KR20120027354A

KR20120027354A - Ｄ-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 ｄ-락트산의 제조 방법

Info

Publication number: KR20120027354A
Application number: KR1020117030018A
Authority: KR
Inventors: 켄지 사와이; 카즈미 스다; 히데키 사와이; 카츠시게 야마다; 준야 야마기시
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2012-03-21
Also published as: AU2010255000A1; US8822195B2; EP2439271A1; RU2553563C2; ES2436567T3; RU2011152925A; CN102459590A; EP2439271A4; JP5803106B2; CN102459590B; JPWO2010140602A1; MY159074A; BRPI1008141A2; EP2439271B1; SG176263A1; WO2010140602A1; CA2764448A1; US20120070871A1

Abstract

종래보다 높은 D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 하기 (A)?(C) 중 어느 하나의 폴리펩티드를 발현시키도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입해서 얻어지는 형질 전환체에 의해 생산성이 높은 D-락트산 발효를 실현한다.
(A) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(B) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 몇개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드
(C) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열과의 서열동일성이 적어도 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드

Description

Ｄ-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Ｄ-락트산의 제조 방법{POLYPEPTIDE HAVING D-LACTATE DEHYDROGENASE ACTIVITY, POLYNUCLEOTIDE ENCODING THE POLYPEPTIDE, AND PROCESS FOR PRODUCTION OF D-LACTIC ACID}

본 발명은 D-락트산을 제조하기 위한 새로운 D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형질 전환체에 관한 것이고, 상기 형질 전환체를 배양하는 것을 더 포함하는 D-락트산의 제조 방법에 관한 것이다.

재생 가능 자원인 바이오매스를 원료로 하는 폴리락트산(PLA)은 카본 뉴트럴(Carbon Neutral)의 사고방식으로부터 강하게 주목을 받고 있다. PLA는 비교적 비용이 저렴하고, 융점도 약 170℃로 내열성을 갖고, 용융 성형 가능한 생분해성 폴리머로서 기대되고 있다. 또한, 폴리-L-락트산과 폴리-D-락트산을 혼합함으로써 폴리락트산 스테레오컴플렉스가 얻어지는 것이 알려져 있다(특허문헌 1?3). 폴리락트산 스테레오컴플렉스는 단독의 폴리머보다 고융점 및 고결정성을 나타내고, 섬유나 필름, 수지 성형품으로서 유용한 성형품을 부여하는 것이 알려져 있고, 그 원료인 L-락트산, D-락트산과 함께 고순도이며 동시에 고효율인 제조법이 요구되고 있다.

자연계에는 유산균 등의 락트산을 효율 좋게 생산하는 세균이 존재하고, 그들을 사용한 락트산 제조법 중에는 이미 실용화되어 있는 것도 있다. 예를 들면, L-락트산을 효율 좋게 생산하는 세균으로서 락토바실러스?델브릭키이(Lactobacillus delbrueckii) 등이 있다. 또한, D-락트산을 효율 좋게 생산하는 세균으로서 스포로락토바실러스?라에볼락티쿠스(Sporolactobacillus laevolacticus)의 미생물 등이 알려져 있다(특허문헌 4). 어떠한 경우도 혐기 배양에 의해 락트산의 축적량은 높은 레벨에 도달하고 있지만 L-락트산 발효의 경우에는 D-락트산이, D-락트산 발효의 경우에는 L-락트산이 부산물로서 생성되어 광학 순도의 저하를 초래한다. 그리고 이들을 분리하는 것은 매우 곤란하다.

그래서 고광학 순도인 락트산의 제조 방법으로서 본래 락트산 생산능을 갖지 않는 효모에 L-락트산 또는 D-락트산 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 도입하고, 상기 효모를 사용한 L-락트산 및 D-락트산 발효가 검토되고 있다(특허문헌 4?6, 비특허문헌 1). 유전자 재조합 효모에 의한 L-락트산 발효에 관해서는 고활성인 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis)로부터 유래된 L-락트산 탈수소효소를 코딩하는 유전자를 도입함으로써 고효율이며 또한 고광학 순도인 락트산 발효가 가능해지고 있다(특허문헌 4). 한편, 유전자 재조합 효모에 의한 D-락트산 발효에 관해서는 L-락트산 발효와 마찬가지로 높은 광학 순도의 D-락트산이 얻어지지만 D-락트산 수율에 과제가 있었다(특허문헌 5 및 6, 비특허문헌 1).

일본 특허 공개 소 61-36321호 공보 일본 특허 공개 소 63-241024호 공보 일본 특허 공개 평 2000-17163호 공보 WO 2007/043253 일본 특허 공개 2007-074939호 공보 WO 2004/104202

이시다 외, 저널 오브 바이오사이언스 바이오엔지니어링(2006), 101, 172-7(Ishida N, Journal biosci bioeng(2006),101,172-7)

본 발명은 종래보다 높은 D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 생산성이 높은 D-락트산 발효를 실현하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 여러 가지 D-락트산 탈수소효소에 대해서 예의 검토한 결과 D-락트산의 산생량을 증대시키고, 동시에 부산물의 생성이 적은 D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발견하여 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 이하의 형태로 이루어진다.

(1) 하기 (A)?(C) 중 어느 하나의 폴리펩티드.

(A) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드

(B) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 몇개의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드

(C) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열과의 서열동일성이 적어도 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드.

(2) 하기 (a)?(e) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.

(a) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드

(b) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열에 있어서 1개 또는 몇개의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

(c) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건에서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드로서, D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

(d) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열과의 서열동일성이 적어도 80% 이상인 염기서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

(e) (1)에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

(3) (2)에 기재된 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터를 연결시킨 DNA 구축물.

(4) (3)에 있어서, 상기 프로모터가 피루브산 탈탄산효소1 유전자(PDC1 유전자), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1 유전자) 또는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소3 유전자(TDH3 유전자)의 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA 구축물.

(5) (3) 또는 (4)에 있어서, 상기 프로모터가 하기 (Ⅰ)?(Ⅲ) 중 어느 하나로부터 선택되는 DNA 구축물.

(Ⅰ) 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어지는 프로모터

(Ⅱ) 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그 일부를 포함하는 염기서열과 엄격한 조건으로 하이브리다이징하는 염기서열로 이루어지는 프로모터

(Ⅲ) 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열에 있어서 1개 또는 몇개의 염기가 결실, 치환 및/또는 부가된 염기서열로 이루어지는 프로모터.

(6) (2)에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 (3)?(5) 중 어느 하나에 기재된 DNA 구축물이 도입되어 있는 형질 전환체.

(7) (2)에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 (3)?(5) 중 어느 하나에 기재된 DNA 구축물이 도입되어 있는 형질 전환 효모.

(8) (7)에 있어서, 상기 형질 전환 효모는 그 피루브산 탈탄산효소1 유전자(PDC1 유전자), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1 유전자) 및 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소3 유전자(TDH3 유전자) 중 적어도 1종류의 유전자가 (2)에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 (3)?(5) 중 어느 하나에 기재된 DNA 구축물로 치환되어 있는 형질 전환 효모.

(9) (8)에 있어서, 상기 유전자 중 적어도 1종류는 PDC1 유전자인 형질 전환 효모.

(10) (6)에 기재된 형질 전환체 또는 (7)?(9) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환 효모를 배양하는 공정을 포함하는 D-락트산의 제조 방법.

(11) 투구게과(Limulidae)로부터 유래된 D-락트산 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터가 연결된 DNA 구축물이 도입되어 있는 형질 전환체.

(12) 미국 투구게속(Limulus)으로부터 유래된 D-락트산 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터가 연결된 DNA 구축물이 도입되어 있는 형질 전환 효모.

(13) (12)에 있어서, 상기 형질 전환 효모는 그 피루브산 탈탄산효소1 유전자(PDC1 유전자), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1 유전자) 및 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소3 유전자(TDH3 유전자) 중 적어도 1개의 유전자가 상기 투구게과로부터 유래된 D-락트산 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터가 연결된 DNA 구축물에 치환되어 있는 형질 전환 효모.

(14) (11)에 기재된 형질 전환체 또는 (12) 또는 (13)에 기재된 형질 전환 효모를 배양하는 공정을 포함하는 D-락트산의 제조 방법.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면 D-락트산 발효 생산에 적합한 D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 D-락트산을 고생산 가능한 형질 전환체를 용이하게 얻을 수 있고, 나아가서는 상기 형질 전환체를 배양함으로써 D-락트산을 효율 좋고 고순도로 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 효모 SU042주 중 1개의 제작 순서를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 효모 SU042주의 막이용 연속 배양 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다.

D-락트산 탈수소효소(이하, D-LDH라고도 한다) 활성이란 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH)와 피루브산을 D-락트산과 산화형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NAD+)로 변환하는 활성이다.

본 발명은 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드 또는 그 호몰로그(Homologue)를 포함하고 있고, 상기 폴리펩티드는 D-LDH 활성을 갖고 있는 것을 특징으로 하고 있다.

서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 투구게과(Lomulidae) 미국 투구게속(Limulus)에 속하는 미국 투구게(Limulus polyphemus)로부터 유래된 폴리펩티드이다.

서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 호몰로그로서는 예를 들면 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 몇개, 바람직하게는 1?10개, 보다 바람직하게는 1?5개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이며, 또한 D-LDH 활성을 갖고 있는 폴리펩티드를 들 수 있다.

또한, 서열 번호 3 또는 4에 기재된 폴리펩티드의 호몰로그는 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노 서열과의 서열동일성이 적어도 80% 이상, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상인 아미노산 서열을 갖고, 또한 D-LDH 활성을 갖고 있는 폴리펩티드이어도 좋다. 또한, 아미노산 서열의 서열동일성은 이 분야에서 범용되고 있는 소프트웨어인 BLAST를 사용해서 용이하게 조사할 수 있다. BLAST는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 홈페이지에서 누구나 이용 가능하며, 디폴트의 파라메타를 사용해서 용이하게 동일성을 조사할 수 있다.

또한, 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 호몰로그는 투구게과에 속하는 생물로부터 유래, 바람직하게는 미국 투구게속 또는 투구게속에 속하는 생물로부터 유래, 보다 바람직하게는 미국 투구게속의 미국 투구게 또는 투구게속의 투구게(Tachypleus tridentatus), 타키플류스 기가스(Tachypleus gigas) 또는 타키플류스 로툰디카우다(Tachypleus rotundicauda)로부터 유래된 폴리펩티드이며, D-LDH 활성을 갖는 것이어도 좋다.

서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 미국 투구게로부터 공지의 방법에 의해 추출, 또는 펩티드 합성법으로서 알려지는 공지의 방법을 사용해서 조제할 수 있고, 또한 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용해서 유전자 재조합 기술에 의해 조제할 수도 있다. 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 투구게속에 속하는 생물로부터 공지의 방법에 의해 추출 또는 펩티드 합성법으로서 알려지는 공지의 방법을 사용해서 조정할 수 있고, 또한 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용해서 유전자 재조합 기술에 의해 조정할 수도 있다.

