PT1513923E - Métodos e materiais para a produção de ácido d-láctico em levedura - Google Patents

Description

ΡΕ1513923 1

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E MATERIAIS PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO D-LÁCTICO EM LEVEDURA"

Antecedentes do Invento 0 ácido láctico é uma molécula orgânica que pode ser produzida através de síntese química ou através de processos de fermentação em microrganismos (biossíntese). As vantagens que uma abordagem biossintética possa ter em relação a uma abordagem de síntese química para a produção de um produto orgânico incluem um rendimento mais eficiente de produto, produção mais rápida, pureza isomérica e menor custo. 0 ácido D-(ou R-)láctico é um bloco de construção na produção de materiais biologicamente activos, incluindo herbicidas e produtos farmacêuticos. No entanto, novos processos que baixem o custo do ácido D-láctico podem permitir a sua penetração e utilização disseminada em mercados de produtos químicos maiores incluindo, por exemplo, o dos plásticos. 0 ácido D-láctico pode ser convertido em D-láctido, um condensado cíclico do ácido D-láctico, que tem muitas potenciais aplicações, incluindo o fabrico de películas, fibras e outras aplicações dos ΡΕ1513923 polímeros. 0 D-láctido pode ser polimerizado em poli(D-láctido) (D-PLA), um polímero que possui propriedades semelhantes ao poli(L-láctido) (L-PLA), que é utilizado para várias aplicações de polímeros. 0 PLA altamente cristalino tal como é actualmente produzido por Cargill Dow contém o L-estereoisómero. Esta resina rica no L-isómero é mais vulgarmente utilizada no mercado das fibras de PLA devido à sua capacidade para aumentar a tenacidade das fibras, a resistência ao encolhimento, e aumentar a sua temperatura utilizável acima da temperatura de transição vítrea de L-PLA, quando lhes é aplicado elevado stress. Esperar-se-ia que um polímero semelhantemente rico no D-isómero tivesse propriedades semelhantes. Mais, um polímero rico em D-isómero pode ser misturado com um polímero rico no L-isómero para formar um estereo-complexo que possua uma temperatura de fusão significativamente mais elevada (até aproximadamente 230°C). Esta temperatura de fusão mais elevada permite que o PLA seja utilizado em aplicações onde é necessária uma melhor resistência térmica. Um exemplo de uma tal aplicação é em certas aplicações de vestuário, onde é necessária uma maior temperatura de fusão para produzir tecidos engomáveis. 0 ácido D-láctico é também um intermediário químico industrial útil que é utilizado em aplicações herbicidas e farmacêuticas. Por exemplo, o ácido D-láctico é um intermediário no fabrico de herbicidas fenoxi-propiónicos e ariloxifenoxipropiónicos. 3 ΡΕ1513923

Os processos biossintéticos conhecidos para a produção de ácido láctico têm certas limitações. Por exemplo, organismos produtores de ácido láctico natural tais como Lactobacilli podem produzir grandes quantidades de ácido L-láctico sob condições de fermentação. No entanto, estes organismos requerem um meio de fermentação complexo para produzirem eficientemente. A complexidade do meio de fermentação aumenta os custos da matéria-prima e torna mais difícil e dispendioso separar o ácido láctico do meio. Mais, os processos de fermentação utilizando estes organismos tendem a infecção por outras espécies não produtoras de ácido láctico. Não existe um método económico para eliminar selectivamente as estirpes indesejadas. É necessário manter o pH no caldo de fermentação quando estes organismos são utilizados, uma vez que ambientes de pH baixo tanto dentro das próprias bactérias como no caldo podem inibir a proliferação das bactérias ou causar morte celular. Isto é alcançado através da adição de agentes neutralizantes tais como carbonato de cálcio ao caldo de fermentação para formar lactato de cálcio. Para recuperar o ácido láctico, é necessário tratar o lactato de cálcio com um ácido forte tal como ácido sulfúrico, que reage com o lactato de cálcio para formar ácido láctico e gesso (sulfato de cálcio) . A incapacidade destes organismos para funcionarem a pH baixo conduz portanto a custos adicionais em matéria-prima e para eliminação de subprodutos indesejados (gesso) . 4 ΡΕ1513923

Em Japanese Kokai N° 2002-136293A é divulgada uma levedura geneticamente modificada que se diz produzir ácido D-láctico. A levedura hospedeira é de um tipo especial que "acumula" piruvato, i.e., produz quantidades significativas de piruvato que já não são metabolizadas.

Dequin et al. (BIO/TECHNOLOGY, 1994, vol 12, n° 2, páginas 173-177) ensinam a expressão de L-lactato-desidrogenase de Lactobacillus casei na levedura Saccharomyces cerevisiae a partir de um plasmideo. De modo semelhante, Chelstowska et al. (YEAST, 1999, vol. 15, n° 13, páginas 1377-1391) ensinam a expressão da D-lactato-desidrogenase DLD2 e DLD3 a partir de plasmídeos na levedura S. cerevisiae.

Assim, permanece a necessidade na arte de processos biossintéticos para a preparação de ácido D-láctico com um organismo que: 1) permita que o ácido D-láctico seja produzido a bons niveis e produtividades; 2) requeira de preferência apenas um meio de fermentação simplificado, e 3) permita de preferência um pH baixo e/ou um meio de fermentação a temperatura elevada que possa eliminar a contaminação de estirpes de microrganismos indesejadas.

Sumário do Invento

Num aspecto, este invento proporciona células de levedura recombinantes de uma espécie que naturalmente não acumula piruvato, compreendendo pelo menos um gene da D- 5 ΡΕ1513923 lactato-desidrogenase exógeno integrado no seu genoma, em que o gene da D-lactato-desidrogenase está operativamente ligado a sequências promotoras e terminadoras funcionais. 0 invento proporciona também ácidos nucleicos recombinantes codificando um gene da D-lactato-desidro-genase operativamente ligado a sequências promotoras e terminadoras funcionais. Os ácidos nucleicos recombinantes do invento permitem a expressão do gene da D-lactato-desidrogenase numa célula de levedura recombinante.

Noutro aspecto, o invento proporciona um método para produção de ácido láctico compreendendo as células fermentadoras do invento sob condições que permitem a biossíntese do ácido D-láctico.

As células de levedura transformadas são capazes de produzir ácido D-láctico a rendimentos comercialmente significativos. As células podem tolerar bem a presença de ácido D-láctico e podem continuar a produzir eficientemente quando o caldo de fermentação contém uma concentração significativa de ácido D-láctico. Este efeito é inesperado, uma vez que tanto o ácido L-láctico como o ácido D-láctico tendem a ser inibidores do crescimento e da sobrevivência de certos microrganismos (ver Lett. Appl. Microbiol. 35(3): 176-80, 2002; "Susceptibility of Escherichia coli 0157 and non-0157 isolates to lactate", McWilliam Leitch EC, Stewart CS., Appl. Environ. Microbiol. 68(9): 4676-8, Set. de 2002). Nalguns casos mostrou-se que células eucarióticas e 6 ΡΕ1513923 bacterianas respondem ao ácido D-láctico de modo diferente ao do ácido L-láctico (ver, Uribarri J., Oh M.S., Carroll H.J., Medicine (Baltimore) 77(2): 73-82, Mar. 1998, "D-lactic acidosis: a review of clinicai presentation, biochemical features, and pathophysiologic mechanisms", cf. Leitch et al., supra) .

As concretizações preferidas especificas do presente invento serão evidentes a partir da seguinte descrição mais detalhada de certas concretizações preferidas e das reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos A FIG. 1 é um mapa plasmidico de pNC2, compreendendo o promotor de PGK e o terminador de GAL10, ambos de S. cerevisiae. A FIG. 2 é um mapa plasmidico de pNC4, compreendendo o promotor de PDC1 e o terminador de GAL10, ambos de S. cerevisiae. A FIG. 3a é um mapa de um fragmento de restrição Not I de uma sequência de 1235 pb derivada de ADN cromossómico de S. cerevisiae amplificado por PCR, que compreende o promotor de PGK e o terminador de GAL10 (S. cerevisiae) e um local de clonagem múltipla entre o promotor e o terminador. 7 ΡΕ1513923 A FIG. 3b é um mapa de um fragmento de restrição Not I de uma sequência de 1235 pb derivada de ADN cromossómico de S. cerevisiae amplificado por PCR, que compreende o promotor de PDCl e o terminador de GAL10 (S. cerevisiae) e um local de clonagem múltipla entre o promotor e o terminador. A FIG. 4 é um mapa plasmidico de pVR24, compreendendo L-LDH de B. megaterium funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 5 é um mapa plasmidico de pVR22, compreendendo o marcador de resistência a G418 funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 6 é um mapa plasmidico de pNC7, compreendendo o gene LDH de B. megaterium, funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae.

As FIG. 7A-B são: A) um mapa plasmidico de pS021, compreendendo PDCl de K. marxianus; e B) um mapa plasmidico de pS027, compreendendo um fragmento de 3,3 kb de PDCl (K. marxianus) que contém uma região 5' a montante do locus de PDCl; e A FIG. 8 é um mapa plasmidico de pS028, compreendendo uma deleção na região de codificação de PDCl ΡΕ1513923 contida em pS021 e o gene de resistência a G418 funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 9 é um mapa plasmidico de pS029, compreendendo uma deleção na região de codificação de PDC1 contida em pS021, e o gene de resistência à zeocina funcionalmente ligado ao promotor de TEFl e ao terminador Tcycl de S. cerevisiae (de pTEFl/Zeo; Invitrogen). A FIG. 10 é um mapa plasmidico de pPSl, compreendendo o gene de resistência à higromicina (hph) de E. coli funcionalmente ligado ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 11a é um mapa plasmidico de pVR43, compreendendo o gene D-LDH de L. helveticus. A FIG. 11b é um mapa plasmidico de pVR44, compreendendo o gene D-LDH de L. helveticus com os locais Xbal e BamEl na extremidade 5' e 3' do gene, respectivamente. A FIG. 12 é um mapa plasmidico de pVR47, compreendendo o gene D-LDH de L. helveticus funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 13 é um mapa plasmidico de pVR48, compreendendo o gene D-LDH de L. helveticus funcionalmente ligado 9 ΡΕ1513923 ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae, e o gene de resistência hph funcionalmente ligado ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 14 é um mapa plasmidico de pCA50, compreendendo uma cassete de expressão inserida entre as regiões flanqueadoras a 3' e 5' do locus de PDC1 (K. marxianus) , contendo gene D-LDH de L. helveticus funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae, e o gene de resistência hph funcionalmente ligado ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 15 é um mapa plasmidico de pVR29, compreendendo o marcador de resistência a G418 funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 16a é um mapa plasmidico de pBH5a, compreendendo um flanco 5' do locus de PDC1 (K. marxianus) e separadamente, o gene de resistência a G418 funcionalmente ligado ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. A FIG. 16b é um mapa plasmidico de pBH5b, compreendendo as regiões flanqueadoras 5' e 3' do locus de PDC1 (K. marxianus) e separadamente, o gene de resistência a G418 funcionalmente ligado ao promotor de PDCl e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae. 10 ΡΕ1513923 A FIG. 16C é um mapa plasmídico de pBH5c, compreendendo o locus de PDC1 de K. marxianus. A FIG. 17 é um mapa plasmídico de pBH6, compreendendo o gene D-LDH de L. helveticus situado entre as regiões flanqueadoras 5' e 3' do locus de PDC1 {K. marxianus), e separadamente o gene de resistência a G418 funcionalmente ligado ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae.

Descrição Detalhada do Invento

As células de levedura do invento são proporcionadas a partir de uma espécie que, antes da recombinação tal como aqui descrita, não acumula piruvato. Por "não acumula piruvato", entenda-se que a espécie não produz pelo menos 10 g/1 de ácido pirúvico quando cultivada de acordo com o método exposto na Concretização 5 de Japanese Kokai 2000-78996. Geralmente, uma célula de levedura não acumulará piruvato quando contém naturalmente uma via metabólica activa que metaboliza o piruvato em vários metabolitos tais como etanol ou acetato ou biomassa. Tais células de levedura metabolizam o piruvato de modo suficientemente rápido para que exista pouco piruvato dentro da célula em qualquer momento e seja segregado pouco piruvato pela célula. As células de levedura preferidas têm naturalmente um ou mais genes activos da piruvato-descarboxilase (PDC) que produzem a proteína piruvato- 11 ΡΕ1513923 descarboxilase, que converte piruvato em etanol. Células de levedura ainda mais preferidas são as que exibem o fenótipo Crabtree-negativo, no qual a via metabólica aeróbica das células (respiração e ciclo de TCA) não é inibida pela presença de uma elevada concentração de glicose. Exemplos de células de levedura adequadas incluem as dos géneros Candida, Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula. As células dos géneros Candida e Kluyveromyces são particularmente preferidas. Células especialmente preferidas são C. sonorensis, K. lactis, K. theromotolerans e K. marxianus. As células mais preferidas são C. sonorensis e K. marxianus.

As células de levedura recombinantes do invento contêm pelo menos um gene de D-LDH exógeno integrado no seu genoma. Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, lactobacillus plantarum e Lactobacillus pentosus são estirpes que possuem D-lactato-desidrogenases adequadas que podem ser obtidas, inter alia, através de técnicas genéticas recombinantes para utilizar aqui. Um gene de D-lactato-desidrogenase preferido é o da D-lactato-desidrogenase de L. helveticus. A célula pode conter múltiplos genes de LDH exógenos, i.e., pelo menos dois desses genes, de preferência cerca de 2-10 de tais genes, de maior preferência 2-5 de tais genes. Os genes de LDH inseridos podem ser todos o mesmo gene, ou podem ser constituídos por dois ou mais tipos diferentes de genes de LDH. 12 ΡΕ1513923

Um gene, promotor ou terminador é considerado como "exógeno" para fins deste invento se (1) não for verificado no genoma da célula não modificada e (2) não for homólogo ao material genético presente no genoma da célula não modificada. Tal como aqui utilizado, um gene, terminador ou promotor é "nativo" para a espécie de levedura se for verificado (para além de mutações de indivíduo para indivíduo que não afectem a sua função) dentro do genoma das células não modificadas dessa espécie de levedura. 0 gene de D-LDH exógeno é operativamente ligado a sequências promotoras e terminadoras funcionais. Por "operativamente ligado" entenda-se, dentro do contexto deste invento, que o promotor ou terminador, conforme possa ser o caso, funciona após integração no genoma da levedura para controlar o início e o fim, respectivamente, da transcrição do gene de D-LDH.

Tal como aqui se utiliza, o termo "promotor" refere-se a uma sequência não transcrita situada a montante (i.e., a 5') do codão de início da tradução de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 1 a 1000 pb, de preferência 1-500 pb, especialmente 1-100 pb) e que controla o início da transcrição de um gene estrutural. O promotor pode ser nativo à célula hospedeira ou exógeno. Os promotores podem ser os que controlam a expressão de genes que estão envolvidos no metabolismo central do carbono, e.g., promotores glicolíticos ou promotores dos genes do 13 ΡΕ1513923 ciclo do TCA. Promotores adequados incluem os exemplos não limitantes de promotores de genes de levedura da fosfoglicerato-cinase (PGK) , gliceraldeido-3-fosfato-desi-drogenase (TDH) , piruvato-descarboxilase (PDC1), triose-fosfato-isomerase (TP1), Factor estimulador da transcrição-1 (TEF-1), purina-citosina-permease (PCPL3) , e álcool-desidrogenase (ADH). Promotores preferidos do invento incluem os promotores de TEF-1 (S. cerevisiae), PGK (S. cerevisiae) e PDC1 (S. cerevisiae, K. marxianus) .

Em concretizações onde se deseja integrar o gene ou genes de D-LDH num locus alvo do genoma da célula de levedura, a sequência promotora é homóloga à sequência promotora do gene onde se direcciona a inserção. O gene alvo é de preferência um gene de piruvato-descarboxilase (PDC) . Genes alvo vantajosos adicionais incluem os de álcool-desidrogenase (ADH), orotidina-5'-fosfato-descarbo-xilase (ura3), e 3-isopropilmalato-desidrogenase (leu2) .

De modo semelhante, o termo "terminador" refere-se a uma sequência não transcrita situada a jusante (i.e., 3') do codão de terminação da tradução de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 1 a 1000 pb, mais tipicamente 1-500 pares de bases e especialmente 1-100 pares de bases) e que controla o fim da transcrição do gene estrutural. O terminador pode ser exógeno ou nativo à espécie de levedura. Terminadores exógenos adequados incluem os terminadores de GAL10 e CYC-1 de S. cerevisae ou de outra espécie de levedura. 14 ΡΕ1513923

Tal como com os promotores, em certas concre tizações, a sequência terminadora é homóloga à sequência terminadora de um gene alvo.

Um gene, promotor, terminador ou outro material genómico é considerado como sendo "homólogo" a outro material genético se for idêntico, i.e. tiver pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou cerca de 99% de identidade na sequência nucleotidica com o outro material genético, ou se não for idêntico, é suficientemente semelhante a este que mantém a sua função. Portanto, o material genético é considerado "homólogo" mesmo se contiver diferenças devido a, e.g., mutações pontuais, deleções ou adições de pares de bases, desde que essas mutações, deleções ou adições não afectem a função do material genético. No caso de sequências flanqueadoras, é estabelecida homologia se a sequência for suficientemente semelhante à sequência flanqueadora do gene nativo que a sequência flanqueadora se possa envolver num único acontecimento de "crossover" com a sequência flanqueadora do gene nativo. O termo "identidade", tal como é conhecido na arte, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas polipeptidicas ou de duas ou mais moléculas de ácido nucleico, tal como determinado através da comparação das sequências destas. Na arte, "identidade" significa também o grau de relação de sequência entre 15 ΡΕ1513923 moléculas de ácido nucleico ou polipéptidos, conforme seja o caso, tal como determinado através da coincidência entre cadeias de duas ou mais sequências nucleotidicas ou duas ou mais sequências de aminoácidos. A "identidade" mede a percentagem de coincidências idênticas entre a menor de duas ou mais sequências com alinhamento dos intervalos (se os houver) resolvidos através de um modelo matemático ou programa de computador particular (i.e., "algoritmos"). 0 termo "semelhança" é utilizado na arte em relação a um conceito relacionado, mas em contraste com "identidade", a "semelhança" refere-se a uma medida de relação, que inclui tanto as coincidências idênticas como as coincidências de substituições conservativas. Se duas sequências polipeptídicas têm, por exemplo, 10/20 aminoácidos idênticos e o restante são todos substituições não conservativas, então a percentagem de identidade e de semelhança seriam ambas de 50%. Se no mesmo exemplo, existirem mais cinco posições onde existam substituições conservativas, então a percentagem de identidade permanece 50%, mas a percentagem de semelhança seria 75% (15/20) . Portanto, em casos onde existem substituições conservativas, a percentagem de semelhança entre dois polipéptidos será superior à percentagem de identidade entre esses dois polipéptidos. A identidade e semelhança de ácidos nucleicos e polipéptidos relacionados podem ser facilmente calculadas através de métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas 16 ΡΕ1513923 não se limitam aos descritos em COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Parte 1, (Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New

Jersey; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48: 1073, 1988; e Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.

Os métodos preferidos para determinar a identidade são desenhados para dar a maior coincidência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador publica-mente disponíveis. Métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não se limitam ao pacote de programas GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12: 387, 1984; Genetics Computer Group, University of

Wisconsin, Madison, WI) , BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). O programa BLASTX está publicamente disponível em National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, supra). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido pode também ser utilizado para determinar a identidade. 17 ΡΕ1513923

Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos ou polinucleotidicas podem resultar na coincidência de apenas uma curta região das duas sequências e esta pequena região alinhada pode ter uma identidade de sequência muito elevada embora não haja uma relação significativa entre as duas sequências inteiras. Concordantemente, em certas concretizações, o método de alinhamento seleccionado (programa GAP) resultará num alinhamento que abrange pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipéptido alvo. Nalgumas concretizações, o alinhamento pode compreender pelo menos 60, 70, 80, 90, 100, 110, ou 120 aminoácidos do polipéptido alvo. Se os polipéptidos forem alinhados utilizando GAP, o alinhamento pode abranger pelo menos cerca de 100, 150 ou 200 nucleótidos, que podem ser contíguos.

