactídeo (feito de duas moléculas de ácido L-lático) ou D-L-lactídeo (feito de uma de cada molécula de ácido L-lático e D-lático). Um método conveniente de produzir lactídeo de ácido lático é por meio de um método de polimerização/despolimerização como descrito na USP 5.142.023 de Gruber e outros.

[0044] Lactídeo, por sua vez, é particularmente útil como um mo-nômero para a produção de copolímeros e polímeros de polilactídeo (PLA). Processos para preparar estes polímeros são também descrito na USP 5.142.023 de Gruber e outros. Os produtos de PLA preferidos são polímeros estáveis em fusão como descrito na USP 5.338.822 de Gruber e outros. O PLA pode ser semicristalino ou amorfo.

[0045] Os seguintes exemplos servem para ilustrar certas modalidades da invenção e não a limitam em escopo ou espírito. Todas as partes e percentagens são em peso a menos que de outra maneira indicado.

Exemplo 1 [0046] Uma matéria-prima de inoculação de uma célula de levedura construída designada CD 587 é preparada em um frasco de agitação de 250 ml contendo 100 ml meio de cultura de extrato de levedura (10 g/l)tamponado por CaC03 (42 g/l) - peptona (20 g/l) com 100 g/l de glicose. Em OD60o = 10, as células são colhidas por centrifugação e subsequentemente ressuspensas em 15% (p/v) de solução de glicerol e estocadas em 1,5 mL de alíquotas a -80°C.

[0047] A célula CD 587 é uma célula de K. marxianus tendo seu gene PDC deletado e um gene D-LDH de L. helveticus exógeno integrado no seu genoma no sítio do gene de PDC deletado, sob o contra- le de sequências terminadoras e promotoras de PDC nativas. A célula CD 587 e sua preparação são descritas mais totalmente no Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos n° 60/384.333, depositado em 30 de maio de 2002.

[0048] A fase de crescimento é iniciada inoculando-se um fermento com uma matéria-prima de 1,5 ml_ de glicerol, resultando em um OD60o inicial de 0,05. A fase de crescimento é desenvolvida aerobica-mente por purga contínua de ar em uma taxa de fluxo de 1,5 L/min (0,5 vvm) em uma velocidade agitadora constante de 800 rpm. O crescimento é continuado té o DO ser reduzido para 5% de saturação de ar. Isto coincide com uma concentração de C02 constante no desprendimento de gás. A OUR é medida monitorando-se a quantidade de ar suprida e analisando-se os desprendimento de gases quanto ao oxigênio empregando-se espectrometria de massa. Durante a fase de crescimento, a OUR é em torno de 20,8 ± 2,5 mmoles 02/gdw/hora. Sob estas condições, a OUR é limitada pela capacidade da célula me-tabolizar o oxigênio disponível. A densidade celular final é em torno de 4 g/L.

[0049] Uma vez que o DO alcança zero, as condições de aeração são mantidas durante uma hora antes de iniciar a fase de produção. A fase de produção é iniciada instantaneamente mudando as taxa de fluxo de ar para 0,1 L/min (0,033 wm) e diminuindo-se a taxa do agitador para 500 rpm. Esta mudança em condições de aeração resulta em uma OUR de 1,5 ± 0,1 mmol de 02/gdw/hora e um DO de zero durante a fase de produção. A fermentação é continuada durante cerca de 60 horas. A taxa de consumo de glicose, taxa de produção de lacta-to e a produção de lactato são medidos periodicamente removendo amostras para análise HPLC/IC/GC-MS. Os resultados na fase de produção são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1 [0050] Esta experiência é repetida diversas vezes, variando as condições de aeração na fase de produção a fim de executar os valores de OUR de cerca de 1,2, 2,2, 2,8, 3,0 e 3,2 em ciclos sucessivos. Os resultados são mostrados graficamente na figura 1. Como mostrado na figura 1, a produção (curva 1) diminui constantemente e dramaticamente com OUR crescente através da faixa de 1,2 a 3,0, onde um aumento (possivelmente uma anomalia) é observado antes de um decréscimo significante em uma OUR de 3,2. Estes rendimentos diminuídos são consistentes com a respiração de célula aumentada quando o oxigênio está crescentemente disponível. As taxas de produção de lactato (curva 3) aumentam ligeiramente dentro de uma faixa de OUR de 1,2 a cerca de 2,2 e em seguida caem quando a OUR é aumentada para 2,8 antes de aumentar. Entretanto, o benefício de taxas de produção aumentadas em valores de OUR de 3 ou mais é perdido devido à perda de produção crescente. As taxas de utilização de glicose (curva 2) aumentam um pouco quando a OUR aumenta de 1,2 para 2,8 e aumentam substancialmente em uma OUR acima de 3,0 devido à rápida respiração da célula. Os dados na figura 2 sugerem que para esta linhagem, um valor de OUR ideal é na faixa de cerca de 0,8 a 2,2, e especialmente de cerca de 1,0 a cerca de 1,5.

