JP5564423B2

JP5564423B2 - Ｄ−キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体

Info

Publication number: JP5564423B2
Application number: JP2010517869A
Authority: JP
Inventors: 英明湯川; 将行乾
Original assignee: Research Institute of Innovative Technology for Earth
Current assignee: Research Institute of Innovative Technology for Earth
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2029-06-10
Also published as: EP2287287B1; CN102066553A; US20110117612A1; EP2287287A4; EP2287287A1; US8685703B2; WO2009154122A1; KR20110027780A; CN102066553B; JPWO2009154122A1

Description

本発明はＤ−キシロース利用技術に関する。さらに詳しくは、Ｄ−キシロース利用機能を向上するために特定の遺伝子操作が施されたコリネ型細菌形質転換体及びそれによる高効率的な有機化合物の製造技術に関する。

セルロース系バイオマスは、生物的方法による各種の有機酸化合物、エタノール等の製造原料として有用である。セルロース系バイオマスは、コーンデンプン、砂糖などの糖質系バイオマスと異なり、安価に、農産廃棄物又は木質廃棄物として多種多様に入手可能であり、将来的にも、食糧資源確保の為の障害とはならない原料種であるからである。セルロース系バイオマスは、およそ、３５質量％〜４５質量％のセルロース、３０質量％〜４０質量％のヘミセルロース、１０質量％のリグニンそして１０質量％の他の成分から成っている。セルロースはグルコース（ヘキソース）のポリマーである。一方、ヘミセルロースでは、ペントースであるキシロース、アラビノース等が主要な構成成分である。

コーンストーバー（Corn stover）、小麦わら（Wheat straw）、稲わら（Rice straw）、バガス（Baggasse）等のセルロース系バイオマスのヘミセルロース中ではＤ−キシロースがその大部分を占める。従って、セルロース系バイオマスの有効利用を図る上で、生物的方法による高効率的なＤ−キシロース利用技術の確立が不可欠となっている。

セルロース系バイオマスの利用技術においては、まず、これらの原料をヘキソース、ペントース等の単糖類に糖化分解することが必要であるが、プロセス設計上、有機化合物産生培地にはこれら単糖類が共存することになる。通常、このような場合、ヘキソースによるペントースの所謂“グルコース抑制”が起こり、ヘキソース及びペントースを並行的かつ同時に利用できなくなり（プロセス設計及び運転制御が複雑となる要因）、ペントース成分を含むセルロース系バイオマスの効率的な工業化利用技術確立の妨げとなっている。この点に関しても改良が望まれている。

ヘキソースであるグルコースを利用し、各種の有機化合物を発酵生産する多くの微生物はよく知られているところであるが、ペントースであるＤ−キシロースを利用し、エタノール等を産生することのできる微生物も幾つか知られている。

特許文献１及び非特許文献１では、野生型ではＤ−キシロースを利用することができないサッカロミセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）に、ピキアスティピティス（Pichia stipitis）由来のキシロースレダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、並びにサッカロミセスセレビシアエ由来のキシルロキナーゼ遺伝子の３つの遺伝子をプラスミドにより導入するＤ−キシロース利用機能付与技術、及び得られる形質転換体サッカロミセスセレビシアエによるＤ−キシロース利用技術が開示されている。しかし、この形質転換体サッカロミセスセレビシアエはＤ−キシロースの利用速度が未だ不十分であり、且つ、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの両糖の存在下では、Ｄ−キシロース利用に対してグルコース抑制（Ｄ−グルコース存在下では、Ｄ−キシロース利用能が非常に遅い）が観察されており、高効率なＤ−キシロース利用技術は未確立である。従って、これらの点に関する改良が望まれている。

非特許文献２では、同じく、サッカロミセスセレビシアエを用いる技術として、カビであるピロマイセススピージーズ（Piromyces sp.）由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子を発現するのに加えて、サッカロミセスセレビシアエ由来のキシルロキナーゼ遺伝子、リブロース５−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子、リブロース５−ホスフェートエミペラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子、及びトランスアルドラーゼ遺伝子を高発現する、アルドースレダクターゼ遺伝子が破壊された形質転換体サッカロミセスセレビシアエを作製し、さらに、この形質転換体を用いて嫌気キシロース制限ケモスタット（anaerobic, xylose-limited chimostat）と、続いて嫌気自動連続回分培養（anaerobic automated sequencing-batch reactor）とを行なうことにより、Ｄ−キシロース取り込み及び資化速度が向上した変異株を単離する技術、及びこの株を用いたＤ−キシロース利用技術が開示されている。この技術では、上記の特許文献１及び非特許文献１の技術と比較して、Ｄ−キシロース利用速度は改善されたが十分とはいえず、さらに未だにＤ−グルコース及びＤ−キシロースの両糖の存在下では、Ｄ−キシロース利用に対してグルコース抑制が観察されている。従って、これらの点に関する改良が望まれている。

特許文献２では、野生型ではＤ−キシロースを利用することができないザイモモナスモビリス（Zymomonas mobilis）に、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子の４つの遺伝子をプラスミドにより導入し、発現することにより得られる形質転換体ザイモモナスモビリスを用いるＤ−キシロース利用技術が開示されている。
また、特許文献３では、同様に、ザイモモナスモビリスに、エシェリヒアコリ由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシルロキナーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子の４つの遺伝子を染色体に導入し、発現することにより得られる、導入した遺伝子がより安定な形質転換体ザイモモナスモビリスによるＤ−キシロース利用技術が開示されている。これらの公知技術においては、ヘキソースに対するペントースの同時利用性はある程度達成されてはいるものの、Ｄ−キシロースの消費速度（利用速度）はＤ−グルコースの消費速度に比し、不十分であり、実用的な意味でのヘキソース及びペントース同時利用性技術としては更なる改良が求められている。

エシェリヒアコリの野生株ではＤ−キシロース等のペントースも利用できるが、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの両糖の存在下では、Ｄ−キシロース利用に対して上記のグルコース抑制がかかることが知られている。非特許文献３と非特許文献４では、グルコース取り込みに関わるｐｔｓＧ（glucose phosphotransferase system (PTS) transport）遺伝子を破壊することにより、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの同時利用性を有する微生物が得られることが報告されている。しかしながら、エシェリヒアコリはプロセス運転条件の変動により、溶菌作用が起こり易いことも指摘されており、プロセス運転上の問題点がある。また、エシェリヒアコリを用いてエタノールを生産する場合、サッカロミセスセレビシアエ及びザイモモナスモビリスと比較して、エタノール耐性が低いことから、最終エタノール濃度が低いことが課題である（発酵液からのエタノール濃縮及び精製に多大のエネルギーを要する）。

コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）及びその組換え株は、還元条件下の糖類からの有機酸等の有機化合物へのバイオ変換反応において、増殖することなく、有機化合物の生産が行えるので、糖類の有効利用上、有用な微生物である（特許文献４）。また、増殖の為の反応器容積を必要としないので、コンパクトな反応装置設計が可能である。本発明者等は、ザイモモナスモビリス由来のピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入し、導入遺伝子を発現させた形質転換体により、高効率にエタノールが生産される技術を開示している（非特許文献５）。

さらに、増殖を伴い物質生産を行う、例えばサッカロミセスセレビシアエ、ザイモモナスモビリス、エシェリヒアコリなどを用いた発酵法では、セルロース系バイオマス由来の原料糖類を得る為に必要な前処理工程において生成するフェノール類、フラン類、有機酸などの所謂“発酵阻害物質”（増殖阻害物質）による生産阻害を受けることが大きな課題となっている。コリネバクテリウムグルタミカムを用いる技術は、増殖を伴わなずに有機酸等の有機化合物へのバイオ変換反応が可能であることから、所謂“発酵阻害物質”（増殖阻害物質）による生産阻害を受けない利点を有することが明らかになっている（非特許文献６）。

しかしながら、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の野生株は様々な利点を有するバイオ変換反応を可能とする能力を有するものの、本来の特性として、Ｄ−キシロース等のペントースを利用することができない。発明者らは、この点に関して、コリネバクテリウムグルタミカムに、エシェリヒアコリ由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子及びキシルロキナーゼ遺伝子を導入し、発現させることで、Ｄ−キシロースの利用能を付与する技術を開示している（非特許文献７）。

しかしながら、このＤ−キシロース利用能を有するコリネバクテリウムグルタミカム組換え株においても、Ｄ−グルコース利用速度と比較して、Ｄ−キシロース利用速度は充分とは云えず、さらなるＤ−キシロース利用速度の向上が求められていた。

一方、発明者らは、セルロース系バイオマス原料に含まれているペントースの一つであるＬ−アラビノースの効率的な利用能をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に付与する技術を提案している（特許文献５）。

特許文献５の技術においては、具体的には、Ｌ−アラビノース利用能を有さないコリネバクテリウムグルタミカムR (FERM P-18976)株に、エシェリヒアコリ由来のアラビノースイソメラーゼ遺伝子、リブロキナーゼ遺伝子、及びリブロース−５−ホスフェート４−エピメラーゼ遺伝子を導入して発現させたコリネバクテリウムグルタミカム形質転換体に、さらに、コリネバクテリウムグルタミカムATCC31831由来のＬ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子を導入する。これにより創製された新たな形質転換体は、Ｌ−アラビノース利用速度を大幅に向上出来ると共に、Ｄ−グルコース及びＬ−アラビノースの両糖の存在下での、Ｌ−アラビノース利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ−グルコース及びＬ−アラビノースを完全同時利用できるものである。
しかしながら、上述したように、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの両糖の存在下でのＤ−キシロース利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ−キシロース及びＤ−グルコースを並行的かつ同時に効率よく利用できるコリネバクテリウム形質転換体は、未だ開発されていない。

US patent 5,789,210 WO 0238740 US patent 7,354,755 PCT 公開公報 WO01/96573 A1 特願2007-222439（特開２００９−５０２３６号公報）

Applied and Environmental Microbiology、Vol.64，1852-1859 (1998). FEMS Yeast Research、Vol.5、925-934 (2005). Applied Microbilogy and Biotchnology、Vol.56、１20-125 (2001). Applied Microbilogy and Biotchnology、Vol.57、186-191 (2001). Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology、Vol.8、243-254. (2004). Applied and Environmental Microbiology、Vol.73，2349-2353 (2007). Applied and Environmental Microbiology、Vol.72，3418-3428 (2006).

