CN102559527B - 一株木糖转运能力高的酿酒酵母菌株及其应用 - Google Patents
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本发明公开了一株木糖转运能力提高的酿酒酵母菌株，该菌株为BSW2ABE，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年12月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC5658。该菌株表达了克隆自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的转运蛋白基因araE，表达该转运蛋白的酿酒酵母菌株利用筛选表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法(见同一申请人提交的申请日为2011年12月15日，申请号为：201110420908.4的发明专利申请)进行检测，其转运木糖的速率较出发菌株提高了1.9倍。本发明还涉及该木糖转运能力提高的菌株在构建可代谢木糖的重组酿酒酵母中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一株木糖转运能力高的酿酒酵母重组菌株，该菌株表达了克隆自谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum的转运蛋白基因araE，转运蛋白基因araE的表达提高了酿酒酵母菌株对木糖的转运能力。本发明还涉及该木糖转运能力高的菌株在构建可代谢木糖的重组酿酒酵母中的应用。
背景技术
目前，能源紧缺问题受到世界各国的广泛关注，用可再生资源生产能源物质来代替非再生的化石资源对未来社会可持续发展具有重大的意义。我国，以农业废弃物为主的木质纤维素原料是年产量巨大的可再生生物质资源，以之作为新能源物质的生产原料对促进可持续发展和保障国家安全具有战略意义。木质纤维素原料水解后，会产生大量单糖，其中，主要成分是葡萄糖，其次是木糖和阿拉伯糖。木糖在水解液中含量可达到总糖的30％，其有效利用是木质纤维素实现经济化大生产的必要条件。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是广泛使用于食品及化工工业的生产菌株，具有抗逆性强、发酵条件易控制、遗传背景清楚、食品级安全等许多优良特性，是优秀的细胞工厂菌株。但天然的酿酒酵母菌株并不能发酵木糖。不同来源木糖代谢途径的引入可以使酿酒酵母利用木糖，但利用效率仍旧不能满足工业生产的需求。制约酵母对木糖利用的瓶颈问题主要有两个：①酵母木糖代谢效率还有待进一步提高；②酵母对木糖的摄取效率偏低。
天然的酿酒酵母通过非特异性己糖转运蛋白(主要有Hxt1、Hxt2、Hxt4、Hxt5和Hxt7)和半乳糖透性酶(Gal2)摄取木糖，这些转运蛋白都属于主要易化子超家族(Major FacilitatorSuperfamily，MFS)转运蛋白，对木糖的亲和性较低，其Km值是葡萄糖的10～100倍，因此，木糖的转运受到葡萄糖的强烈抑制。异源表达高亲和力木糖转运蛋白或提高现有木糖转运蛋白的亲和力，对提高酿酒酵母的木糖代谢的研究十分重要。到目前为止，已报道了部分真菌来源的木糖转运蛋白在酿酒酵母中的异源表达，并且可以促进菌株对木糖的利用，例如，来源于间型假丝酵母(Candida intermedia)的Gxf1、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的Sut1和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的At5g5920等，但要满足构建高效木糖利用重组酿酒酵母的需求，尚需要对木糖的亲和力更高的转运蛋白。2009年，Hideo等人从十种谷氨酸棒状杆菌中筛选到了一株可利用阿拉伯糖为唯一碳源的菌株Corynebacterium glutamicum ATCC31831，其利用阿拉伯糖的能力是利用葡萄糖的2倍，在此种菌株中不受葡萄糖代谢抑制(CCR机制)的影响。后续研究发现了具有高活性阿拉伯糖转运能力的AraE转运蛋白，并且此转运蛋白对木糖的利用同样有较明显的促进作用。推测，此蛋白在谷氨酸棒状杆菌中是戊糖诱导的高亲和性质子同向转运蛋白，在低浓度阿拉伯糖和木糖培养基中转运效果明显，其超表达可使谷氨酸棒状杆菌的戊糖消耗速率提高3倍，可使戊糖与葡萄糖同时被利用，即AraE转运蛋白不受葡萄糖抑制。此蛋白的优良特性使其在酿酒酵母中具有潜在的筛选木糖专一性转运蛋白的研究价值。
酿酒酵母内源的木糖运输蛋白是膜内在蛋白，主要含有12个跨膜结构域，其功能表达需要正确定位在细胞膜上。细菌和真菌的细胞膜骨架虽均为脂双层结构，但两者含有不同的附属物，如固醇类物质、膜蛋白等，造成两者化学组成存在差异，进而导致质膜间的不相容性，另外，细菌和真菌细胞的内膜系统和膜蛋白辅助调节因子均存在差异，造成了细菌源的转运蛋白在酿酒酵母菌株中正确表达、膜定位和发挥完整功能的难度。至今，尚缺少关于细菌源木糖转运蛋白在酿酒酵母中功能表达的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一株木糖转运能力高的酿酒酵母菌株，该菌株表达了克隆自谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum的转运蛋白基因araE，转运蛋白基因araE的表达提高了酿酒酵母菌株对木糖的转运能力。本发明还提供了该木糖转运能力高的菌株在构建可代谢木糖的重组酿酒酵母中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株木糖转运能力高的酿酒酵母菌株，该菌株命名为BSW2ABE，已于2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC5658。