Por exemplo, utilizando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipéptidos para os quais se pretende determinar a percentagem de identidade das sequências são alinhados para uma coincidência óptima dos seus respectivos aminoácidos (o "alcance coincidente", conforme determinado pelo algoritmo). Em certas concretizações, são utilizadas em conjunto com o algoritmo uma penalidade de abertura de intervalo (que é calculada como três vezes a diagonal média; onde a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação a utilizar; a "diagonal" é o registo ou número atribuído a cada coincidência perfeita de 18 ΡΕ1513923 aminoácidos pela matriz de comparação em particular) e uma penalidade de extensão de intervalo (que é normalmente um décimo da penalidade de abertura de intervalo), bem como uma matriz de comparação tal como PAM250 ou BLOSUM 62. Em certas concretizações, é também utilizada pelo algoritmo, uma matriz de comparação padrão (ver, Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352, 1978 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919, 1992 para a matriz de comparação BLOSUM 62).

Em certas concretizações, os parâmetros para uma comparação de sequências polipeptidicas incluem o seguinte:

Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970;

Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra;

Penalidade de Intervalo: 12

Penalidade de Comprimento do Intervalo: 4

Limiar de Semelhança: 0 O programa GAP pode ser útil com os parâmetros de cima. Para sequências nucleotídicas, os parâmetros podem incluir uma penalidade de intervalo de 50 e uma penalidade de comprimento do intervalo de 3, o que é uma penalidade de 3 para cada símbolo em cada intervalo. Em certas concretizações, os parâmetros acima mencionados são os parâmetros por defeito para comparações de polipéptidos (juntamente 19 ΡΕ1513923 com nenhuma penalidade para intervalos finais) utilizando o algoritmo de GAP. A célula de levedura pode ter várias outras modificações ao seu genoma natural. Por exemplo, a célula

de levedura pode conter vários genes marcadores de selecção, tal como descrito mais abaixo, juntamente com sequências promotoras e/ou terminadoras associadas. A célula de levedura pode ainda ter um gene de PDC suprimido ou uma destruição num gene de PDC. Um método para suprimir o PDC juntamente com a inserção do gene de D-LDH no locus do gene de PDC é descrito mais completamente abaixo. Outros métodos de supressão ou destruição da actividade de PDC estão descritos em Porro, "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic acid", Biotechnol. Prog. 11(3): 294-8 Mai-Jun 1995; Porro et al., "Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts", App. Environ. Microbiol. 65(9): 4211-5, Set. 1999; Bianchi et al., "Efficient homolactic fermen-tation by Kluyveromyces lactis strains defective in piruvato utilization and transformed with the heterologous LDH gene", App. Environ. Microbiol. 67(12): 5621-5, Dez. 2001; e WO 99/14335.

As células de levedura recombinantes do invento podem ser preparadas através da inserção de um fragmento de ácido nucleico contendo o gene de D-LDH operativamente ligado a uma sequência promotora. O fragmento faz tipi- 20 ΡΕ1513923 camente parte de um ácido nucleico recombinante que pode conter e de preferência contém também outros elementos, incluindo (a) uma sequência terminadora; (b) um ou mais genes marcadores de selecção (incluindo um promotor e um terminador associados); (c) uma ou mais sequências flan-queadoras homólogas para inserção do fragmento num determinado locus no genoma da célula hospedeira; (d) um ou mais locais de restrição que lhe permitem ser cortado para formar um fragmento linear contendo o gene de LDH, seus promotores e sequências flanqueadoras, genes marcadores e promotores e terminadores associados, etc., para inserção no genoma da célula de levedura; e/ou (e) uma porção estrutural. O termo "ácido nucleico recombinante" é aqui utilizado para se referir a qualquer molécula (e.g., ácido nucleico, plasmideo ou vírus) utilizada para transferir informação de codificação de proteínas para a célula hospedeira. Os métodos de transformação de células são bem conhecidos na arte e podem incluir exemplos não limitantes tais como electroporação, métodos baseados em cloreto de cálcio ou acetato de lítio. O ADN utilizado nas transformações pode ser cortado com determinadas enzimas de restrição ou não ser cortado.

Tal como aqui se utiliza, o termo "genes marcadores de selecção" refere-se a material genético que codifica uma proteína necessária à sobrevivência e/ou ao crescimento de uma célula hospedeira criada num meio de cultura selectivo. Genes marcadores de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a anti- 21 ΡΕ1513923 bióticos ou outras toxinas, e.g., zeocina (gene sh ble de Streptoalloteichus hindustanus), G418 (gene de resistência à canamicina de Tn903), higromicina (gene de resistência a antibióticos aminoglicósidos de E. coli), ampicilina, tetraciclina ou canamicina, para as células hospedeiras; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula e/ou fornecem nutrientes críticos não disponíveis a de meios simples, tais como a deficiência do aminoácido leucina (gene Leu2 de K. marxianus) ; ou um gene ura3 de K. marxianus que dá uracilo a células negativas para a orotidina-5'-fosfato-descarboxilase. Marcadores seleccioná-veis preferidos incluem os exemplos não limitantes do gene de resistência à zeocina, o gene de resistência a G418 e o gene de resistência à higromicina.

As porções estruturais são convenientemente obtidas a partir de vectores de levedura comercialmente disponíveis.

Os métodos adequados de transformação de células de levedura para inserir um gene de LDH exógeno são descritos em WO 00/71738A1 e WO 02/42471A1. Os métodos aqui descritos são geralmente aplicáveis para produzir as células de levedura recombinantes deste invento, com a substituição dos genes de L-LDH aqui descritos por um gene de D-LDH.

Os termos "transformante" e "transformação" tal como aqui se utilizam referem-se a uma mudança nas 22 ΡΕ1513923 características genéticas da célula, e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter um novo ácido nucleico. Assim, uma célula é transformada quando está geneticamente modificada em relação ao seu estado nativo. Por exemplo, após transfecção, o ADN transformante recombina de preferência com o ADN genómico celular através de integração física num cromossoma da célula. Alternativamente, pelo menos transientemente (i.e., dentro de 48-96 h da transformação celular), o ácido nucleico pode ser mantido transientemente como elemento epissómico sem ser replicado ou pode replicar-se independentemente como um plasmídeo. Uma célula é considerada como tendo sido estavelmente transformada quando o ADN está integrado no cromossoma e se replica com a divisão da célula. 0 termo "transfecção" é utilizado para se referir à tomada de ADN estranho ou exógeno por uma célula α e uma célula foi "transfectada" quando o ADN exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são bem conhecidas na arte. Ver, e.g., Graham et al., Virology 52: 456, 1973; Sambrook et al., 2001, "MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL", Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, "BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY", Elsevier; e Chu et al., Gene 13: 197, 1981. Tais técnicas podem ser utilizadas para introduzir uma ou mais espécies de ADN exógeno em células hospedeiras adequadas.

Podem ser integrados múltiplos genes de D-LDH 23 ΡΕ1513923 através de múltiplas transformações. No entanto, é possível construir um ácido nucleico recombinante contendo múltiplos genes de D-LDH, permitindo assim que múltiplos genes de LDH sejam inseridos num único passo.

Um método de transformação de particular interesse direcciona a inserção do gene de D-LDH para o locus de um gene alvo de ocorrência natural. Um gene alvo é um qualquer gene que se deseje substituir pelo gene de LDH. Um gene alvo preferido é um gene de piruvato-descarboxilase, uma vez que a substituição deste gene destrói uma via competidora que produz etanol. Adicionalmente, o gene de piruvato tende a ser activo em espécies de levedura, assim a inserção do gene de LDH no genoma sob controlo dos promotores e terminadores de PDC tende a produzir um mutante que expressa bem LDH. Genes alvo preferidos adicionais são ADH, Leu2 e Ura3.

De preferência, as células de levedura do invento são transformadas com ácidos nucleicos recombinantes do invento e seleccionadas através de crescimento num meio selectivo no qual o marcador seleccionável no ácido nucleico recombinante permite o crescimento preferencial de transformantes. As células transformadas são de preferência criadas após selecção sob condições não selectivas. Sob estas condições, obtêm-se células de levedura recombinantes possuindo o gene de D-LDH exógeno compreendendo o ácido nucleico recombinante integrado no locus genético do gene alvo no cromossoma da levedura. Tal como obtidas de acordo 24 ΡΕ1513923 com os métodos deste invento, estas células têm o gene alvo suprimido e o gene de D-LDH exógeno integrado é inserido no locus do gene alvo de modo a que fique operativamente ligado e sob o controlo da transcrição das sequências de controlo da expressão (tais como as sequências promotora e terminadora) do gene alvo. Quando o gene alvo é um gene de PDC, as células nas quais ocorre a deleção de PDC não crescem bem sob condições anaeróbicas. Assim, podem ser seleccionadas colónias das células identificadas e selec-cionadas através da sua exposição a condições anaeróbicas. As colónias que não crescem são identificadas como aquelas nas quais ocorreu a deleção de PDC. De modo semelhante, a integração direccionada em qualquer outro gene alvo pode ser identificada através do fenótipo associado à deleção de cada um dos genes alvo. A célula de levedura resultante fica sem o gene alvo e contém um gene de D-LDH exógeno integrado no seu genoma no locus do gene alvo. 0 gene de LDH está sob o controlo da transcrição de uma sequência promotora e de uma sequência terminadora que são homólogas às sequências promotora e terminadora do gene alvo.

As sequências, promotora e terminadora de D-LDH podem ser as que estavam presentes nas sequências flanqueadoras contidas no ácido nucleico recombinante que foi utilizado para transformar a célula, ou podem ser as que estavam originalmente presentes no genoma da célula no local da integração. É também possível que o terminador do 25 ΡΕ1513923 gene alvo seja mantido com a deleção da sequência terminadora que estava presente no vector de integração. A sequência flanqueadora pode estar imediatamente adjacente ao gene de D-LDH ou separada do gene por uma sequência intermédia de pares de bases, tal como de 1-1000, de preferência 1-100 pares de bases. As sequências flanqueadoras utilizadas nos ácidos nucleicos recombinantes deste invento são de preferência homólogas às sequências flanqueadoras correspondentes do gene alvo. Os comprimentos típicos das sequências flanqueadoras são de cerca de 50 a cerca de 4000 pares de bases, de preferência cerca de 100 a cerca de 2000 pares de bases, especialmente até cerca de 1200 pares de bases. As sequências flanqueadoras contêm de preferência uma sequência promotora (terminadora no caso de uma sequência flanqueadora a jusante), cada uma homóloga às do gene alvo. Em concretizações preferidas, as sequências flanqueadoras são homólogas e compreendem sequências promotoras e terminadoras, respectivamente, para a levedura nativa. De maior preferência, a integração do ácido nuclei-co recombinante no locus do gene alvo no ADN cromossómico do genoma da levedura resulta no gene de D-LDH exógeno codificado deste modo ficar sob o controlo da transcrição das sequências reguladoras da expressão do gene nativo compreendendo as referidas sequências flanqueadoras.

As sequências flanqueadoras adequadas podem ser obtidas através da identificação do local de integração pretendido no genoma da célula de levedura, da clonagem das 26 ΡΕ1513923 sequências que flanqueiam esse local (utilizando qualquer método conveniente) e da ligação dessas sequências à posição desejada no ácido nucleico recombinante. 0 ácido nucleico recombinante inclui ainda de preferência um ou mais genes marcadores de selecção, que estão, de preferência, sob o controlo da transcrição das suas próprias sequências promotora e terminadora. Nesta concretização as sequências promotora e terminadora, para os genes marcadores não são de preferência sequências promotoras nem terminadoras para o gene alvo. 0 gene ou genes marcadores de selecção e seus respectivos promotores e terminadores de preferência não interrompem a sequência de sequência flanqueadora a montante-gene de LDH-sequência flanqueadora a jusante do ácido nucleico recombinante. O gene ou genes marcadores de selecção e respectivos promotores ou terminadores são de preferência posicionados no ácido nucleico recombinante a montante (5') da sequência flanqueadora a montante.

Um gene alvo é um qualquer gene que se deseje substituir pelo gene de LDH. Um gene alvo preferido é um gene de piruvato-descarboxilase, uma vez que a substituição deste gene destrói uma via competidora que produz etanol. Adicionalmente, o gene de piruvato tende a ser activo em espécies de levedura, assim a inserção do gene de LDH no genoma sob o controlo dos promotores e terminadores de PDC tende a produzir um mutante que expressa bem LDH. Genes alvo adicionais preferidos incluem os da álcool- 27 ΡΕ1513923 desidrogenase (ADH), orotidina-5'-fosfato-descarboxilase (ura3) e 3-isopropilmalato-desidrogenase (leu2). A célula de levedura resultante fica sem o gene alvo e contém um gene de D-LDH exógeno integrado no seu genoma no locus do gene alvo. 0 gene de D-LDH está sob o controlo da transcrição de uma sequência promotora e de uma sequência terminadora que são cada uma homólogas às sequências promotora e terminadora, respectivamente, do gene alvo.

Nesta concretização, as sequências promotora e terminadora de LDH podem ser as que estavam presentes no ácido nucleico recombinante que foi utilizado para transformar a célula, ou podem ser as que estavam originalmente presentes no genoma da célula no local de integração. Após o primeiro acontecimento de "crossover", o gene da D-LDH fica operativamente ligado às sequências promotora e terminadora que estavam presentes no vector de integração. Após o segundo acontecimento de "crossover", uma ou ambas as sequências promotora e terminadora podem ser substituídas pelo promotor e/ou terminador de PDC nativos. Por exemplo, o promotor de PDC nativo pode ser mantido com a deleção da sequência promotora que é fornecida com o vector de integração. É também possível que o terminador de PDC nativo seja mantido com a deleção da sequência terminadora que estava presente no vector de integração. 28 ΡΕ1513923 A célula de levedura transformada do invento é útil para produção de ácido D-láctico a partir de açúcares num processo de fermentação. A célula não contém de preferência um gene de L-LDH funcional ou se contiver um gene de L-LDH funcional a sua actividade é tal que pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, sendo preferível pelo menos 99,0% e ainda de maior preferência pelo menos 99,5% do ácido láctico produzido pela célula é o isómero D. A fermentação pode ser conduzida utilizando qualquer método de fermentação conveniente. Tipicamente a célula é proporcionada com um hidrato de carbono que é capaz de metabolizar em piruvato, e exposta a condições sob as quais ocorre fermentação. O meio de fermentação contém também nutrientes (tais como fontes de azoto, fósforo, enxofre, minerais vestigiais, etc.) que promovem a viabilidade das células.

Os hidratos de carbono em particular que podem ser utilizados dependem da célula hospedeira em particular e de se a célula hospedeira foi modificada para metabolizar em piruvato qualquer hidrato de carbono em particular. Açúcares hexose tais como glicose e frutose, oligómeros de glicose tais como maltose, isomaltose, maltotriose, amido e sacarose, maltodextrinas e xilose (um açúcar pentose) são preferidos. Hidratos de carbono menos preferidos incluem a galactose, a manose e a arabinose. A temperatura durante a fermentação pode ser de 29 ΡΕ1513923 cerca da temperatura ambiente, de preferência de cerca de 30°C, de maior preferência de cerca de 35°C, a cerca de 55°C, de preferência a cerca de 50%, sendo preferível a cerca de 45°C. A temperatura máxima dependerá de algum modo da célula hospedeira em particular. Quando a célula hospedeira é K. marxianus, por exemplo, a célula recombi-nante pode tolerar temperaturas relativamente elevadas (tais como acima de 40°C e até 50°C, especialmente até 45°C). Outra espécie hospedeira preferida, C. sonorensis, pode tolerar temperaturas até cerca de 40°C. Esta elevada tolerância à temperatura proporciona a possibilidade de realizar a fermentação a tais temperaturas elevadas (reduzindo deste modo os custos de arrefecimento) sem perda significativa de produtividade. Outra vantagem proporcionada pela boa tolerância a temperaturas elevadas é a de que se a fermentação ficar contaminada com um microrganismo indesejado, em muitos casos o microrganismo indesejado pode ser selectivamente morto através de aquecimento do meio de fermentação a 40°C ou mais, especialmente 45°C ou mais, sem prejudicar significativamente as células desejadas do invento.

Durante a fermentação, a concentração de células no meio de fermentação está tipicamente no intervalo de cerca de 1-150, de preferência cerca de 3-10, sendo ainda preferível cerca de 3-6 g de células secas/litro de meio de fermentação.

Durante a fase de produção da fermentação, nal- 30 ΡΕ1513923 guns casos pode ser preferível operar microaerobicamente em vez de estritamente anaerobicamente. As condições óptimas de arejamento podem ser estabelecidas para cada microrganismo através da medição das velocidades de tomada de oxigénio (OUR) e da correlação destas com o rendimento, as velocidades de consumo de substrato e a velocidade a que é produzido o produto de fermentação desejado. Em muitos casos, o rendimento e as velocidades são optimizados dentro de um intervalo particular de OUR. Para leveduras possuindo uma destruição de PDC, os valores óptimos de OUR tendem a estar dentro do intervalo de cerca de 0,8 a cerca de 3,5 mmol 02/peso seco de células/h. A OUR refere-se à velocidade a que o oxigénio é consumido pelas células durante a fermentação, e é expressa em unidades (mmoles ou gramas) de oxigénio por peso seco de células por unidade de tempo, tal como mmol 02/peso seco de células/hora. O consumo de oxigénio é convenientemente determinado através da medição do oxigénio introduzido na fermentação e do oxigénio removido da fermentação. As medições de OUR podem ser utilizadas como base para o controlo das condições de arejamento (nomeadamente a velocidade de introdução de gás, de agitação, a proporção de oxigénio no gás de arejamento, etc.) durante a fase de produção de uma fermentação para manter a OUR dentro do intervalo que é óptimo para o organismo em particular. A concentração de oxigénio dissolvido no caldo é simultaneamente mantida a menos de 1% de saturação, particularmente a menos de 10 micromoles de O2/I. Num processo particularmente preferido, é conduzida uma fase de crescimento da fermentação de modo a que a concentração de oxigénio dissolvido no caldo seja reduzida 31 ΡΕ1513923 para menos de 1% de saturação, particularmente menos de 10 micromoles de O2/I, durante um período de tempo, tal como cerca de 15-90 minutos, antes do início da fase de produção (i.e., mudando de condições aeróbicas na fase de crescimento para condições microaeróbicas na fase de produção). À medida que o ácido D-láctico é produzido, o pH do meio de fermentação tende a cair a menos que seja adicionada uma base para neutralizar todo ou parte do ácido à medida que se forma. Numa concretização do processo de fermentação, um agente neutralizante tal como carbonato de cálcio, hidróxido de cálcio, carbonato de sódio, hidróxido de sódio, amoníaco, hidróxido de amónio e semelhantes é adicionado ao caldo de fermentação para manter o pH dentro de um intervalo desejado, tipicamente de cerca de 5,0 a cerca de 8,0, especialmente de cerca de 5,5 a cerca de 7,5. Quando uma tal base é adicionada, forma-se o sal lactato correspondente. A recuperação do ácido láctico envolve portanto a regeneração do ácido láctico livre. Isto é tipicamente feito através da separação das células e da acidificação do caldo de fermentação com um ácido forte tal como ácido sulfúrico. Forma-se um subproduto salino (gesso no caso de um sal de cálcio ser o agente neutralizante e ácido sulfúrico ser o agente acidificante) , que é separado do ácido láctico. O ácido láctico é então recuperado através de técnicas tais como extracção líquido-líquido, destilação, absorção, etc., tal como são descrito em T.B. Vickroy, Vol. 3, Capítulo 38 de "Comprehensive Biotechno-logy", (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev. 16: 221-231, 1995; 32 ΡΕ1513923

Patente U.S. Nos 4275234, 4771001, 5132456, 5420304, 5510526, 5641406 e 5831122; e Pedido de Patente Internacional N° WO 93/00440.