本発明は、セルロース系バイオマス資源の有効利用を図る上で必要なＤ−キシロースの利用機能が向上した組換え微生物、及び該微生物を用いる有機化合物の製造方法を提供することを目的とする。

前記の課題を解決すべく、本発明者は研究を重ね、コリネ型細菌に特定の外来遺伝子、すなわちシュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を導入することにより、創製される形質転換体がＤ−キシロースから有機化合物を効率よく生産することを見出した。
具体的には、上述したＤ−キシロースの利用能を付与したコリネバクテリウムグルタミカムに、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） ATCC31831由来のＬ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子を導入したところ、思いもかけず、基質特異性が発現することもなく、Ｄ−キシロース利用速度が大幅に向上すると共に、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの両糖の存在下での、Ｄ−キシロース利用に対するグルコース抑制が完全に解除され、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの並行的かつ同時利用が可能となることを見出した。

なお、本明細書中、コリネ型細菌形質転換体が「Ｄ−キシロース及びＤ−グルコース（又はＤ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノース）を並行的かつ同時利用することができる」、又は「同時利用性（能）を有する」とは、Ｄ−キシロース及びＤ−グルコース（又はＤ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノース）の混合糖を炭素源とする培地中で該形質転換体を用いて有機化合物を生成させた場合に、該形質転換体がほぼ同等の消費速度でもって、これら炭素源を並行的にかつ同時に利用できることを意味する。

本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の微生物及び有機化合物の製造方法を提供する。本発明の組換え微生物は、優れたＤ−グルコース及びＤ−キシロースの同時利用性能を有しているので、セルロース系バイオマス原料からの有用な有機化合物の生産プロセス設計及び運転が容易な技術を提供することに繋がる技術となるものである。

（１）シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入したことを特徴とする、コリネ型細菌形質転換体。
（２）シュガートランスポーター機能を有するタンパク質が、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターである上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（３）シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシュガートランスポーター機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる上記（１）又は（２）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（４）Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)、セロビオース利用性組換え株もしくは変異株であるFERM P-18979、FERM P-18977及びFERM P-18978、コハク酸生産組換え株であるFERM P-19446及びFERM P-19477、並びにエタノール生産組換え株であるFERM P-17887、FERM P-17888、FERM P-19361及びFERM P-19362からなる群より選択されるいずれか１種の菌株のコリネ型細菌であって、かつＤ−キシロース利用能が付与されているものであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体。
（５）シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC31831、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）、バチラスサブチリス（Bacillus subtilis）、バチラスリチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラスコアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルスサケイ（Lactobacillus sakei）、ペディオコッカスペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ラクトバチルスレウテリ（Lactobacillus reuteri）、オーシャノバチルスイヘエニス（Oceanobacillus iheyensis）、ラクトコッカスラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ラクトバチルスプランタリューム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルスファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルスブレビス（Lactobacillus brevis）、ロイコノストックシテリューム（Leuconostoc citreum）、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）、クレブシエラオキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いる上記（１）又は（２）に記載のコリネ型細菌形質転換体。
（６）Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用することができる上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体。
（７）Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースを並行的かつ同時利用することができる上記（６）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（８）コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) Ind-araE/pCRA811 (受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５７６)である上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（９）コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE/Plac-araBAD (受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５７７)である上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（１０）コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAra (受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５８１)である上記（１）記載のコリネ型細菌形質転換体。
（１１）Ｄ−キシロースを含有する培地中で上記（１）〜（１０）のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させる工程と、同培地より有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
（１２）有機化合物が、エタノール、乳酸、コハク酸、キシリトール、酢酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする上記（１１）記載の有機化合物の製造方法。

本発明により、Ｄ−キシロースの効率的な利用が可能となり、また、Ｄ−グルコースとＤ−キシロースとを並行的に同時に、かつ、同等の利用速度でもって利用できるので、セルロース系バイオマス資源の有用な有機化合物への有効利用を効率的な合理的プロセスにより実現することができる。

図１は、実施例１、（１）項において作製したベクターｐＣＲＡ８１１を示す模式図である。図２は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831におけるara gene mapを示す図である。図３は、実施例１、（３）項において作製したベクターＩｎｄ１１−ａｒａＥの作製方法を示す図である。図４は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図４（１））及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811（図４（２））それぞれによる、好気条件下、単一炭素源としてＤ−キシロースを含有するＢＴ培地における培養時の、Ｄ−キシロース消費及び増殖の経時変化を示す図である。図５は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図５（１））及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図５（２））それぞれによる、還元条件下、Ｄ−キシロース単一基質におけるＤ−キシロース消費及び乳酸生成の経時変化を示す図である。図６は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図６（１））及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図６（２））それぞれによる、好気条件下、炭素源としてＤ−グルコース及びＤ−キシロースを含有するＢＴ培地における培養時の、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロース消費、並びに増殖の経時変化を示す図である。図７は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図７（１））及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図７（２））それぞれによる、還元条件下、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの含有比率２対１の混合糖におけるＤ−グルコース及びＤ−キシロース消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。図８は、実施例６、（１）項において作製したベクターＰｌａｃ−ａｒａＢＡＤを示す模式図である。図９（１）及び（２）は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD（図９（１））及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBAD（図９（２））それぞれによる、還元条件下、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの含有比率５：２．５：１の混合糖における糖消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。図１０は、実施例９において作製したベクターpEthAraを示す模式図である。図１１は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraによるＤ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの含有比率５：２．５：１の混合糖における糖消費及びエタノール生成の経時変化を示す図である。

（Ｉ）Ｄ−キシロース利用機能が向上したコリネ型細菌形質転換体
本発明のコリネ型細菌形質転換体は、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入したものである。
Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌に、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を導入することにより、該コリネ型細菌のＤ−キシロース利用能が顕著に向上する。このため、コリネ型細菌形質転換体はＤ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用することができるものとなる。

本発明でシュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子を導入する、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌は、Ｄ−キシロース利用能が付与されているコリネ型細菌であれば特に限定されるものではない。コリネ型細菌の野生株は、Ｄ−キシロース等のペントースを利用することができない。コリネ型細菌にＤ−キシロース利用能を付与する方法としては特に限定されず、例えば、該コリネ型細菌に他の生物種由来のＤ−キシロース代謝関連遺伝子を導入する方法が挙げられる。

原核生物及び一部のカビにおけるＤ−キシロースからＤ−キシルロース−５−ホスフェートへの代謝は、具体的には、（ａ）Ｄ−キシロースからＤ−キシルロースへの反応を触媒するキシロースイソメラーゼ（以下、酵素を「ＸｙｌＡ」、遺伝子を「ｘｙｌＡ」ともいう）、及び（ｂ）Ｄ−キシルロースからＤ−キシルロース−５−ホスフェートへの反応を触媒するキシルロキナーゼ（以下、酵素を「ＸｙｌＢ」、遺伝子を「ｘｙｌＢ」ともいう）の２つの酵素に触媒された２ステップの反応により行われる。本発明では該代謝系を用いることができる。これらの酵素をコードする上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子をコリネ型細菌に導入することによりコリネ型細菌にＤ−キシロース利用能が付与されるが、該遺伝子がコードしているポリペプチドがＤ−キシロース代謝機能を有する限り、（ａ）及び（ｂ）の遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は特に限定されない。

例えば、発明者らは既に、コリネ型細菌に、Ｄ−キシロース代謝関連遺伝子として、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）、及びキシルロキナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）を導入し、発現させることで、Ｄ−キシロースの利用能を付与する技術を開示している（Appl. Environ. Microbiol. Vol.72，3418-3428 (2006)）。本発明においては、このような技術により作製されるＤ−キシロース利用能が付与されたコリネ型細菌を用いることができる。また、例えばＤ−キシロース利用能を付与する方法としては、上記のエシェリヒアコリ（Escherichia coli）以外の生物種由来遺伝子を導入した形質転換体であってもよい。

上記（ａ）及び（ｂ）のＤ−キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子は、同じ遺伝子座上に存在していてもよく、又は、これら２つの遺伝子がそれぞれ別の遺伝子座上に存在していてもよい。２つの遺伝子が同じ遺伝子座上に存在している例としては、例えば、上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子が連結して形成されたオペロンなどが挙げられる。

上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子は、通常、Ｄ−キシロースの代謝能を有する微生物に保有されている。本発明における（ａ）及び（ｂ）の遺伝子としては、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) (ｘｙｌＢ遺伝子のみ保有)、バチラスサブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、バチラスハロデュランス（Bacillus halodurans）、シノリゾビュームメリロッティ（Sinorhizobium meliloti）、及びアグロバクテリュウムツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）からなる群より選ばれる同一又は異なる微生物由来のｘｙｌＡ遺伝子、及びｘｙｌＢ遺伝子を用いることが好ましい。
中でも本発明では、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）に由来するｘｙｌＡ遺伝子、及びｘｙｌＢ遺伝子の使用が最も好ましい。

Ｄ−キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子は、上記（ａ）及び（ｂ）の遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成したＤＮＡ断片を使用することができる。ＤＮＡ配列が不明の場合であっても、Ｄ−キシロース代謝関連酵素タンパク質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション法、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のＤ−キシロース代謝関連遺伝子配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＰＣＲによって断片を取得することが可能である。

Ｄ−キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子は、該遺伝子がコードしているポリペプチドのＤ−キシロース代謝活性が保持されている限り、塩基配列の一部が他の塩基に置換されていてもよく、削除されていてもよく、また新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これらのＤ−キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子の誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記の塩基配列の一部とは、例えばアミノ酸残基換算で１乃至数個（通常１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。