서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 호몰로그는 서열 번호 1 또는 2에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드보다 D-LDH 활성이 향상되어 있어도 좋고, 열안정성이 향상되어 있어도 좋다. 여기서 「D-LDH 활성이 향상한다」란 기질인 피루브산이나 NADH에 대한 기질 친화성이나 분자활성(Kcat)이 향상되는 것이나 또한 상기 폴리펩티드의 효소 활성의 최적 pH가 상기 폴리펩티드를 발현시키는 세포의 생육에 적합한 pH에 의해 근접하게 시프트하는 것을 의미한다. 그러한 폴리펩티드는 서열 번호 1 또는 2에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 기에 인공적으로 디자인해도 좋고, 천연으로부터 분리해도 좋다. 또한, 분자 진화 공학적 방법에 의해 D-락트산 탈수소효소 유전자에 대하여 랜덤하게 이변을 도입하고, 거기에서 바람직한 폴리펩티드를 스크리닝해도 좋다.

본 발명은 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 그 호몰로그를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 D-LDH 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 코딩하고 있는 것을 특징으로 한다. 여기서 「폴리뉴클레오티드」는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, mRNA, 합성 RNA, 레플리콘 RNA 등 그 유래에 상관없이 바람직하게는 DNA 또는 RNA이며, 보다 바람직하게는 DNA이다. 또한, 1개쇄 에서도 그 상보쇄를 갖는 2개 쇄이어도 좋다. 또한, 천연의 또는 인공의 뉴클레오티드 유도체를 포함하고 있어도 좋다.

서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드는 미국 투구게로부터 유래된 폴리뉴클레오티드이며, 상기 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하고 있다.

서열 번호 3 또는 4에 기재된 폴리뉴클레오티드의 호몰로그로서는 예를 들면 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열에 있어서 1개 또는 몇개, 바람직하게는 1?40개, 보다 바람직하게는 1?30개, 더욱 바람직하게는 1?20개, 특히 바람직하게는 1?10개, 가장 바람직하게는 1?5개의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되어 있는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드이며, 동시에 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 것을 들 수 있다.

또한, 서열 번호 3 또는 4에 기재된 폴리뉴클레오티드의 호몰로그로서는 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드로서, 동시에 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 있는 것을 들 수 있다. 여기서 「엄격한 조건으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드」란 예를 들면 본래의 염기서열 중 임의의 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 적어도 30개의 연속된 서열을 1개 또는 복수개 선택한 폴리뉴클레오티드를 프로브로 하고 공지의 하이브리다이제이션 기술(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al.,(1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4) 등을 사용해서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드이다. 여기서 엄격한 조건으로서는 예를 들면 50% 포름아미드 존재 하에서 하이브리다이제이션 온도가 77℃, 보다 엄격한 조건으로서는 42℃, 더욱 엄격한 조건으로서는 65℃이며, 0.1?2배 농도의 SSC(saline-sodium citrate) 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성:150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산 나트륨)을 사용해서 세정함으로써 달성할 수 있다.

또한, 서열 번호 3 또는 4에 기재된 폴리뉴클레오티드의 호몰로그는 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열에 대하여 적어도 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열동일성을 갖는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로서, 동시에 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이어도 좋다. 여기서 말하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열의 서열동일성은 상술한 유전자 해석 프로그램 BLAST 등에 의해 결정할 수 있다.

또한, 서열 번호 3 또는 4에 기재된 폴리뉴클레오티드의 호몰로그는 투구게과에 속하는 생물로부터 유래, 바람직하게는 미국 투구게속 또는 투구게속에 속하는 생물로부터 유래, 보다 바람직하게는 미국 투구게, 투구게, 타키플류스 기가스 또는 타키플류스 로툰디카우다로부터 유래된 폴리뉴클레오티드로서, D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이어도 좋다.

상기 폴리뉴클레오티드는 투구게과, 바람직하게는 투구게과 미국 투구게속에 속하는 생물(이하, 이들을 총칭해서 투구게라고도 한다)로부터 클로닝함으로써 조정할 수 있지만 화학적으로 합성 또는 길이쇄 DNA의 합성 방법으로서 알려져 있는 후지모토들의 방법(후지모토 히데야, 합성 유전자의 제작법, 식물 세포 공학 시리즈 7 식물의 PCR 실험 프로토콜, 1997, 슈쥰사, p95-100)을 채용해서 합성할 수도 있다. 투구게로부터의 클로닝은 통상 공지의 방법을 사용해서 단리할 수 있고, 이러한 방법으로서는 예를 들면 투구게 혈구로부터 단리된 polyA(＋) RNA로부터 제작한 cDNA로부터 D-락트산 탈수소효소에 있어서 높게 보존되어 있는 서열을 기초로 합성한 프라이머를 사용해서 부분 단편의 증폭?서열 결정을 행하고, 그 후 5'RACE 및 3'RACE법에 의해 전체 ORF 서열을 결정하고, 그 후 PCR에 의해 증폭함으로써 얻어진다. 또한, D-락트산 탈수소효소의 기능 상보에 의해서도 행할 수 있다. 그 원리의 상세한 것은 (DOMINIQUE, G., Appl Environ Microbiol, United States (1995) 61 266-272)에 기재되어 있다. 이렇게 해서 일단 결정된 염기서열을 갖는 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이것을 다시 투구게 혈구로부터 얻는 것도 가능하지만 이것을 직접 DNA 합성 장치에 의해 화학 합성하는 것도 가능하다.

또한, 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열 또는 염기서열에 부위 특이적 변위 도입법(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel etal.,(1987) Publish . John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5) 등을 사용해서 적당히 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가 이변을 도입함으로써 적당히 개변(改變)할 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드의 염기서열의 개변은 인공적으로 이변을 도입하거나 또는 합성한 것에 한정되지 않고, 인공적인 이변 처리에 의거해서 또는 이것에 한정되지 않고 자연계에 있어서의 아미노산의 이변에 의해 생긴 것도 포함된다.

상기 폴리뉴클레오티드는 유전자 재조합에 의한 D-락트산 산생 세포의 제작에 사용할 수 있다. 유전자 재조합에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주 세포(이하, 형질 전환체라고도 한다)가 D-락트산을 산생시키도록 하기 위해서는 형질 전환체 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현시킬 필요가 있지만 그때 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현시키는 방법의 하나로서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터를 연결시킨, 즉 상기 프로모터의 3'말단측에 상기 폴리뉴클레오티드를 연결시킨 DNA 구축물을 이용하는 것이 유용하며, 상기 DNA 구축물에 대해서도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 DNA 구축물은 본 발명의 폴리뉴클레오티드(DNA)와, 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터를 각각 적절한 제한 효소로 절단하고, 후술의 벡터 DNA의 제한 효소 부위 또는 멀티클로닝 사이트(multicloning site)에 삽입해서 연결하는 방법이나 본 발명의 폴리뉴클레오티드(DNA)와 상기 프로모터를 PCR에 의해 연결함으로써 제작할 수 있다.

상기 DNA 구축물의 바람직한 형태로서는 상기 DNA 구축물을 플러스미드(DNA), 박테리오파지(DNA), 레트로트랜스포존(DNA), 인공 염색체(YAC, PAC, BAC, MAC 등) 등의 벡터에 유지시킨다. 상기 DNA 구축물의 도입 형태(숙주 게놈 내 또는 숙주 게놈 외)나 숙주 세포의 종류에 따라 상기 분야에 있어서 공지의 원핵 세포성 벡터, 진핵 세포성 벡터, 동물 세포성 벡터 또는 식물 세포성 벡터가 적당히 선택된다.

또한, 플러스미드로서는 예를 들면 pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 또는 pAUR123 등의 YCp형 대장균-효모 셔틀 벡터, pYES32 또는 YEp13 등의 YEp형 대장균-효모 셔틀 벡터, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pAUR101 또는 pAUR135 등의 YIp형 대장균-효모 셔틀 벡터, 대장균으로부터 유래된 플러스미드(pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG396 또는 pTrc99A 등의 ColE계 플러스미드, pACYC177 또는 pACYC184 등의 p1A 계 플러스미드, pMW118, pMW119, pMW218 또는 pMW219 등의 pSC101계 플러스미드 등), 고초균으로부터 유래된 플러스미드(예를 들면, pUB110, pTP5 등) 등을 들 수 있다. 박테리오파지로서는 λ파지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt100, gt11, zap), φX174, M13mp 18 또는 M13mp 19 등을 들 수 있다. 레트로트랜스포존으로서는 Ty 인자 등을 들 수 있다. YAC로서는 pYACC2 등을 들 수 있다.

상기 DNA 구축물에 있어서의 「프로모터」란 유전자로부터의 mRNA의 전사 개시에 관여하는 염기서열을 의미하고, 통상 염색체 중에 존재하는 유전자의 5말단측의 상류 서열을 나타낸다. 프로모터의 염기서열 길이로서는 바람직하게는 1?3000bp, 보다 바람직하게는 1?1000bp이지만 하류에 존재하는 유전자의 mRNA의 전사를 개시할 수 있는 염기서열이면 특별히 제한은 없다. 또한, 프로모터의 전사 활성을 향상시키는 이변이나 조작은 공지이며, 「프로모터」에는 공지의 방법에 의해 개변된 것도 포함된다. 상기 DNA 구축물에 있어서의 프로모터는 상기 DNA 구축물이 도입된 형질 전환체 내에서 프로모터 활성을 갖는 것이면 특별히 제한은 없지만 후술하는 바와 같이 본 발명의 DNA 구축물은 효모에 도입되는 것이 바람직하기 때문에 효모에 있어서 기능하는 프로모터인 것이 바람직하다.

효모에 있어서 기능하는 프로모터의 바람직한 예로서는 산성 포스파타아제 유전자(PHO5), 글리세르알데히드-3-인산 데히드로게나아제 유전자(TDH1,2,3), 알코올데히드로게나아제 유전자(ADH1,2,3,4,5,6,7) 유전자, 갈락토오스 대사계 유전자(GAL1,7,10), 시토크롬c 유전자(CYC1), 트리오스인산 이소메라아제 유전자(TPI1), 포스포글리세린산 키나아제 유전자(PGK1), 포스포프룩토오스키나아제 유전자(PFK1), 피루브산 디카르복실라아제 유전자(PDC1 ,5,6)의 프로모터를 들 수 있고, 국제 출원 PCT/JP2008/072129에 기재?이용되어 있는 효모 배양 개시 후 50시간 이후에 있어서의 유전자 발현량이 전체 유전자의 평균 상대 발현량의 5배 이상인 프로모터인 에놀라아제1 유전자(ENO1), 세포벽 관련 단백질2 유전자(CWP2), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1)의 프로모터를 들 수 있다.

효모에 있어서 기능하는 프로모터의 보다 바람직한 예로서는 효모의 에탄올 발효 경로에 있어서 고발현되어 있는 PDC1 프로모터 또는 TDH3 프로모터 또는 장기간의 효모 배양 시에 고발현되어 있는 SED1 프로모터를 들 수 있고, 보다 구체적으로는 서열 번호 5에 기재되는 PDC1 프로모터, 서열 번호 6에 기재되는 SED1 프로모터 또는 서열 번호 7에 기재되는 TDH3 프로모터를 들 수 있다.