Alternativamente, pode-se permitir que o pH da fermentação caia à medida que o ácido láctico é produzido pelas células. Assim, o pH do caldo de fermentação pode entrar no intervalo de cerca de 1,5 a cerca de 5,0, de preferência de cerca de 1,5 a cerca de 4,2, de maior preferência de cerca de 1,5 a cerca de 3,86 (o pKa do ácido láctico), especialmente de cerca de 2,0 a abaixo de 3,86 devido à produção de ácido láctico. A condução da fermentação deste modo pode proporcionar vários benefícios, se for alcançada uma produtividade e rendimentos aceitáveis. Os custos dos agentes neutralizantes são reduzidos ou eliminados. Se o pH da fermentação (no final da fermentação) for abaixo do pKa do ácido láctico, o ácido láctico existirá principalmente na forma de ácido. Isto permite que o passo de acidificação seja eliminado, poupando passos adicionais ao processo, os custos de acidificação e os custos de eliminação de subprodutos salinos. Assim, um processo especialmente preferido inclui a continuação da fermentação até o pH do caldo de fermentação cair abaixo de 3,86. O ácido láctico pode ser separado do caldo de fermentação resultante utilizando métodos tais como os descritos em WO 99/19290. A capacidade da célula para suportar um ambiente de pH baixo proporciona outro mecanismo através do qual a contaminação de microrganismos indesejados pode ser eli- 33 ΡΕ1513923 minada. A cultura contendo a célula do invento pode ser sujeita a condições de pH reduzido, tais como um pH de cerca de 1,5-4,2, de preferência de cerca de 2,0 a 3,86, durante um tempo suficiente para matar microrganismos contaminantes que não são tolerantes a ácido.

Para ser comercialmente útil, a levedura recom-binante do invento deve exibir várias caracteristicas. A levedura deve converter uma proporção significativa de hidrato de carbono em ácido láctico (i.e., produzir um elevado rendimento de produto). Deve exibir uma elevada produtividade especifica, i.e., produzir uma elevada quantidade de ácido láctico por peso seco de células por unidade de tempo. É de preferência tolerante a um pH de fermentação abaixo de 5,0, de preferência de cerca de 1,5 a 4,2, especialmente de 2,0 a 3,86, ao mesmo tempo que proporciona bons rendimentos e produtividades sob estas condições. A célula é de preferência também tolerante a elevadas concentrações de ácido D-láctico e/ou a sais de ácido D-láctico, a valores de pH de 5,0-8,0 e de preferência a valores de pH de 1,5 a 5,0, ainda de preferência de 1,5 a 4,2 e especialmente de 2,0 a 3,86. Esta última propriedade permite que o processo de fermentação utilize elevadas concentrações do hidrato de carbono de partida.

Em geral, é desejável que o processo de fermentação empregando a célula recombinante do invento proporcione alguma ou todas as seguintes caracteristicas: 34 ΡΕ1513923 A. Um rendimento de pelo menos 30, de preferência pelo menos 40, sendo preferível pelo menos 60, e ainda de maior preferência pelo menos 75 gramas de ácido láctico por grama de hidrato de carbono. O rendimento teórico desejado é de 100%, mas os limites práticos dos rendimentos são de cerca de 98% (g/g). B. Uma produtividade específica de pelo menos 0,1, de preferência pelo menos 0,3, sendo preferível pelo menos cerca de 0,4, especialmente pelo menos cerca de 0,5 gramas de ácido D-láctico/grama de células/hora. As produtividades específicas são desejavelmente tão elevadas quanto possível. C. Um título (concentração máxima de ácido D-láctico) de pelo menos 15 gramas/litro de meio de fermentação, de preferência pelo menos 20 g/1, sendo preferível pelo menos 40 g/1, sendo ainda preferível pelo menos 80 g/1, até 150 g/1, de preferência até cerca de 120 g/. A temperatura do meio de fermentação afecta de alguma forma o importante objectivo de títulos facilmente alcançáveis, uma vez que soluções de ácido láctico altamente concentradas (i.e., acima de cerca de 150 g/1) tendem a tornar-se muito viscosas ou géis a temperaturas abaixo de cerca de 35°C. A utilização de uma temperatura de fermentação mais elevada, tal como cerca de 35-40°C, permite títulos mais elevados sem gelificação ou constituição de uma viscosidade indevida.

Verificou-se que as células recombinantes do invento proporcionam rendimentos tão elevados como 92-98%, 35 ΡΕ1513923 produtividades volumétricas de 1,5-2,2 g/l/h e títulos de 81-90 g/1 quando utilizados numa fermentação neutra (pH 5,0-8,0) em glicose. Em fermentações de pH baixo, nas quais se permite que o pH caia para cerca de 3,0, verificou-se que as células do invento proporcionam rendimentos de 80% ou mais e títulos de 1,2-3,3 g/1. Em todos os casos estes resultados foram obtidos sem optimização das condições de fermentação.

Adicionalmente, o processo de fermentação do invento alcança de preferência uma elevada produtividade de volume. A produtividade de volume é expressa como a quantidade de produto produzido por unidade de volume do meio de fermentação por unidade de tempo, tipicamente grama de produto/litro de meio/h de tempo. São desejáveis produtividades de volume de pelo menos 1,5 g/l/h, de preferência pelo menos 2,0 g/l/h, de maior preferência pelo menos 2,5 g/l/h. A densidades celulares preferidas de até 3-6 g de células/litro de meio de fermentação, as produtividades máximas tendem para até cerca de 5,0 g/l/h e mais tipicamente até cerca de 4,0 g/l/h. É altamente preferido conduzir a fermentação de modo a que estas produtividades de volume sejam alcançadas quando o pH do meio, a temperatura ou ambos estiverem dentro dos intervalos descritos no parágrafo antecedente. O ácido láctico produzido de acordo com o invento é útil para produzir lactido, um anidrido cíclico de duas moléculas de ácido láctico. Dependendo do estereoisómero do 36 ΡΕ1513923 ácido láctico, o lactido pode ser D-lactido (feito de duas moléculas de ácido D-láctico), L-lactido (feito de duas moléculas de ácido L-láctico) ou D-L-lactido (feito de uma molécula de ácido L-láctico e uma de ácido D-láctico). Um método conveniente de produzir lactido a partir de ácido láctico é através de um método de polimerização/despoli-merização tal como descrito em USP 5142023 de Gruber et al. O lactido é, por sua vez, particularmente útil como monómero para a produção de polímeros e copolímeros polilactídicos (PLA). Os processos para a preparação destes são também descritos em USP 5142023 de Gruber et al. Os produtos de PLA preferidos são polímeros estáveis à fusão tal como descrito em USP 5338822 de Gruber et al. O PLA pode ser semi-cristalino ou amorfo.

Os seguintes exemplos servem para ilustrar certas concretizações do invento e não o limitam no seu âmbito ou espírito.

Exemplos

Exemplo IA: Construção dos plasmídeos de expressão pNC2, baseado no promotor de PGK de S. Cerevisiae, e pNC4, baseado no promotor de PDC1 de S. cerevisiae. O plasmídeo de expressão pNC2 (FIG. 1), foi gerado através da combinação do promotor de PGKl de S. cerevisiae com o terminador de GAL10 de S. cerevisiae no 37 ΡΕ1513923 vector estrutural pGEMSZ ( + ) (Promega, Wisconsin) . O promotor de PGK1 e o terminador de GAL10 de S. cerevisiae foram separados por uma região poli-ligadora com os locais de restrição Xbal, EcoRI e BamRI para inserção de genes particulares a expressar entre o promotor e o terminador de levedura.

Foi utilizado um promotor de PGK1 de S. cerevisiae possuindo a seguinte sequência:

S^CGQCCGCGQ ATCGCfPCTTC CQCTATCOAT ΤΑΑΤΠΤΠΤ TTCTTTCCfC ΤΤΠΤΑΤΓΜ ΟΟΤΑΑΤΠΤ TATTTTAGAT TCCTOACSTC MCTCMOAC GCACAG-ATAT TATAACATCT GCACMTAGG CATTTOCAAO MITÀCTCOT gaotaaogaa agagtgagga actatcgcat acctgcattt magatoccg áfTtGGGCGC cmATOcrnA TPrmocrTc accctcatac tattatcaog

GCCAGAAAAA GGAAGTGTTT CCCTCCTTCT ΤΟΑΑΤΤΟΑΤΟ TPACCCTCAT

.AAAOCACGTG CrCCTCTTATG QAGAAAGAAA TTACCGTCOC 1OQTGA7XTQ TTTGCAAAAA GÂAOAMACT GAAAAAAOCC AGACACGCTC GACTOCTC?

CTTCCTATTG ATmCAGCTT CCAAlTrcGT CACAQMCM GGTCCTA0CG

ACOOCfCACA GGmTOTAA CAAGCAATCG AAâOftTCTâa AATOGOGOGA

AAGCKHTTÁG TACCACAtÕC TATGATGCCC ACTGTGATCT CCAGAGCAÀA

GTTGCíTTCGA TOGTACfGTT ACTCTCTCTC mCAAACAG MTTGTCCGA ATCGTGTGAC AACAACAQGC TOTTCTCACA CACTCTTTTC TfCTAACCÂA QQGÇGTGGTT TAGTTTAGTA GAAC€T'€GTG AAACTTACAT TTACATATA? ATAAACTFGC ATAflATTOâT CAATGCAAGA MTACMWIT "PGQTCTTTTC TAATOGTAO ΤΠΤΤΟΜΟΐ TCTTAGATOC TTTCTÍTFTC TCfTTffTAC AGATCATCAA GCWAGTAATT ATCTACTTTT TACAACAAA? ÇH%GMTf--3;i (SEQ IP Ho> X)

Foi obtido como um fragmento de restrição a partir do plasmideo pBFY004. Alternativamente, pode ser obtido através de amplificação por PCR utilizando ADN cromossómico de S. cerevisiae como molde e iniciadores desenhados com base na sequência. ΡΕ1513923 0 terminador de GAL10 de S. cerevisiae utilizado tem a seguinte sequência:

$!"0:?AGATACAT TGATGCTATC AATCCAQAGA ACTOGAAAGA TOTOTAGCC tTGAAÂAACG GtGMACTTA CGGGTCCMG ATTGTCTACA GaTIT1'CCTG ATTTOCCAGC TTACTATCCT TCTÍtiAAAÂT ATÔGACTCFA TATCTT3TAQ πατΜττα caacacatag atítoctota taac gaattt tatoctattt TíThMTtm QAGTTcmm ataamctfgt cacagcgaat ttcctcagat

GTAGGGACCG AATfGTTTAC AAGTrCTCTG TACCACCATG OAGACATCAA AAATTÔMAA TCTATOGAM QATATGOACG GTAOCAACAA GAATATAGGA CCMQCCGCGG ATITATfTÇG τrAGGC-3, |SEQ W No.

Esta sequência foi obtida como um fragmento de restrição a partir do plasmideo pBFY004. Alternativamente, pode ser obtida através de amplificação por PCR utilizando ADN cromossómico de S. cerevisiae como molde e iniciadores desenhados com base na sequência. O plasmideo pNC4, contendo a cassete de expressão baseada no promotor de PDC1 e no terminador de GAL10 de S. cerevisiae, foi construído e utilizado como um vector de expressão geral. Muitos dos genes marcadores foram expressos sob este promotor. 0 plasmideo pNC4 é mostrado na FIG. 2.

A estrutura plasmídica de pNC4 é pGEMSZ(+) (Promega Corporation; Madison, WI) . 0 promotor de PDC1 de S. cerevisiae foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores PSPDCSl (5'-CCA TCG ATA ACA AGC TCA TGC AAA GAG-3' ; SEQ ID No: 3) e PSPDCAS2 (5'-GCT CTA GAT TTG ACT 39 ΡΕ1513923 GTG TTA TTT TGCG-3'; SEQ ID No: 4) e utilizando ADN cromossómico da estirpe GY5098 de S. cerevisiae como molde. Os ciclos térmicos foram efectuados durante 30 ciclos de 1 min. a 94°C, 1 min. a 56°C, 1 min. a 72°C, seguidos de uma incubação final de 7 min. a 72°C utilizando a ADN-polimerase PfuTurbo (Stratagene). O terminador de GAL10 de S. cerevisiae foi obtido tal como descrito acima. A SEQ ID NO: 41 da FIG. 3 e SEQ ID NO: 42 de 3B representam o fragmento compreendendo o promotor de PGKl e o terminador de GAL10 com locais de clonagem múltipla e o promotor de PDC1 e o terminador de GAL10 com locais de múltipla clonagem.

Exemplo 1B. Construção de pVR24 contendo L-LDH de B. megaterium sob o controlo do promotor de PGKl de S. cerevisiae ADN de B. megaterium codificando o gene L-LDH foi isolado como se segue. B. megaterium foi obtido em American Type Culture Collection (Acesso ATCC #6458) e criado sob condições padrão. O ADN genómico foi purificado a partir destas células utilizando um estojo "Easy-DNA" de Invitrogen de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores foram desenhados com base na sequência disponível em Genbank para o L-LDH de B. megaterium (Acesso Genbank #M22305). As reacções de amplificação por PCR foram efectuadas utilizando o tampão II de Perkin Elmer (MgCl2 1,5 mM) e a polimerase AmpliTaq Gold. Cada reacção continha 40 ΡΕ1513923 ADN genómico de B. megaterium a uma concentração de 6 ng/μΐ, cada um dos 4 dNTPs a uma concentração de 0,2 mM e cada um dos dois iniciadores de amplificação BM1270 e BM179 a uma concentração de 1 μΜ, em que estes iniciadores têm a sequência: BM1270: 5'-CCT GAG TCC ACG TCA TTA TTC-3'; SEQ ID No: 5 e BM179: 5'-TGA AGC TAT TTA TTC TTG TTAC-3'; SEQ ID No: 6.

As reacções foram efectuadas de acordo com as seguintes condições de ciclos térmicos: incubação inicial durante 10 min. a 95°C, seguido de 35 ciclos de 30 seg. a 95°C, 30 seg. a 50°C e 60 seg. a 72°C. Um forte fragmento de produto (1100 pb) foi purificado e isolado utilizando electroforese em gel de agarose, clonado e sequenciado. A sequência resultante pode ser traduzida num polipéptido que exibia excelente homologia com os genes codificando L-LDH conhecidos (e.g., Acesso Genbank #M22305). A sequência de codificação para o gene codificando L-LDH de B. megaterium estava operativamente ligada a um promotor do gene da fosfoglicerato-cinase (PGK) e a um terminador da transcrição do gene GAL10, ambos da levedura S. cerevisiae. Dois iniciadores oligonucleotí-dicos, Bmeg5' and Bmeg3', foram desenhados com base nesta sequência para introduzir locais de restrição nas extremidades da sequência de codificação do gene: 41 ΡΕ1513923

Bmeg5' : 5'-GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TAC ACC-3; SEQ ID No: 7 e

Bmeg3': 5'-ATGG ATC CTT ACA CAA AAG CTC TGT CGC-3'; SEQ ID No: 8.

Esta reacção de amplificação foi efectuada utilizando as concentrações de dNTP e de iniciador descritas acima utilizando a polimerase Pfu Turbo (Stratagene) no tampão fornecido pelo fabricante. Os ciclos térmicos foram realizados com uma incubação inicial durante 3 min. a 95°C, seguido de 20 ciclos de 30 seg. a 95°C, 30 seg. a 50°C e 60 seg. a 72°C, seguido de uma incubação final durante 9 min. a 72°C. O produto foi digerido com as enzimas de restrição Xbal e BamRI e ligado nos locais Xbal e BamEI do plasmideo pNC2. Esta ligação resultou no promotor de PGK e no terminador de GAL10 ficarem operativamente ligados à sequência de codificação de LDH de B. megaterium, identificada como pVR24 (FIG. 4).

Exemplo 1C: Construção de pVR22 ancorando a cassete de resistência a 6418 operativamente ligada ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 (S. cerevisiae) O marcador de resistência a G418 foi clonado sob o promotor de PDC1 de S. cerevisiae e as construções foram designadas como pVR22 (mostrado na FIG. 5). O terminador de GAL10 de S. cerevisiae foi utilizado neste plasmideo como terminador para o gene de resistência a G418. O gene de resistência a G418 foi amplificado por PCR utilizando a 42 ΡΕ1513923

Polimerase Pfu Turbo (Stratagene) com os iniciadores 5'-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC (fragmento 5' G; SEQ ID No: 9) e 5' -ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC (fragmento 3' G; SEQ ID No: 10) e o plasmídeo, pPIC9K (Invitrogen, Carlsbad, CA), como molde. Os ciclos térmicos foram realizados através de uma incubação inicial da mistura reaccional durante 5 min. a 95°C, depois através de 35 ciclos de 30 seg. a 95°C, 30 seg. a 49°C, 2 min. a 72°C, seguido de uma incubação final durante 10 min. a 72°C. O produto de PCR foi digerido com BamRI e Xbal e um fragmento de 821 pb foi isolado e ligado ao fragmento BamEl-Xbal de 4303 pb de pNC2. O plasmideo resultante possui o promotor de PGK e o terminador de GAL10 funcionalmente ligados ao gene de resistência a G418 e foi designado pVR22, tal como é mostrado esquematicamente na FIG. 5.

Exemplo ID: Construção do plasmideo pNC7 para expressão do gene L-LDH de Bacillus megaterium no plasmídeo replicante, pKDl O plasmídeo pNC7 (FIG. 6) foi construído como se segue. A cassete de expressão contendo o gene L-LDH de Bacillus megaterium sob o controlo da transcrição do promotor de PGK e do terminador de GAL10 (S. cerevisiae) foi isolado de pVR24 como um fragmento Notl e ligado no plasmídeo pNC3 cortado com Notl, para dar pNC7. pNC3 foi construído através da ligação do plasmídeo pKDl inteiro (ver, Wesolowski-Louvel et al., "Nonconventional Yeasts in Biotechnology", "Kluyveromyces lactis", pág. 139-201; 43 ΡΕ1513923 K.Wolf ed.; Springer-Verlag, Berlin, 1996) linearizado com Sphl no local Sphl único de pTEFl/Zeo (Invitrogen);

Exemplo 1E: Construção da estirpe NC39 de Kluyveromyces marxianus 0 plasmideo pNC7 foi transformado em K. marxianus de tipo selvagem (estirpe CD21) utilizando métodos padrão para dar uma estirpe recombinante NC39 que possuía o gene L-LDH de B. megaterium num plasmideo pKDl de múltiplas cópias.