Ｄ−キシロース代謝関連酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、原核生物由来、すなわち原核生物中に天然に存在するＤ−キシロース代謝関連酵素と同じアミノ酸配列を持つＤ−キシロース代謝関連酵素をコードしていることが好ましい。真核生物由来のＤ−キシロース代謝関連酵素に比べ、原核生物由来のＤ−キシロース代謝関連酵素の発現は、細菌においてＤ−キシロース代謝関連酵素が活性形態で発現する可能性を高める。

宿主となるコリネ型細菌としては、糖類の代謝変換機能を有しているものであればよく、特に限定されない。糖類の種類や目的有機化合物の種類によっては、コリネ型細菌が本来有していない糖類の取り込み、代謝経路又は目的有機化合物への変換経路等の新たな機能の導入を必要とする場合があるが、そのような場合には組換え技術や突然変異誘発処理等によりそれらの機能を付与すればよい。

本発明で用いられるコリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌又はマイクロコッカス属菌等が挙げられる。

さらに具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R（FERM P-18976）、ATCC13032、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020又はATCC31831等が挙げられる。

ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）ATCC13869、ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacterium flavum）MJ-233（FERM BP-1497）もしくはMJ-233AB-41（FERM BP-1498）、又はブレビバクテリウムアンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC6872等が挙げられる。

アースロバクター属菌としては、アースロバクターグロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）ATCC8010、ATCC4336、ATCC21056、ATCC31250、ATCC31738又はATCC35698等が挙げられる。

マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウムボビス（Mycobacterium bovis）ATCC19210又はATCC27289等が挙げられる。
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカスフロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）NO. 239（FERM P-13221）、マイクロコッカスルテウス（Micrococcus leuteus）NO. 240（FERM P-13222）、マイクロコッカスウレアエ（Micrococcus ureae）IAM1010又はマイクロコッカスロゼウス（Micrococcus roseus）IFO3764等が挙げられる。

好ましくは、細胞の中へ能動的に又は受動的にＤ−キシロースを輸送できるコリネ型細菌であることである。また、形質転換されるコリネ型細菌は、正常に機能する解糖経路とペントースリン酸経路とを有していることが好ましい。さらには、ピルビン酸から目的とする発酵産物、例えばコハク酸、酢酸又は乳酸に変換するための酵素を含有することが好ましい。さらに用いるコリネ型細菌は、エタノール；乳酸、酢酸、ギ酸等のような有機酸；フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールのような糖分解産物に対して高い耐性を持っていることが好ましい。このような点から、本発明で用いられるコリネ型細菌としては、コリネバクテリウムグルタミカムR（FERM P-18976、特願２００２−２５２１９０（特開２００４−０８９０２９号公報））又は、コリネバクテリウムグルタミカムATCC31831等が好ましい。

また、これらコリネ型細菌は自然界に存在する野生株の変異株（例えば、セロビオース利用性変異株：FERM P-18977、FERM P-18978）（特願２００２−２５２１９０（特開２００４−０８９０２９号公報））又は人為的な遺伝子組換え株等であってもよい。人為的な遺伝子組換え株としては、例えば、エタノール生産組換え株として、FERM P-17887（FERM BP-7621）、FERM P-17888（FERM BP-7622）（ＰＣＴ／ＪＰ０１／０４９３５（国際公開ＷＯ０１／０９６５７３））及びJ.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol8,243-254(2004)記載株、すなわち日本国特許第４２９４３７３５号に記載のFERM P-19361及びFERM P-19362等；セロビオース利用組換え株として、FERM P-18979（特願２００２−２５２１９０（特開２００４−０８９０２９号公報））等；コハク酸生産組換え株として、FERM P-19446（すなわちFERM BP-10060）及びFERM P-19477（すなわちFERM BP-10061）（FERM P-19446及びFERM P-19477はそれぞれ、ＷＯ２００５／０１０１８２Ａ１に記載されているFERM BP-10060及びFERM BP-10061と同じ菌株である）等が挙げられる。J.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol8,243-254(2004)記載株（日本国特許第４２９４３７３５号に記載のFERM P-19361及びFERM P-19362）は、ザイモモナスモビリス由来のピルベートデカルボキシラーゼ遺伝子及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に導入したコリネ型細菌形質転換体である。

本発明においては、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R (FERM P-18976)、セロビオース利用性組換え株もしくは変異株(FERM P-18979、FERM P-18977及びFERM P-18978)、コハク酸生産組換え株（FERM P-19446及びFERM P-19477）、並びにエタノール生産組換え株(FERM P-17887（FERM BP-7621）、FERM P-17888（FERM BP-7622）及びJ.Mol.Microbiol.Biotechnol.,Vol 8,243-254（2004）記載の株（すなわちFERM P-19361及びFERM P-19362）)からなる群より選択されるいずれか１種の菌株のコリネ型細菌であって、かつＤ−キシロース利用能が付与されているものであることが好ましい。
本発明において特に好ましいコリネ型細菌は、Ｄ−キシロース利用能が付与されたコリネバクテリウムグルタミカムR（FERM P-18976）である。

シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子
本発明では、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌に、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子（シュガートランスポーター遺伝子ともいう）を導入する。これにより、コリネ型細菌形質転換体のＤ−キシロース利用能をより向上させることができる。シュガートランスポーター機能を有するタンパク質としては、ヘキソース及びペントースを輸送する機能を有するタンパク質であればよいが、中でも、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターが好ましい。

本発明においては、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子ともいう）を用いることが好ましい。Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子は既知であり、ａｒａＥと称されている。細菌では、以下に示す菌株等でａｒａＥ遺伝子配列や酵素特性が報告されている。バチラスサブチリス（Bacillus subtilis）〔J. Bacteriol.、Vol. 179、7705?7711(1997)〕、クレブシエラオキシトカ8017（Klebsiella oxytoca 8017）〔J. Bacteriol.、Vol. 177、5379-5380（1995）〕、エシェリヒアコリ〔J. Biol. Chem.、Vol. 263、8003-8010（1988）〕。

本発明におけるシュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子としては、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC31831、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）、バチラスサブチリス（Bacillus subtilis）、バチラスリチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラスコアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルスサケイ（Lactobacillus sakei）、ペディオコッカスペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ラクトバチルスレウテリ（Lactobacillus reuteri）、オーシャノバチルスイヘエニス（Oceanobacillus iheyensis）、ラクトコッカスラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ラクトバチルスプランタリューム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルスファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルスブレビス（Lactobacillus brevis）、ロイコノストックシテリューム（Leuconostoc citreum）、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）、クレブシエラオキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いることができる。

本発明に適したＬ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター活性を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子としては、コリネバクテリウムグルタミカム ATCC31831、エシェリヒアコリ、バチラスサブチリス、クレブシエラオキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラティフィムリウムからなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いることが好ましい。また、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子として、配列番号１３で示されるＤＮＡ配列、又は配列番号１３で示されるＤＮＡ配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシュガートランスポーター機能（例えば、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター機能）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることが好ましい。すなわち本発明においては、シュガートランスポーター機能を有するタンパク質をコードする外来性遺伝子として、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシュガートランスポーター機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いることが好ましい。配列番号１３の塩基配列のＤＮＡは、コリネバクテリウムグルタミカムATCC31831等由来の遺伝子であり、ａｒａＥ遺伝子のＤＮＡの塩基配列である。Ｄ−キシロース利用菌株におけるａｒａＥ遺伝子の適当な発現量の調節方法は、当業者には良く知られている。本発明においては、上記Ｄ−キシロース代謝関連酵素遺伝子、及びシュガートランスポーター遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は特に限定されない。

ここで、ストリンジェントな条件とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上の相同性が配列間に存在するときにハイブリダイゼーションが起こることを意味する。通常、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約５〜３０℃、好ましくは約１０〜２５℃、より好ましくは、約１５〜２０℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、J.Sambrookら，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989),特に11.45節”Conditions for Hybridization of Oligonucleotide Probes”に記載されており、ここに記載の条件を使用し得る。
本発明において、塩基配列間の相同性は、計算ソフトＧＥＮＥＴＹＸ（登録商標）Ｖｅｒ．８（ジェネティックス社製）を用いて計算した値である。

なお、本発明において、あるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、例えば、配列番号１３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号１３の塩基配列と約９０％以上の配列相同性を有することが好ましく、約９５％以上の配列相同性を有することがより好ましく、約９８％以上の配列相同性を有することが特に好ましい。

本発明のコリネ型細菌形質転換体は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用するものであることが好ましく、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースを並行的かつ同時利用するものであることがより好ましい。

本発明のコリネ型細菌形質転換体は、例えば、上記のシュガートランスポーター遺伝子を、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入して形質転換することによって作製することができる。また、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースを並行的かつ同時利用するコリネ型細菌形質転換体は、例えば、コリネ型細菌に、上述したＤ−キシロース代謝関連酵素遺伝子及びシュガートランスポーター遺伝子、並びにＬ−アラビノース代謝関連遺伝子を導入することにより作製することができる。Ｌ−アラビノース代謝関連遺伝子としては、例えば、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）のＬ−アラビノースイソメラーゼをコードする遺伝子、Ｌ−リブロキナーゼをコードする遺伝子及びＬ−リブロース−５−フォスフェイト−４−エピメラーゼをコードする遺伝子等が好適である。Ｄ−キシロース代謝関連酵素遺伝子、シュガートランスポーター遺伝子及びＬ−アラビノース代謝関連遺伝子の由来微生物の種類、組み合わせ、及び導入の順番等は特に限定されない。