또한, PDC1 프로모터, SED1 프로모터 또는 TDH3 프로모터는 그 프로모터 활성을 갖는 범위에 있어서는 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열에 있어서 1개 또는 몇 개, 바람직하게는 1?40개, 보다 바람직하게는 1?30개, 더욱 바람직하게는 1?20개, 특히 바람직하게는 1?10개, 가장 바람직하게는 1?5개의 염기서열이 결실, 치환 및/또는 부가된 염기서열이어도 좋다.

또한, PDC1 프로모터, TDH3 프로모터 또는 SED1 프로모터는 그 프로모터 활성을 갖는 범위에 있어서는 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그 일부를 포함하는 염기서열과 엄격한 조건으로 하이브리다이징하는 염기서열이어도 좋다. 여기서 「엄격한 조건으로 하이브리다이징한다」란 예를 들면 본래의 염기서열의 임의의 적어도 20개, 바람직하게는 25개, 보다 바람직하게는 적어도 30개의 연속된 서열을 1개 또는 복수개 선택한 폴리뉴클레오티드를 프로브로서 당업자의 주지의 하이브리다이제이션 기술(Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al.,(1987) Publish . John Wily & SonsSectoin 6.3-6.4) 등을 사용해서 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드이다. 여기서 엄격한 조건으로서는 예를 들면 50% 포름아미드 존재 하에서 하이브리다이제이션 온도가 77℃, 보다 엄격한 조건으로서는 42℃, 더욱 엄격한 조건으로서는 65℃이며, 0.1?2배 농도의 SSC(saline-sodium citrate) 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성:150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산 나트륨)을 사용해서 세정함으로써 달성할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 구축물을 숙주 세포에 도입해서 얻어지는 형질 전환체에 대해서도 본 발명에 포함된다. 숙주 세포로서는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 구축물을 안정적으로 유지하는 세포이면 특별히 제한은 없고, 대장균, 고초균, 유산균 등의 세균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 또는 식물 세포를 들 수 있지만 효모는 내산성이며, D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현시킴으로써 D-락트산을 고산생한 경우이어도 생육할 수 있기 때문에 바람직하게 사용된다.

효모로서는 사카로미세스속(Saccharomyces), 시조사카로미세스속(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스속(Kluyveromyces), 칸디다속(Candida), 피치아속(Pichia), 한세눌라속(Hansenura), 야로이야속(Yarrowia), 자이고사카로마이세스속(Zygosaccharomyces), 토룰롭시스속(Torulopsis), 데바리오미세스속(Debaryomyces), 이싸첸키아속(Issachenkia), 펠로마이세스속(Fellomyces)에 속하는 효모를 들 수 있지만 바람직하게는 사카로미세스속, 칸디다속 또는 클루이베로마이세스속에 속하는 효모이며, 보다 바람직하게는 사카로미세스?세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 또는 칸디다?유틸리스(Candida utilis), 칸디다?글라브라타(Candida glabrata), 칸디다?알비칸스(Candida albicans), 칸디다?보이디니(Candida boidinii), 칸디다?소노렌시스(Candida sonorensis) 또는 클루이베로마이세스?락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스? 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)이다.

또한, 효모가 고차배수체 효모이면 간편한 조작 조건으로 장시간에 걸쳐 안정되게 D-락트산의 고생산성을 유지하는 것이 가능해지고, D-락트산을 저비용이며 안정적으로 생산할 수 있기 때문에 본 발명에 있어서 바람직하게 사용된다. 여기서 「고차배수체 효모」란 세포 내에 2세트 이상의 염색체를 갖는 효모이다. 고차배수체 효모의 염색체의 세트 수에 관해서는 특별히 제한은 없지만 2세트의 염색체를 가진 2배체 효모가 바람직하다. 고차배수체 효모는 예를 들면 발효 공업에 있어서 자주 사용되는 빵 효모, 청주 효모, 와인 효모나 맥주 효모 등의 효모 등을 들 수 있다. 사용하는 고차배수대 효모는 자연 환경으로부터 단리된 것이어도 좋고, 또한 돌연변이나 유전자 재조합에 의해 일부 성질이 개변된 것이어도 좋다.

또한, 효모가 영양 비요구성이면 종래보다 영양소가 적은 배지, 즉 저비용의 배지가 사용 가능해짐과 아울러 간편한 조작 조건으로 장시간에 걸쳐 안정되게 D-락트산의 고생산성을 유지하는 것이 가능해지고, 락트산을 저비용으로 안정적으로 생산하는 것도 가능해지기 때문에 본 발명에 있어서 바람직하게 사용된다. 여기서 「영양 요구성」이란 야생형 효모가 갖는 영양 합성 유전자에 어떠한 원인에 의해 이변이 발생하여 결과적으로 상기 영양의 합성능을 결손하고 있는 것을 의미한다. 즉, 「영양 비요구성 효모」란 영양 요구성을 나타내는 유전자형을 갖지 않거나 또는 상보되어 있는 효모이다. 영양 요구성 효모의 영양 요구성을 복귀시켜서 영양 비요구성 효모를 작출하는 방법으로서는 유전자 재조합법에 의해 영양합성 유전자를 도입하고, 영양 요구성을 복귀시키는 방법이나 또한 다른 영양 요구성을 갖는 효모끼리를 접합, 자낭(子囊) 형성시켜서 목적으로 하는 영양 요구성을 복귀시키는 과정을 반복하고, 최종적으로 영양 요구성을 모두 복귀시켜 영양 비요구성 효모로 하는 방법 등을 들 수 있다. 또한, 영양 비요구성 효모인지의 여부의 판정 방법으로서는 효모의 최소 배지인 SD 배지에 있어서 생육 가능한지를 가지고 판단 기준으로 할 수 있다.

또한, 효모는 왕성하게 에탄올 발효를 행하는 미생물이며, 그 대사 경로는 해당계 산물인 피루브산을 피루브산 탈탄산효소에 의해 아세트알데히드로 변환하고, 그 아세트알데히드를 알코올 탈수소효소에 의해 에탄올로 변환한다. 따라서, 에탄올 대사 경로의 기점이 되는 피루브산 탈탄산효소 유전자가 파괴된 효모주를 숙주로 하는 것은 본래 에탄올 대사 경로로 대사되어야 할 피루브산이 D-락트산 대사 경로로 사용되기 때문에 바람직하다.

특히 사카로미세스?세레비시아의 경우 피루브산 탈탄산효소를 코딩하는 유전자에는 피루브산 탈탄산효소1(PDC1) 유전자, 피루브산 탈탄산효소5(PDC5) 유전자 및 피루브산 탈탄산효소6(PDC6) 유전자의 3종류가 존재하고, 그 중 PDC1 과 PDC5만이 효모 세포 내에 있어서 피루브산 탈수소효소 활성을 갖는다고 되어 있기 때문에 PDC1 유전자 또는 PDC5 유전자가 파괴된 주를 사용하는 것이 바람직하고, PDC1 유전자가 파괴된 주를 사용하는 것이 보다 바람직하다. 또한, PDC1 유전자가 파괴된 주에 있어서는 일본 특허 공개 2008-048726호 공보에 기재되어 있는 바와 같이 PDC5의 활성이 저하되는 이변을 갖는 이변형 PDC5 유전자를 갖는 주가 바람직하고, 온도 감수성의 이변형 PDC5 유전자를 갖는 주가 보다 바람직하다. 여기서 「온도 감수성의 이변형 PDC5」란 야생형 PDC5에 비해 어떤 배양 온도에서는 동일 정도의 피루브산 탈탄산효소 활성을 나타내지만 배양 온도를 변화시켜서 특정한 배양 온도 이상이 되면 PDC5활성의 소실 또는 저하를 나타내는 성질을 갖는 이변형 PDC5이다. 사카로미세스?세레비시아의 통상의 배양 온도는 28?30℃이며, 온도 감수성을 나타내는 온도가 통상의 배양 온도에 가까울수록 배양 온도를 변화시키기 위해서 필요한 열량이 적어도 되고, 배양에 드는 비용을 저감시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 구체적으로는 온도 감수성 이변형 PDC5는 34℃ 이상에서 온도 감수성을 나타내는 것이 바람직하다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 구축물을 효모에 도입해서 형질 전환 효모 내에서 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현시키는 방법으로서는 상술한 바와 같이 상기 DNA 구축물을 포함하는 벡터를 효모 염색체 외에 도입하는 방법이나 상기 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 구축물을 효모 염색체에 도입하는 방법을 들 수 있지만 모두 채용할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드를 효모 염색체에 도입하는 방법으로서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 효모 염색체와 상동적인 서열인 상동 재조합용 DNA 세그먼트를 구비하는 구축물(이하, 상동 재조합용 DNA 구축물이라고도 한다)을 바람직하게 사용할 수 있다. 상동 재조합용 DNA 세그먼트는 효모 염색체에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하려고 하는 타겟 부위 근방의 DNA 서열과 상동인 DNA 서열이다. 상동 재조합용 DNA 세그먼트는 적어도 1개 구비되고, 바람직하게는 2개 구비되어 있다. 상동 재조합용 DNA 세그먼트가 2개 구비되어 있는 경우 2개의 상동 재조합용 DNA 세그먼트를 염색체 상의 타겟 부위의 상류측과 하류측의 DNA에 상동인 DNA 서열로 하고, 이들의 DNA 세그먼트 사이에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 연결하는 것이 바람직하다.

상동 재조합용 DNA 구축물에 의해 상동 재조합하는 방법에 제한은 없지만 PCR에 의해 상동 재조합용 DNA 구축물을 증폭하고, 상기 PCR 단편을 플러스미드에 삽입해서 효모에 도입하는 방법이나 상기 PCR 단편을 효모에 도입하는 방법을 채용할 수 있다. 또한, 상동 재조합용 DNA 구축물에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하기 위한 터미네이터가 포함되는 것이 바람직하다. 여기서 「터미네이터」란 유전자로부터의 mRNA 전사를 종결시키는 서열을 의미하고, 통상 염색체 중에 존재하는 유전자의 3'말단측의 하류 서열을 나타낸다.

또한, 상동 재조합용 DNA 구축물에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 구축물의 이외에 형질 전환 효모의 선택을 쉽게 하기 위해서 선택 마커가 포함되는 것이 바람직하다. 여기서 말하는 선택 마커로서는 URA3 또는 TRP1 등의 영양 요구성 상보적 유전자 또는 G418 내성 유전자 또는 네오마이신 내성 유전자 등의 약제 내성 유전자를 들 수 있다.

PCR에 의해 상기 폴리뉴클레오티드, 터미네이터 및 선택 마커를 포함하는 상동 재조합용 DNA 구축물을 조정하는 방법은 예를 들면 하기 스텝1?3의 공정에 의해 행할 수 있다.