该菌株表达了有功能的木糖转运蛋白基因araE。该araE木糖转运蛋白基因克隆自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC31831)。为了检测方便，此菌株还在胞内表达了β-木糖苷酶。该酵母菌株生物学特征是：单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单倍体，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Leu-Ura，该培养基是现有技术中已有的)的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑，呈乳白色。
本发明的木糖转运能力高的酿酒酵母菌株是发明人通过重组构建并利用发明人在本申请之前申请的另一项发明专利(该发明专利的申请日为2011年12月15日，申请号为：201110420908.4)中提到的筛选表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法筛选得到的，本发明的菌株在构建能利用木糖生产食品、化工等产品以及研究木糖转运蛋白机理等方面有重要的应用价值。
本发明的木糖转运能力高的酿酒酵母菌株的构建方法如下：
(1)表达载体构建：建立包含有木糖转运蛋白基因araE的重组载体；
(2)重组菌株构建：将步骤(1)中建立的重组载体转化到胞内表达有β-木糖苷酶的酿酒酵母重组菌株BSW2AB中，并通过筛选得到转化成功的转化子；
(3)对上述转化子进行筛选，筛选方法为“筛选表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法”，得到木糖转运能力高的酿酒酵母菌株BSW2ABE。
具体的构建步骤如下：
(1)受体菌株选择：选用胞内异源表达有木糖苷酶的实验室菌株BSW2AB(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受体株菌，该菌株分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年11月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.5465(在同一申请人提交的申请日为2011年12月15日，申请号为：201110420908.4的发明专利申请中有提到)。其菌学特征为：CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭圆形，不运动，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Leu，该培养基是现有技术中已有的)的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面光滑、湿润、粘稠，呈乳白色；
(2)表达载体选择：采用实验室前期构建的pJFE3(YEplac195，TEFp-PGKt，Ura-，Amp+)空质粒；
(3)表达载体构建：将从谷氨酸棒状杆菌DNA上扩增得到的araE基因序列构建于步骤(2)中的表达载体；
(4)重组菌株构建：将步骤(3)中的表达载体用醋酸锂转化法转化BSW2AB菌株，用添加2％葡萄糖(质量分数)的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura(该培养基是现有技术中已有的)筛选正确转化子。
(5)上述筛选得到的转化子，用申请日为2011年12月15日，申请号为：201110420908.4的发明专利申请中提到的筛选表达有活性的木糖转运蛋白的酿酒酵母菌株的方法进行筛选和检测，与未表达此转运蛋白的对照菌株BSW2ABP(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3)相比，筛选得到了一株对木糖的运输能力提高了1.9倍的菌株，即为本发明的木糖转运能力高的酿酒酵母菌株。
本发明的木糖转运能力高的菌株BSW2ABE，测定胞内木糖积累量结果显示，在胞外木糖浓度的质量分数分别为0.4％、2％和4％时，其比对照菌株BSW2ABP的胞内木糖积累量分别提高了20％、18％和1％，可以预料，本发明的菌株将在构建可代谢木糖的酿酒酵母中有着广阔的应用前景。
附图说明
菌株BSW2ABE，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，已于2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC5658，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
图1是酿酒酵母附加体穿梭质粒pJFE3-araE示意图。其中，转运蛋白基因araE克隆自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC31831)，在酿酒酵母TEFp启动子控制下表达。
图2是酿酒酵母附加体穿梭质粒pYX242-PGKt-TEFp-xynB示意图。其中木糖苷酶基因(xynB)克隆自短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)，在酿酒酵母TPIp启动子控制下表达。