ベクターの構築
まず、上記のシュガートランスポーター遺伝子、例えば、Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードするＤＮＡ（ａｒａＥ、タンパク質をＡｒａＥともいう）の配列をＰＣＲ (polymerase chain reaction) 法により増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを作製する。このようなプライマーセットとしては、例えば配列番号１４、１５の塩基配列で示されるものなどが挙げられる。ＰＣＲ法は、公知のＰＣＲ装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用することができる。ＰＣＲのサイクルは、公知の技術にしたがって行なわれてよく、例えば、変性、アニーリング、伸張を１サイクルとし、通常１０〜１００サイクル、好ましくは、約２０〜５０サイクルである。ＰＣＲの鋳型としては、シュガートランスポーター遺伝子を有する微生物から単離したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法によりＡｒａＥをコードするＤＮＡのｃＤＮＡを合成することができる。ＰＣＲ法によって得られた遺伝子は、適当なクローニングベクターに導入することができる。クローニング法としては、pGEM-T easy vector system（Promega社製）、TOPO TA-cloning system（Invitrogen社製）、Mighty Cloning Kit（Takara社製）などの商業的に入手可能なＰＣＲクローニングシステムなどを使用することもできる。また、方法の１つの例を実施例で詳記するが、該領域を含むＤＮＡ断片を、既知のＡｒａＥをコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて適当に設計された合成プライマーを鋳型として用いたハイブリダイゼーション法により取得することもできる。

次いで、ＰＣＲ法で得られた遺伝子を含むクローニングベクターを、微生物、例えばエシェリヒアコリＪＭ１０９菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例えばアンピシリン、クロラムフェニコールなど）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の技術によって行なうことができ、また市販のプラスミド抽出キットを用いて簡便に抽出することもできる。市販のプラスミド抽出キットとしては、キアクイックプラスミド精製キット（商品名：Qiaquick plasmid purification kit、キアゲン社製）などが挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＡｒａＥをコードする遺伝子配列を確認することができる。ＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えばジオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用いて、検出には多蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシーケンサー、例えばABI PRISM 3730xl DNA Analyzer（アプライドバイオシステム社製）などを使用して塩基配列を決定することもできる。

上記の方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行なうことができる。種々の微生物のベクターや外来遺伝子の導入及び発現法は、多くの実験書に記載されているので〔例えば、Molecular Cloning： A Laboratory Manual（3^rd Edition）CSHL Press（2001）、又はCurrent protocols in molecular biology. Green Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）等〕、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入及び発現を行なうことができる。

次に、ａｒａＥ遺伝子を、前述したＤ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌において、プラスミド上又は染色体上で発現させる。例えば、プラスミドを用いて、これらの遺伝子は発現可能な制御配列下に導入される。ここで「制御配列下」とはこれらの遺伝子が、例えば、プロモーター、インデューサー、オペレーター、リボソーム結合部位及び転写ターミネーター等との共同作業により転写翻訳できることを意味する。このような目的で使用されるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、例えば、ブレブバクテリウムラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）2256由来のpAM330〔特開昭58-67699号公報、Agric. Biol. Chem.、Vol. 48、2901-2903（1984）及びNucleic Acids Symp Ser.、Vol. 16、265-267（1985）〕、コリネバクテリウムグルタミカム ATCC13058由来のpHM1519〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 48、2901-2903（1984）〕及びpCRY30〔Appl. Environ. Microbiol.、 Vol. 57、759-764（1991）〕、コリネバクテリウムグルタミカム T250由来のpCG4〔特開昭57-183799号公報、J. Bacteriol.、Vol. 159、306-311（1984）〕、pAG1、pAG3、pAG14、pAG50（特開昭62-166890号公報）pEK0、pEC5、pEKEx1〔Gene、Vol. 102、93-98（1991）〕等、あるいはそれらから誘導されるプラスミドなどが使用可能である。また、ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつマルチクローニングサイトを含んでいる、又は単一の制限酵素部位を含んでいることが好ましい。

本発明においては、広範囲の種類のプロモーターを好適に用いることができる。このようなプロモーターは、酵母、細菌及び他の細胞供給源を含む多くの公知の供給源から得ることができ、コリネ型細菌において目的遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればいかなるものであってもよい。本発明に使用されるプロモーターとしては、効率の良い、非グルコース抑制プロモーターが好ましい。そのようなプロモーターの好適な例としては、例えば、コリネ型細菌で強力な構成的なプロモーターとして既知である、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。本発明に使用されるプロモーターは、必要に応じて、修飾して、その調節機構を変更することができる。また、目的遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネーターについても、コリネ型細菌においてその遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなるものであってもよい。

本発明のコリネ型細菌形質転換体の創製に使用されるプラスミドベクターの構築は、例えば、コリネバクテリウムグルタミカム ATCC31831のａｒａＥ遺伝子を用いる場合では、塩基配列が確認された該遺伝子を、適当なプロモーター、ターミネーター等の制御配列と連結後、上記例示されているいずれかのプラスミドベクターの適当な制限酵素部位に挿入することにより、行うことができる。詳細は、実施例に記載している。

形質転換
目的遺伝子を含むプラスミドベクターのコリネ型細菌への導入方法としては、電気パルス法（エレクトロポレーション法）、ＣａＣ１_２法等コリネ型細菌への目的遺伝子導入が可能な方法であれば特に限定されるものではない。その具体例として、例えば電気パルス法としては、公知の方法〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447（1990）〕又は〔Res. Microbiol.、Vol. 144、181-185（1993）〕を用いることができる。

本発明のコリネ型細菌形質転換体の取得方法としては、常法に従い、目的遺伝子を含むプラスミドに薬剤耐性遺伝子等を組み入れて、適切な濃度の当該薬剤を含むプレート培地上に目的遺伝子導入処理を行ったコリネ型細菌を塗布することにより形質転換されたコリネ型細菌を選抜することができる。その方法の具体例としては、例えば、〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447（1990）〕又は〔Res. Microbiol.、Vol. 144、181-185（1993）〕に記載の方法等を挙げることができる。

上記の方法により創製されるコリネ型細菌の形質転換体の例としては、具体的には、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) Ind-araE/pCRA811（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５７６）及びコリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE/Plac-araBAD（受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５７７）（いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818））に寄託済み。受託日：２００８年５月２８日）、並びにコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAra （受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５８１）（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818））に寄託済み。受託日：２００８年６月４日）などが挙げられる。これらのコリネ型細菌の形質転換体は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用するものであるため、後述するようにＤ−キシロース及びＤ−グルコース資源を含む培地で好適に用いることができる。

本発明で創製したコリネ型細菌形質転換体は、有機化合物生産性を向上させるために、ペントースリン酸経路の流量の増加；エタノール、浸透圧又は有機酸に対する耐性の増加及び副生物（目的とする生成産物以外の炭素含有分子を意味すると理解される）生産の減少からなる群から選択される特徴の１又は２以上を生じる遺伝子修飾をさらに含むことができる。そのような遺伝子修飾は、具体的には、外来性遺伝子の過剰発現及び／又は内在性遺伝子の不活化；古典的突然変異誘起；スクリーニング及び／又は目的変異体の選別などにより導入することができる。

かくして創製された本発明のコリネ型細菌形質転換体は、Ｄ−キシロースを原料として（TCA経路に存在するポリカルボン酸を製造する場合は、さらに炭酸イオン等も原料として）、モノカルボン酸、ジカルボン酸、ケトカルボン酸、ヒドロキシカルボン酸、アミノ酸、モノアルコール、ポリオール及びビタミン等の多様な有機化合物を、糖類の代謝速度を向上させる、又は糖類の代謝速度の経時低下を抑制すると同時に、高い生産速度と高い蓄積濃度でもって、反応液中に生成させることができるものである。

（ＩＩ）有機化合物の製造方法
増殖培養工程
本発明のコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を製造する場合は、まず上述したコリネ型細菌形質転換体を好気条件下で増殖培養することが好ましい。

コリネ型細菌形質転換体の培養は、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことができる。培養には、炭素源として、例えばグルコース又は廃糖蜜等；窒素源として、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム又は尿素等をそれぞれ単独で又は２種以上を混合して用いることができる。また、無機塩として、例えば、リン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウム又は硫酸マグネシウム等を使用することができる。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸；ビオチン又はチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することもできる。

培養は、通気撹拌又は振盪等の好気的条件下、約１５〜４５℃、好ましくは約２５〜３７℃の温度で行うことができる。培養時の培地のｐＨは５〜１０付近、好ましくは６．５〜８．５付近の範囲がよく、培養中のｐＨ調整は、酸又はアルカリを添加することにより行うことができる。培養開始時の培地の炭素源濃度は、好ましくは約１〜２０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは約２〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、培養期間は通常１〜７日間程度である。

次いで、コリネ型細菌形質転換体の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離、膜分離等の公知の方法を用いることができる。

回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程に用いてもよい。前記菌体処理物としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものであればよく、例えば、菌体をアクリルアミド又はカラギーナン等で固定化した固定化菌体等が挙げられる。
上記の如くして得られる培養物から回収分離されたコリネ型細菌形質転換体の培養菌体又はその菌体処理物を用いて、有機化合物を生成させる工程（有機化合物生成工程ともいう）を行う。

有機化合物生成工程
有機化合物生成工程においては、Ｄ−キシロースを含有する培地（反応培地）中で、上記コリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させる。このような工程を含む有機化合物の製造方法も、本発明の１つである。

反応培地には炭素源としてＤ−キシロースが含まれるが、Ｄ−キシロースに加えてＤ−グルコースも含むことができる。Ｄ−キシロース又はＤ−グルコースとしては、Ｄ−キシロース又はＤ−グルコースそのものでもよく、例えば、リグノセルロース、アラビナン、セルロース、デンプンなどのようなＤ−キシロース又はＤ−グルコース単位からなる炭水化物のオリゴマー又はポリマーでもよい。そのような炭水化物からＤ−キシロース又はＤ−グルコース単位を遊離させるために、適当な炭水化物分解酵素（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼなど）を、反応培地に加えてもよく、コリネ型細菌形質転換体に該酵素を生産させてもよい。

反応培地は、Ｄ−キシロース及びＤ−グルコース以外の有機炭素源を含んでもよい。このような有機炭素源としては、本発明のコリネ型細菌形質転換体が生化学反応に利用できる糖類が挙げられる。
具体的には、糖類としては、（Ｄ−又はＬ−）アラビノース、ガラクトース、フルクトース又はマンノースなどの単糖類；セロビオース、ショ糖、ラクトース、マルトースなどの二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。特に、Ｃ６糖やＣ５糖などの単糖類が好ましく、中でも、Ｌ−アラビノースが好ましい。