스텝1: 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 하류에 터미네이터가 연결된 플러스미드를 주형으로 하고, 프라이머1, 2를 세트로 해서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 터미네이터를 포함하는 단편을 PCR로 증폭한다. 프라이머1은 도입 목적 개소의 상류측에 상동적인 서열 40bp 이상을 부가하도록 디자인하고, 프라이머2는 터미네이터보다 하류의 플러스미드로부터 유래된 서열을 바탕으로 디자인한다.

스텝2: 선택 마커를 갖는 플러스미드, 예를 들면 pRS400, pRS424, pRS426 등을 주형으로 하고, 프라이머3, 4를 세트로 해서 선택 마커를 포함하는 단편을 PCR로 증폭한다. 프라이머3은 스텝1의 PCR 단편의 터미네이터보다 하류의 서열과 상동성이 있는 서열이 30bp 이상을 부가하도록 디자인하고, 프라이머4에는 도입 목적 개소의 하류측에 상당하는 서열 40bp 이상을 부가하도록 디자인한다.

스텝3: 스텝 1,2에서 얻어진 PCR 단편을 혼합한 것을 주형으로 하고, 프라이머1, 4를 세트로 해서 PCR을 행함으로써 양 말단에 도입 목적 개소의 상류측 및 하류측에 상당하는 서열이 부가된 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 터미네이터 및 효모 선택 마커를 포함하는 상동 재조합용 DNA 구축물이 얻어진다.

상기 상동 재조합용 DNA 구축물을 효모에 도입하기 위해서는 트렌스펙션, 코트랜스펙션 또는 일렉트로포레이션 등의 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 아세트산 리튬을 사용하는 방법이나 프로토플라스트법 등이 있다.

상동 재조합에 의해 효모 염색체에 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 경우 상기 폴리뉴클레오티드가 효모 염색체 상의 내재성 유전자의 프로모터에 의해 제어 가능해지도록 도입한다. 이 경우 상기 폴리뉴클레오티드의 도입에 의해, 동시에 본래 상기 프로모터에 의해 제어되어야 할 내재성 유전자를 파괴하고, 이 내재성 유전자로 바꿔서 외래의 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시켜도 좋다. 본 방법은 특히 상기 프로모터가 상기한 바와 같이 효모에 있어서 고발현 프로모터인 경우나 효모의 D-락트산 대사 경로를 저해하도록 기능하는 내재성 유전자를 파괴하는 경우에 유용하다.

상기 폴리뉴클레오티드를 효모 염색체에 도입할 때의 타겟이 되는 내재성 유전자로서 산성 포스파타아제 유전자(PHO5), 글리세르알데히드-3-인산 데히드로게나아제 유전자(TDH1,2,3), 알코올데히드로게나아제 유전자(ADH1,2,3,4,5,6,7), 갈락토오스 대사계 유전자(GAL1,7,10), 시토크롬c 유전자(CYC1), 트리오스인산 이소메라아제 유전자(TPI1), 포스포글리세린산 키나아제 유전자(PGK1), 포스포프룩토오스키나아제 유전자(PFK1), 피루브산 디카르복실라아제 유전자(PDC1 ,5,6)를 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 국제 출원 PCT/JP2008/072129에 기재?이용되어 있는 효모 배양 개시 후 50시간 이후에 있어서의 유전자 발현량이 전체 유전자의 평균 상대 발현량의 5배 이상인 에놀라아제1 유전자(ENO1), 세포벽 관련 단백질2 유전자(CWP2), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1 유전자)의 프로모터도 바람직한 예로서 들 수 있다. 특히, 효모의 에탄올 발효 경로에 있어서 고발현되어 있는 PDC1 유전자 또는 TDH3 유전자 또는 장기간의 효모 배양 시에 고발현되어 있는 SED1 유전자를 보다 바람직한 예로서 들 수 있고, 또한 상술한 바와 같이 적어도 에탄올 발효 경로의 기점이 되는 PDC1 유전자 또는 PDC5 유전자, 바람직하게는 PDC1 유전자를 파괴하도록 상기 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 에탄올 발효 경로로 대사되는 피루브산을 D-락트산 대사 경로에 이용할 수 있게 되기 때문에 더욱 바람직하다.

또한, 상기 DNA 구축물을 효모 염색체에 도입하는 방법으로서는 상기 폴리뉴클레오티드를 효모 염색체에 도입하는 경우와 마찬가지로 상동 재조합용 DNA 구축물을 작성하고, 상동 재조합에 의해 목적으로 하는 염색체 상의 개소에 도입할 수 있다. 또한, 상기 DNA 구축물에는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터가 이미 포함되어 있기 때문에 상기 폴리뉴클레오티드가 효모 염색체 상의 내재성 유전자의 프로모터에 의해 제어 가능하게 되도록 도입할 필요는 없다.

또한, 효모 염색체 상의 소망의 위치에 상기 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 구축물이 도입되었는지 여부의 확인은 PCR법이나 서던하이브리다이제이션법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 형질 전환 효모로부터 DNA를 조제하고, 도입 부위특이적 프라이머에 의해 PCR을 행하고, PCR산물에 대해서 전기영동에 있어서 예기되는 밴드를 검출함으로써 확인할 수 있다. 또는 형광 색소 등에 의해 표식된 프라이머로 PCR을 행하는 것으로도 확인할 수 있다. 이들의 방법은 당업자에 있어서 공지이다.

상기 형질 전환체를 배양하는 공정을 포함하는 D-락트산의 제조 방법에 대해서도 본 발명에 포함된다. 상기 형질 전환체를 배양하면 상기 형질 전환체 내에서 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현이 새롭게 부여 또는 증강되어서 D-락트산 대사 경로가 새롭게 부여 또는 증강되고, 그 결과 배양물 중에서 D-락트산을 분리하는 공정을 실시함으로써 D-락트산이 얻어진다. 배양물이란 배양 상청액 이외에 형질 전환체 또는 형질 전환체의 파쇄물을 포함하고 있다.

상기 형질 전환체의 배양 방법에 대해서는 특별히 한정은 없고, 공지의 방법이 채용된다. 예를 들면, 상기 형질 전환 효모의 배양 방법으로서는 「M.D. Rose et al.,"Methods In Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)」 등에 기재되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기 DNA 구축물을 포함하는 플러스미드나 상동 재조합용 DNA 구축물에 선택 마커가 포함되는 경우 선택 마커에 따른 영양 비첨가 배지 또는 약제 첨가 배지로 배양함으로써 소망의 형질 전환체를 선택할 수 있다.

상기 형질 전환체를 배양하는 배지로서는 상기 형질 전환체가 자화(資化) 가능한 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 포함하고, 상기 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지 모두 사용할 수 있다. 예를 들면, 형질 전환 효모의 경우 탄소원으로서는 글루코오스, 프룩토오스, 스쿠로오스, 갈락토오스, 말토오스, 라피노스, 트레할로스, 소르보오스, 셀로비오스, 락토오스, 멜리비오스, 멜레치토스, 이눌린, 크실로오스, 아라비노스, 리보오스, 람노스, 글루코사민, 에리스리톨, 리비톨, 만니톨, 글루시톨, 살리신, 녹말, 전분 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산, 시트르산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올을 사용할 수 있다. 질소원으로서는 암모니아, 염화 암모니아, 황산 암모늄, 아세트산 암모늄, 인산 암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염 또는 그 밖의 질소 포함 화합물 이외에 펩톤, 육류 엑기스, 옥수수 침지액 등을 사용할 수 있다. 무기물로서는 인산 제 1 칼륨, 인산 마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1 철, 황산 망간, 황산 구리, 탄산 칼슘 등을 사용할 수 있다.

상기 형질 전환체의 배양은 통상 진동 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기 조건 하로부터 통기를 실시하지 않는 혐기 조건 하까지의 범위로 락트산의 생산성이 좋은 조건을 설정할 수 있지만 미호기로부터 혐기의 조건 하가 바람직하게 사용된다. 배양 온도는 25?77℃에서 행할 수 있지만 28?35℃가 바람직하다. D-락트산이 배지 중에 축적됨에 따라 배양물의 pH가 저하되기 때문에 수산화 칼슘, 탄산 칼슘, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 암모니아수, 암모니아가스 등의 알카리성 물질에 의해 중화될 수도 있다. 또한, 후단에 있어서의 락트산의 정제를 쉽게 하기 위해서 중화를 행하지 않고 배양할 수도 있다. 또한, 배양 방법으로서는 목적으로 하는 D-락트산을 발효 생산할 수 있는 형태이면 특별히 제한은 없고, 배치 배양, 페드-배치 배양, 케모스타트 배양, 연속 배양 등을 채용할 수 있다. 바람직하게는 배치 배양 또는 WO 2007/097260에 기재되어 있는 클로깅(clogging)을 일으키기 어려운 막을 이용해서 발효 배양물을 분리막에 의해 여과액과 미여과액으로 분리하고, 여과액으로부터 소망의 발효 생산물을 회수함과 아울러 미여과액을 발효 배양물에 유지 또는 환류시키는 막이용 연속 배양이다.

상기 배양물 중에 얻어진 D-락트산의 측정법에 특별히 제한은 없지만 예를 들면 HPLC를 사용하는 방법이나 F-키트(로슈사제)를 사용하는 방법 등이 있다.

상기 발효 배양물 중에 포함되는 D-락트산의 분리?정제는 종래 알려져 있는 농축, 증류 및 정석(晶析) 등의 방법을 조합해서 행할 수 있고, 예를 들면 여과?분리 발효액의 pH를 1 이하로 하고나서 디에틸에테르나 아세트산 에틸 등으로 추출하는 방법, 이온 교환 수지에 흡착 세정한 후에 용출하는 방법, 산촉매의 존재 하에서 알코올과 반응시켜서 에스테르로 하여 증류하는 방법, 칼슘염이나 리튬염으로 해서 정석하는 방법, WO 2009/004922에 개시되는 나노 여과막과 증류를 조합시킨 분리?정제 방법 등을 들 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 가지고 본 발명의 실시형태를 설명하지만 이들은 본 발명의 예시이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다.

(실시예 1) 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(이하, 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자)의 염기서열 결정

미국 투구게의 cDNA를 제작하기 위해서 polyA(+)RNA의 정제를 행했다. polyA(+)RNA는 미국 투구게의 혈구로부터 단리했다. 미국 투구게(Marine Biological Laboratory(USA)로부터 구입)의 혈구로부터 AGPC법(실험 의학 Vol. 9(1991), 1937-1940페이지를 참조)을 사용해서 전체 RNA를 분리했다. 분리한 전체 RNA를 사용하고, "Oligotex-dT30 Super키트"(다카라바이오사제)를 사용해서 polyA(+)RNA를 단리했다. 이어서, "SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase"(인비트로젠사제)를 사용하여 Oligo d(T)를 프라이머로 해서 cDNA를 합성했다. 이어서, 이 반응액을 주형으로서 사용하여 D-LDH 유전자에 있어서 높게 보존되어 있는 DNA 서열에 주목해서 디자인된 서열 번호 8 및 서열 번호 9에 기재된 올리고 DNA를 프라이머로 해서 PCR을 행하고, 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자의 부분 서열을 증폭했다. PCR은 이하의 조건으로 행했다. 95℃(3분간):{95℃(30초간)-45℃(30초간)-72℃(30초간)}×35사이클:72℃(5분간). 이어서, 1.0% 아가로스 겔을 사용한 전기영동에 의해 증폭 DNA 단편의 확인을 행하고, 600bp의 증폭 단편을 "QIA quick Gel extraction kit"(가부시키가이샤 퀴아젠제)를 사용해서 정제한 후 플러스미드 벡터 "pGEMt-easy"(프로메가 가부시키가이샤제)에 클로닝하고, DNA 서열의 결정을 행했다. 염기서열의 결정은 "Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit"(어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 Sanger의 방법에 따라 행했다. 그 결과 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자에 상당한다고 생각되는 2종류의 서열(D-LDH1, D-LDH2)의 부분 서열이 얻어졌다.