Exemplo 1F: Construção dos plasmídeos pS028 e pS029 para destruição dos vectores de destruição de PDC1 0 plasmideo pS021 foi construído utilizando os iniciadores S0-M2 5'-CTT CCA GTC CAG CAG GTC GAC CAG- 3'; SEQ. ID. No: 11, e S0-M1 5'-GTC CAG CAT GTC GAC CAG-3'; SEQ. ID. No: 12 . ADN genómico de K. marxianus (estirpe CD21) foi utilizado como molde e com os iniciadores descritos acima utilizando metodologias convencionais de PCR foi obtido um fragmento de 5,5 kb que consistia no gene de PDC1 de K. marxianus juntamente com o seu promotor, terminador e região grande a montante e a jusante do gene. 0 fragmento de 5,5 kb foi clonado no plasmideo pCRII (Invitrogen) para dar o plasmideo pS021 (FIG. 7a). 0 plasmideo pS027 (FIG. 7b) foi sintetizado através de amplificação por PCR do fragmento de PDC1 de 3,3 kb (gene e promotor de PDC1) de pS021 utilizando os iniciadores S0-M4 44 ΡΕ1513923 5'-GAA CGA AAC GAA CTT CTC TC-3'; SEQ ID No: 13 e SO-M5 5'-CTT GGA ACT TCT TGT CAG TG-3'; SEQ ID No: 14, utilizando metodologias convencionais de PCR. O fragmento resultante foi purificado e isolado através de electroforese em gel e subsequentemente ligado em pCRII (Invitrogen) para dar pS027. pS028 (FIG. 8) foi construído através da digestão de pS027, ancorando PDC1, com Bbsl para suprimir 417 pb da região de codificação de PDC1. As pontas oligonucleotídicas salientes resultantes foram preenchidas com a ADN-poli-merase Pfu (Stratagene) . Este fragmento (ca. 2,9 kb) foi ligado num fragmento NotI tornado de extremidades cegas com Pfu de pVR22 (Exemplo 1C) que contém o promotor de PGK de S. cerevisiae e o gene de resistência a G418 seguido do terminador de GAL10 de S. cerevisiae.

Semelhantemente, pS029 (FIG. 9) foi construído através da digestão de pS027 com Bbsl para suprimir 417 pb da região de codificação de PDC1. As pontas oligonucleotídicas salientes resultantes foram preenchidas com a ADN-polimerase Pfu (Stratagene). Este fragmento foi ligado a um fragmento Xhol/Xbal tornado de extremidades cegas com Pfu de pTEFl/Zeo (Invitrogen) que contém o promotor de TEF1 de S. cerevisiae e o gene de resistência à zeocina seguido de um terminador CYC1 de S. cerevisiae.

Estas construções foram feitas para conceber várias cassetes de integração úteis para a criação de 45 ΡΕ1513923 estirpes de K. marxianus possuindo um genótipo nulo para pdcl, com vários genes de selecção integrados. Os transformantes são primeiro pesquisados para verificar a inserção da construção no locus de PDC1 e depois pesquisados quanto a uma incapacidade para produzir etanol e incapacidade para crescer anaerobicamente. 0 acontecimento de recombinação preferido é um duplo "crossover" em PDC1 no genoma. No entanto, pode ocorrer um acontecimento de recombinação simples ou duplo ou pode ocorrer um acontecimento de mutagénese de inserção no ADN.

Exemplo 1G: Transformação e selecção de K. marxianus quanto a um genótipo nulo para pdcl utilizando o fenótipo Pdc-: Construção das estirpes CD181, CD186, CD214, CD215, CD216, CD217, CD218, CD219, CD220 e CD221 A estirpe NC39 foi escolhida como um hospedeiro de transformação porque contém o plasmideo pNC7 no hospedeiro como plasmideo de replicação contendo o L-LDH na estrutura de pKDl cuja presença pode aumentar a probabilidade de uma deleção em PDC1 (ver, Chen, X.J. et al.r Curr. Genet. 16(2): 95-8, Ago de 1989).

NC39 foi criada de um dia para o outro em YPD com selecção 100 yg/ml de zeocina (Invitrogen) para manter o plasmideo pNC7 e a transformação foi realizada de acordo com o seguinte protocolo de transformação química de levedura. As células foram criadas de um dia para o outro em 5 ml de meio YPD a 30°C, com agitação a 250 rpm. A 46 ΡΕ1513923 cultura foi diluída com 50 ml de YPD, até uma ΌΟβοο de partida de cerca de 0,2. A cultura foi então criada a 30°C, com 250 rpm até uma DOêoo de cerca de 3,0. As células foram então colhidas através de centrifugação a 2500 rpm durante 5 minutos, e ressuspensas em 50 ml de água estéril. As células foram colhidas através de centrifugação a 2500 rpm durante 5 min. A centrifugação da ressuspensâo foi repetida uma vez. Após esse passo, o sedimento celular foi ressuspenso em 0,1 ml de Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, acetato de litio 20 mM, pH 7,5. Num tubo de microcentrífuga foi adicionado: 4,0 yg de fragmento linear de ADN de pS028 cortado com Saci/Apal contendo o marcador de selecção de G418 e a região flanqueadora de PDC1, 25 μΐ de ADN transportador (Colette -10 mg/ml necessário lixar) e 500 μΐ das células NC39 preparadas, foram adicionados e misturados através de vórtice. A isto foram adicionados 3 ml de PEG a 40%, Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, acetato de litio 20 mM, pH 7,5 e misturou-se através de vórtice. Esta mistura foi então incubada durante 30 min. a 30°C, com agitação a 250 rpm. Após o período de incubação, foram adicionados 350 μΐ de DMSO e misturou-se através de inversão dos tubos. As células foram então sujeitas a choque térmico a 42°C durante 15 minutos, seguido de arrefecimento rápido em gelo durante cerca de 3 min. As células foram sedimentadas através de uma centrifugação de 10 segundos a 14000 rpm e o sobrenadante foi removido. As células foram ressuspensas em 1 ml de YPD. As células foram deixadas recuperar através de uma incubação durante 4 h a 30°C, com agitação a 250 rpm. Após o período de recuperação, as células foram sedimentadas e o sobrenadante foi removido. Neste ponto as 47 ΡΕ1513923 células foram ressuspensas num volume final de cerca de 500 μΐ de YPD. Uma alíquota (20 μΐ) da suspensão celular foi plaqueada numa placa de selecção e alíquotas de 100 μΐ foram plaqueadas em 6 outras placas de selecção. As células plaqueadas foram deixadas a incubar a 30°C até ser observado crescimento de colónias.

As placas utilizadas para esta transformação continham 300 pg/ml de agente de selecção (G418). Os transformantes que cresceram nestas placas primárias foram então plaqueados por zonas em placas secundárias com a mesma concentração de agente de selecção. As colónias que cresceram nestas placas secundárias foram pesquisadas através de PCR, utilizando métodos convencionais, quanto a acontecimentos de integração em PDC1 utilizando um iniciador 3' a jusante e fora do fragmento de integração (S0454 5'-CCA TCC GAA GAA GTC GAT CTC-3'; SEQ ID No: 15) e o iniciador 5' que fica dentro do gene de resistência a G418 (S0285 5'-CTT GCC ATC CTA TGG AAC TGC-3'; SEQ ID No: 16). Através desta análise de PCR apenas 1 de 200 colónias era positiva. Foi utilizada análise adicional de PCR utilizando métodos de PCR convencionais e iniciadores de PDC1 dirigidos ao fragmento Bbsl suprimido de pS07 (-SO2740 5'-GAA GGC TGG GAA TTG AGT GA-3'; SEQ ID No: 17 e -S024 4 5' -GCT CCA TCT GAA ATC GAC AG- 3'; SEQ ID No: 18) para confirmar a presença de PDC1 de tipo selvagem intacto. O único transformante positivo foi isolado como uma única colónia, utilizado para produzir uma reserva de glicerol e identificado como CD181. A estirpe foi então 48 ΡΕ1513923 curada do plasmídeo pNC7 através de cultura sem pressão selectiva, seguida de plaqueamento das células cultivadas em placas de YPD-agar compreendendo G418 (300 pg/ml). Quatro colónias foram apanhadas e testadas quanto à sensibilidade à zeocina e falta de produção de ácido L-láctico. Todas as quatro colónias exibiram sensibilidade à zeocina e tiveram perda da capacidade de produzir ácido L-láctico. Uma única colónia foi escolhida e utilizada para produzir uma reserva de glicerol e identificada como CD186.

Para criar uma estirpe de K. marxianus com um fenótipo PDC- (sem produção de etanol e sem crescimento sob condições anaeróbicas), era necessário outra transformação de CD186. CD186 foi transformada, de acordo com o protocolo de cima, com 6,8 pg de fragmento de ADN pS029 linearizado, cortado com Nhel/Notl, contendo o marcador de selecção de zeocina e a deleção na região de PDCl.

Os transformantes resultantes foram plaqueados em placas de YPD-agar compreendendo 300 pg/ml de zeocina. Os transformantes que cresceram nestas placas primárias foram plaqueados por zonas em placas secundárias com 300 mg/ml de G418 e 300 mg/ml de zeocina. As colónias que cresceram nestas placas secundárias foram pesquisadas quanto à integração no locus de PDCl através de PCR, depois testadas quanto à ausência de PDCl de tipo selvagem, utilizando iniciadores que estão presentes no fragmento Bbsl suprimido de pS07 (-SO274 0 5' -GAA GGC TGG GAA TTG AGT GA-3'; SEQ ID No: 17 e -S02444 5'-GCT CCA TCT GAA ATC GAC AG- 3'; SEQ ID

No: 18. 49 ΡΕ1513923

Verificou-se que oito colónias tinham deleções em PDC1. Isto foi verificado através de análise de PCR que mostrou a deleção esperada do PDC1 de tipo selvagem e o fenótipo PDC- (sem produção de etanol nem crescimento anaeróbico). Colónias individuais destes oitos transformantes foram isoladas e entraram na colecção Cargill Dow Culture. Estas oito estirpes nulas para pdcl de K. marxianus foram designadas CD214, CD215, CD216, CD217, CD218, CD219, CD220 e CD221. CD215 foi testada quanto à produção de etanol através da inoculação de uma colónia em 50 ml de meio YPD num balão de agitação de 250. A cultura foi incubada a 30°C com agitação a 70 rpm e a análise de HPLC das amostras não detectou qualquer etanol.

Exemplo 1H. Construção do plasmídeo pPSl, ligando funcionalmente o gene de resistência à higromicina ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 de 5. cerevisiae

Um ácido nucleico recombinante conferindo resistência à higromicina a células de levedura transformadas, permitindo a selecção de transformantes de células de levedura compreendendo uma construção de ácido nucleico recombinante codificando uma proteína útil para a síntese de um produto orgânico, foi preparado como se segue. O marcador de resistência à higromicina (hph de E. coli) foi clonado sob o controlo da transcrição do promotor de PDCl de Saccharomyces cerevisiae. 50 ΡΕ1513923 O gene hph de E. coli que confere resistência a higromicina B foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5' HYGXBA1 (5'-AAG CTC TAG ATG AAA AAG CCT GAA CTC AC-3'; SEQ ID No: 19) e 3'HYGBAMH1 (5'-CGC GGA TCC CTA TTC CTT TGC CCT CGG AC-3'; SEQ ID No: 20) e O plasmideo pRLMex30 (ver, e.g., Mach et al., Curr. Genet. 25: 567-570, 1994; Rajgarhia et al., Pedido de Patente U.S. N° 10/154,460, apresentado a 23 de Maio de 2002, aqui incorporados por referência na sua totalidade) como molde. O gene hph pode também ser obtido através da utilização dos mesmos iniciadores com ADN cromossómico de E. coli servindo de molde. O ciclo térmico foi efectuado através de 30 ciclos de 1 min. a 94°C, 1 min. a 56°C, 3 min. a 72°C, seguido de uma incubação final de 7 min. a 72°C utilizando a ADN-polimerase PfuTurbo (Stratagene). O produto de PCR foi separado por electroforese e num gel de agarose a 0,8% e o produto de 1026 pb foi isolado. O produto de PCR foi digerido com Xbal e Bam* Hl e ligado no plasmideo pNC4 cortado com Xbal e BamRl para dar o plasmideo pPSI (ver FIG. 10) .

Exemplo II: Construção de pVR43 contendo D-LDH de L. helveticus D-LDH foi isolado a partir Lactobacillus helveticus como se segue. As células de Lactobacillus helveticus foram obtidas em American Type Culture Collection (Acesso ATCC #10797) e criadas sob condições padrão. O ADN genómico foi purificado a partir destas células utilizando o seguinte protocolo: 51 ΡΕ1513923 1. Uma única colónia ou 5 μΐ de uma reserva de glicerol de bactérias de ácido láctico foi utilizada para inocular 2x50 ml de caldo MRS estéril em balões estéreis de 250 ml. A cultura foi criada com agitação a 37°C durante 48 horas a 170 rpm. 2. A cultura foi transferida para tubos estéreis de tampa azul de 50 ml e centrifugada a 3000 rpm durante 10 min. O sedimento celular foi ressuspenso em 50 ml de solução de sacarose a 12,5% p/v e centrifugada novamente a 3000 rpm durante 10 min. Os sedimentos foram ressuspensos e combinados em 5 ml de sacarose a 12,5% p/v em tubos de tampa azul de 50 ml de Falcon (n° de Cat. 29050). À suspensão celular foram adicionados 5 ml de solução TES (TES é: TRIS 10 mM (pH 8,0), EDTA 50 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM, esterilizado por filtração). Outros 5 ml de solução de sacarose a 25% p/v foram adicionados e depois misturados. Pó de lisozima (300 mg) foi adicionado à suspensão e sujeito a vórtice para misturar. Uma vez cuidadosamente misturado, foram adicionados à mistura 25 μΐ de solução de mutanolisina (conc. da reserva de 2,2 mg/ml). A suspensão foi incubada de um dia para o outro (*10-12 h) a 37°C. 3. Após a incubação de um dia para o outro, foram adicionados 2,5 ml de uma solução de SDS a 20% e 168 μΐ de uma solução de Proteinase K (conc. da reserva 28 mg/1,4 ml). O tubo foi misturado por inversão, mas não 52 ΡΕ1513923 agitado. 0 tubo foi incubado a 50°C durante 1 hora. Neste ponto a matéria da membrana celular parecia quebrada e a solução tornou-se translúcida. Foi adicionado NaCl suficiente para se obter uma concentração de 0,15 M na solução. A solução foi misturada cuidadosamente por inversão. 4. A mistura foi transferida para um tubo Oakridge de 50 ml (Beckman Instruments Inc., Paio Alto, CA) ou dividida entre dois tubos e tratada com um volume igual de solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1). A mistura foi agitada e centrifugada a 10000 rpm durante 10 min. 5. O sobrenadante aquoso foi removido para um tubo Oakridge limpo e foi adicionado um volume igual de clorofórmio. A solução foi misturada através de agitação e centrifugada a 5000 rpm durante 10 min. 6. O sobrenadante foi aspirado e colocado num tubo fresco. Ao sobrenadante foram adicionados 25 μΐ de ARNase (conc. de reserva 100 mg/ml), que foram misturados por inversão. O tubo foi incubado a 37°C durante 15 min. A ARNase livre de ADNase é adicionada em excesso para degradar rapidamente o ARN.

7. Finalmente, foram adicionados 2,5 volumes de EtOH à mistura dispensando-o cuidadosamente ao longo dos lados do tubo. A camada de EtOH não foi misturada. O ADN 53 ΡΕ1513923 que se forma na interface líquida foi recolhido utilizando uma pipeta de vidro e lavado em EtOH a 70%. O ADN foi seco ao ar e ressuspenso em TRIS-HC1 10 mM, pH 8,5 (tampão de eluição na maioria dos estojos Qiagen) num tubo de microcentrífuga. O tubo foi incubado a 50 °C até o ADN entrar em solução.

Os iniciadores foram desenhados com base na sequência disponível em Genbank para D-LDH de L. helveticus (acesso Genbank #U07604 ou #X66723 (SEQ ID NO: 43)). As reacções de amplificação por PCR foram efectuadas utilizando polimerase Pfu Turbo (Stratagene, WI, USA). Cada reacção continha ADN genómico de L. helveticus a uma concentração de 500 ng, cada um dos dNTPs a uma concentração de 0,2 mM e cada um dos iniciadores de amplificação VR150 5'-GGT TGG ATT TAT GAC AAA GGT TTT GCTT-3'; SEQ ID NO: 21) e VR153 5'-AAT TAA AAC TTG TTC TTG TTC AAA GCA ACT-3'; SEQ ID NO: 22) a 1 μΜ. As reacções foram efectuadas de acordo com as seguintes condições de ciclo: uma incubação inicial durante 10 min. a 95°C, seguida de 35 ciclos de 30 seg. a 95°C, 30 seg. a 51°C e 60 seg. a 72°C. Um forte fragmento do produto de 1027 pb foi purificado em gel utilizando procedimentos convencionais e clonado por TA no vector de clonagem topo PCR-BluntII (Invitrogen, Carlsbad, CA) . O plasmídeo resultante foi sequenciado e designado pVR43 (mostrado na FIG. 11a). A sequência resultante pôde ser traduzida num polipéptido que exibiu excelente homologia com as sequências conhecidas do gene codificando D-LDH de L. helveticus no Genbank (Acesso #U07604 ou #X66723) . ΡΕ1513923

Exemplo 1J: Construção de pVR47, contendo D-LDH de L. helveticus sob o controlo do promotor de PGKl e do terminador de GAL10 de S. cerevisiae

Os iniciadores foram desenhados para introduzirem locais Xbal BamEI nas extremidades 5' e 3' do gene D-LDH para clonagem em pNC2. As reacções de amplificação por PCR foram efectuadas utilizando polimerase Pfu Turbo (Stra-tagene, WI, USA). Cada reacção continha pVR43 (ancorando D-LDH de L. helveticus) (5 ng), cada um dos dNTPs a uma concentração de 0,2 mM e cada um dos iniciadores de amplificação VR165 5'-CGT CTA GAT TTA TGA CAA AGG TTT TGCT-3'; SEQ ID NO: 23 e VR166 5'-GCG GAT CCT TAA AAC TTG TTC TTG TTC AA-3'; SEQ ID NO: 24 a 1 μΜ. As reacções foram efectuadas de acordo com as seguintes reacções de ciclo: uma incubação inicial durante 10 min. a 95°C, seguida de 35 ciclos de 30 seg. a 95°C, 30 seg. a 55°C e 60 seg. a 72°C. Um forte fragmento do produto de 1035 pb foi purificado em gel utilizando procedimentos convencionais e clonado por TA utilizando o vector de clonagem topo PCR-BluntII (Invi-trogen, Carlsbad, CA) . O plasmideo resultante foi sequen-ciado e designado pVR44 (ver FIG. 11b). Esta sequência pôde ser traduzida num polipéptido que exibiu excelente homologia com o gene codificando D-LDH de L. helveticus e possuía os locais Xbal e BamRl nas extremidades 5' e 3' do gene D-LDH. O plasmideo pNC2 foi digerido com Xbal e BamEI. 55 ΡΕ1513923

As extremidades 5'-fosfato do pNC2 linearizado foram desfosforiladas utilizando fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics, USA) seguindo o protocolo do fabricante. pVR4 4 foi também digerido com Xbal e BamRI e o gene D-LDH de L. helveticus de 1027 pb foi isolado através de electroforese em gel (gel de agarose a 0,8%). Os dois fragmentos foram ligados e o plasmideo resultante, designado pVR47 (ver FIG. 4) foi sequenciado. O plasmideo pVR4 7 possui o promotor de PGK e o terminador de GAL10 de S. cerevisiae funcionalmente ligados (i.e., activos na transcrição numa célula de levedura) ao gene D-LDH de L. helveticus, tal como mostrado na FIG. 12 (SEQ ID NO: 43).

Sequência do gene D-LDH

ATOACAAAGGTmi(3C!?ACGaAWCGMMOACGAAGAM:CATOriGM?iSAAlOO AAGQMOClCACAAO<lAtAJCGA!<SnGAHAC^CItWM-ACimGACTCClaAAAC!