より好ましくは、有機化合物の生成反応に用いられる反応培地組成は、コリネ型細菌形質転換体又はその処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源；蛋白質合成に必要な窒素源；リン、カリウム又はナトリウム等の塩類；さらに鉄、マンガン又はカルシウム等の微量金属塩を含む。これらの添加量は所要反応時間、目的有機化合物生産物の種類又は用いられるコリネ型細菌形質転換体の種類等により適宜定めることができる。用いるコリネ型細菌形質転換体によっては特定のビタミン類の添加が好ましい場合もある。炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン、微量金属塩は、公知のもの、例えば増殖培養工程につき例示したものでよい。
培地のｐＨは、約６〜８が好ましい。

コリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物とＤ−キシロースを含む炭素源との反応は、本発明のコリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物が活動できる温度条件下で行なわれることが好ましく、コリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる。温度は、通常、約２５〜３５℃である。また、後述する反応系の炭酸ガス封入法にも関連して、反応培地に二酸化炭素又は各種の炭酸塩もしくは炭酸水素塩等の無機炭酸塩を糖類などの有機炭素源に加えて注入することが目的有機化合物によっては有効な場合もある。培地中の炭素源濃度としては特に限定されないが、通常、約０．１〜３０質量％、好ましくは約０．５〜２０質量％の濃度で使用される。また、炭素源における糖類の（Ｄ−キシロース／Ｄ−グルコース）混合比率（質量比）に関しては、糖類由来バイオマス原料種にもよるが、通常その比率は１／３〜２／３程度である。また、例えば、反応培地中の炭素源に各種のＣ６糖類やＣ５糖類を含む場合、Ｃ６糖及びＣ５糖の混合比率（Ｃ５糖／Ｃ６糖の質量比）は、通常１／４〜３／４程度である。

有機化合物生成工程においては、反応培地が還元状態下にあることが好ましい。すなわちコリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物は、還元状態下の反応培地で目的有機化合物の生成反応に供せられることが好ましい。有機化合物生成方式は、回分式、流加式、連続式いずれの生成方式も可能である。

本発明において、還元状態下にある反応培地中でコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させると、すなわち還元状態下の生化学反応により有機化合物を製造すると、本発明のコリネ型細菌形質転換体の増殖分裂が完全に抑制され、増殖に伴う分泌副生物の実質的な完全抑制を実現することができる。この観点からは、培養増殖工程から回収されたコリネ型細菌形質転換体又はその菌体処理物が反応培地に供せられるときには、コリネ型細菌細胞内外の好気増殖時の環境状態が反応培地にもたらされない方法や条件を用いることが好ましい。つまり、反応培地は、増殖培養過程で生成し、菌体内外に存在する生成物質を実質的に含有しないことが好ましい。より具体的には、増殖培養過程で生成し、菌体外に放出された分泌副生物、及び培養菌体内の好気的代謝機能により生成し菌体内に残存する物質が、反応培地に実質的に存在しない状態であることが好ましい。このような状態は、例えば、増殖培養後の培養液を用いて遠心分離、膜分離等の方法を行うことによって、及び／又は培養後の菌体を還元状態下で２時間ないし１０時間程度放置することで実現される。

本工程においては、還元状態下の反応培地を用いることが好ましいが、反応培地は、固体状、半固体状又は液体状等いずれの形状を有していてもよい。
本発明における還元状態とは、反応系（反応培地）の酸化還元電位で規定され、反応培地の酸化還元電位がマイナス（−）の値であることを意味する。還元状態下にある反応培地の酸化還元電位は、好ましくは約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶ程度、より好ましくは約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶ程度である。

反応培地の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）である程度推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、ORP Electrodes、BROADLEY JAMES社製）を用いて測定する。本発明においては、反応培地に菌体又はその処理物を添加した直後から有機化合物を採取するまで、還元状態を維持していることが好ましいが、少なくとも有機化合物を採取する時点で反応培地が還元状態であればよい。反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応培地が還元状態に保たれていることが好ましい。中でも、反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応培地の酸化還元電位が約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶ程度に保たれていることが特に好ましい。

このような還元状態の実現は具体的には、前記の培養後の培養菌体調製方法、反応培地の調製方法、又は反応途中における還元状態の維持方法等によりなされる。還元状態下の反応培地の調製方法は、公知の方法を用いてよい。例えば、反応培地用水溶液の調製方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調製方法〔The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Ed. by Starr, M. P. et. al. Berlin, Springer Verlag、926-940（1981）や（農芸化学実験書第三巻、京都大学農学部農芸化学教室編、1990年第26刷、産業図書株式会社出版）〕などを使用することができ、所望する還元状態の水溶液を得ることができる。

反応培地の調製方法として、より具体的には反応培地を加熱処理又は減圧処理することにより溶解ガスを除去する方法等が挙げられる。より具体的には、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは約５〜４０分程度、反応培地を処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去し、還元条件下の反応培地を作製することができる。また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、硫化ソーダ等）を添加して還元状態の反応培地を調製することもできる。また、場合により、これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元状態の反応培地を調製する方法となる。

反応途中における還元状態の維持方法としては、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが好ましく、反応系を窒素ガス等の不活性ガス、炭酸ガス等で封入する方法が通常用いられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中においてコリネ型細菌形質転換体の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加する溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。

最後に、上述のようにして反応培地で生成した有機化合物を採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることができる。そのような公知の方法として、有機化合物生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法又は電気透析法等があり、生成有機化合物の特性に応じてその分離精製採取法は適宜定めることができる。

本発明の方法により製造することができる有機化合物としては、有機酸、アルコール、アミノ酸又はビタミン類等が挙げられる。有機酸としては例えば、酢酸、乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、シスアコニット酸、イソクエン酸、イタコン酸、２−オキソグルタル酸又はシキミ酸などが挙げられる。アルコールとしては、例えば、エタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール、グリセロール、キシリトール、ソルビトール又は１，４−ブタンジオールなどが挙げられる。アミノ酸としては、例えば、バリン、ロイシン、アラニン、アスパラギン酸、リジン、イソロイシン又はスレオニンなどが挙げられる。本発明の方法は、エタノール、乳酸、コハク酸、キシリトール、酢酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上の有機化合物の製造に好適である。

本発明はまた、前記の条件下における反応によりＤ−キシロース、又はＤ−グルコースとＤ−キシロースとの混合物を有機化合物にする能力が著しく改善されたＤ−キシロース利用コリネ型細菌形質転換体を提供する。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811の創製
（１）プラスミドｐＣＲＡ８１１構築方法
ａ）エシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９からの染色体ＤＮＡの抽出
エシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を、Ｌ培地（トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ及びＮａＣｌ５ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期まで３７℃で振盪培養し、菌体を集めた。ＤＮＡゲノム抽出キット（商品名：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit、アマシャム社製）を用いて、取扱説明書に従い、集めた菌体から染色体ＤＮＡを回収した。

ｂ）エシェリヒアコリ（Escherichia coli）からのＤ−キシロースイソメラーゼ遺伝子（ｘｙｌＡ）及びＤ−キシルロキナーゼ遺伝子（ｘｙｌＢ）のクローニング
エシェリヒアコリ（Escherichia coli）のキシロースイソメラーゼ遺伝子（以下、ｘｙｌＡと記す）（配列番号１）、及びキシルロキナーゼ遺伝子（以下、ｘｙｌＢと記す）（配列番号２）の２つの遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。

ＰＣＲに際して、ｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子をクローン化するべく、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）の配列を基に、下記の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。

ｘｙｌＡ遺伝子増幅用プライマーセット

尚、前者にはＥｃｏＲＩサイトが、後者にはＳｍａＩサイトがそれぞれ末端に付加されている。鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（１）、ａ）項にて抽出したエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡを用いた。
ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Takara LA Taq HS DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。

反応液：

以上を混合し、この１００μＬの反応液をＰＣＲにかけた。

ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃、１分
アニーリング過程：５５℃、１分
エクステンション過程：７２℃、２分
以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。
上記で生成した反応液の一部を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、それぞれｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子を含む、約１．４ｋｂ及び約１．６ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

上述の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで処理した約１．６ｋｂの増幅産物と、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理をしたベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia社製）とを混合し、これにライゲーションキット（商品名：Mighty Cloning Kit、宝酒造株式会社製）を添加後、取扱説明書に従い反応させた。このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology.、Vol. 53、159（1970）〕によりエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ、Ｘ−ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside）２００μｇ／ｍＬ、ＩＰＴＧ（isopropyl 1-thio-beta-d-galactoside）１００μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。この培地上で白色を呈する生育株を常法により液体培養し、培養液よりｘｙｌＡ遺伝子を含有する長さ約１．４ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、プラスミド抽出キット（商品名：QIAprep Spin Miniprep Kit、キアゲン社製）を用いて抽出した。
該ｘｙｌＡ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＡ８０１と命名した。

制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで処理した約１．６ｋｂの増幅産物も同様の方法でＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理をしたベクターｐＴｒｃ９９Ａと連結し、該ｘｙｌＢ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＡ８０２を構築した。

構築したｐＣＲＡ８０１を鋳型としてｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）に連結したｘｙｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、下記に示すプライマーセットを用いたこと以外は上記と同じ条件でＰＣＲを行なった。
Ｐｔｒｃ−ｘｙｌＡ遺伝子増幅用プライマーセット

制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで処理した約１．６ｋｂの増幅産物も同様の方法でＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理をしたベクターコリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１（特開２００６−１２４４４０）と連結し、該Ｐｔｒｃ−ｘｙｌＡ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＡ８１０を構築した。

構築したｐＣＲＡ８０２を鋳型としてｔｒｃプロモーター（Ｐｔｒｃ）に連結したｘｙｌＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を用いて、下記に示すプライマーセットを用いたこと以外は上記と同じ条件でＰＣＲを行なった。
Ｐｔｒｃ−ｘｙｌＢ遺伝子増幅用プライマーセット