이어서, 5'RACE 및 3'RACE법을 사용하여 D-LDH1 및 D-LDH2의 전체 ORF 서열을 명확히 했다. 5'RACE는 이하의 방법으로 행했다. 우선 100μM로 조정한 서열 번호 10에 기재(D-LDH1용)된 또는 서열 번호 11에 기재(D-LDH2용)된 올리고 DNA를 50㎕, T4PolynucleotideKinase(다카라바이오사제) 50unit, 10×Kinase Buffer(500mM Tris-HCl pH 7.6, 100mMMgCl2, 50mM DTT, 1mM Spermidine, 1mM EDTA) 10㎕, 100mMATP 1㎕, 증류수 34㎕를 혼화하고, 77℃에서 1시간 정치함으로써 올리고 DNA의 5'말단의 인산화를 행하여 페놀?클로로포름?이소아밀알코올 처리, 에탄올 침전에 의해 정제했다. 이어서, 미국 투구게의 polyA(+)RNA를 주형으로 "SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase"(인비트로젠 가부시키가이샤제)를 사용하여 상기 인산화 올리고 DNA를 프라이머로 해서 cDNA의 합성을 행했다. 이하, 라이게이션 반응에 의한 1개쇄 cDNA의 콘카테머화를 "5'-Full RACE Core Set"(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용해서 행하고, 생성한 콘카테머화 cDNA를 주형으로 하고, 서열 번호 12 및 서열 번호 13에 기재(D-LDH1용)되거나 또는 서열 번호 14 및 서열 번호 15에 기재(D-LDH2용)된 올리고 DNA를 프라이머로 해서 1번째의 PCR, 또한 그 반응액을 주형으로 하고, 서열 번호 16 및 서열 번호 17에 기재(D-LDH1용)되거나 또는 서열 번호 18 및 서열 번호 19에 기재(D-LDH2용)된 올리고 DNA를 프라이머로 해서 2번째의 PCR을 행했다. 증폭 단편의 확인, 정제 및 염기서열의 결정은 상술한 바와 같이 행했다.

3'RACE는 이하의 방법으로 행했다. 우선 미국 투구게의 polyA(+)RNA를 주형으로 "SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase"(인비트로젠 가부시키가이샤제)를 사용하고, Oligo d(T)를 프라이머로 해서 cDNA의 합성을 행했다. 이어서, 이 반응액을 주형으로서 Oligo d(T) 및 서열 번호 13에 기재(D-LDH1용)되거나 또는 서열 번호 15에 기재(D-LDH2용)된 올리고 DNA를 프라이머로 해서 1번째의 PCR을 행하고, 또한 그 반응액을 주형으로서 Oligo d(T) 및 서열 번호 17에 기재(D-LDH1용)되거나 또는 서열 번호 19에 기재(D-LDH2용)된 올리고 DNA를 프라이머로 해서 2번째의 PCR을 행했다. 증폭 단편의 확인, 정제 및 염기서열의 결정은 상술한 바와 같이 행했다.

미국 투구게로부터 유래된 D-LDH1 유전자의 아미노산 서열(서열 번호 1) 및 cDNA의 ORF 서열(서열 번호 3),또는 D-LDH2의 아미노산 서열(서열 번호 2) 및 cDNA의 ORF 서열(서열 번호 4)은 상기 방법에서 얻어진 서열을 서로 연결시켜서 결정했다. 또한, BLAST에 의한 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열간의 서열동일성은 93%이며, 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 기재된 염기서열 간의 서열동일성은 82%이었다.

(실시예 2) 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자 발현 플러스미드의 구축

실시예 1에서 결정된 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자라고 생각되는 D-LDH1 유전자 및 D-LDH2 유전자(이하, 각각 Lp.D-LDH1 유전자, Lp.D-LDH2 유전자라고 한다)의 ORF5'측과 ORF3'측에 상당하는 서열 번호 20 및 서열 번호 21에 기재된 올리고 DNA 또는 서열 번호 22 및 서열 번호 23에 기재된의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 하고, 미국 투구게의 polyA(+)RNA로부터 합성한 cDNA를 주형으로 PCR을 행하여 유전자의 클로닝을 행했다. 얻어진 DNA 단편을 제한 효소 XhoⅠ 및 NotⅠ로 절단하고, 마찬가지로 제한 효소 XhoⅠ 및 NotⅠ로 절단한 효모 발현용 벡터 pTRS11(TDH3 프로모터 및 선택 마커 URA3 유전자를 탑재, 일본 특허 공개 2006-280368호 공보 참조. 또한, TDH3 프로모터 및 터미네이터가 GAPDH 프로모터 및 터미네이터로 표기되어 있다)의 절단 부위에 도입하고, TDH3 프로모터와 Lp.D-LDH1 유전자 또는 Lp.D-LDH2 유전자가 연결된 DNA 구축물을 포함하는 플러스미드 벡터를 제작했다. 이후, 이들의 플러스미드 벡터를 pTRS205(Lp.D-LDH1을 유지한다) 및 pTRS206(Lp.D-LDH2를 유지한다)으로 한다. 여기서 pTRS11벡터는 pNV11벡터(Nature, vol.357,25 JUNE 1992, p.700참조)를 제한 효소 XhoⅠ로 절단하고, 인서트를 제외한 후에 셀프 라이게이션함으로써 작성했다.

(실시예 3) 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자 발현 플러스미드의 효모로의 도입

실시예 2와 같이 해서 얻어진 pTRS205 및 pTRS206을 효모인 사카로미세스?세레비시아 SW029-1B주(유전자형:MATa ura TRP(ΔPDC1::TRP1) his ade lys leu)(이하, SW029-1B주로 한다)에 도입했다. 플러스미드의 도입은 "YEASTMAKER Yeast Transformation System"(클론테크사제)을 사용한 아세트산 리튬법에 의해 행했다(상세한 것은 부속의 프로토콜 참조). 숙주로 하는 SW029- 1B주는 우라실 합성능을 결손한 주이며, pTRS205 및 206이 갖는 선택 마커 URA3 유전자의 활동에 의해 우라실 비첨가 배지 상에서 pTRS205 및 206의 도입된 형질 전환 효모의 선택이 가능하다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환체로의 D-LDH 유전자 발현 벡터 도입의 확인은 우라실 비첨가의 액체 배지로 배양한 형질 전환주로부터 게놈 DNA 추출 키트 "Gen토루쿤"(다카라바이오 가부시키가이샤제)에 의해 플러스미드 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 추출하고, 이것을 주형으로 해서 사용한 PCR에 의해 행했다. 프라이머에는 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 클로닝했을 때에 사용한 프라이머를 각각 사용했다. 그 결과 모든 형질 전환 효모에 있어서 각 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자가 각각 도입되어 있는 것을 확인했다.

(실시예 4) D-락트산 생산성 테스트1

실시예 3과 같이 해서 얻어진 pTRS205 및 206이 도입된 사카로미세스?세레비시아 SW029-1B주(이하, SW029-1B/pTRS205주, SW029-1B/pTRS206주라고 한다)를 사용해서 D-락트산 생산성 테스트를 행했다.

표 1에 나타낸 조성의 SC3 배지로부터 우라실을 제거한 배지(SC3-Ura 배지) 10㎖를 시험관에 취하고, 거기에 소량의 각 주를 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다(전배양). 이어서, SC3-Ura 배지 10㎖를 시험관에 넣고, 각 전배양액을 각각 100㎕ 식균하고, 30℃에서 진동 배양했다(본배양). 본배양 개시 후 40시간의 배양액을 원심분리하고, 상청액에 포함되는 락트산을 하기에 나타내는 조건으로 HPLC에 의해 측정했다.

컬럼: "Shim-Pack SPR-H"(가부시키가이샤 시마즈 세이사쿠쇼제)

이동상: 5mM p-톨루엔술폰산(유속 0.8㎖/min)

반응액: 5mM p-톨루엔 술폰산, 20mM 비스트리스, 0.1mM EDTA?2Na(유속 0.8㎖/min)

검출 방법: 전기 전도도

온도: 45℃.

또한, D-락트산의 광학 순도는 이하의 조건으로 HPLC법에 의해 측정한 D-락트산 및 L-락트산 농도의 측정 결과로부터 다음 식에 의거해서 계산했다.

컬럼: "TSK-gel Enantio LI"(등록상표: 토소 가부시키가이샤제)

이동상: 1mM 황산 구리 수용액

유속: 1.0㎖/min

검출 방법: UV254nm

온도: 30℃

광학 순도(%e.e.)= 100×(D-L)/(D+L)

광학 순도(%)=100×D/(D+L)

여기서 L은 L-락트산의 농도, D는 D-락트산의 농도를 나타낸다.

그 결과 D-락트산의 축적 농도는 SW029-1B/pTRS205주에서 13g/L, SW029-1B/pTRS206주에서 12g/L이었다. 또한, 배양액 중에는 D-락트산만 검출되고, L-락트산은 검출 한계 이하이었다. 미국 투구게로부터 클로닝된 D-LDH 유전자를 효모에 도입함으로써 상기 형질 전환 효모는 D-락트산을 산생하는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 5) 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자의 효모 염색체로의 도입

이하의 스텝1?3에 의해 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 포함하는 상동 재조합용 DNA 구축물을 제작했다.

[스텝1]

실시예 2에서 얻어진 Lp.D-LDH1 유전자를 유지하는 pTRS205 및 Lp.D-LDH2 유전자를 유지하는 pTRS206을 주형으로 하고, 서열 번호 24 및 25기재의 올리고 DNA 또는 서열 번호 26 및 25기재의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 각 D-LDH 유전자를 포함하는 약 1.1kb의 DNA 단편을 증폭했다. 여기서 서열 번호 24, 26에 기재된 올리고 DNA는 PDC1 유전자의 상류 65bp에 상동성이 있는 서열이 부가되도록 디자인했다.