图3是菌株BSW2ABE(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3-araE)相比于BSW2ABP(CEN.PK102-3Aderivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3)菌株的pNPX运输能力测定结果。菌株培养时间为10h。超表达araE基因的菌株其木糖运输能力显著增强，比对照菌株提高了1.9倍。
图4是检测菌株BSW2ABP和BSW2ABE转运pNPX和不同浓度木糖之间的竞争关系。其中，□代表BSW2ABP菌株，■代表BSW2ABE菌株；菌株培养时间为10h。随着胞外木糖浓度的提高，两株菌的pNPX的利用速率呈下降趋势，而且BSW2ABE菌株下降趋势更明显，证明无论对于酿酒酵母内源性木糖转运蛋白还是AraE转运蛋白而言，pNPX和木糖之间均存在竞争关系。
图5菌株BSW2ABP和BSW2ABE胞内木糖积累水平的测定结果。其中，1、2、3分别代表胞外木糖浓度为0.4％、2％和4％质量分数时的实验结果；□代表BSW2ABP菌株，■代表BSW2ABE菌株；菌株培养时间为10h；在胞外木糖浓度分别为0.4％、2％和4％质量分数时，BSW2ABE菌株比对照菌株BSW2ABP胞内木糖积累量分别提高了20％、18％和1％。说明，超表达AraE转运蛋白可以提高酿酒酵母菌株对木糖的摄取量，这种摄取优势在低浓度胞外木糖浓度下显著。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：araE酿酒酵母表达载体的构建
方法如下：
(1)载体选择：采用实验室前期构建的pJFE3(Yeplac195，TEFp-PGKt，Ura-，Amp+)空质粒；
(2)表达载体构建：用上下游引物AraE3up：5’-ATCGCGGATCCATGGCAGGGCACATCATCCGCTCAG-3’和AraEdown-His：5’-ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTAAGGAGTGTTTAAGAGC-3’从谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 31831)DNA上克隆转运蛋白基因araE，利用BamH I和Sal I两酶切位点在(1)中的质粒上构建酿酒酵母附加体穿梭质粒pJFE3-araE，见附图1；
实施例2：表达AraE转运蛋白的菌株BSW2ABE的构建
方法如下：
(1)菌种选择：选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶的实验室菌株BSW2AB(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt)做受体株菌，该菌株含有构建的pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt异源表达载体，见图2，该菌株已于2011年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5465；
(2)菌株构建：将实施例1中构建的质粒pJFE3-araE用醋酸锂转化法转化BSW2AB菌株，用添加2％葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura筛选正确转化子；
(3)菌株验证：将步骤(2)中验证正确的转化子单菌落用添加2％葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura培养，反提质粒，用载体的上游引物TEF W up：5’-CCCAAGCTTCACAATGCATACTTTGTACGTT-3’和araE基因的下游引物AraEdown-His：5’-ACGCBGTCGACCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGCTAAGGAGTGTTTAAGAGC-3’进行PCR验证，得到正确的BSW2ABE重组菌株。
实施例3：菌株BSW2ABE的pNPX运输能力的测定
方法如下：
(1)常规菌株选择：选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶(Bp-xynB)和含有空质粒pJFE3的实验室菌株BSW2ABP(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3)做常规株菌；
(2)菌株培养：将菌株BSW2ABP和BSW2ABE的单菌落用添加2％葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura活化两次，转接40ml于100ml小三角瓶中，初始600nm光吸收(表示为OD600或OD600nm)接为0.5，培养条件均为30℃，200r·min-1；
(3)完整细胞悬液制备：取步骤(2)中培养10小时的菌液，离心(3000r·min-1，5min)去掉原培养基后用pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；