制限酵素ＦｂａＩ及びＢａｍＨＩで処理した約１．７ｋｂの増幅産物も、選択培地にアンピシリンの代わりにクロラムフェニコールを使用する以外は、上記と同様の方法でＦｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理をしたベクターｐＣＲＡ８１０と連結し、該Ｐｔｒｃ−ｘｙｌＢ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＡ８１１（ベクターｐＣＲＡ８１１）を構築した（図１）。

（２）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からのａｒａオペロンの単離、及びａｒａＥの単離
ａ）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からの染色体ＤＮＡの抽出
コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からの染色体ＤＮＡ抽出は、培地として表１に示すＡ液体培地を使用することと、培養温度が３０℃であること以外は、上記のエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９と同様の条件で行なった。

ｂ）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からのＬ−アラビノース代謝関連遺伝子のクローニング
Ｌ−アラビノースを単一炭素源として良好な増殖を示したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831よりＬ−アラビノース代謝に関与する遺伝子のクローニングを試みた。データベースのホモロジー検索の結果より、３種のＬ−アラビノース代謝酵素Ｌ−アラビノースイソメラーゼ、Ｌ−リブロキナーゼ、Ｌ−リブロース−５−フォスフェイト−４−エピメラーゼをコードする各遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤの内、ａｒａＡが最も異種間での保存性が高かった。そこで、このａｒａＡにおける保存領域の配列から以下の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー」を用いて合成し、ＰＣＲに使用した。

ａｒａＡ相同領域増幅用プライマーセット

鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（２）、ａ）項にて抽出したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） 31831の染色体ＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Takara LA Taq HS DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。

反応液：

以上を混合し、この５０μＬの反応液をＰＣＲにかけた。

ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃、１分
アニーリング過程：３７℃、１分
エクステンション過程：７２℃、１分
以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。

上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、ａｒａＡ相同領域を含む、約３９０ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。
ＰＣＲ増幅産物は、pGEM-T easy vector system（Promega社製）を用いて取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、上記の実施例１、（１）、ｂ）項と同様の条件、方法にてａｒａＡ相同領域を含有する長さ約３９０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド取得した。このように作製されたプラスミドをシーケンスすることでＤＮＡ配列を決定した。こうして得た配列は、他の細菌で報告されているａｒａＡの塩基配列と非常に高い相同性を示した。

決定した配列から作製したプローブと、上記の実施例１、（２）、ａ）項にて抽出したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831の染色体ＤＮＡを用いてサザンハイブリダイゼーションを行なった結果、制限酵素ＸｂａＩで処理した断片において約９．９ｋｂの位置にシングルのバンドが検出できた。サザンハイブリダイゼーションの結果を基にコロニーダイハイブリダイゼーションを行ない、ａｒａＡを含むＸｂａＩ断片と連結したプラスミドを作製した。このプラスミドをシーケンスすることでＤＮＡ配列を決定した。得られた配列を解析した結果、ａｒａＢ、ａｒａＤ、ａｒａＡの順に並ぶ約４．０ｋｂのＤＮＡ配列を確認できた。またａｒａＢの約２．５ｋｂ上流にはＬ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子ａｒａＥ（配列番号１３）が存在していた（図２）。

ｃ）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831からのＬ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーター遺伝子（ａｒａＥ）のクローニング
コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831のａｒａＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。

ＰＣＲに際しては、以下の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー」を用いて合成し、使用した。
ａｒａＥ遺伝子増幅用プライマーセット

尚、いずれのプライマーにもＥｃｏＲＩサイトが末端に付加されている。

鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（２）、ａ）項にて抽出したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831の染色体ＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Pyrobest DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。

反応液：

ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９８℃、１０秒
アニーリング過程：５５℃、３０秒
エクステンション過程：７２℃、２分
以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。

上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、ａｒａＥ遺伝子を含む、約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上述のＥｃｏＲＩ制限酵素で処理した増幅産物と、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理をしたｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）とを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。
この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｒａＥ遺伝子を含有する長さ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。
該ａｒａＥ遺伝子を含むプラスミドをｐＫＫ２２３−３−ａｒａＥ（図３）と命名した。

（３）マーカーレス用ａｒａＥ導入用ベクターＩｎｄ−ａｒａＥの構築
次に、ａｒａＥ遺伝子をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rにマーカーレスで染色体に導入するために必要なＤＮＡ領域を、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの生育に必須でないと報告されている配列〔Appl. Environ. Microbiol.、Vol. 71、3369-3372（2005）〕（ＳＳＩ領域）を基に決定した。このＤＮＡ領域（Ｉｎｄｅｌ１１領域）を以下のＰＣＲ法により増幅した。

ＰＣＲに際しては、以下の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー」を用いて合成し、使用した。
ａｒａＥ遺伝子導入用Ｉｎｄｅｌ１１領域増幅用プライマーセット

尚、いずれのプライマーにもＸｂａＩサイトが末端に付加されている。

鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（２）、ａ）項と同様の方法で抽出したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの染色体ＤＮＡを用いた。ＰＣＲは、Takara LA Taq HS DNA polymeraseを使用し、反応液にＤＭＳＯを使用しないことと、ＰＣＲサイクルを以下に示す条件で行なったこと以外は上記（実施例１、（２）、ｂ）項）と同様の条件で行なった。

ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃、３０秒
アニーリング過程：５５℃、３０秒
エクステンション過程：７２℃、３分
以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。

上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、Ｉｎｄｅｌ１１領域を含む、約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上述の制限酵素ＸｂａＩで処理した増幅産物と、ＸｂａＩで制限酵素処理をしたマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドｐＣＲＡ７２５〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、 Vol. 8、243-254（2004）、（特開2006-124440）〕とを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、形質転換体選定用培地の抗生物質としてクロラムフェニコールの代わりに、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを使用したこと以外は、上記の実施例１、（１）、ｂ）と同様の条件及び方法にてＩｎｄｅｌ１１領域を含有する長さ約２．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを取得した。
該ａｒａＥ遺伝子導入用Ｉｎｄｅｌ１１領域を含むプラスミドをＩｎｄ１１ＬＫＳ２−４（図３）と命名した。

プラスミドｐＫＫ２２３−３−ａｒａＥをＥｃｏＲＩで処理後、アガロース電気泳動で分離し、ゲルから切り出した約２．０ｋｂの遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲル抽出キット（商品名：Minelute Gel Extraction Kit、キアゲン社製）を用いて回収した。得られたＤＮＡを、平滑末端処理キット（商品名：DNA Blunting Kit、宝酒造株式会社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ＥｃｏＲＶで制限酵素処理をしたＩｎｄ１１ＬＫＳ２−４を混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。

この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｒａＥ遺伝子を含有する長さ約１．７ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。
該ａｒａＥ遺伝子導入用プラスミドをＩｎｄ１１−ａｒａＥ（図３）と命名した。

（４）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ｉｎｄ−ａｒａＥの作製
ａｒａＥ遺伝子導入用プラスミドＩｎｄ１１−ａｒａＥは、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R内で複製不可能なプラスミドである。Ｉｎｄ１１−ａｒａＥを、電気パルス法〔Agric. Biol. Chem.、Vol. 54、443-447（1990）及びRes. Microbiol.、Vol. 144、181-185（1993）〕の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rへ導入し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕に塗布した。

さらに、上記の培地で得られた株を、スクロース１０％（Ｗ／Ｖ）を含有する表２に示すＢＴ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けばＢＴ液体培地と同一成分組成〕に塗布した。

プラスミドＩｎｄ１１−ａｒａＥが染色体上の相同領域と１点相同組換えを起こした場合、Ｉｎｄ１１−ａｒａＥ上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチラスサブチリス（Bacillus subtilis）のｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子の発現によるスクロース致死性を示すのに対し、２点相同組換えを起こした場合は、Ｉｎｄ１１−ａｒａＥ上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、ｓａｃＲ−ｓａｃＢ遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性とを示す。従って、目的とするａｒａＥ遺伝子染色体導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。
カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示した株をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araEと命名した。

（５）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811の構築
プラスミドｐＣＲＡ８１１を上記の実施例１、（４）項に示した電気パルス法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rとコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind11-araEへ導入し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕により、形質転換株コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811とを得た。尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００８年５月２８日、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−５７６）。

実施例２Ｄ-キシロースを単一炭素源とした培地を用いたコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811の好気培養
上記の実施例１、（５）項で作製したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811をそれぞれ用いて、Ｄ−キシロースを唯一の炭素源として含有するＢＴ液体培地におけるＤ−キシロースの減少と菌の増殖とを検討した。該２菌株をそれぞれ、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むことを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成培地１０ｍＬに一白金耳植菌して３３℃、１３時間、２００ｒｐｍの条件で好気的に培養後、上記で示したＢＴ培地で２回洗浄し、単一炭素源として２５ｍＭＤ−キシロースを含有する１００ｍＬのＢＴ培地にＯＤ６１０が０．２になるように植菌した。Ｄ−キシロース濃度は、逐次培地の少量をサンプリングして液体クロマトグラフィーによる分析を行い、経時的な消費量の変動を調べた。結果を、図４（１）及び（２）に示す。図４（１）及び（２）において、白丸（○）は、ＯＤ６１０の変化を、黒丸（●）は、培地中のＤ−キシロース濃度の変化を、それぞれ示す。図４（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ−キシロース消費及び増殖の経時変化を示す図である。図４（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811による、Ｄ−キシロース消費及び増殖の経時変化を示す図である。結果、図４（１）及び（２）に示すように、好気条件下において、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図４（２））のＤ−キシロース消費速度と増殖速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図４（１））と比較して、著しく速くなった。

実施例３コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ−キシロースを単一基質とした還元条件下の糖消費及び乳酸生成反応
（1）好気培養増殖
冷凍庫にて−８０℃で保存してある上記の実施例１、（５）項で作製したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811を、それぞれプレート培養用培地であるクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕に塗布し、３３℃、１２時間暗所に静置した。

上記のプレートで生育した該２種のコリネ型細菌株をそれぞれ、１０ｍＬのクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ液体培地が入った試験管に一白金耳植菌し、３３℃、１２時間、２００ｒｐｍの条件で好気的に培養した。