[스텝2]

이어서, 플러스미드 pRS424(GenBank Accession Number:U03453)를 주형으로 하고, 서열 번호 27 및 28에 기재된 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 효모 선택 마커인 TRP1 유전자를 포함하는 약 1.4kb의 DNA 단편을 증폭했다. 여기서 서열 번호 28에 기재된 올리고 DNA는 PDC1 유전자의 하류 65bp에 상동성이 있는 서열이 부가되도록 디자인했다.

[스텝3]

DNA 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리한 후, "QIA quick Gel extraction kit"(퀴아젠 가부시키가이샤제)를 사용해서 정제했다. 여기서 얻어진 D-LDH 유전자를 포함하는 1.1kb단편, TRP1 유전자를 포함하는 1.4kb단편을 각각 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열 번호 24 및 28에 기재된 올리고 DNA 또는 서열 번호 26 및 28에 기재된 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 각 D-LDH 유전자, TDH3 터미네이터 및 TRP1 유전자가 연결된 약 2.5kb의 상동 재조합용 DNA 구축물을 증폭했다.

상기한 바와 같이 해서 제작한 상동 재조합용 DNA 구축물을 사카로미세스?세레비시아 NBRC10505주(이하, NBRC10505주라고 한다)의 라이신 영양 요구성을 복귀시킨 주인 사카로미세스?세레비시아 SW092-2D주(이하, SW092-2D주라고 한다)로 형질 전환했다.

또한, SW092-2D주의 제작법은 이하와 같다. 후나코시 카부시키가이샤제의 사카로미세스?세레비시아 BY4741주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 29, 30)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 LYS2 유전자의 전반 약 2kb의 PCR 단편을 증폭시켰다. 상기 PCR 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제한 후 NBRC10505주에 형질 전환 조작을 행하고, LYS2 유전자의 엄버(umber) 이변을 해제했다. 라이신 비첨가 배지로 배양함으로써 라이신 합성능이 복귀한 형질 전환주(NBRC10505(LYS2)주)를 선택했다. 형질 전환주가 LYS2 유전자의 엄버 이변을 해제된 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선 얻어진 형질 전환체와 야생형의 LYS2 유전자를 갖는 사카로미세스?세레비시아 L0GY7주를 접합시켜 이배체 세포를 얻고, 상기 이배체 세포를 자낭 형성 배지에 의해 자낭 형성시켰다. 마이크로 매니퓰레이터로 자낭를 해부해서 각각의 일배체 세포를 취득하고(테트래드), 각각 일배체 세포의 영양 요구성을 조사했다. 취득한 일배체 세포의 모두가 라이신 합성능을 가지고 있는 것을 확인했다. 얻어진 NBRC10505(LYS2)주와 NBRC10506주를 접합하고, 마이크로 매니퓰레이터에 의한 자낭 해부에 의해 SW092-2D(유전자형:MATa ura3 leu2 trp1 his3 ade2 LYS2)주를 얻었다.

상기 상동 재조합용 DNA 구축물을 사용해서 SW092-2D주를 형질 전환하고, 트립토판이 비첨가된 배지로 배양함으로써 형질 전환 효모를 선발했다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환 효모를 SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH1-TRP1)주 및 SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-DLH2-TRP1)주로 한다.

(실시예 6) D-락트산 생산성 테스트2

실시예 5에서 제작한 SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH1-TRP1)주, SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH2-TRP1)주를 사용해서 미니 자퍼멘터(mini jar fermenter)(마루비시바이오엔지 가부시키가이샤제, 5L)를 사용해서 발효 평가를 행했다.

표 1에 나타내는 SC3 배지 10㎖를 시험관에 취하고, 거기에 소량의 각 주를 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다(전배양). 이어서, 45㎖의 SC3 배지를 투입한 삼각 플라스크에 전배양액을 5㎖ 첨가하고, 30℃에서 8시간 더 배양했다(전배양). 1L의 SC3 배지를 투입한 미니 자퍼멘터에 전배양액을 전량 식균하고, 30시간 배양을 행했다. 배양 조건을 이하에 나타낸다.

pH: pH5

통기: 100㎖/min

교반: 120rpm

중화제: 1N 수산화 나트륨.

배양 종료 시의 배양액량 및 배양액 중의 D-락트산 농도 및 글루코오스 농도를 "글루코오스 테스트와코C"(등록상표)(와코쥰야쿠 가부시키가이샤제)로 측정하고, 상기 락트산 및 글루코오스 농도로부터 산출된 투입 글루코오스로부터 산출된 락트산 대당수율을 구했다. 그 결과 SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH1-TRP1)는 대당수율 45%, SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH2-TRP1)는 대당수율 42%에서 D-락트산을 생산하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

(비교예 1) 유산균으로부터 유래된 D-LDH 유전자의 클로닝, 발효 평가

형질 전환 효모에 있어서 D-락트산을 효율 좋게 발효 생산할 수 있는 D-LDH 유전자로서는 류코노스톡?메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)ATCC9135주로부터 유래된 D-LDH 유전자가 공지이며(WO 2004/104202 참조), 상기 D-LDH 유전자(이하, Lm.D-LDH 유전자라고 한다)를 클로닝해서 효모에 도입?발효시킴으로써 미국 투구게로부터 유래된 Lp.D-LDH1 유전자 또는 Lp.D-LDH2 유전자와의 D-LDH 활성의 비교 검토를 행했다.

Lm.D-LDH 유전자의 클로닝은 WO 2004/104202에 기재된 염기서열을 참고로 설계한 프라이머 세트(서열 번호 31, 32)를 사용해서 ATCC9135주를 템플릿으로 한 콜로니 PCR(토요보 가부시키가이샤제 "KOD-Plus-polymerase"를 사용)에 의해 행했다. PCR 증폭 단편을 정제하고 말단을 "T4 Polynucleotide Kinase"(다카라바이오 가부시키가이샤제)에 의해 인산화한 후 pUC118 벡터(제한 효소 HincⅡ로 절단하고, 절단면을 탈인산화 처리한 것)에 라이게이션했다. 라이게이션은 "DNA Ligation Kit Ver.2"(다카라바이오 가부시키가이샤제)를 사용해서 행했다. 라이게이션플러스미드 산물로 대장균DH5α을 형질 전환하고, 플러스미드 DNA를 회수함으로써Lm.D-LDH 유전자가 서브 클로닝된 플러스미드를 얻었다. 얻어진 Lm.D-LDH 유전자가 삽입된 pUC118 플러스미드를 제한 효소 XhoⅠ 및 NotⅠ로 소화하고, 얻어진 각 DNA 단편을 효모 발현용 벡터 pTRS11의 XhoⅠ/NotⅠ절단 부위에 삽입했다. 이렇게 해서 Lm.D-LDH 유전자 발현 플러스미드 pTRS207을 얻었다.

이어서, pTRS207을 주형으로 하고, 서열 번호 24 또는 26에 나타내는 프라이머 대신에 서열 번호 33에 나타내는 프라이머 세트를 사용한 점을 제외하고, 실시예 5와 마찬가지의 방법으로 Lm.D-LDH 유전자를 사카로미세스?세레비시아 SW092-2D주의 염색체 중의 PDC1 유전자좌로 도입했다. 제작한 형질 전환 효모를 SW092-2D(ΔPDC1::Lm.D-LDH-TRP1)로 한다. 이어서, 실시예 6과 마찬가지의 방법으로 배치 배양에 의한 D-락트산 생산성의 평가를 행했다. 그 결과 SW092-2D(ΔPDC1::Lm.D-LDH-TRP1)의 대당수율은 38%이었다. 실시예 6의 결과와 함께 표 2에 나타낸다.

(참고예 1) 아프리카 발톱 개구리로부터 유래된 L-LDH 유전자 도입 효모의 제작

일본 특허 공개 2008-029329호 공보에 기재되어 있는 방법에 의해 아프리카 발톱 개구리로부터 유래된 L-LDH 유전자(X.L-LDH 유전자)를 PDC1 유전자좌로 도입한 효모를 제작했다. 또한, 염색체에 도입하는 효모로서 NBRC10506주의 아데닌 영양 요구성을 복귀시킨 주(SU013-1D주)를 사용했다. SU013-1D주의 작성 방법을 이하에 나타낸다. 플러스미드 pRS422를 주형으로 하고, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 34, 35)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 ADE2 유전자의 PCR 단편 약 2kb를 증폭시켰다. 상기 PCR 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리, 상법에 따라 정제한 후 형질 전환 조작을 행하여 ADE2 유전자의 이변을 해제했다. 아데닌 비첨가 배지로 배양함으로써 아데닌 합성능이 복귀한 형질 전환주를 선택했다.

상기한 바와 같이 해서 얻어진 형질 전환주가 AED2 유전자의 이변을 해제된 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선 얻어진 형질 전환체와 야생형의 ADE2 유전자를 갖는 사카로미세스?세레비시아 L0GY77주를 접합시켜 이배체 세포를 얻었다. 상기 이배체 세포를 자낭 형성 배지에 의해 자낭 형성시켰다. 마이크로 매니퓰레이터로 자낭를 해부해서 각각의 일배체 세포를 취득하고(테트래드), 각각 일배체 세포의 영양 요구성을 조사했다. 취득한 일배체 세포 전체가 아데닌 합성능을 갖고 있는 것을 확인했다. 얻어진 NBRC10506(ADE2)주와 NBRC10505주를 접합하고, 마이크로 매니퓰레이터에서의 자낭 해부에 의해 SU013-1D주(유전자형:MATα ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 lys2)를 얻었다. 얻어진 형질 전환 효모를 SU013-1D(ΔPDC1::X.L-LDH-TRP1)주로 한다.

(실시예 7, 비교예 2) D-락트산 생산성 테스트3

참고예 1과 같이 해서 제작한 SU013-1D(ΔPDC1::X.L-LDH-TRP1)주와, 실시예 5 및 비교예 1에서 제작한 SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH1-TRP1)주, SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH2-TRP1)주 및 SW092-2D(ΔPDC1::Lm.D-LDH-TRP1)주를 각각 접합시키고, PDC1 유전자좌에 L-LDH 유전자와 D-LDH 유전자를 헤테로에 갖는 이배체 효모를 제작했다. 제작한 이배체 효모를 각각 Lp1-X주, Lp2-X주, Lm-X주로 한다.

이어서, Lp1-X주, Lp2-X주, Lm-X주를 실시예 5와 마찬가지인 조건으로 배치 배양을 행하고, 생산한 락트산의 광학 순도를 평가했다(표 3).