GCÍMQCTAGCTMGGQTGCIOACGGTCTrGITGTJTACCAACAATlAGACrACAClGCA

GATACTCTICAAGCMÃGCAGACGCTGGGGTAACTAÃGAIGlCAHACGTAACGfíGGT

ClUC^ACAÃCAnGMAlGGAC.AAGbctAAGGAAmCGfrrÇÇAAA5tACCÂÀTGTTCCT

GmÂCÍCACCAAACGCTATfGCTGAÁCAróCTGCTAnCAGGCTGCACGTGTATmCGt

CAAGACAAGCGCAlGGACGAAAAGATGGCmAACGFSACTFACGTTGGGCACCMCTAlC

GGCCGTGAAGTTCGTGACCAAGTTGTCÕGTGtTGTtGGTACTGGTCACATKSGTCMGÍA

mAfGCGrAmfGGMGGTríCGGIGCMAC^TÍAlTGCTTACGATAIcrtCMGAAC

CCAGAACTIGAMAGAAGGGTrAClACÓtrGAClCACPGACGACnGÍACAAGCAAGO

GAIGTÀAUrCACTTCACGTACCACMTGTFCCAfôCÍAACGTTCACATGATCAACGACMG

TCMK6CIGAAAK^W^0ACC^G11^MTfGTAAAC«KnCACG1GGrC0ACÍfG1T GÁCÀCTGAOGCtGtÂATCCGIGGIT!O0ACí'CACK3CAAGÀÍCnCGGCtfCGTTATGGAt' ACfTACGMGACGMGWGGIGmmAACAAGGAWGGGAAGGÍAAAGAAlTCCGAGAÇ

AAGCGTrrGGCAÔACrrAA,nGArOGICCÁAACGTAT!GGTAACICCACACACCGCCTlC

ÍÁCACÍACTCÀCGCíGTACGlAÃCATGGWGlTAAGGCAIlCÀACÃACAACnGAAGTTA ATCAAC<XlCG.AAAAGCCAGAtTOCC AGnGCTírCMA.CAAGAACAAGmTAA - â* 56 ΡΕ1513923

Exemplo 1K: Construção de pVR48, contendo o gene D-LDH de L. helveticus e o marcador de resistência à higromicina, adjacentes um ao outro pPSl foi digerido com Sphl e o fragmento de 2259 pb contendo o gene de resistência à higromicina expresso sob o controlo do promotor de PDCl e do terminador de GAL10 de S. cerevisiae foi isolado por electroforese utilizando um gel de agarose a 0,8%. pVR47 foi digerido com Sphl e as extremidades 5'-fosfato do plasmideo linearizado foram desfosforiladas utilizando fosfatase alcalina de camarão (Roche Diagnostics, USA) seguindo o protocolo do fabricante. Os dois fragmentos foram ligados e o plasmideo resultante foi sequenciado e designado pVR48 (ver FIG. 13). O plasmideo contém as cassetes do gene D-LDH de L. helveticus e do marcador de resistência à higromicina adjacentes uma à outra.

Exemplo 1L: Introdução do ADN codificando o gene D-LDH de L. helveticus através de Integração aleatória no genoma de K. marxianus

Um fragmento de 4,54 kpb contendo a cassete do gene de resistência D-LDH:HPH de L. helveticus foi isolado de pVR48 através de digestão do plasmideo com SstI e Apal. O fragmento foi isolado através de electroforese em gel num gel de agarose a 0,8%. Este fragmento foi utilizado para transformar Kluyveromyces marxianus mutante nula para pdcl (CD215; ver Exemplo 1F, 1G) utilizando um protocolo de electroporação, descrito abaixo. 57 ΡΕ1513923

Foi utilizada uma única colónia de K. marxianus para inocular 50 ml de YPD (compreendendo 10 g/1 de extracto de levedura, 20 g/1 de peptona, 20 g/1 de glicose e agar a 2%) num balão de agitação com deflectores de 250 ml até uma ϋΟεοο de 0,1. A cultura foi criada 16 h a 30°C com 250 rpm até uma DOêoo final de 10. As células de 10 ml de cultura foram colhidas através de centrifugação e lavadas uma vez com tampão de electroporação (EB; TRIS-HC1 10 mM, sacarose 270 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,5). As células foram ressuspensas em tampão de incubação (IB; YPD + DTT 25 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0) e incubadas a 30°C com 250 rpm durante 30 min. As células foram então colhidas através de centrifugação e lavadas uma vez com EB. As células foram ressuspensas em 1 ml de EB e foram transferidos 400 μΐ destas células para uma cuvete de electroporação de 0,4 cm (BioRad; Hercules, CA) .

Foram adicionados à cuvete 2 yg do fragmento SstI/Apal de 4,54 kpb de pVR4 8 e as células foram electroporadas a 1,8 kV, 1000 Ω, 25 yF. As células foram transferidas para 1 ml de YPD num tubo Falcon de tampa de rosca de 50 ml e incubadas a 30°C com 250 rpm durante 4 h antes de plaqueamento selectivo em YPD contendo 200 yg/ml de higromicina. Os transformantes foram criados a 37°C durante 3 dias. Os transformantes que eram resistentes à higromicina foram novamente riscados em placas selectivas frescas contendo 200 yg/ml de higromicina. 58 ΡΕ1513923

Análise de PCR: A verificação da integração do fragmento no genoma de K. marxianus CD21 foi feita utilizando dois conjuntos de iniciadores de PCR: 1. Um conjunto de iniciadores foi desenhado para ser homólogo ao gene de D-LDH de L. helveticus e um iniciador reverso homólogo ao gene de resistência à higromicina. Os iniciadores VR161 5'-AGT TGG TGT ATT TAA CAA GG-3'; SEQ ID NO: 25 e VR142 5'-GTG ACA CCC TGT GCA CGG CGG GAG ATG-3’; SEQ ID NO: 26 foram desenhados para amplificar um produto de 1,748 kb entre D-LDH de L. helveticus e o gene de resistência à higromicina em estirpes que possuem a cassete e não devem amplificar qualquer fragmento em estirpes que não possuam a cassete. Foram efectuados ciclos térmicos sobre as colónias transformantes utilizando ADN-polimerase Taq (Qiagen, USA) incubando inicialmente a mistura reaccional durante 2 min. a 94°C, seguido de 35 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 43°C, 3 min. a 72°C, seguido de uma incubação final de 7 min. a 72°C. 2. Um segundo conjunto de iniciadores foi desenhado para ser homólogo à região promotora de PGK e um iniciador inverso homólogo ao D-LDH de L. helveticus. Os iniciadores VR173 5'-GCG ACG GCT CAC AGG TTT TG-3'; SEQ ID NO: 27, e VR170 5'-CTT GTC TTG ACG TAA TAC ACG TGC AGC-3'; SEQ ID NO: 28, foram desenhados para amplificar um produto 59 ΡΕ1513923 de 0,75 kb entre o promotor de PGK e o gene D-LDH de L. helveticus em estirpes que possuem a cassete e não devem amplificar qualquer fragmento em estirpes que não possuam a cassete. Foram efectuados ciclo térmicos sobre as colónias transformantes utilizando ADN-polimerase Taq (Qiagen, USA) incubando inicialmente a mistura reaccional durante 2 min. a 94°C, seguido de 35 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 55°C, 1 min. a 72°C, seguido de uma incubação final de 7 min. a 72°C. Dos transformantes analisados, dezanove produziram os produtos de PCR esperados.

Verificação enzimática e por GC do ácido D-láctico: A pureza óptica do ácido D-láctico produzido pelos transformantes foi determinada utilizando o estojo de detecção de ácido D-láctico de Boehringer Mannheim (Roche Diagnostics, USA). O protocolo do fabricante foi seguido e indicou que seis dos dezanove transformantes produziram 0% de ácido D-láctico. A análise de cromatografia gasosa (GC) do sobrenadante dos transformantes indicou que as estirpes produziam mais de 99% de ácido D-láctico.

Método da Análise de CG A separação e quantificação dos enantiómeros "D" e "L" do ácido láctico são alcançadas utilizando um método de cromatografia gasosa quiral. O método estabelecido 60 ΡΕ1513923 envolve a hidrólise catalisada por bases de amostras em metanol, seguida pela acidificação com ácido sulfúrico para catalisar a esterificação e subsequente extracção dos enantiómeros de metil-lactato em cloreto de metileno. A camada orgânica é então analisada através de cromatografia gasosa (GC) utilizando um detector de ionização de chama (FID) [Hewlett Packard 6890 com conjunto de injector fraccionado/não fraccionado regulado para o modo fraccionado, auto-injecção e um detector FID]. A separação dos enantiómeros de metil-lactato é alcançada utilizando uma coluna capilar quiral [coluna capilar β-Dex 325 de 30 metros χ 0,25 mm d.i. (espessura da película de 0,25 ym), Supelco. (#24308)]. As percentagens relativas normalizadas do ácido láctico "D" e "L" são obtidas a partir deste método.

As amostras para análise de GC são preparadas pesando uma quantidade de amostra (1,000 g) num frasco de vidro de 20 ml, ao qual são adicionados 4 ml de metanol. O frasco é tapado e são lentamente adicionados 150 μΐ de ácido sulfúrico concentrado. O frasco é colocado a 65°C num aquecedor/agitador Reati-therm durante 10 minutos. É então adicionada água desionizada (5 ml) ao frasco, seguida da adição de 10 ml de cloreto de metileno. O frasco é tapado e agitado vigorosamente. Utilizando uma seringa de plástico descartável ajustada a um filtro com um tubo na ponta, uma parte da camada orgânica do fundo é removida e a restante camada orgânica do fundo é transferida para um frasco de GC de 2 ml para injecção na GC. 61 ΡΕ1513923

Exemplo 1M: Produção de ácido D-láctico em meios YPD mais glicose em culturas em balões de agitação por K. marxianus ancorando o gene de D-LDH de L. helveticus integrado no genoma sob condições tamponadas

Os seis transformantes que produziram ácido D-láctico opticamente puro foram designados CD554, CD555, CD556, CD557, CD558 e CD559. Estas estirpes foram cultivadas em balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD, suplementado com 100 g/1 de glicose e foram inoculadas a partir de placas de YPD-agar. As culturas foram criadas durante 16 horas a 30°C com agitação a 250 rpm até uma ϋΟεοο de 0,1. Após determinar que permanecia glicose residual em cada balão e que as células estavam em fase de crescimento exponencial, foram colhidos equivalentes a 4 g/1 de peso seco de células através de centrifugação e foram ressuspensos em balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD suplementado com aproximadamente 100 g/1 de glicose e 5 g/1 de CaC03. As culturas foram colocadas a 30°C com 70 rpm. Amostras foram tiradas a vários intervalos de tempo e as células foram removidas através de filtração. O sobrenadante da cultura foi analisado quanto a glicose, D-lactato, piruvato e etanol através de HPLC (descrito abaixo).

Método de Análise de HPLC

Os métodos de HPLC utilizados nas seguintes experiências empregam uma Bio-Rad Fast Acid Analysis Column 62 ΡΕ1513923 combinada com uma Rezex Fast Fruit Analysis Column, cada uma contendo resina de estirenodivinil-benzeno na forma hidrogenada. Os componentes orgânicos são quantificados com um detector do índice Refractivo combinado com um detector de UV a 220 nm, utilizando ácido isobutírico como padrão interno. As amostras são preparadas pesando uma quantidade conhecida e diluindo-a na presença de um padrão interno. A solução resultante é injectada num sistema de HPLC e quantificada utilizando padrões conhecidos.

Sob estas condições de cultura, as estirpes CD554, CD555, CD556, CD557, CD558, CD559 produziram mais de 99% de ácido D-láctico, com um rendimento com base em glicose de 92-98%, um titulo de ácido D-láctico variando de 82-90 g/1, e uma produtividade volumétrica superior a 2,2 g/l/h a 30°C.

Exemplo 2A: Construção de estirpes com deleções da sequência de codificação de PDC1 e o gene D-LDH de L. helveticus integrado no locus de PDC1 utilizando um método de substituição de um único passo O plasmideo pCA50 foi construído através da ligação do fragmento NgoMIV/Psil de 4,7 kb do plasmideo pVR48 (Exemplo 1K) na estrutura do plasmideo pBH5c (descrito no Exemplo 3B; FIG. 16c) cortado com MscI e SgrAI. O fragmento pVR48 continha o gene D-LDH de L. helveticus dirigido pelo promotor de PGK de S. cerevisiae, seguido pela sequência de terminação da transcrição de 63 ΡΕ1513923 GAL10 de S. cerevisiae. Esta cassete de expressão fica adjacente ao gene de resistência à higromicina (hph), dirigido pelo promotor de PDC1 de S. cerevisiae, seguido pelo terminador de GAL10 (S. cerevisiae) . 0 fragmento de pVR48 foi ligado na estrutura de pBH5c, gerando o plasmideo pCA50, em que a construção D-LDH:hph fica flanqueada pelas sequências imediatamente a montante e a jusante do locus de PDCl de K. marxianus (FIG. 14). 0 plasmideo pCA50 foi digerido com Sbfl e BseRI para gerar um fragmento de 6272 pb. 2,5 pg deste fragmento foram isolados e purificados através de electroforese em gel para serem utilizados para transformação. K. marxianus de tipo selvagem (CD21) foi transformada com o fragmento purificado utilizando o protocolo de electroporação divulgado no Exemplo 1M. As células transformadas foram plaqueadas em placas de selecção de YPD contendo 150 pg/ml de higromicina para seleccionar células que contêm uma integração aleatória do fragmento de pCA50 no genoma, ou uma substituição homóloga do locus de PDCl de tipo selvagem pelo fragmento. As colónias foram isoladas após 3 dias de crescimento a 30°C e riscadas sobre YPD fresco com 150 pg/ml de higromicina para confirmar o fenótipo.

As colónias foram ensaiadas através de PCR para identificar as que continham a substituição homóloga do locus de PDCl de tipo selvagem pelo fragmento de pCA50. As células foram ressuspensas na reacção de PCR para proporcionar o ADN molde. O iniciador 5' oCA85 5'-GGA CCG 64 ΡΕ1513923 ATG GCT GTG TAG AA-3'; SEQ ID NO: 29, foi desenhado para amplificar a extremidade 3' do gene hph. 0 iniciador 3' 0CA8O 5'-TCG CTT ACC TCG GTA CAG AA-3'; SEQ ID NO: 30, foi desenhado para amplificar a sequência a jusante do locus de PDC1 de K. marxianus, que não está contido na construção de pCA50. O ensaio de amplificação utilizado como sonda para a sequência alvo empregou polimerase Taq (Qiagen) e as seguintes condições de reacção de PCR: passo de fusão inicial a 95°C durante 10 min., seguido de 40 ciclos de amplificação de 30 seg. a 95°C, 30 seg. a 55°C e 3 min. a 72°C, seguido de 10 min. a 72°C.

As células transformadas possuindo um acontecimento de substituição homóloga geraram um produto de PCR de 2,5 kb. Os acontecimentos de integração aleatórios não gerarão um produto de PCR com os iniciadores oCA85 e 0CA8O. As estirpes CD597 a CD601 foram positivas para este produto de PCR de 2,5 kb.

Exemplo 2B: Produção de ácido D-láctico em meios complexos tamponados de CaCo3 em culturas microaeróbicas de K. marxianus em balões de agitação com uma única cópia de D-LDH integrado no locus de PDC1 utilizando um método de substituição de um único passo A estirpe CD587 pdclA::Lh-D-LDH (do Exemplo 3E) que é o resultado de um acontecimento de substituição em dois passos foi comparada com as estirpes CD597, CD599 e CD600 pdclA::Lh-D-LDH, geradas através de um acontecimento 65 ΡΕ1513923 de substituição de um único passo (do Exemplo 2A) para determinar se estas estirpes produziam títulos semelhantes de ácido láctico independentemente do método de geração. A biomassa foi gerada em balões de agitação com deflectores através de cultura de um dia para o outro a 37°C com agitação de 225 rpm em YPD + 100 g/1 de glicose e + 50 g/1 de CaCCb. Os balões de produção foram inoculados com 2 g/1 de peso seco de células de balões de agitação da biomassa de um dia para o outro. As condições de produção foram meios YPD + 100 g/1 de glicose e + 50 g/1 de CaC03 com agitação a 70 rpm em balões de agitação com deflectores a 35°C. Amostras foram tomadas a vários momentos: a biomassa e o CaC03 foram removidos através de filtração e os filtrados foram analisados quanto a glicose, lactato, EtOH e piruvato através de HPLC (Exemplo 1M).

Após 54 horas, CD587, CD589 e CD590 consumiram 85-88 g/1 de glicose, produzindo 81 g/1 de lactato e 2,5 g/1 de piruvato. Estes títulos de lactato representam um rendimento de lactato de 92-95% em glicose e uma produtividade volumétrica superior a 1,5 g/l/h durante a produção microaeróbica. Estes resultados mostram que os transformantes de D-LDH podem produzir ácido D-láctico. A análise enzimática do ácido láctico produzido por estas estirpes mostrou que o ácido láctico é ácido D-láctico mais de 99% enantiomericamente puro.

Estes resultados mostram que os transformantes de 66 ΡΕ1513923 D-LDH gerados utilizando uma estratégia de substituição de genes num único passo (CD597, CD599 e CD600) podem produzir ácido D-láctico de modo semelhante à estirpe de substituição em dois passos, CD587.

Exemplo 3A: Construção do plasmídeo pVR29 possuindo o gene de resistência a 6418 funcionalmente ligado ao promotor de PGK e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae (pVR29) 0 marcador de resistência a G418 (pVR22, Exemplo 1C) foi clonado em pNC2 (Exemplo IA) e a construção foi designada pVR29 (FIG. 15). 0 promotor de PGK de S. cerevisiae e o terminador de GAL10 de S. cerevisiae foram utilizados para expressar o gene de resistência a G418. 0 gene de resistência a G418 foi amplificado por PCR utilizando Polimerase Pfu (Stratagene, Madison, WI) com os iniciadores 5'-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC (fragmento 5'G; SEQ ID NO: 9) e 5'-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCA TCG AGC ATC (fragmento 3'G; SEQ ID NO: 10) e o plasmídeo pVR22 (Exemplo 1C) como molde. Alternativamente, o plasmídeo pPIC9K (Invitrogen, Carlsbad, CA) pode também ser utilizado como molde. Foram efectuados ciclos térmicos incubando inicialmente a mistura reaccional durante 5 min. a 95°C, seguido de 35 ciclos de 30 seg. a 95°C, 30 seg. a 49°C, e 2 min. a 72°C, seguido de uma incubação final durante 10 min. a 72°C. O produto de PCR foi digerido com BamHI e Xbal e um fragmento de 821 pb foi isolado e ligado ao fragmento BamRI-Xbal de 4303 pb de pNC2. O plasmídeo resultante, pVR29 (FIG. 15) continha o promotor de PGK e o 67 ΡΕ1513923 terminador de GAL10 operativamente ligados (i.e., activos na transcrição numa célula de levedura) ao gene de resistência a G418.

Exemplo 3B: Plasmideo para a Integração dlreccionada de adn no locus de PDCl de K. marxianus A sequência de ADN flanqueadora do gene PDCl de K. marxianus foi clonada no plasmideo pVR29 (Exemplo 3A, FIG. 15) para gerar um ácido nucleico recombinante para integração de ADN direccionada no locus de PDCl. A construção resultante foi designada pBH5a (FIG. 16a). pBH5a compreende um local de restrição Sbfl que permite que os genes clonados fiquem operativamente ligados ao promotor de PDCl.