上記の条件で生育した該２種の菌株をそれぞれ、好気培養増殖用培地であるクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ液体培地５００ｍＬが入っている容量１Ｌの三角フラスコに移し、３３℃、１３時間、２００ｒｐｍの条件で好気的に培養した。このようにして培養増殖された菌体は、遠心分離（４℃、１０分、５，０００×ｇ）によって回収し、次の還元条件下の乳酸生成反応に供した。

（2）還元条件下の糖消費及び有機酸生成反応
上記の実施例３、（１）項の好気培養増殖工程により回収された該２種の菌株それぞれの湿潤菌体４ｇ（Dry cell換算約０．８ｇ）を、ＢＴ−Ｕ培地（組成：尿素が含まれていないことを除けば上記ＢＴ液体培地と同一成分組成）８０ｍＬに懸濁後、１００ｍＬ容のバイアルに入れ、Ｄ−キシロース１００ｍＭを利用炭素源として加え、炭酸水素ナトリウム１００ｍＭを添加後、密閉した状態で３３℃にてゆるく撹拌し、還元条件下の乳酸生成反応を行なった。

この間、２．５Ｎ（規定）濃度のＮＨ_４ＯＨ水溶液（２．５Ｎアンモニア水溶液）を使用して反応槽内のｐＨを７．５に常時維持した。
反応槽内のＤ−キシロース及び乳酸濃度は、逐次培地少量をサンプリングして液体クロマトグラフィーによる分析を行い、経時的な消費量及び生成量の変動をそれぞれ調べた。

その結果を図５（１）及び（２）に示す。図５（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ−キシロース消費及び乳酸生成の経時変化を示す図である。図５（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811による、Ｄ−キシロース消費及び乳酸生成の経時変化を示す図である。図５（１）及び（２）において、黒丸（●）は、培地中のＤ−キシロース濃度の変化を、白丸（○）は、培地中の乳酸濃度の変化を、それぞれ示す。

尚、Ｄ−キシロース消費速度及び乳酸生成速度は反応開始０時間から３時間後における単位時間当たりの消費量及び生成量である。コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図５（１））及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図５（２））それぞれのＤ−キシロース消費速度及び乳酸生成速度は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811が、Ｄ−キシロース消費速度１５．１ｍＭ／ｈ及び乳酸生成速度１８．５ｍＭ／ｈ、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811が、Ｄ−キシロース消費速度４８．４ｍＭ／ｈ及び乳酸生成速度５８．５ｍＭ／ｈであった。
この結果より、還元条件下においても、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ−キシロース消費速度及び乳酸生成速度はいずれも、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811と比較して、著しく速くなったことが分かった。

実施例４Ｄ−グルコース及びＤ−キシロース混合糖を炭素源とした培地を用いたコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の好気培養
上記の実施例２における炭素源をＤ−キシロースから、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの混合物（３．６ｇ／Ｌ及び３．６ｇ／Ｌ；存在比率１：１）に代えて反応を行なう以外は、実施例２と同様の条件及び方法にて、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の好気培養増殖及び糖消費を調べた。

結果を、図６（１）及び（２）に示す。図６（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロース消費、並びに増殖の経時変化を示す図である。図６（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811による、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロース消費、並びに増殖の経時変化を示す図である。なお、図６（１）及び（２）において、星印（＊）は、ＯＤ６１０の変化を示す。黒丸（●）は、培地中のＤ−グルコース濃度の変化を示す。白丸（○）は、培地中のＤ−キシロース濃度の変化を示す。

この結果、図６（１）及び（２）に示すように、好気条件下において、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811（図６（２））のＤ−キシロース消費速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図６（１））と比較して著しく速くなった。これにより、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、培地中のＤ−グルコース及びＤ−キシロースを３０時間以内に完全に消費することができたのに対して、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811では、同じ３０時間でキシロースの残存が観察された。

さらに、好気培養において、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの共存下では、Ｄ−キシロース利用に関してグルコース抑制が観察されるのに対して、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用することが可能であった。

実施例５コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ−グルコース及びＤ−キシロース混合糖を基質とした還元条件下の糖消費及び乳酸生成反応
上記の実施例３における基質をＤ−キシロースから、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの混合物（４０ｇ／Ｌ及び２０ｇ／Ｌ；存在比率２：１）に代えて反応を行なう以外は、実施例３と同様の条件及び方法にて好気培養増殖後、還元条件下での反応を行なった。

結果を、図７（１）及び（２）に示す。図７（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811による、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロース消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。図７（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811による、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロース消費、並びに乳酸生成の経時変化を示す図である。なお、図７（１）及び（２）において、黒丸（●）は、培地中のキシロース濃度の変化を示す。星印（＊）は、培地中のＤ−グルコース濃度の変化を示す。白丸（○）は、培地中の乳酸濃度の変化を示す。

この結果、図７（１）及び（２）に示すように、還元条件下においても、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） Ind-araE/pCRA811（図７（２））のＤ−キシロース消費速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811（図７（１））と比較して著しく速くなった。これにより、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを８時間以内に完全に消費することができたのに対して、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811では、同じ８時間で著量のキシロースの残存が観察された。８時間後のコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811とコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の生成した乳酸生成濃度はそれぞれ、３３９ｍＭ及び４３１ｍＭと、後者が約１．３倍高かった。

さらに、還元条件下において、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースの共存下では、Ｄ−キシロース利用に関してグルコース抑制が観察されるのに対して、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811は、Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用することが可能であった。

実施例６コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADの構築
（１）Ｐｌａｃ−ａｒａＢＡＤの構築方法
エシェリヒアコリ（Escherichia coli）のＬ−アラビノースイソメラーゼ（以下ａｒａＡと記す）、Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢと記す）、Ｌ−リブロース−５−フォスフェイト−４−エピメラーゼ（ａｒａＤと記す）の３つの遺伝子はａｒａＢ、ａｒａＡ、ａｒａＤが順に連結したオペロン（ａｒａＢＡＤ）を形成している（配列番号１８）〔Gene、Vol. 47、231-244（1986）〕。ａｒａＢＡＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。

ＰＣＲに際して、ａｒａＢＡＤ遺伝子をクローン化するべく、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）の配列を基に、下記の一対のプライマーセットを、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用いて合成し、使用した。
ａｒａＢＡＤ遺伝子増幅用プライマーセット

尚、前者にはＥｃｏＲＩサイトが、後者にはＳａｌＩサイトがそれぞれ末端に付加されている。

鋳型ＤＮＡには、上記の実施例１、（１）、ａ）項にて抽出したエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡを用いた。
ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：PrimeSTAR HS DNA polymerase、宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行なった。

反応液：
（５×）ＰＣＲ緩衝液：１０μＬ
２．５ｍＭｄＮＴＰ混合液：４μＬ
鋳型ＤＮＡ：１μＬ（ＤＮＡ含有量２００ｎｇ以下）
上記の２種のプライマー：各々１μＬ（最終濃度０．２μＭ）
PrimeSTAR HS DNA polymerase：０．５μＬ
滅菌蒸留水：３３．５μＬ
以上を混合し、この５０μＬの反応液をＰＣＲにかけた。

ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９８℃、１０秒
アニーリング過程：５５℃、１０秒
エクステンション過程：７２℃、５分
以上を１サイクルとし、３０サイクル行なった。

上記で生成した反応液の一部を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、ａｒａＢＡＤ遺伝子を含む、約４．５ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
上述の制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで処理した増幅産物と、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで制限酵素処理をしたコリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１（特開２００６−１２４４４０）とを混合し、これにライゲーションキット（商品名：Mighty Cloning Kit、宝酒造株式会社製）を添加後、取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法〔Journal of Molecular Biology.、Vol. 53、159（1970）〕によりエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬ、Ｘ−ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galactopyranoside）２００μｇ／ｍＬ及びＩＰＴＧ（isopropyl 1-thio-beta-d-galactoside）１００μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。

この培地上で白色を呈する生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｒａＢＡＤ遺伝子を含有する長さ約４．５ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、プラスミド抽出キット（商品名：QIAprep Spin Miniprep Kit、キアゲン社製）を用いて抽出した。
該ａｒａＢＡＤ遺伝子を含むプラスミドをＰｌａｃ−ａｒａＢＡＤ（図８）と命名した。

（２）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araEの構築方法
ａ）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）RからのＳＳＩ領域のクローニング
コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）RのＳＳＩ領域にＤ−キシロース代謝関連遺伝子ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子の導入を行なうため、これらのＤＮＡ領域を、表３に示したプライマー及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Rの染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。ＰＣＲは、Takara LA Taq HS DNA polymeraseを使用し、上記の実施例１、（３）項と同条件で行なった
上記で生成した反応液を用いて１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルにより電気泳動を行なったところ、約２．０から３．０ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

表３に示した制限酵素で処理した増幅産物と、同じ制限酵素で処理をしたマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドｐＣＲＡ７２５〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254（2004）、（特開2006-124440）〕とを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、形質転換体選定用培地の抗生物質としてクロラムフェニコールの代わりに、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを使用すること以外は、上記の実施例６、（１）項と同様の条件及び方法にて各ＳＳＩ領域を含有する長さ約２．０から３．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを取得した。

表１中、^ａアスタリスクは、インバースＰＣＲのためのプライマーを示している。
表１において、^ｂアンダーラインで示した塩基配列は、クローニング用に作製した制限酵素サイトを示している。

ｂ）マーカーレス用ｘｙｌＡ−ｘｙｌＢ遺伝子導入用ベクターの構築
上記の実施例１、（１）項で作製したプラスミドｐＣＲＡ８１１をＸｂａＩ及びＸｈｏＩで処理後、アガロース電気泳動で分離し、ゲルから切り出した約３．３ｋｂのｘｙｌＡ−ｘｙｌＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲル抽出キット（商品名：Minelute Gel Extraction Kit、キアゲン社製）を用いて回収した。得られたＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで制限酵素処理をした上記実施例６、（２）、ａ）項で作製したプラスミドと混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。

この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりｘｙｌＡ−ｘｙｌＢ遺伝子を含有する長さ約３．３ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。