그 결과 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 갖는 효모는 광학 순도 50% 이상에서 D-락트산을 산생한 것에 대해 류코노스톡?메센테로이데스로부터 유래된 D-LDH 유전자를 갖는 효모가 산생한 D-락트산의 광학 순도는 44.4%이었다. 각 효모가 생산하는 D-락트산의 대당수율 및 D-락트산의 광학 순도는 D-LDH 유전자 형질 전환 효모 내에서의 D-LDH 활성에 비례한다고 여겨지므로 표 2 및 표 3의 결과로부터 류코노스톡?메센테로이데스로부터 유래된 D-LDH 유전자보다 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자쪽이 효모에 도입된 경우에 고활성의 폴리펩티드를 코딩하는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 8) 효모 염색체 중으로의 D-LDH 유전자의 다복제 도입 및 온도 감수성 이변형 PDC5 효모의 제작

이어서, 추가적인 D-락트산 수율 향상을 목적으로서 PDC1 유전자좌 이외의 유전자좌에도 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 도입한 효모의 제작을 검토하고, 일본 특허 공개 2008-029329호 공보에 도입 효과가 기재되어 있는 TDH3 유전자 및 국제 출원 PCT/JP2008/072129에 도입 효과가 기재되어 있는 SED1 유전자좌에 도입했다. 또한, 일본 특허 공개 2008-048726호 공보에 기재되어 있는 온도 감수성 이변형 PDC5 유전자도 도입했다.

[TDH3 유전자좌로의 D-LDH 유전자 도입]

TDH3 유전자좌로의 도입을 위해서 일본 특허 공개 2008-029329호 공보에 기재되어 있는 pTRS150의 제작 방법과 마찬가지로 Lp.D-LDH1 유전자를 유지하는 pTRS205의 TDH3 터미네이터를 ADH1 터미네이터로 치환한 플러스미드 pTRS208을 제작했다. 이어서, 일본 특허 공개 2008-029329호 공보 중의 서열 번호 8 대신에 서열 번호 36에 나타내는 프라이머를 사용하고, pTRS208을 주형으로 해서 TDH3 유전자좌 도입용의 상동 재조합용 DNA 구축물을 얻었다.

상기 상동 재조합용 DNA 구축물을 도입하는 효모로서는 SU013-1D주의 로이신 비요구성 주(SW087-2C주)를 사용했다. SW087-2C주의 작성 방법을 이하에 나타낸다. 플러스미드 pRS425을 주형으로 하고, 올리고 뉴클레오티드(서열 번호 37, 38)를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 LEU2 유전자의 PCR 단편 약 2kb를 증폭시켰다. 상기 PCR 단편을 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 상법에 따라 정제한 후 SU013-1D주의 형질 전환 조작을 행하여 LEU2 유전자의 이변을 해제했다. 로이신 비첨가 배지로 배양함으로써 로이신 합성능이 복귀한 형질 전환주를 선택했다. 이렇게 해서 얻어진 형질 전환주가 LEU2 유전자의 이변을 해제된 효모인 것의 확인은 하기와 같이 행했다. 우선 얻어진 형질 전환체와 야생형의 LEU2 유전자를 갖는 사카로미세스?세레비시아 L0GY77주를 접합시켜 이배체 세포를 얻었다. 상기 이배체 세포를 자낭 형성 배지에 의해 자낭 형성시켰다. 마이크로 매니퓰레이터로 자낭를 해부해서 각각의 일배체 세포를 취득하고(테트래드), 각각 일배체 세포의 영양 요구성을 조사했다. 취득한 일배체 세포 전체가 로이신 합성능을 가지고 있는 것을 확인했다. 얻어진 SU013-1D(LEU2)주와 NBRC10505주를 접합하고, 마이크로 매니퓰레이터에 의한 자낭 해부에 의해 SW087-2C주(유전자형:MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2)를 얻었다.

상기 상동 재조합용 DNA 구축물을 사용해서 SW087-2C주를 형질 전환하고, 우라실 비첨가 배지로 셀렉션함으로써 TDH3 유전자좌에 Lp.D-LDH1 유전자가 도입된 형질 전환 효모를 얻었다. 얻어진 형질 전환 효모를 SW087-2C(ΔTDH3::Lp.D-LDH-URA3)주로 한다.

[SED1 유전자좌로의 D-LDH 유전자 도입]

SED1 유전자좌로의 도입법은 국제 출원 PCT/JP2008/072129의 실시예 2에 기재되어 있는 방법을 개변하여 행했다. 즉, PCR의 주형으로서 pTRS102 대신에 pTRS205를 사용하고, 또한 상기 공보 중의 서열 번호 14 대신에 서열 번호 39에 나타내는 프라이머를 사용해서 SED1 유전자좌 도입용의 상동 재조합용 DNA 구축물을 증폭했다.

상기 상동 재조합용 DNA 구축물을 도입하는 효모로서는 실시예 5에서 제작한 NBRC10505(LYS2)주와 참고예 1에서 제작한 NBRC10506(ADE2)주를 접합시키고, 마이크로 매니퓰레이터에 의한 자낭 해부에 의해 분리한 SW092-7D주(유전자형:MATa ura3 leu2 trp1 his3 ADE2 LYS2)주를 사용했다.

상기 상동 재조합용 DNA 구축물을 사용해서 SW092-7D주를 형질 전환하고, 히스티딘 비첨가 배지로 셀렉션함으로써 SED1 유전자좌에 Lp.D-LDH1 유전자가 도입된 형질 전환 효모를 얻었다. 얻어진 형질 전환 효모를 SW092-7D(ΔSED1::Lp.D-LDH-HIS3)주로 한다.

[온도 감수성 이변형 PDC5 유전자(PDC5ts-9)의 도입]

온도 감수성 이변형 PDC5 유전자가 도입된 효모로서 일본 특허 공개 2008-048726호 공보에 기재된 온도 감수성 이변형 PDC5 유전자(PDC5ts-9)를 갖는 효모 SW015주를 사용했다. SW015주와 SW087-2C주를 접합시키고, 마이크로 매니퓰레이터에 의한 자낭 해부에 의해 분리함으로써 SW095-4B주(유전자형:MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 lys2 PDC5ts-9ΔPDC1::TRP1)를 얻었다. 또한, SW095-4B주와 SW092-2D주를 접합시키고, 마이크로 매니퓰레이터에 의한 자낭 해부에 의해 분리함으로써 SW098-21B주(유전자형:MATα ura3 LEU2 trp1 his3 ADE2 LYS2 PDC5ts-9)를 얻었다.

[PDC1, TDH3 및 SED1 유전자좌로의 D-LDH 유전자 도입 및 온도 감수성 이변형 PDC5 유전자(PDC5ts-9)의 도입]

제작한 SW092-2D(ΔPDC1::Lp.D-LDH1-TRP1)주, SW087-2C(ΔTDH3::Lp.D-LDH1-URA3)주, SW092-7D(ΔTDH3::Lp.D-LDH1-HIS3) 및 SW098-21B를 사용해서 이배체 접합, 테트래드를 반복하여 PDC1, TDH3 및 SED1 유전자좌에 Lp.D-LDH1 유전자를 갖고, 온도 감수성 이변형 PDC5(PDC5ts-9)을 갖고, 또한 이배체이며 아데닌?로이신?라이신의 영양 요구성을 갖지 않는 SU042주를 얻었다. SU042주의 제작 순서를 도 1에 나타낸다.

(실시예 9) D-락트산 생산성의 테스트4

실시예 8과 같이 해서 제작한 SU042주를 사용하여 배치 배양에 의한 D-락트산 생산성의 테스트를 행했다. 배지에는 표 1에 나타내는 SC3 배지 또는 원료당 배지(100g/L "유토세이"(무소 가부시키가이샤제), 1.5g/L 황산 암모늄)를 사용했다. 우선 SU042주를 시험관에서 5㎖의 SC3 배지 또는 원료당 배지로 하룻밤 진동 배양했다(전배양). 전배양액을 신선한 SC3 배지 또는 원료당 배지 50㎖에 식균하고 500㎖용량 사카구치 플라스크로 24시간 진동 배양했다(전배양). 미니 자퍼멘터(Able사제, 2L)에 1L의 SC3 배지 또는 원료당 배지를 투입하고, 온도 조정(32℃), pH 제어(pH5, 5N 수산화 칼슘)를 행하고, 통기?교반(200㎖/min, 400rpm)시키면서 배양을 행했다. 그 결과 SC3 배지에서는 배양은 30시간에서 종료하고, 대당수율은 63%이었다. 또한, 원료당 배지에서는 배양은 50시간에서 종료하고, 대당수율은 70%이었다. 이 결과로부터 Lp.D-LDH1 유전자의 PDC1 , TDH3, SED1 유전자좌로의 도입 및 PDC5 유전자로의 온도 감수성 이변의 도입에 의해 D-락트산의 발효 성능이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 10) 연속 배양에 의한 D-락트산 생산성 테스트

SU042주를 사용해서 WO 2007/097260에 기재되어 있는 분리막을 사용한 연속 배양의 검토를 행했다. 배지에는 원료당 배지(75g/L "유토세이"(무소 가부시키가이샤제), 1.5g/L 황산 암모늄)를 사용했다. 배양 조건을 하기에 나타낸다.

발효조 용량: 2(L)

배양액 용량: 1.5(L)

사용 분리막: pVDF 여과막(WO 2007/097260의 참고예 2에 기재)

막분리 요소 유효 여과 면적: 120㎠

온도 조정: 32(℃)

발효 반응조 통기량: 공기 0.02(L/min), 질소 가스 0.18(L/min)

발효 반응조 교반 속도: 800(rpm)

pH 조정: 5N 수산화 칼슘에 의해 pH5로 조정

멸균: 분리막 요소를 포함하는 배양조 및 사용 배지는 전부 121℃, 20min의 오토클레이브에 의해 고압 증기 멸균.

우선 SU042주를 시험관에서 10㎖의 원료당 배지로 30℃, 하룻밤 진동 배양했다(전배양). 얻어진 배양액을 신선한 원료당 배지 100㎖에 전량 식균하고, 500㎖용액 사카구치 플라스크로 24시간, 30℃에서 진동 배양했다(전배양). 전배양액을 1.5L의 원료당 배지를 투입한 막일체형의 연속 배양 장치(WO 2007/097260의 도 2에 나타내는 장치)에 식균하고, 배양 개시 50시간으로부터 페리스타 펌프에 의한 배양액 추출을 개시하고(200㎖/h), 400시간까지 배양을 행하여 생산 물질인 락트산 농도 및 락트산 생산 속도를 측정했다. 결과를 도 2에 나타낸다. 또한, 연속 배양 중의 락트산 생산 속도는 이하의 식 1을 사용해서 산출했다.

락트산 생산 속도(g/L?h)=추출액 중의 생산물 농도(g/L)×발효 배양액 추출 속도(L/hr)÷장치의 운전액량(L) ???(식 1).

분리막을 사용한 연속 배양을 행한 결과 D-락트산의 대당수율은 85% 정도까지 더 향상되고, 또한 D-락트산 생산 속도는 7.5g/L?h까지 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 11) 칸디다?유틸리스로의 미국 투구게 D-LDH의 도입

이어서, 크랩트리 음성 효모인 칸디다?유틸리스를 사용한 D-락트산의 검토를 행했다.