Exemplo 2 [0051] O Exemplo 1 é repetido diversas vezes empregando-se uma linhagem designada CD558. A linhagem CD 558 é uma célula K. marxianus tendo seu gene de PDC deletado, Ela contém um gene D-LDH de L helvetícus exógeno aleatoriamente integrado em seu genorma, O gene LDH está sob o controle de um promotor de PGK-1 de S. cerevisiae e sequências terminadoras de Gal-10 de S. cerevisiase. Em cada ciclo, a OUR na fase de desenvolvimento é em tomo de 20,5 mmoles de 02/gdw/hora. As condições de aeração durante as fases de produção são variadas de ciclo a ciclo controlando-se as taxas de purga e agitação, a fim de variar a OUR. Os valores de OUR para os ciclos diferentes são em torno de 0,6, 1,4, 1,7 e 2,2. Em uma OUR de fase de produção de 1,7, os resultados são como mostrados na Tabela 2: Tabela 2 [0052] A figura 2 ilustra como as OUR variãves afetam as taxas de produção e rendimentos, Para esta linhagem, a produção de ácido lá-tico (curva 1) exibe uma dependência muito forte sobre OUR na faixa de 0,7 a 2,2, obtendo um máximo quando a OUR é em torno de 1,4, As taxas de produção de lactato (curva 3) similarmente atingem o pico naquele valor de OUR. As taxas de consumo de glicose (curva 2) aumentam até a OUR ficar em torno de 2,2 e então nivelam-se. Para es- ta linhagem, os dados na figura 2 sugerem que a OUR ideai seja na faixa de cerca de 1 a cerca de 1,7, especialmente em torno de 1,2 -1,5.

Exemplo 3 [0053] O Exemplo 1 é repetido três vezes. O primeiro destes ciclos (3A) é conduzido como descrito no Exemplo 1, exceto que a OUR durante a fase de produção é de 2,1 mmol de 02/gdw/hora. Durante o segundo destes ciclos (3B), a cultura é mudada para a fase de produção imediata mente quando o DO durante a fase de crescimento atinge zero. A OUR é de 1,8 mmol de 02/gdw/hora, sob as mesmas condições de aeração como o Exemplo 3A. No terceiro ciclo (3C), a aeração é continuada ao final da fase de crescimento durante mais 1,5 hora após o DO alcançar zero, e a OUR na fase de produção é de 1,4 mmol de 02/gdw/hora sob as mesmas condições de aeração como Exemplo 3A. Os resultados são sumarízados na Tabela 3.

Tabela 3 [0054] Sob determinadas condições de aeração durante a produ- ção, a OUR é um indicador da atividade metabólica do microorganismo. O decréscimo em OUR quando o tempo de posse é zero ou excede a 1,5 hora (com relação àquele após um tempo de posse de 1 hora) indica que o microorganismo funciona menos sob aquelas condições. Isto é também refletido em um decréscimo em consumo de glicose, rendimentos e produção de lactato.

Exemplo 4 [0055] Uma linhagem de inoculação de célula de levedura CD 587 é cultivada aerobicamente em um biorreator de laboratório de 4 litros empregando-se um meio mineral tamponado (pH 5,5) suplementado com 160 g/l glicose. A aeração é suprida por purga de ar com agitação em uma taxa de 5 litros/minuto. O DO durante esta fase de desenvolvimento inicial é inicialmente de 100% e diminui para 20% durante o ciclo. A OUR é mantida em torno de 20 mmoles de 02/gdw/hora. Quando a OD60o = 10,4 litros do caldo é transferida como um fermento de escala de produção de 240 litros do meio de desenvolvimento suplementado com 170 g/l de glicose. As células são desenvolvidas também sob condições aeróbicas em uma temperatura de 42°C e pH de 5,5 durante cerca de 8 horas. A DO é reduzida de um valor de partida de 100 abaixo de zero durante este tempo. A OUR é mantida a 20 mmoles de 02/gdw/hora por aeração com 15 litros/minuto de ar. A cultura é mantida em DO zero durante uma hora. A cultura é então mudada para a fase de produção reduzindo a aeração para obter um OUR de 1,5 - 1,7 mmol de 02/gdw/hora. Agente de tamponamento adicional (Ca(OH)2 é adicionado em demanda para manter o pH a 5,5 ± 0,1. A DO permanece a 0% durante a fase de produção. A glicose é consumida dentro de 30 horas, provendo um título de lactato de 114 g/kg. A taxa de consumo de glicose específica média durante a fase de produção é de 1,1 g/g de DW.h-1. A taxa de produção de ácido láti-co específica média é de 0,8 g/g de DW.h-1 com um rendimento de produção de 0,76 g de ácido lático/g de glicose e um rendimento total (incluindo a fase de crescimento) de 0,67 g de ácido lático / g.de glicose.

REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. Processo de fermentação, caracterizado pelo fato de que uma levedura geneticamente construída tendo um rompimento de uma via de descarboxilase de piruvato (PDC) nativa fermenta um substrato de fermentação, em que a concentração de oxigênio dissolvido é mantida em menos do que 1% da quantidade de saturação e a taxa de absorção de oxigênio específica é monitorada durante uma fase de produção do processo de fermentação, e pelo menos um parâmetro de operação é controlado em resposta à taxa de absorção de oxigênio medida.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o parâmetro de operação é um ou mais selecionado do grupo consistindo em taxa de aeração, taxa de agitação, e composição de gás de aeração.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a levedura tem pelo menos um gene exógeno funcional que possibilita a célula produzir um produto de fermentação desejado.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o gene exógeno é um gene de lactato desidrogenase.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a levedura é dos gêneros Candida ou Kluyveromyces.