ｃ）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5- Ind-araE株の作製
上記の実施例６、（２）、ｂ）項で作製したｘｙｌＡ−ｘｙｌＢ遺伝子導入用プラスミドを上記の実施例１、（３）の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）RのＳＳＩ領域にＸｙｌ３、７、８、４、１、１１、６の順番に導入した。最終的に得られた菌株をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5と命名した。

さらに、上記の実施例１、（３）項で作製したａｒａＥ遺伝子導入用プラスミドＩｎｄ１１−ａｒａＥを上記と同様の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5へ導入し得られた菌株をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araEと命名した。

（３）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADの構築
プラスミＰｌａｃ−ａｒａＢＡＤを上記の実施例１、（４）項に示した電気パルス法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araEそれぞれへ導入し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕により、形質転換株コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADを得た。尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADは、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００８年５月２８日、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−５７７）。

実施例７コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADのＤ−グルコース及びＤ−キシロース混合糖を基質とした還元条件下の糖消費及び乳酸生成反応
上記の実施例３と同様の条件及び方法にて、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADそれぞれを好気培養増殖させた。その後、上記の実施例３における基質をＤ−キシロースから、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの混合物（それぞれ３２ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ及び６．４ｇ／Ｌ；存在比率５：２．５：１）に代えて行なう以外は、上記の実施例３と同様の条件及び方法にて、還元条件下での反応を行なった。

結果を図９（１）及び（２）に示す。図９（１）は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBADによる糖消費の経時変化を示す図である。図９（２）は、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADによる糖消費の経時変化を示す図である。図９（１）及び（２）において、黒丸（●）は、培地中のＬ−アラビノース濃度の変化を示す。三角（▲）は、培地中のＤ−キシロース濃度の変化を示す。星印（＊）は、培地中のＤ−グルコース濃度の変化を示す。白丸（○）は、培地中の乳酸濃度の変化を示す。

この結果、図９（１）及び（２）に示すように、還元条件下において、ａｒａＥ遺伝子を染色体に導入したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBAD（図９（２））のＤ−キシロース及びＬ−アラビノース消費速度は、ａｒａＥ遺伝子を導入していないコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD（図９（１））と比較して著しく速くなった。これにより、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum） X5-Ind-araE/Plac-araBADは、培地中のＤ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの３種の糖を９時間以内に完全に消費することができたのに対して、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBADは、同じ９時間でＤ−キシロース及びＬ−アラビノースの残存が観察された。９時間後のコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5/Plac-araBAD及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADの生成した乳酸の濃度は、それぞれ３４２ｍＭ及び３７４ｍＭであった。

さらに、還元条件下において、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADは、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの３種の糖を並行的かつ同時利用することが可能であった。

実施例８コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811のＤ−グルコース及びＤ−キシロースの混合糖を基質とした還元条件下のコハク酸生成反応
上記の実施例１、（５）項で作製したコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811それぞれを、上記の実施例５と同様の条件及び方法にて、好気培養増殖後、還元条件下、コハク酸生成反応を行った。

その結果、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R/pCRA811及びコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ind-araE/pCRA811の反応開始３時間後のコハク酸生成速度は、それぞれ１４．２ｍＭ／ｈ及び１６．９ｍＭ／ｈであった。

実施例９コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind11-araE-Δldh/pEthAraの構築
（１）プラスミドｐＥｔｈＡｒａ構築方法
エタノール生産に必要なザイモモナスモビリス（Zymomonas mobilis）のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（以下ａｄｈＢと記す）及びピルベートデカルボキシラーゼ（ｐｄｃと記す）の２つの遺伝子〔Journal Mol Microbiol Biotechnol、Vol. 8、4（2004）〕を含むプラスミドｐＣＲＡ７２３〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、 Vol. 8、243-254（2004）、（特開２００６−１２４４４０）〕を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで処理後、アガロース電気泳動で分離した。ゲルから切り出した約４．０ｋｂのａｄｈＢ−ｐｄｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片をゲル抽出キット（商品名：Minelute Gel Extraction Kit、キアゲン社製）を用いて回収した。得られたＤＮＡを、平滑末端処理キット（商品名：DNA Blunting Kit、宝酒造株式会社製）を用いて平滑末端処理を行ない、ＳａｌＩで制限酵素処理後、同じく平滑末端処理をした上記の実施例６、（１）項で作製したプラスミドＰｌａｃ−ａｒａＢＡＤを混合し、これにMighty Cloning Kit（宝酒造株式会社製）を添加した後、取扱説明書に従い反応させた。

このライゲーション溶液を用い、塩化カルシウム法によりエシェリヒアコリ（Escherichia coli）ＪＭ１０９を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬを含むＬ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ｌ培地と同一成分組成〕に塗布した。

この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりａｄｈＢ−ｐｄｃ遺伝子を含有する長さ約４．０ｋｂのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いて抽出した。作製したプラスミドをｐＥｔｈＡｒａと命名した（図１０）。

（２）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldhの作製
乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子をマーカーレス破壊するために、マーカーレスｌｄｈ遺伝子破壊用プラスミドｐＣＲＡ７２８〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol.、Vol. 8、243-254（2004）〕を上記の実施例１、（３）の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind11-araEに導入した。最終的に得られた菌株をコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldhと命名した。

（３）コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraの構築
上記の実施例９、（１）項で作製したプラスミドｐＥｔｈＡｒａを、上記の実施例１、（４）項に示した電気パルス法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldhへ導入し、クロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ寒天培地〔組成：寒天が１．５％（Ｗ／Ｖ）含まれていることを除けば上記Ａ液体培地と同一成分組成〕により、形質転換株コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraを得た。尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraは、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託した（受託日：２００８年６月４日、受託番号：ＮＩＴＥＢＰ−５８１）。

実施例１０コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraのＤ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノース混合糖を基質とした還元条件下の糖消費及びエタノール生成反応
上記の実施例３と同様の条件及び方法にて、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraを好気培養増殖後、上記の実施例３における基質をＤ−キシロースからＤ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの混合物（３２ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ及び６．４ｇ／Ｌ；存在比率５：２．５：１）に代えて行なう以外は、実施例３と同様の条件及び方法にて還元条件下での反応を行なった。

この結果、図１１に示すように、還元条件下において、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraは、培地中のＤ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの３種の糖を９時間以内に消費し、エタノールを生成した。この際の、３種の糖の消費速度は、実施例７におけるコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE/Plac-araBADとほぼ同等であった。図１１において、黒丸（●）は、培地中のＤ−グルコース濃度の変化を示す。三角（▲）は、培地中のＤ−キシロース濃度の変化を示す。黒い四角（■）は、培地中のＬ−アラビノース濃度の変化を示す。白い四角（◇）は、培地中のエタノール濃度の変化を示す。

さらに、還元条件下においてコリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAraは、Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースの３種の糖を並行的かつ同時利用することが可能であった。

本発明は、セルロース系バイオマス資源からの有機化合物の製造に好適に利用することができる。

Claims

シュガートランスポーター機能を有するＬ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードする外来性遺伝子を、Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌に導入したことを特徴とする、コリネ型細菌形質転換体。
前記Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードする外来性遺伝子として、配列番号１３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は配列番号１３で示される塩基配列と９０％以上の配列相同性を有し、かつシュガートランスポーター機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる請求項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
Ｄ−キシロース利用能を有するコリネ型細菌が、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum) R (FERM BP-18976)、セロビオース利用性組換え株もしくは変異株であるFERM P-18979、FERM P-18977及びFERM P-18978、コハク酸生産組換え株であるFERM BP-10060及びFERM BP-10061、並びにエタノール生産組換え株であるFERM BP-7621、FERM BP-7622、FERM P-19361及びFERM P-19362からなる群より選択されるいずれか１種の菌株のコリネ型細菌であって、かつＤ−キシロース利用能が付与されているものであることを特徴とする請求項１又は２に記載のコリネ型細菌形質転換体。
前記Ｌ−アラビノース輸送系のプロトンシンポーターをコードする外来性遺伝子として、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) ATCC31831、エシェリヒアコリ（Escherichia coli）、バチラスサブチリス（Bacillus subtilis）、バチラスリチェニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチラスコアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルスサケイ（Lactobacillus sakei）、ペディオコッカスペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ラクトバチルスレウテリ（Lactobacillus reuteri）、オーシャノバチルスイヘエニス（Oceanobacillus iheyensis）、ラクトコッカスラクティス（Lactococcus lactis）、ロイコノストックメセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ラクトバチルスプランタリューム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルスファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルスブレビス（Lactobacillus brevis）、ロイコノストックシテリューム（Leuconostoc citreum）、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）、クレブシエラオキシトカ（Klebsiella oxytoca）、及びサルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）からなる群より選ばれる微生物由来のａｒａＥ遺伝子を用いる請求項１に記載のコリネ型細菌形質転換体。
Ｄ−グルコース及びＤ−キシロースを並行的かつ同時利用することができる請求項１〜４のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体。
Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース及びＬ−アラビノースを並行的かつ同時利用することができる請求項５記載のコリネ型細菌形質転換体。
コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) Ind-araE/pCRA811 (受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５７６)である請求項１記載のコリネ型細菌形質転換体。
コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウムグルタミカム (Corynebacterium glutamicum) X5-Ind-araE/Plac-araBAD (受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５７７)である請求項１記載のコリネ型細菌形質転換体。
コリネ型細菌形質転換体が、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）X5-Ind-araE-Δldh/pEthAra (受託番号ＮＩＴＥＢＰ−５８１)である請求項１記載のコリネ型細菌形質転換体。
Ｄ−キシロースを含有する培地中で請求項１〜９のいずれか一項に記載のコリネ型細菌形質転換体を用いて有機化合物を生成させる工程と、同培地より有機化合物を回収する工程とを含む有機化合物の製造方法。
有機化合物が、エタノール、乳酸、コハク酸、キシリトール、酢酸及びアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上であることを特徴とする請求項１０記載の有機化合物の製造方法。