(4)完整细胞状态下测定木糖苷酶酶活：用96孔平板或EP管取适量步骤(3)中的完整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，两者总体系为120μl，随后置于30℃，200r·min-1摇床中孵育30分钟，离心取上清100μl加入96孔平板中，再加入等体积的0.4mol/L的Na2CO3水溶液，混匀后，用酶标仪测定孵育30分钟前后405nm光吸收(表示为OD405或OD405nm)，该光吸收由生成的对硝基酚(pNP)产生。孵育初始值测定时，先不加pNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100μl，再加入100μl的0.4mol/L的碳酸钠水溶液，混匀后，用酶标仪测定OD405nm根据pH6.5的PBS液配制的pNP标准曲线y(OD405nm)＝0.0916x(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD600nm值和细胞干重的对应关系y(mg dw/ml)＝0.2365x(OD600nm)+0.1149，计算得到该菌株对pNPX的转运速率；见图3，可见，BSW2ABE重组菌株的木糖运输能力显著增强，比对照菌株提高了1.9倍，因此，将该菌株进行了保藏，分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC5658。
实施例4：菌株BSW2ABE的pNPX和木糖的竞争关系测定
方法如下：
(1)选用实施例3步骤(3)中培养10小时的菌液，离心(3000r·min-1，5min)去掉原培养基后用pH6.5的50mmol/L PBS液重悬；
(2)竞争关系验证：用96孔平板或EP管取适量步骤(1)中的完整细胞悬液，加入终浓度为6mmol/L的pNPX，另外加入终浓度分别为50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L的木糖，三者总体系为120μl，随后置于30℃，200r·min-1摇床中孵育30分钟，离心取上清100μl加入96孔平板中，再加入等体积的0.4mol/L的Na2C03水溶液，混匀后，用酶标仪于405nm下测定孵育30分钟后生成的对硝基酚(pNP)的光吸收值。孵育初始值测定时，先不加pNPX，只加菌悬液与实验组共同孵育，离心取适量体积上清后加入终浓度6mmol/L的pNPX，两者总体系为100μl，再加入100μl的0.4M的碳酸钠水溶液，混匀后，用酶标仪测定OD405nm；根据pH6.5的PBS液配制的pNP标准曲线y(OD405nm)＝0.0916x(pNP/nmol)+0.0735和实验室菌株的菌液OD600nm值和细胞干重的对应关系y(mg dw/ml)＝0.2365x(OD600nm)+0.1149，计算得到该菌株对pNPX的转运速率；在两菌株中检验不同浓度的木糖对pNPX的竞争关系，见图4。
实施例5：菌株BSW2ABE胞内木糖积累水平的测定
方法如下：
(1)常规菌株选择：选用构建的胞内异源表达有木糖苷酶(Bp-xynB)和含有空质粒pJFE3的实验室菌株BSW2ABP(CEN.PK102-3A derivative，MATa，leu2-3，ura3-52，pYX242-PGKt-TEFp TPIp-xynB-PGKt，pJFE3)做常规株菌；
(2)菌株培养：将菌株BSW2ABP和BSW2ABE的单菌落用添加2％葡萄糖的全合成营养缺陷型培养基SC-Leu-Ura活化两次，各转接150ml于500ml三角瓶中，初始OD600接为0.5，培养条件均为30℃，200r·min-1；
(3)完整细胞悬液制备：取步骤(2)中培养10小时的菌液，用刻度离心管收集150ml菌液(3000r·min-1，5min)，去掉原培养基后用10ml pH6.5的50mmol/LPBS液重悬；
(4)完整细胞状态下测定胞内木糖积累水平：每株菌分别取步骤(3)中的完整细胞悬液各3ml三份，分装于三个5ml离心管中，添加木糖，木糖终浓度分别为0.4％、2％和4％(质量分数)三个胞外木糖浓度水平；置于30度摇床中孵育30min；到时间后取菌液离心(5000r·min-1，2-3min)，弃上清，置于冰上放置；加入等体积的冰浴无菌水，混匀，分成三管，每管1ml；快速洗涤两次(8000r·min-1，15s)，最后用1ml冰浴的无菌水重悬，在37℃中摇床孵育1h；测定每管的OD600，13000r·min-1，离心5min，上清液冻存于-20℃中。
(5)取步骤(4)中的上清液，用HPLC测定木糖和木糖醇浓度，因为木糖和木糖醇等摩尔转化，最终可换算出胞内的总木糖积累水平，见图5。
上述未详尽展开描述的内容，均为公知常识或在同一申请人提交的申请日为2011年12月15日，申请号为：201110420908.4的发明专利申请中有涉及，故在此不再赘述。
Claims (2)
1.一株木糖转运能力高的酿酒酵母菌株，其特征在于：该菌株为BSW2ABE，分类命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），已于2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.5658。
2.权利要求1所述的木糖转运能力高的酿酒酵母菌株在构建可代谢木糖的重组酿酒酵母中的应用。
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Application publication date: 20120711 Assignee: Jiangsu Lianhai Biological Technology Co., Ltd. Assignor: Shandong University Contract record no.: 2018370000016 Denomination of invention: Saccharomyces cerevisiae bacterial strain with high xylose transport capacity and application thereof Granted publication date: 20131211 License type: Common License Record date: 20180516 |
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