Um fragmento de ADN de 1254 pb imediatamente a montante de PDCl foi amplificado por PCR com os iniciadores 5' -CAA GAA GGT ACC CCT CTC TAA ACT TGA ACA-3' (5' -Flanco 5'; SEQ ID NO: 31) e 5'-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTT GG-3' (5'-Flanco 3'; SEQ ID NO: 32) e o plasmideo pS021 (FIG. 7B, Exemplo 1F) como molde. Os ciclos térmicos foram feitos incubando inicialmente a mistura reaccional durante 2 min. a 94°C, depois por 35 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 55°C e 1,5 min. a 72°C, seguido de uma incubação final de 7 min. a 72°C. O produto de PCR de 1254 pb foi separado por electroforese num gel de agarose a 0,8% e isolado. O produto de PCR e pVR29 (FIG. 15a) foram ambos digeridos com Kpnl e Sbfl. O produto de PCR digerido foi 68 ΡΕ1513923 ligado ao pVR29 de 5067 pb para dar o pBH5a de 6315 pb (ver FIG. 16A). O plasmídeo resultante contém um gene de resistência a G418 operativamente ligado ao promotor de PDC1 e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae e um fragmento de 1240 pb de ADN homólogo ao ADN imediatamente a montante do gene PDC1.

Um fragmento de 535 pb de ADN imediatamente a jusante de PDC1 foi amplificado por PCR com os iniciadores 5'-CCA AGC CCT GCA GGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3' (3'-Flanco 5'; SEQ ID NO: 33) e 5'-CTC GTA ACG CGT GTA CAA GTT GTG GAA CAA-3' (3'-Flanco 3'; SEQ ID NO: 34) utilizando o plasmídeo pS021 (FIG. 7A) como molde. Os ciclos térmicos foram feitos incubando inicialmente a mistura reaccional durante 2 min. a 94°C, depois amplificando através de 35 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 55°C e 45 seg. a 72°C, seguido de uma incubação final de 4 min. a 72°C. O produto de PCR foi separado por electroforese num gel de agarose a 0,8% e o produto de 535 pb foi isolado. O produto de PCR foi digerido com SbfI e MluI. O fragmento de 529 pb foi ligado com o fragmento Sbfl-Mlul de pBH5a para dar o plasmídeo pBH5b. pBH5b contém 1,2 kb do ADN imediatamente a montante e 0,5 kb do ADN imediatamente a jusante, de PDC1 com um local Sbfl único situado entre as sequências flanqueadoras de pdcl, incluindo também um marcador seleccionável de resistência a G418 operativamente ligado ao promotor de PDCl e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae, e é mostrado esquematicamente na FIG. 16b. 69 ΡΕ1513923

Uma porção do locus de PDCl (K. marxianus) foi também subclonada no plasmídeo comercial pUC19 (Invitrogen) para gerar pBH5c, como se segue. 0 plasmídeo pS021 foi digerido com NheI e NdeI e o fragmento de ADN de 3339 pb contendo 486 pb do ADN imediatamente a montante de PDCl, a sequência completa de PDCl, e 1157 pb do ADN imediatamente a jusante de PDCl foi isolado após separação electroforética num gel de agarose a 0,8%. pUCl9 foi digerido com XbaI e NdeI e o fragmento de ADN de 2452 pb foi isolado após separação electroforética num gel de agarose a 0,8%. O pUCl9 digerido e o locus de PDCl foram ligados um ao outro para dar o pBH5c de 5791 pb, e mostrado esquematicamente na FIG. 16c.

Exemplo 3C: Plasmídeo para a integração direccionada do gene D-LDH de L. helveticus no locus de PDCl de K. marxianus O gene D-LDH de pVR48 (Exemplo 1K) foi clonado no local Sbfl de pBH5b para criar um ácido nucleico recombinante capaz de integrar D-LDH no locus de PDCl de K. marxianus e expressar D-LDH sob o controlo do promotor e do terminador endógenos de PDCl. O gene D-LDH foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5'-TTT TTA CCT GCA GGC TAG ATT TAT GAC AAA GG-3' (Lh-D-LDH 5'; SEQ ID NO: 35) e 5'-TCT ACC CCT GCA GGA AAA CTT GTT CTT GTT CA-3' (Lh-D-LDH 3'; SEQ ID NO: 36) utilizando pVR47 (Exemplo 1J) como molde. Foram efectuados 70 ΡΕ1513923 ciclos térmicos em 30 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 55°C, 1,5 min. a 72°C, seguido de uma incubação final durante 4 min. a 72°C utilizando o Failsafe PCR System (Epicentre, Madison, WI). O produto de PCR foi separado por electroforese num gel de agarose a 0,8% e o produto de 1028 pb foi isolado. O produto de PCR foi digerido com Sbfl e ligado ao pBH5b digerido com Sbfl de 6844 pb para dar o

plasmideo pBH6 de 7872 pb. pBH6 contém o gene D-LDH operativamente ligado ao promotor e ao terminador de PDC1, juntamente com um marcador de resistência a G418 operativamente ligado ao promotor de PDCl e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae, mostrado esquematicamente na FIG. 17.

Exemplo 3D: Integração de pBH6 no locus de PDCl, criando a estirpe CD588 de K. marxianus O plasmideo de integração pBH6, contendo D-LDH foi transformado em K. marxianus de tipo selvagem (CD21). O plasmideo inteiro foi integrado no locus de PDCl através de uma única recombinação homóloga inicial entre o ADN de PDCl flanqueador imediatamente a montante do gene D-LDH de pBH6 e o ADN imediatamente a montante do gene PDCl no cromossoma. A estirpe resultante contém a cópia de tipo selvagem de PDCl bem como uma única cópia de pBH6 integrada no locus de PDCl. CD21 foi utilizada para inocular 50 ml de YPD, suplementados com 100 g/1 de glicose num balão de agitação 71 ΡΕ1513923 com deflectores de 250 ml até uma ϋΟεοο de 0,1. A cultura foi criada durante 16 h a 30°C com 250 rpm até uma DOôoo final de 12. As células de 10 ml de cultura foram colhidas através de centrifugação e lavadas uma vez com tampão de electroporação (EB; Tris-HCl 10 mM, sacarose 270 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,5). As células foram ressuspensas em tampão de incubação (YPD + DTT 25 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0) e incubadas a 30°C com 250 rpm durante 30 min. As células foram colhidas através de centrifugação e lavadas uma vez com EB. As células foram ressuspensas em 1 ml de EB, e 400 μΐ desta suspensão foram transferidos para uma cuvete de electroporação de 0,4 cm. 12 yg de pBH6 não cortado num volume total de 50 μΐ foram adicionados à cuvete e as células foram electroporadas a 1,8 kV, 1000 Ω, 25 yF. As células foram transferidas para 1 ml de YPD num tubo Falcon com tampa de rosca de 50 ml e incubadas a 30°C com agitação de 250 rpm durante 4 h antes de plaqueamento selectivo em YPD contendo 300 yg/ml de G418. Os transformantes foram criados a 37°C durante 2 dias. Os transformantes que cresceram foram riscados em placas de selecção frescas. A verificação da integração correcta de pBH6 no locus de PDC1 através de uma única recombinação homóloga entre o ADN de PDC1 flanqueador imediatamente a montante do gene D-LDH de pBH6 e o DNA imediatamente a montante do gene PDC1 no cromossoma de K. marxianus foi avaliada utilizando os iniciadores 5' -AAG CAC CAA GGC CTT CAA CAG-3' (Cromossoma PDC1 5'; SEQ ID NO: 37) e 5'-CTT GTC TTG ACG TAA TAC ACG TGC AGC-3' (D-LDH 3'; SEQ ID NO: 38) desenhado 72 ΡΕ1513923 para amplificar um produto de 2,7 kb entre o ADN cromossómico a montante do gene PDCl e fora da homologia incorporada em pBH6, e o gene D-LDH. Foram efectuados ciclos térmicos através da incubação da mistura reaccional durante 2 min. a 94°C, seguido de 35 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 55°C e 3 min. a 72°C, seguido de uma incubação final de 7 min. a 72°C. Sete dos dez transformantes analisados deram o produto de PCR de 2,7 kb esperado. Dois produtos resultaram da análise de PCR, utilizando iniciadores desenhados para amplificar o locus de PDC1 5' -CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3' (PDCl 5'; SEQ ID NO: 39) e 5'-CCC ATA CGC TTA TAA TCC CCC-3' (PDCl 3'; SEQ ID NO: 40), numa banda de 1,7 kb correspondendo a PDCl, e numa banda de 1,0 kb correspondendo a D-LDH. Os ciclos térmicos foram efectuados através da incubação da mistura reaccional durante 2 min. a 94°C, seguido de 35 ciclos de amplificação de 30 seg. a 94°C, 30 sec. a 55°C, 2 min. a 72°C, e de uma incubação final de 5 min. a 72°C. A análise de "Southern blot" utilizando uma sonda desenhada para detectar o gene de resistência a G418 foi utilizada para mais verificações do acontecimento de integração de uma única cópia. Um dos sete transformantes analisados apresentou o padrão de bandas correcto consistente com a integração de uma cópia de ρΒΗβ. A estirpe com uma cópia de pBH6 situada no locus de PDCl, tal como verificado através de PCR e análise de "Southern", foi designada CD588.

Estes resultados demonstram que a integração direccionada do ADN de pBH6 transformado no locus de PDCl 73 ΡΕ1513923 de K. marxianus de tipo selvagem CD21 ocorreu através de uma única recombinação homóloga entre as sequências do promotor de PDC1. Estes resultados confirmam também que pBH6 está presente como uma única cópia na estirpe CD588.

Exemplo 3E: Perda da estrutura do plasmídeo pBH6 e do gene PDCl de CD588, gerando as estirpes de K. marxianus CD587, CD589 e CD590 CD588 foi propagada em meios não selectivos durante vários ciclos de crescimento para encorajar uma segunda recombinação homóloga entre as sequências do terminador de PDC1 do pBH6 integrado e do terminador de PDCl nativo. Um segundo acontecimento de recombinação homóloga nas sequências dos terminadores resultou numa estirpe onde o gene PDCl foi substituído pelo gene D-LDH. Esta estirpe é isenta do gene marcador de resistência a G418 devido à perda do gene de G418, juntamente com o gene PDCl, ocorrendo como resultado de um segundo acontecimento de recombinação. A estirpe resultante em que PDCl é substituído por D-LDH exibiu um fenótipo sensivel a G418 juntamente com uma falta de crescimento anaeróbico. CD588 foi plaqueada em placas de YPD-agar e criada de um dia para o outro a 37°C. Um esfregaço de colónias foi transferido para placas de YPD-agar frescas. Isto foi repetido quatro vezes. Após o quinto ciclo de crescimento não selectivo em placas de YPD-agar, 6 balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo cada um 50 74 ΡΕ1513923 ml de YPD suplementado com 100 g/1 de glicose e 42 g/1 de CaC03 foram inoculados até uma ϋΟεοο de 0,1 com células CD588 do quinto ciclo de plaqueamento não selectivo. Os balões de agitação foram criados a 30°C com 250 rpm durante 16 h. As culturas foram então diluidas e utilizadas para plaquear colónias individuais em placas de YPD-agar. Adicionalmente, um esfregaço de colónias do quinto ciclo de placas de crescimento não selectivo foi suspenso em 1 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato) e subsequentemente diluído e utilizado para plaquear colónias individuais em placas de YPD-agar. As colónias individuais resultantes deste ciclo de plaqueamento foram plaqueadas em YPD-agar e colocadas numa câmara anaeróbica. Após crescimento durante 2 dias a 37°C, a câmara anaeróbica foi aberta e as colónias que cresceram anaerobicamente foram marcadas. As placas foram incubadas mais um dia a 37°C. As colónias que cresceram aerobicamente mas não anaerobicamente foram transferidas para placas em triplicado para pesquisa. As placas utilizadas para estas condições de pesquisa foram placas de YPD (aeróbicas) , placas de YPD (anaeróbicas) e placas de YPD suplementado com 300 yg/ml de G418. Foram identificados três transformantes com o fenótipo desejado possuindo sensibilidade a G418 e falta de crescimento anaeróbico. Estes transformantes foram designados CD587, CD589 e CD590.

A confirmação da substituição de PDC1 por D-LDH foi efectuada utilizando os iniciadores 5'-CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3' (PDC1 5'; SEQ ID NO: 39) e 5'-CCC ATA CGC 75 ΡΕ1513923 ΤΤΑ ΤΑΑ TCC CCC-3' (PDC1 3'; SEQ ID ΝΟ: 40), desenhados para amplificar ο locus de PDCl, utilizando ADN cromos-sómico de CD587, CD589 e CD590 como moldes. Os ciclos térmicos foram efectuados através de uma incubação inicial da mistura reaccional durante 2 min. a 94°C, seguido de 35 ciclos de 30 seg. a 94°C, 30 seg. a 55°C, 2 min. a 72°C, e de uma incubação final de 5 min. a 72°C. O ADN cromossómico de todas as três estirpes produziu um único produto de PCR de 1,0 kb correspondendo a D-LDH. A análise de "Southern blot" utilizando uma sonda desenhada para hibridar com o gene de G418 indicou a ausência do gene de G418. Mais, análise de "Southern" com uma sonda para a região de codificação de PDCl não mostrou qualquer banda. Sondas desenhadas para hibridar com regiões imediatamente a montante e a jusante de PDCl deram bandas com tamanhos consistentes com a substituição de PDCl por D-LDH.

Estes resultados demonstram que o gene PDCl, juntamente com a estrutura do plasmideo pBH6 contendo o marcador de resistência a G418 operativamente ligado ao promotor de PDCl e ao terminador de GAL10 de S. cerevisiae se perderam do cromossoma de CD588 através de um segundo acontecimento de recombinação homóloga que ocorreu entre os dois terminadores de pdcl presentes no locus de PDCl de CD588. Este segundo acontecimento de recombinação proporciona uma estirpe onde o gene PDC1 foi exactamente substituído pelo gene D-LDH flanqueado pelos locais Sbfl. 76 ΡΕ1513923

Exemplo 3F: Produção de ácido D-láctico em meios complexos tamponados com CaC03 em culturas microaeróbicas de K. marxianus em balão de agitação com uma única cópia de D-LDH integrada no locus de PDC1 A estirpe Lh-D-LDH Pdc+, CD588 e as estirpes Lh-D-LDH Pdc-, CD587, CD589 e CD590 foram cultivadas em balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD suplementado com 100 g/1 de glicose e 50 g/1 de CaCOs, após inoculação até uma DOêoo de 0,1 de placas de YPD-agar, durante 16 horas a 30°C com 250 rpm. Após nos assegurarmos de que permanecia em cada balão glicose residual e que as células estavam em crescimento exponencial, foram colhidos equivalentes a 4 g/1 de peso seco de células através de centrifugação e ressuspensos em balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD suplementado com 100 g/1 de glicose e 50 g/1 de CaCC>3. As culturas foram colocadas a 30°C com 70 rpm. As amostras foram tiradas a vários intervalos de tempo e as células foram removidas através de filtração. O sobrenadante da cultura foi analisado quanto a glicose, lactato, piruvato e etanol através de HPLC (descrito acima no Exemplo 1M).

Após 23 horas, a estirpe Lh-D-LDH Pdc+, CD588 tinha consumido 127 g/1 de glicose e produzido 33 g/1 de lactato, 37 g/1 de etanol e 0,2 g/1 de piruvato. As estirpes Lh-D-LDH Pdc-, CD587, CD589 e CD590 tinham consumido 40-43 g/1 de glicose, produzindo 36-39 g/1 de lactato e 1,0-1,3 g/1 de piruvato. 77 ΡΕ1513923

Após 54 horas, CD587, CD589 e CD590 tinham consumido 85-88 g/1 de glicose e produzido 81 g/1 de lactato e 2,5 g/1 de piruvato. Estes títulos de lactato representam um rendimento em lactato de 92-95% em glicose e uma produtividade volumétrica superior a 1,5 g/l/h durante a fase de produção microaeróbica. Após 54 horas, formou-se um precipitado de lactato de cálcio insolúvel ("em bolo") devido aos elevados níveis de D-lactato produzidos nas culturas, impedindo mais análises. As análises enzimática e de GC, de acordo com o Exemplo 1L, mostraram que mais de 99% do lactato produzido era D-lactato. Não se detectou etanol em culturas de CD587, CD589 e CD590, consistente com a substituição de PDC1 por LDH.

Estes resultados mostram que os transformantes de D-LDH podem produzir ácido D-láctico. A produção de ácido láctico com um PDC1 funcional resultou numa produção aproximadamente igual de ácido láctico e etanol, demonstrando que o D-LDH pode competir com o PDC1 nativo pelo piruvato. Através da substituição do PDC1 por D-LDH de L. helveticus, o título de ácido láctico aumentou duas vezes, resultando em elevados títulos e rendimentos que se aproximam do máximo teórico. Mais, estas estirpes não produziram etanol, demonstrando a substituição de PDC1 por D-LDH. A análise enzimática do ácido láctico produzido por estas estirpes mostrou que o ácido láctico era ácido D-láctico mais de 99% enantiomericamente puro. 78 ΡΕ1513923

Exemplo 3G: Produção de ácido D-láctico a elevadas temperaturas em meios complexos tamponados com CaC03 em culturas microaeróbicas de estirpes de K. marxianus em balão de agitação A estirpe de tipo selvagem de K. marxianus, CD21, a estirpe Lh D-LDH PDC+, CD588, e as estirpes Lh-D-LDH Pdc-, CD558 e CD587, foram inoculadas até uma DCtoo de 0,1 a partir de placas de YPD-agar e foram criadas durante 16 horas a 33°C com 250 rpm, em balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD suplementado com 100 g/1 de glicose e 50 g/1 de CaCC>3. Após determinar que permanecia glicose residual em cada balão e que as células estavam consequentemente na fase de crescimento exponencial, foram colhidos equivalentes de 4 g/1 de peso seco de células através de centrifugação e ressuspensos em balões com agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD suplementado com 100 g/1 de glicose e 50 g/1 de CaC03. As culturas foram criadas a 37°C, 42°C ou 50°C com 70 rpm. Amostras foram tiradas a vários intervalos de tempo e as células foram removidas através de filtração. O sobrenadante da cultura foi analisado quanto a glicose, lactato, piruvato, acetato, glicerol e etanol através de métodos de HPLC (do Exemplo 1M).

Após 23 horas, a estirpe Lh-D-LDH PDC+, CD588, a fermentar a 37°C, tinha consumido 115,5 g/1 de glicose e produzido 16,2 g/1 de lactato, 37,6 g/1 de etanol, 7,6 g/1 de glicerol, 2,6 g/1 de acetato e 0,2 g/1 de piruvato. Após 79 ΡΕ1513923 47 horas a 37°C, as estirpes Lh-D-LDH PDC-, CD558 e CD587 tinham consumido 99-105 g/1 de glicose e produzido 90-99 g/1 de lactato, 2,7-3,5 g/1 de piruvato e 1,2-1,4 g/1 de acetato. Em contraste, a estirpe de tipo selvagem, CD21, consumiu 115,5 g/1 de glicose e produziu principalmente etanol (43,5 g/1) e uma pequena quantidade de lactato (1,7 g/1) ·

Após 23 horas, a estirpe Lh-D-LDH PDC+, CD588, a fermentar a 42°C, tinha consumido 115,5 g/1 de glicose e produzido 12,8 g/1 de lactato, 34,7 g/1 de etanol, 6,9 g/1 de glicerol, 3,0 g/1 de acetato e 0,3 g/1 de piruvato. Após 47 horas a 42°C, as estirpes Lh-D-LDH PDC-, CD558 e CD587 tinham consumido 80 g/1 de glicose e produzido 75 g/1 de lactato, 2,5 g/1 de etanol e 1,5 g/1 de acetato. Em contraste, a estirpe de tipo selvagem CD21 consumiu 115,5 g/1 de glicose, e produziu principalmente etanol (39,7 g/1) e uma pequena quantidade de lactato (1,0 g/1).

Após 47 horas, a estirpe Lh-D-LDH PDC+ CD588, a fermentar a 50°C, tinha consumido 49,6 g/1 de glicose e produzido 6,8 g/1 de lactato, 9,5 g/1 de etanol, 4,5 g/1 de glicerol e 1,8 g/1 de acetato. Após 47 horas a 50°C, as estirpes Lh-D-LDH PDC-, CD558 e CD587 tinham consumido 15 g/1 de glicose e produzido 10 g/1 de lactato, 1,2-1,4 g/1 de piruvato e 1,6-1,7 g/1 de acetato. Em contraste, a estirpe de tipo selvagem CD21 consumiu 70,5 g/1 de glicose, e produziu principalmente etanol (13,6 g/1) e uma pequena quantidade de lactato (0,5 g/1). 80 ΡΕ1513923

Estes resultados demonstram que os transformantes D-Ldh+ podem produzir ácido D-láctico a temperaturas tão elevadas como 50°C. O ácido láctico produzido por estas estirpes é ácido D-láctico mais que 99% enantiomericamente puro, tal como determinado através de análise enzimática. Embora as velocidades globais de consumo de glicose e de produção de lactato diminuam com o aumento da temperatura, o rendimento em lactato a partir de glicose permanece entre 88-100% para as estirpes Lh-D-LDH PDC-, CD558 and CD587.

Exemplo 3H: Produção de ácido D-láctico em meios complexos não tamponados em culturas microaeróbicas de K. marxianus em balões de agitação com uma única cópia de D-LDH de L. helveticus integrada no cromossoma das estirpes A estirpe de tipo selvagem de K. marxianus CD21, a estirpe Lh-D-LDH PDC+ CD588 e as estirpes Lh-D-LDH PDC-CD558 e CD587 foram inoculadas até uma DOêoo de 0,1 a partir de placas de YPD-agar e criadas durante 16 horas a 30°C com agitação a 250 rpm, em balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD suplementado com mais 100 g/1 de glicose. Após determinar que permanecia glicose residual em cada balão e que as células estavam consequentemente na fase de crescimento exponencial, foram colhidos equivalentes de 4 g/1 de peso seco de células através de centrifugação e ressuspensos em balões de agitação com deflectores de 250 ml contendo 50 ml de YPD suplementado com 4 0 g/1 de glicose, em duplicado. As 81 ΡΕ1513923 culturas foram colocadas a 37°C com 70 rpm. Amostras foram tiradas a vários intervalos de tempo e as células foram removidas através de filtração. Os sobrenadantes das culturas foram analisados quanto a glicose, lactato, piruvato, acetato, glicerol e etanol através de HPLC.

Após 23 horas, a estirpe Lh-D-LDH PDC+ CD588 tinha consumido 58,9 g/1 de glicose e produzido 0,9 g/1 de lactato, 0,2 g/1 de piruvato, 2,6 g/1 de glicerol e 0,6 g/1 de acetato. O pH final da cultura foi medido como 4,6. O etanol foi o principal produto desta fermentação, a 24-24,7 g/1. Após 23 horas, as estirpes Lh-D-LDH PDC-, CD558 e CD587 tinham consumido 4,1 g/1 de glicose e produzido entre 2,5 g/1 de lactato, 1,0 g/1 de piruvato, 0,8 g/1 de glicerol e 0,4 g/1 de acetato. O pH final da cultura para as estirpes CD587 e CD558 variou de 3,31-3,65. O lactato foi o principal produto da fermentação, a um nivel que variou de 1,2-3,3 g/1. A estirpe de tipo selvagem CD21 consumiu 58,9 g/1 de glicose em 23 horas e produziu principalmente etanol (12,8-20,4 g/1) e uma pequena quantidade de lactato (1,2-1,3 g/1), com um pH final de 4,65.

Estes resultados mostram que os transformantes D-Ldh+ produzem ácido D-láctico a valores de pH tão baixos como 3,31. A análise enzimática do ácido láctico produzido por estas estirpes mostrou que o ácido láctico era ácido D-láctico mais de 99% enantiomericamente puro. ΡΕ1513923

Exemplo 31: Produção de ácido D-láctico a partir de D-xilose nas estirpes

Três estirpes de K. marxianus modificadas foram analisadas quanto à produção de ácido D-láctico a partir de D-xilose relativamente a CD21 (tipo selvagem), incluindo CD588 (nula para PDC1 contendo D-LDH de L. helveticus integrado aleatoriamente), CD587 (PDCl::Lh-D-LDH) e CD588 (contendo D-LDH de L. helveticus). Os seguintes resultados demonstram que as estirpes modificadas podem produzir ácido D-láctico a partir de um substrato que não glicose. Células das estirpes CD21, CD558, CD587 e CD588 foram criadas em placas de YPD-agar + 20 g/1 de D-xilose e utilizadas para inocular balões de agitação com deflectores contendo 100 ml de meio de cultura que continha 20 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de peptona, 17 g/1 de CaC03, e 50 g/1 de D-xilose. Os balões de agitação inoculados foram incubados a 35°C e agitados a 250 rpm. Amostras foram tomadas a partir dos balões e a D06oonm medida para monitorizar o crescimento da cultura e a utilização do açúcar. Após cerca de 36 horas, as células foram colhidas através de centrifugação, e foi determinado o peso seco das células (CDW) de cada cultura. Em balões de agitação com deflectores em duplicado contendo 20 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de peptona e 50 g/1 de D-xilose foram adicionados 3,0 g/1 de CDW de células de cada estirpe. Os balões foram incubados a 35°C com agitação a 70 rpm. Amostras foram tomadas a vários momentos para análise de 83 ΡΕ1513923 HPLC e quantificação dos componentes do meio, incluindo xilose, D-lactato, xilitol e etanol. 0 principal componente orgânico produzido pelas estirpes CD588 e CD587 foi o ácido D-láctico, que alcançou um titulo médio mais elevado de 13,7 g/kg. Isto resulta num rendimento em ácido D-láctico a partir de D-xilose de cerca de 33%. 0 principal componente orgânico produzido pela estirpe CD21 é o xilitol, que alcançou um titulo médio mais elevado de 25,0 g/kg. Isto resulta num rendimento em xilitol a partir de D-xilose de cerca de 50%. O principal componente orgânico produzido pela estirpe CD588 foi o xilitol, que alcançou um título médio mais elevado de 19,6 g/kg. Isto resulta num rendimento médio em xilitol a partir de D-xilose de cerca de 44%. A análise de HPLC não detectou qualquer produção de glicerol, ácido cítrico, piruvato, ácido succinico ou acetato em nenhuma das estirpes.

Exemplo 4: Plasmídeos para expressão de D-LDH de B. megaterium e para integração direccionada do ADN transformado no locus de PDCl.

Os plasmideos compreendendo um gene de D-LDH de B. megaterium para integração direccionada no locus do gene PDCl de C. sonorensis são preparados como se segue: O plasmídeo pMl257 (pedido para Candida) é linearizado com Ncol e as pontas salientes a 5' foram parcialmente preenchidas com ADN-polimerase I, fragmento 84 ΡΕ1513923

Klenow, e uma mistura de dATP, dCTP e dTTP, omitindo dGTP da reacção. Isto é seguido pela remoção dos prolongamentos de cadeia simples através de tratamento com nuclease do feijão mungo. 0 ADN então digerido com BamH.1 e o fragmento de 9200 pb isolado de um gel de agarose a 0,8% após separação electroforética. O plasmideo pVR47 (Ex. 1J) contendo D-LDH de B. megaterium é gerado a partir de ADN genómico de B. megaterium e é mostrado na FIG. 12. O fragmento de 1023 pb contendo LDH de B. megaterium é excisado a partir de pVR47 através de digestão com Xbal seguida de preenchimento das pontas salientes 5' pela ADN-polimerase I, fragmento Klenow e cada um dos 4 dNTPs, e digestão com BamHI. O fragmento Ncol(cego)-BamHI de 9200 pb de pMl257 e o fragmento Xbal(cego)-BamHI de 976 pb de pVR47 são ligados e o plasmideo resultante é designado pMIXXX, mostrado na FIG. 18. pMHOOO contém, por ordem, o promotor de PDCl de C. Sonorensis, o promotor de PGK1 de C. sonorensis operativamente ligados ao gene MEL5 de S. cerevisiae, o promotor de PGK1 de C. sonorensis operativamente ligado ao D-LDH de B. megaterium e 0 terminador de PDC1 de C. sonorensis. PMI1000 é digerido com NotI para excisar o fragmento de 7300 pb que consiste nas cassetes de expressão de MEL5 e LDH flanqueadas pelas regiões 5' e 3' de PDCl. Este fragmento de 7500 pb é utilizado para transformar C. sonorensis (apresentação para Candida) e os transformantes são pesquisados em placas de YPD suplementadas com χ-α-gal a uma concentração de 40 pg/mL. Os transformantes são criados em placas de YPD-agar suplementadas com X-a-gal (40 pg/mL). 85 ΡΕ1513923

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Cargill Dow Polymers LLC Rajgarhia, Vineet Asleson, Catherine Olson, Stacey Suominen, Pirkko <120> Métodos e Material para a Produção de Ácido D-láctico em Levedura

<130> 00-1237-Q <150> US 60/384,333 <151> 2002-05-30 <160> 43 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 848

<212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <4 0 0 > 1

Ocggíxgcgg atcQctcttc cgctatcgat taattttttt ttctttccte tttttattaa 60 ccttaatttt tattttaçat tcctgacttc aacteaagae gcacagatat tataaeatct 120

gcacaataig catttgtaag aatt.actc.git gagtaaggaa agagtgagga actatcgcat MO acctgeattt aaagatgctg atttpggcgc gaatecttta ttttggctte accctcatac. 240 tattatcagg gtxagaaâaa ggaagtgttt cectccttct tsaattgatg ttaccctcat 506 aasgcacgtg gcctcttatc gagaaagaaa ttaccgtcgc tcgtgatttg tttgcaaaaa 560 gaacaaaatt gaaaaaaccc agacacgctc gacttcctgt cttcctattg attgcagctt 420 ccastttcgt cácacsacaa ggtcctagcg atggttcaca ggttttgtaa caagcaateg 480 aaggttçtgg aatggcggga aagggtttag taccacatgc t&tgalgeç.ç actgtgatç.t 540 ccagagcaaa gttcgttcga txgtactgtt actctctctt tttcáâacag aattgttcga 60Ô atcgtgtgae aacascagcc tgttctcaca cactcttttc ttctaatcaa gggggtggtt 660 tagtttafta goacctcgtg aaacttacat tfcaeatatat at&aacitgc ataaattggt 220 CMigtMsa astacitett tggtcmtc xaattcgug tfcítuaagt tcttagatgc 780 tttctttttc tcttttttac agatcatcaa ggaagtaatt atctactttt tacaacaaat 840 ctagaatt 848 <210> 2 <211> 376

<212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <4 00> 2 86 ΡΕ1513923 gtagatacat tgatfctetc aatccagaga actggaaaga ttpftagcc tigaaaaacg 60 gtgaaaetta cgggtteaag attgtctacã gãttttcetf atttg-ccagc. ttactatcct 110 tcttgaaaat atgcactcta tstettttag ttcttaattg caacacafag atttgctgta :18o taacgaattt tatgctâttt tttaaatttg gagttcagtg ataaaagtgt cacagcgaat 240 ttxeteacat íjtagggaceg aattgtttac aagttetctg taccaecatg gagacatcaa 300 aaattpaaa tctatgiaâá gatatfgacg gtagcaacaa gaatatagca cpgcegcgg 360 atttatttcg ttacgc 376

<210 > 3 <211> 27 <212 > ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador PSPDCS1 <4 00> 3 ccatcgataa caagctcatg caaagag 27

<210> 4 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador PSPDCAS2 <400> 4 gctctagatt tgactgtgtt attttgcg 28

<210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador BM1270 <400> 5 cctgagtcca cgtcattatt c 21

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador BM179 <400> 6 tgaagctatt tattcttgtt ac 22 87 ΡΕ1513923

<210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Bmeg5' <4 00> 7 gctctagatg aaaacacaat ttacacc 27

<210> 8 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Bmeg3' <4 00> 8 atggatcctt acacaaaagc tctgtcgc 28

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador do fragmento 5' G <4 00> 9 gctctagatg agccatattc aacgggaaac 30

<210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador do fragmento 3' G <400> 10 atggatcctt agaaaaactc atcgagcatc 30

<210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador SO-M2 <400> 11 cttccagtcc agcaggtcga ccag 24

<210> 12 <211> 18 <212> ADN ΡΕ1513923 <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador S0-M1 <400> 12 gtccagcatg tcgaccag

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador SO-M4 <4 0 0 > 13 gaacgaaacg aacttctctc

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador SO-M5 <4 0 0 > 14 cttggaactt cttgtcagtg

<210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador S04549 <400> 15 ccatccgaag aagtcgatct c

<210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador S0285 <400> 16 cttgccatcc tatggaactg c

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial 89 ΡΕ1513923 <223> Iniciador SO2740 <4 0 0 > 17 gaaggctggg aattgagtga 20

<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador S02444 <4 0 0 > 18 gctccatctg aaatcgacag 20

<210> 19 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 5'HYGXBAl <4 0 0 > 19 aagctctaga tgaaaaagcc tgaactcac 29

<210> 20 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 3'HYGBAMH1 <400> 20 cgcggatccc tattcctttg ccctcggac 29

<210> 21 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR150 <400> 21 ggttggattt atgacaaagg ttttgctt 28

<210> 22 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR153 <400> 22 ΡΕ1513923 aattaaaact tgttcttgtt caaagcaact

<210> 23 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR165 <400> 23 cgtctagatt tatgacaaag gttttgct

<210> 24 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR166 <400> 24 gcggatcctt aaaacttgtt cttgttcaa

<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR161 <400> 25 agttggtgta tttaacaagg

<210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR142 <400> 26 gtgacaccct gtgcacggcg ggagatg

<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR173 <400> 27 gcgacggctc acaggttttg 27ΡΕ1513923 91 <211> 27 <212 > ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR170 <400> 28 cttgtcttga cgtaatacac gtgcagc <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador oCA85 <400> 29 ggaccgatgg ctgtgtagaa <210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 0CA8O <400> 30 tcgcttacct cggtacagaa <210> 31 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 5'-Flanco 5' <400> 31 caagaaggta cccctctcta aacttgaaca <210> 32 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 5'-Flanco 3' 20 20 30 <400> 32 gtaattcctg caggtgcaat tatttggttt gg <210> 33 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; 32 32 32 92 ΡΕ1513923 <2 2 Ο > <223> Iniciador 3'-Flanco 5 <400> 33 ccaagccctg caggagaggg agaggataaa ga

<210> 34 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 3'-Flanco 3' <400> 34 ctcgtaacgc gtgtacaagt tgtggaacaa 30

<210> 35 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Lh-D-LDH 5' <400> 35 32 tttttacctg caggctagat ttatgacaaa gg

<210> 36 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Lh-D-LDH 3' <400> 36 tctacccctg caggaaaact tgttcttgtt ca 32

<210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Cromossoma PDC1 5' <400> 37 aagcaccaag gccttcaaca g

<210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador D-LDH 3' 21 93 ΡΕ1513923 <4 Ο Ο > 38 cttgtcttga cgtaatacac gtgcagc 27

<210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador PDC1 5' <400> 39 cgcaaagaaa agctccacac c 21

<210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador PDC1 3' <400> 40 cccatacgct tataatcccc c 21

<210> 41 <211> 1235 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <4 00> 41 cgctettCfeg ètàtcptt» «ttttttttt útttCiitttt tttattaace ttsatmta ttmgatte ctfâtttcaa ctçaape§€ acagatattat taacatcigç 120 94 ΡΕ1513923

acaa&aggca tttgeaagaa tt&ctcgtga gtasggaaag agtg&ggaac tattgcatae ISO ctgcatttaa aptgccgat ttgggcgega atcmtatt ttggttteae cetcatscta 240 ttattagggc çagaaaaagg aagtgntcc ctccttcttg aattgatgtt accacataa 300 agcac.gtg.fc ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc gtgatttgtt tgcaaaaaga 3S0 acaaaactga aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct tcctattgat tgcagcttcc 420 aatttcgtca cacaacaagg tcctagcgac ggctc&esgg ttttgtaaca agcaatçgaa 480 ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta tgatgcccac tgtgatctcc 549 agagcaaagt tcgttcgatc gtactgttac mctctm tcaaacagaa ttgtccgaat 600 egtgtgacaa caacagectg ttctcacaca ctmttctt ctaaccaagg gggtggtttã 660 gcttagtaga acctcgtgaa acttacattt acatatatat aaacttgcat aaattggtca 720 atgcaagaaa tacatatttg gtcttttcta attçgtagtt tttcaagttc ttagatgctt 780 tctttttctt trttttaeag atcatcáagf aagtaattat ctacttítta caacaaatct 840 agaattegga tccggtagat aeattgatge tatcââtcaa gagaaetgga aagattgtft 000 aaccttgaaa ascggtgaaa cttacgggtc caagaccctc tacagatttt cctgatttgc 960 eagcttacta tccttcttga aaatatgeac tctatatctt ttagttctta attgcaacac 1020 atagatttgc tgtataacga attttatgct attfctttaaa tttggagttc. agtgataaaa 3080 gtgteacagç gaatttccte aeatgtagga ecgaattgtt tacaagttct ctgtaccacc 1140 atggágacat cáaagattga aaatctãtgg aãagatãtgg acggtãgeaa caagaatata 1200 gcacgagccg çggatttatt tcgttacgca tgege 1235

<210> 42 <211> 1314 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <400> 42 95 ΡΕ1513923 ggccgcçgat cgctcttcçg ctatcgataa caagctcatg taaagaggtg gtactcgcae 60

gcccaaatgc stgcasgt&a ectattea&a gtaatatctc at&eatgttt eatgagggta ISO acaamgcg actgggtgag «atatgttet getgatgtga tgtgcaagat aaaeaageaa I8ô ggoigaaatt aaettcttct tottgtaata »aca«ac«cc gcgtttattt acctatctc* 240

aaacttcaae accttatatc ataactaata tttcttgaga taajjeacact geacccatae SOO cttccttaaa aacgtagctt ccsgtttttg gtggttccgg cttccttett g&ttxcgccc 360 gctaas.cgcã tôtttttftt gcCtggtggt àtttgt&á&a tgftataaeçt atgcatttaa 420 aagattatgt atgctettct gatttttegt gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat 48® ttatgaattt gagaacaatt ctgtgttgtt acggt&tm actatfgaat aatcaatcaa $40 ttgaggattt tatgcaaata tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt actttttttt 600 ataattgcat aatattgtcc gctgexcctt tttctgttag acggtgtctt gatctaçug 660 ctategttca acaccacctt attttctaac tattt.ttt.tt ttagctcatt tg&atcagct 720 tstggtgatg geacamtt gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaataaa 780 atatatââac aâtgctcttt cactc.ttc.tt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt 840 tteatatttc ttgtcatatt cctttctcaa ttattatm ctactcataa cctcacgcaa ¢00 aataacacag tcaaatctág aurctcggatc «ggtagacac attgatgcta íxeatecaga 960 gaactggasa gattgtgtag ccttgaaaaa eggtgaaact tacgggtcta agattgttta 1020 cagatttttc tgatttgcc» §cttactatc tttmgaaa mtgcactc tatatctttt 1080 agttcttaat tgeaacacat aptttgctg tataaegaat tttatgctat cttttaaatt 1140 cggagttxag tptaaaagt gtcacagcga atttcctcac atgtagggac cgamgttt 1205 acaagttctc tgtaecacca tggagacatc aaaaattgaa aatctatgga aagatatggs 1260 cggtagcaac: aagaatatag cacgagtcgc ggatttattt cgttaegcat: gcgc 1314 <210> 43 <211> 1014

<212> ADN <213> Lactobacillus helveticus; <400> 43 96 ΡΕ1513923 aigacaaagg tttttgctta cgetattcga aaagacgaag aactattctt gaatgaatgg 60 aaggaagctc acaaggatat cgatgttgat tscactgata aacttctgac icctgaaact 120

gctaagctag ctaagggtgc tgacggtgtt gttgttt»CC Mcaattagá etãcsttgca ISO gatactcttc aagctttagc agacgctggc glaacta&ga cgtcattacg taacgttggt 240 gttgacaaca ttgatatgga caaggctaag gaattaggtt tccaaattac caatgttcct 300

gtttactcac caaaqjctat tgctgaacat getgctattc aggctgcacg tgtattacgt 3ÊQ caagacaagc gcatggacga aaagatggct aaacgtgact tacgttgggc «ccaactatc 420 ggccgtgaag ttcgtgacca agttgttggt gtcgttggta ctggtcacat tggtcaagta 460

ttfcãtgcgta ttatggaagg tttcggtgca aaggttattg cttaegatat ettcaagaac S4Q ctagaacttg aaa&g&aggg ttactacgtt gactcacttg atgacttgta caagcaagtt 600 gatgtaattt cacttcacgt «íccagatgtt ccagctaacg ttcacatgat caacgacaag 660 tcaatcgctg aaatga&aga cggcgttgta attgtaaact getcacgtgg tcgacttgtt 720 gacactgacg ctgtaatccg tggmçgac teaggcaaga tettcggctt cgttatggat 780 acttãçgaag acgaagttgg tgtatttaac aaggattggg aaggtaaaga attcccagac 840 aagcgtttfo cagacttaat tgatcgtcca aacgtattgg taactccaca caccgccttx 900 taesçtactc acgetgtaçg tM«ãtggtt fç^aaggçat tmçãsata cttpagtta 950 Ãtcaacggcg aaaagctaya ttctccagtt gctttgaaca agâaçaagtt ttaa 1014

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

<110> Cargill Dow LLC <120> Métodos e Material para a Produção de Ácido D-láctico em Levedura

<130> 3J336220 004 EP ECT GPO/HW/SG <150> us 60/384,333 <151> 2002-05-30 <160> 43 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 848

<212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <4 0 0 > 1 97 ΡΕ1513923 gcggccgçgg atcgctctte cgctatcgat taattttttt tictttcctc tttttatta» 60 ecttaatttt tâttttapt tcctgacttc aaçtçaapc gtaeaptat tataacatct 120 gçacaatagg eatttgcaag aattactcgt pgtaagpa apppgp aetatcpar 180 acctgcattt aaagatgccg atttgfgçgç gaatccttta ttttfgcttc accctcata.c · 240 mmcagg gceagaaaaa ggaagtgttt ccctecttct tgaattgatg ttaccctcat 300 aaagcacgtg gtctçttâtc gagaaagaaa ttacegtcfc tcgtgatttg tttgtaaaaa 360 pacaaaâct paaaaaccc agacacgctc pçttcetft cttcctattg attgcagctt 420 cxaatttcgt cacacaacaa ggttctagcg acpttcaca ggttttgtaa caagcaatxg 480 aaggttctgg aatggcggga aagggíttag taceacatgc tatptgtcc actgtgatçt $40 ecagageaaa gttcgttcga tcgtactgtt actctctetc tttxsaacág ââttgtccga 600 âtcgtgtgac aâcaacagce tgttetcaca * cactcttttc ttctaaccãâ gggggtggtt 660 tâgtttagta gaacctxotg aaacttatat ttscatatat ataaacttgc ataaattggt 720 caatgcaaga aatacatatt tggtcttttc taattcgtag tttmaagt tcttagatgç 780 tttettmc ctapsatt tcttttttac agatcatcaa ggaagtaatt atctaettft tacaãcààât 840 848

<210 > 2 <211> 376 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <4 00> 2 gtag#tac*t tgatgetatc a*tcc*$»$i actggaaaga tfftgtagee ttgaaaaaqj 60 ftgaaactta cgtftccaag attgtctaca pttttc£t$ atttgeçacjc mctateet 120 tcttgaaaat atgcactcta mcnttag ttcttuttg caitacata® amgctgts 180 taaegaattt tatgctam maaatttt gagttcaoty ataaaagtgt cácappat 240 ttecteacat gtagggaccg aattgtttac aaptctctg taccaecatg gagacatcaa 300 aaattpto tetatgpaa ptátgpcg papaMM pMttápa cppxpp }$$ atttatttcg ttacgc 37$

<210> 3 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <22 0 > <223> Iniciador PSPDCS1 <4 00> 3 ccatcgataa caagctcatg caaagag 27 <210> 4 98 ΡΕ1513923

<211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador PSPDCAS2 <4 00> 4 gctctagatt tgactgtgtt attttgcg 28

<210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador BM1270 <4 00> 5 cctgagtcca cgtcattatt c 21

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador BM179 <4 00> 6 tgaagctatt tattcttgtt ac 22

<210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Bmegõ' <4 00> 7 gctctagatg aaaacacaat ttacacc 27

<210> 8 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Bmeg3' <4 00> 8 atggatcctt acacaaaagc tctgtcgc 28

<210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; 99 ΡΕ1513923 <220> <223> Iniciador fragmento 5' G <400> 9 gctctagatg agccatattc aacgggaaac 30

<210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador fragmento 3' G <400> 10 atggatcctt agaaaaactc atcgagcatc 30

<210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador SO-M2 <4 0 0 > 11 cttccagtcc agcaggtcga ccag 24

<210> 12 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador S0-M1 <4 0 0 > 12 gtccagcatg tcgaccag 18

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador SO-M4 <400> 13 gaacgaaacg aacttctctc 20

<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador SO-M5 20 20 100 ΡΕ1513923 <400> 14 cttggaactt cttgtcagtg

<210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador S04S49 <400> 15 ccatccgaag aagtcgatct c 21

<210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador S0285 <4 0 0 > 16 21 cttgccatcc tatggaactg c

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador SO2740 <4 0 0 > 17 gaaggctggg aattgagtga 20

<210> 18 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador S02444 <4 0 0 > 18 20 gctccatctg aaatcgacag

<210> 19 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 5'HYGXBAl <400> 19 aagctctaga tgaaaaagcc tgaactcac 29 ΡΕ1513923 101 <210> 20 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 3'HYGBAMH1 <400> 20 cgcggatccc tattcctttg ccctcggac 29 <210> 21 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR150 <4 00> 21 ggttggattt atgacaaagg ttttgctt 28 <210> 22 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR153 <400> 22 aattaaaact tgttcttgtt caaagcaact 30 <210> 23 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR165 <400> 23 cgtctagatt tatgacaaag gttttgct 28 <210> 24 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR166 <400> 24 gcggatcctt aaaacttgtt cttgttcaa

<210> 25 <211> 20 <212> ADN 29 102 ΡΕ1513923 <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR161 <400> 25 agttggtgta tttaacaagg 20

<210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR142 <400> 26 gtgacaccct gtgcacggcg ggagatg 27

<210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR173 <400> 27 gcgacggctc acaggttttg 20

<210> 28 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador VR170 <400> 28 cttgtcttga cgtaatacac gtgcagc 27

<210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador oCA85 <400> 29 ggaccgatgg ctgtgtagaa 20

<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> 20 20 103 ΡΕ1513923 <223> Iniciador 0CA8O <400> 30 tcgcttacct cggtacagaa

<210> 31 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 5'-Flanco 5' <4 00> 31 caagaaggta cccctctcta aacttgaaca 30

<210> 32 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 5'-Flanco 3' <400> 32 32 gtaattcctg caggtgcaat tatttggttt gg

<210> 33 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 3'-Flanco 5' <400> 33 ccaagccctg caggagaggg agaggataaa ga 32

<210> 34 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador 3'-Flanco 3' <400> 34 ctcgtaacgc gtgtacaagt tgtggaacaa

<210> 35 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Lh-D-LDH 5' <400> 35 30 104 ΡΕ1513923 32 tttttacctg caggctagat ttatgacaaa gg

<210> 36 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Lh-D-LDH 3' <400> 36 tctacccctg caggaaaact tgttcttgtt ca 32

<210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador Cromossoma PDC1 5' <400> 37 21 aagcaccaag gccttcaaca g

<210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador D-LDH 3' <400> 38 cttgtcttga cgtaatacac gtgcagc 27

<210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador PDC1 5' <400> 39 21 cgcaaagaaa agctccacac c

<210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial; <220> <223> Iniciador PDC1 3' <400> 40 cccatacgct tataatcccc c 21 <210> 41 105 ΡΕ1513923

<211> 1235 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <4 00> 41 ggccgcgpt cgcttttccg ctâtcgatta attttttttt ctttcctctt tttattaacc 60 ttaattttta ttmgattc etgacttçaa ct«aagacgç «cagatatts taacatctgc 120 acaatagfca tttgtaagaa ttactcgtga gtââggaaag agtgaggaac tátcgcatac l#0 ctgcatttaa agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt ttggcttcac cctcatacta 240 ttatcagggc cagaaaaagg aagtçtíttc çtcçttçttg aattptgtt aecctcataa 100 agcugtggc txtítatcga gaaagaaatt acegtçgttc gtgatttgtx tgcaaaaaga 360 âCâaaactip saaããccéag acacgctcga cttectgtct tcttattgax tgçagcTtct; 420 aatttcgtta taoacãagg xcctagcgae ggcttacagg tmgtaaca agcaatcgaa 460 ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagtâ ccaeatgtta tgatgctcac tgtgatetçc 540 agagcaaagt ttgttcgatc gtactgttac tctctctttt rcaaacagaa ttgtetgaat 600 cgtgtgacaa taatagttxg rtctocats etcttttcti craaccaagg gggtggtttã €60 gtttagtaga acctcgtgaa aettacattt acatatatat aaacttgcat aaattggtta 720 áttxaagaaa taesxsrag gtcttttcta attcgtagtt ntcaagttc ttágatgctt 780 tctttttçtc ttttttacag atcstcaagg aagtaattat ctacttttta eaacaaaxct 840 âgaattcgga tccggtagat acattgatgt tatcaateaa gsgaattgp aagattgtgt 900 sacçttgaaa aacggtgaaa cítacgggtc; esàgaccttc tacagattti cctgatttgc 960 cagettaeta tcmcttga aaaxatgeae ççtatatm ttagttctta attpaacac 102Θ atagatttgc tgtataacga attttatgct atrctttaaa tttggsgtíc agtg&tasââ 1080 gtgtcac^gç ga*m««tc acatgtagga çegaattgtt tacaagttet ctgtaceacc 1140 axggagscst eaaapttgs aaatcmgg aaagatatgg atggtagcaa çaagaatata 1200 gcacgagccg cggatttatt tcgttaceca tgcgt 1235

<210> 42 <211> 1314 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae; <400> 42 106 ΡΕ1513923 ggtcgeogat egttcttccg ctatcg&taa caâgctcatg caaagaggtg gtacecgtac 60 gccgaaatgc atgcaagtsa cctatttaaa gtaatatctc atacatgttt. tatgafggta 120 acaacatgeg ãctgggtgae catatgttec gctiâtgtga tgtgcasgat aaacaagcaa 180 ggcagaaaçt «âcttcttct t<«gtaat.a aaçacaçcçc gcgtttattt acctatctct 240 aaacttcasc acettatatf. ataactaata tttettgaga tasfeacact gcaccçstac 300 cttccttaaa aacgta|ctt ccàgtmtf gtggttccgg mcmccc gatttcgecc 360 gctaaaicgça tatttttgtt gcctfgtggc atttgcaaaâ tgcataacct atgcatttââ 420 aagattatgt atgctcttct gacttttegt gtgatgâggc tcgtggaaaâ 480 ttatg&attt gagaacaatt ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcsatcaa S40 ttgaggattt tatgcaaata tcgtttgaat atttitcqp ccctttgagt actmmc 600 ata.att.gcat áatáttgtçc gctgcccctt «tctgttao atgftgtttt gatctacttg 660 «tategittca açaccatctt attttçtaac tatctttttt ttafctcâtt tpateagct 720 tatggtgatg geacattttt geatáaaeei agctftcctc gttgaacata ggaaaaaaaã 780 «atat*s*ç aaggctcttt cactCtcctt gcastcagat ttgggtttgt tcomtatt 840 tttatatttc ttgtcatatt ectttcteaa ttattatttt ctacttataa cctcacgcaa 900 aatascacag tcaaatctag a&ttcgg&tc cggtagataç âttgat§cta tcaatecaga 960 gaaçtggaaa gattgtgtagi ccttgaaaaa eggtgaaact tacgggtcca agattgtcta 1020 câQsttttcc tgmtgct» gcttactatc cttcttgaaa atatgcactc tatatctttt 1080 agtumat tgcaaçacat agamgctg tataatgaat tmtgmt tttttaaatt u.40 tggagttcag tgstaaaagt gtcacagcga atttcctcac atgugggac cgaaítgttt: 1200 acaagttctc tgtaccacca tggagacsfct aaaaattgas aatctatgga aagatatgga 1160 ç:ggtag«aç .aagaatatag çacgagccçc gptttattt egmcgcat gcgc 1314

<210> 43 <211> 1014 <212> ADN <213> Lactobacillus helveticus; <400> 43 107 ΡΕ1513923 atgacãaãgg mttgctta cgctattcga aaagacgaag aaccattctt gaatgãatgg 60 aaggaagctí acaaggatat ogatgttgat tacattgata aactmgse tcetgaaact .120 gctságctai cíaagggtgc tgaçíjgtgtt gttgtttacc aacaattagá ctacactgca ISO gatactcttc aagctmgc agacgctggc gta&ctaaga tgtcattacg tMcgttggl; 240 fEtfaoaca ttgatatgfa oaggctaaf gaattaggtt tccaaattaf: caatgmct ϊΰϋ gtttactcao maegetat tgctgaacât gçtgctftttc aggctgeacg tgtattacgt 360 €èagac«ag« gçatggaçgâ aàâgâtgget aaa<$t$â£t táCgtt©§gc accsactatc 420 ggccgtgaag mgr.gacca agngtcggt gttgttggta etggt«aeat tggtcaagta 480 tttatsciU ttatggaagg tttcggtgea aaggttattg cttaegatat cttcaagaae 540 ccagaattte aaaaçsfcgeg ttactaçgtt gactcscttg acgacttçta ca.a§caa§et 600 gatgmm eaetteacgt accagatgtt tcagctaacg ttcacatgâí caa<gacaag 600 txaategctg ãaatgaasfa cggcgttgta atrgtaaact getcacgtgg ttgacttgtt 220 gaçactgacg ctgíaatçcg tggtttggac teaggcaaga çcttcggett egttatggat 780 acttacgaag atgaagttgg tgtatttaat aaggattggg aaggtaaaga aucctagat 840 aagcgtttgg cagacttaat tgâtegtcca a&cgtattgg taactccaca caccgccttc 900 tacactactc acgctgtacg taacatggtt gttaaggcat tcaaeaacaa cttgasgtta 960 âttascggcg aaaagccaga ttetccagtt getttgaata agaacaagtt ttaa 1014

Lisboa, 12 de Outubro de 2007

Claims (27)

1. ΡΕ1513923 1 REIVINDICAÇÕES 1. Célula de levedura recombinante de uma espécie que naturalmente não acumula piruvato, compreendendo pelo menos um gene da D-lactato-desidrogenase exógeno integrado no seu genoma, em que o gene da D-lactato-desidrogenase está operativamente ligado a sequências promotoras e terminadoras funcionais.
2. 2. Célula de levedura recombinante da reivindicação 1, que é do género Candida ou Kluyveromyces.
3. 3. Célula de levedura recombinante da reivindicação 2, em que a célula é da espécie C. sonorensis ou K. marxianus.
4. 4. Célula de levedura recombinante da reivindicação 1, em que a sequência promotora é pelo menos 90% homóloga a um promotor que é nativo da espécie de levedura.
5. 5. Célula de levedura recombinante da reivindicação 4, em que a sequência terminadora é pelo menos 90% homóloga a um terminador que é nativo da espécie de levedura.
6. 6. Célula de levedura recombinante da reivindicação 4, em que a espécie de levedura contém um gene de PDC nativo possuindo um promotor de PDC nativo e a sequência 2 ΡΕ1513923 promotora é pelo menos 90% homóloga à do promotor de PDC nativo.
7. 7. Célula de levedura recombinante da reivindicação 6, em que o gene de PDC nativo possui um terminador de PDC nativo e a sequência terminadora é pelo menos 90% homóloga à do terminador de PDC nativo.
8. 8. Célula de levedura recombinante da reivindicação 7, em que o gene de PDC nativo está suprimido.
9. 9. Célula de levedura recombinante da reivindicação 1, em que a espécie de levedura contém um gene de PDC nativo e o gene de PDC nativo está suprimido.
10. 10. Célula de levedura recombinante da reivindicação 1, em que a sequência nucleotidica codifica uma proteína D-lactato-desidrogenase de Lactobacillus helve-ticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum e Lactobacillus pentosus.
11. 11. Célula de levedura recombinante da reivindicação 10, em que o promotor é de uma espécie de levedura do género Kluyveromyces ou Saccharomyces.
12. 12. Célula de levedura recombinante da reivindicação 11, em que o promotor é de Kluyveromyces marxianus. 3 ΡΕ1513923
13. 13. Célula de levedura recombinante da reivindicação 11, em que o promotor é de Saccharomyces cerevisiae.
14. 14. Célula de levedura recombinante da reivindicação 1 que exibe actividade de PDC reduzida.
15. 15. Célula de levedura recombinante da reivindicação 8 em que o gene de D-LDH está integrado no locus do gene de PDC suprimido.
16. 16. Método para fermentação de um hidrato de carbono em ácido láctico compreendendo a cultura da célula da reivindicação 1 sob condições de fermentação num meio contendo um hidrato de carbono que é fermentável pela célula.
17. 17. Método para fermentação de um hidrato de carbono em ácido láctico compreendendo a cultura da célula da reivindicação 8 sob condições de fermentação num meio contendo um hidrato de carbono que é fermentável pela célula.
18. 18. Método para fermentação de um hidrato de carbono em ácido láctico compreendendo a cultura da célula da reivindicação 9 sob condições de fermentação num meio contendo um hidrato de carbono que é fermentável pela célula.
19. 19. Método para fermentação de um hidrato de 4 ΡΕ1513923 carbono em ácido láctico compreendendo a cultura da célula da reivindicação 14 sob condições de fermentação num meio contendo um hidrato de carbono que é fermentável pela célula.
20. 20. Método de acordo com as reivindicações 16, 17, 18 ou 19, compreendendo ainda o passo de conversão de pelo menos uma porção do ácido láctico em láctido.
21. 21. Método da reivindicação 20, compreendendo ainda o passo de polimerização do láctido para formar um polímero ou copolímero de poliláctido.
22. 22. Método para produção de ácido láctico compreendendo a cultura da célula da reivindicação 1 sob condições de fermentação num meio contendo um açúcar que é fermentável pela célula.
23. 23. Método para produção de ácido láctico compreendendo a cultura da célula da reivindicação 8 sob condições de fermentação num meio contendo um açúcar que é fermentável pela célula.
24. 24. Método para produção de ácido láctico compreendendo a cultura da célula da reivindicação 9 sob condições de fermentação num meio contendo um açúcar que é fermentável pela célula.
25. 25. Método para produção de ácido láctico 5 ΡΕ1513923 compreendendo a cultura da célula da reivindicação 14 sob condições de fermentação num meio contendo um açúcar que é fermentável pela célula.
26. 26. Método de acordo com as reivindicações 22, 23, 24 ou 25 compreendendo ainda o passo de conversão de pelo menos uma porção do ácido láctico em láctido.
27. 27. Método de acordo com a reivindicação 26, compreendendo ainda o passo de polimerização do láctido para formar um polímero ou copolímero de poliláctido. Lisboa, 12 de Outubro de 2007