(a) 미국 투구게 D-LDH 유전자 도입용 벡터의 제작

우선 칸디다?유틸리스 염색체 중의 PDC1 유전자좌에 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 도입하기 위한 벡터 구축을 행했다. 칸디다?유틸리스 NBRC0988주(이하, NBRC0988)를 YPD 배지(1％ Bacto Yeast Extract, 2％ Bacto peptone, 2% 글루코오스)에 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다. 얻어진 균체로부터 정법에 따라 게놈 DNA를 추출하고 이어서 PCR의 주형으로 했다. 우선 서열 번호 40, 41의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 해서 PDC1 유전자의 터미네이터 영역을 포함하는 단편을 증폭했다. 또한, 특별히 언급이 없는 한 DNA 폴리메라아제에는 KOD-plus-(토요보 가부시키가이샤제)를 사용해서 부속의 프로토콜에 따라 행했다. 얻어진 약 1kb의 단편을 제한 효소 BssHⅠ로 절단하고, 그것을 정제한 후에 마찬가지로 제한 효소 BssHⅠ로 미리 절단해 둔 pBluescriptⅡSK(+)에 라이게이션했다. 얻어진 플러스미드를 pKS01로 한다.

이어서, 마찬가지로 NBRC0988의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 42, 43의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 PGK 프로모터를 포함하는 단편을 증폭했다. 얻어진 약 1kb의 단편을 정제해서 계속되는 실험에 사용했다. 이어서, 항생 물질의 일종인 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여할 수 있는 유전자인 hph 유전자를 갖는 플러스미드 pLC1-hph를 주형으로 하고, 서열 번호 44, 45의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 hph 유전자를 포함하는 단편을 증폭?정제하여 약 1.1kb의 단편을 얻었다. 또한, NBRC0988의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 46, 47의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 GAP 터미네이터를 포함하는 단편을 증폭?정제하여 약 500bp의 단편을 얻었다.

상기한 바와 같이 해서 얻어진 PGK 프로모터를 포함하는 단편, hph 유전자를 포함하는 단편 및 GAP 터미네이터를 포함하는 단편을 혼합해서 서열 번호 48, 49의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 PGK 프로모터, hph 유전자 및 GAP 터미네이터가 연결된 단편을 증폭했다. 얻어진 약 2.6kb의 단편의 말단을 인산화한 후에 pUC118을 HincⅡ로 절단해서 탈인산화해 둔 것에 라이게이션했다. 얻어진 플러스미드를 pKS02로 한다.

이어서, 마찬가지로 NBRC0988의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 50, 51의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 PGK 터미네이터를 포함하는 단편을 증폭?정제하여 약 500bp의 단편을 얻었다. 또한, 상기한 바와 같이 해서 얻어진 pKS02를 주형으로 하고, 서열 번호 52, 53의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 PGK 프로모터, hph 유전자 및 GAP 터미네이터가 연결된 단편을 증폭?정제하여 약 2.6kb의 단편을 얻었다.

상기한 바와 같이 해서 얻어진 PGK 터미네이터를 포함하는 단편 및 PGK 프로모터, hph 유전자 및 GAP 터미네이터가 연결된 단편을 혼합하고, 서열 번호 50, 53의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 PGK 터미네이터 PGK 프로모터, hph 유전자 및 GAP 터미네이터가 연결된 단편을 증폭했다. 얻어진 약 3kb의 단편을 제한 효소 BamHⅠ 및 ClaⅠ로 절단하고, 그것을 정제한 후에 마찬가지로 제한 효소 BamHⅠ 및 ClaⅠ로 미리 절단해 둔 pKS02에 라이게이션했다. 얻어진 플러스미드를 pKS03로 한다.

이어서, 마찬가지로 NBRC0988의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열 번호 54, 55의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 PDC1 프로모터 영역을 포함하는 단편을 증폭?정제하여 약 2.1kb의 단편을 얻었다. 또한, 실시예 2에서 제작한 pTRS205을 주형으로 하고, 서열 번호 56, 57의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 포함하는 단편을 증폭?정제하여 약 1kb의 단편을 얻었다.

상기한 바와 같이 해서 얻어진 PDC1 프로모터 영역을 포함하는 단편 및 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 포함하는 단편과 혼합하고, 서열 번호 54, 57의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 PDC1 프로모터 영역을 포함하는 단편과 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 포함하는 단편이 연결된 단편을 증폭해서 얻어진 약 3.1kb의 단편을 제한 효소 NotⅠ 및 BglⅡ로 절단하고, 그것을 정제한 후에 제한 효소 NotⅠ 및 BamHⅠ로 미리 절단해 둔 pKS03에 라이게이션했다. 얻어진 플러스미드를 pKS04로 한다.

(b) 미국 투구게 D-LDH 유전자의 PDC1 유전자좌로의 도입

상기한 바와 같이 해서 얻어진 pKS04를 제한 효소 BglⅡ로 절단한 것을 일렉트로포레이션법에 의해 NBRC0988에 도입했다. YPD 배지에 소량의 균체를 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양했다. 원심해서 상청액를 폐기한 후에 균체를 멸균수 및 1M 소르비톨로 세정하고, 최종적으로 1M 소르비톨에 균체를 현탁했다. 이어서, 균체와 제한 효소 BglⅡ로 절단한 pKS04를 혼합하고, 얼음 위에서 5분 둔 후에 일렉트로포레이션용의 크벳에 옮겨 Capacitance(25㎌), 전압(0.75㎸)과 저항(800Ω)의 조건으로 일렉트로포레이션을 행했다. 그 후 1M 소르비톨이 포함된 YPD 배지에 옮겨 30℃에서 4시간 정도 배양하고, 600㎍/L의 하이그로마이신B를 첨가한 YPD 배지에 도포했다. 얻어진 하이그로마이신B 내성주로부터 게놈을 추출하여 서열 번호 54, 57 및 서열 번호 56, 51의 올리고 DNA를 프라이머 세트로 한 PCR에 의해 각각 약 3kb 및 2kb의 단편의 증폭을 확인함으로써 PDC1 유전자좌에 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자가 도입된 형질 전환 효모가 얻어지는 것을 확인했다. 얻어진 형질 전환 효모를 CuLpLDH주로 한다.

(비교예 2) 칸디다?유틸리스로의 유산균으로부터 유래된 D-LDH의 도입

실시예 11과 마찬가지의 방법으로 유산균 류코노스톡?메센테로이데스로부터 유래된 D-LDH 유전자를 도입했다. 또한, 실시예 11에서는 서열 번호 55 대신에 서열 번호 58의 올리고 DNA를 사용하고, 또한 실시예 2의 pTRS205 대신에 비교예 1의 pTRS207을 주형으로 함과 아울러 서열 번호 56, 57 대신에 서열 번호 59, 60의 올리고 DNA를 사용했다. 얻어진 플러스미드를 pKS05로 한다.

상기한 바와 같이 해서 얻어진 플러스미드를 실시예 11과 마찬가지의 방법으로 NBRC0988주에 도입했다. 얻어진 PDC1 유전자좌에 유산균 류코노스톡?메센테로이데스로부터 유래된 D-LDH 유전자가 도입되어 있는 주를 CuLmLDH주로 한다.

(실시예 12, 비교예 3) 칸디다?유틸리스의 D-락트산 생산성 테스트

실시예 11 및 비교예 2에서 제작한 CuLpLDH주, CuLmLDH주를 사용해서 D-락트산 생산성을 평가했다. 500㎖의 사카구치 플라스크에 50㎖의 YPD 배지를 첨가하고, 거기에 소량의 CuLpLDH주 및 CuLmLDH주를 식균하고, 30℃에서 하룻밤 진동 배양했다(전배양). 배양액을 집균하고, 신선한 YPD 배지에서 세정한 후 1L의 YPD10 배지(10% 글루코오스 포함)를 첨가한 미니 자퍼멘터에 투입하여 배양을 행했다. 배양 조건을 이하에 나타낸다.

초기 식균량: OD600=10이 되도록 식균

pH: pH6

통기: 100㎖/min

교반: 120rpm

중화제: 1N 수산화 칼슘

배양 온도: 35℃.

배양은 40시간 행하여 40시간 시점의 배양액의 락트산 농도, 글루코오스 농도를 분석했다. 글루코오스는 모두 소비되어 있었다. 또한, 소비 글루코오스당의 생산성(대당수율) 및 D-락트산 광학 순도는 표 4에 나타내는 바와 같이 칸디다?유틸리스에 D-LDH 유전자를 도입한 효모는 D-락트산을 발효 생산 가능한 것을 알수 있고, 또한 수율은 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자를 도입한 CuLpLDH주쪽이 높았다.

(실시예 13, 비교예 4) 칸디다?유틸리스의 D-락트산 생산성 테스트2

이어서, CuLpLDH주, CuLmLDH주를 사용하여 5단당인 크실로오스를 당원으로 한 D-락트산 생산성의 평가를 행했다. 500㎖의 사카구치 플라스크에 50㎖의 YPD 배지를 첨가하고, 거기에 소량의 CuLpLDH주 및 CuLmLDH주를 식균하고, 30℃에서 하룻밤 진동 배양했다(전배양). 배양액을 집균하여 신선한 YPD 배지에서 세정한 후, 1L의 YPX10 배지(1% 효모 엑기스, 2% 박토펩톤, 4% 크실로오스)를 첨가한 미니 자퍼멘터에 투입하여 배양을 행했다. 배양 조건을 이하에 나타낸다.

초기 식균량: OD600=10이 되도록 식균

pH: pH6

통기: 100㎖/min

교반: 120rpm

중화제: 1N 수산화 칼슘

배양 온도: 30℃.

배양은 60시간 행하여 60시간 시점의 배양액의 락트산 농도, 크실로오스 농도를 분석했다. 크실로오스는 모두 소비되어 있었다. 또한, 소비크실로오스당의 생산성(대당수율) 및 D-락트산 광학 순도는 표 4에 나타내는 바와 같이 칸디다?유틸리스에 D-LDH 유전자를 도입한 효모는 크실로오스를 원료로서 D-락트산을 발효 생산가능한 것을 알수 있고, 또한 수율은 미국 투구게로부터 유래된 D-LDH 유전자 도입한 CuLpLDH주쪽이 높았다.

본 발명에 의해 D-락트산을 저비용이며 안정적으로 생산하는 것이 가능하게 되고, 또한 얻어지는 D-락트산은 광학 순도가 높고, 폴리머 원료로서 바람직하게 사용된다.

SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <120> Polypeptide having D-lactate dehydrogenase activity, polynucleotide encoding the same polypeptide and method for producing D-lactate <130> 10029 <160> 60 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 326 <212> PRT <213> Limulus polyphemus <400> 1 Met Ser Lys Pro Lys Val Phe Val Thr Arg Pro Asp Val Pro Gln Ala 1 5 10 15 Gly Ile Asp Leu Leu Lys Glu Lys Cys Asp Val Glu Ile Tyr Asp Gln 20 25 30 Pro Met Pro Ile Pro Arg Asp Ala Leu Ile Lys Gly Val Gln Gly Lys 35 40 45 Asp Ala Leu Tyr Cys Leu Leu Thr Asp Lys Ile Asp Lys Asp Val Met 50 55 60 Asp Ala Ala Gly Pro Gln Leu Lys Val Ile Ala Thr Met Ser Val Gly 65 70 75 80 Phe Asp His Ile Asp Leu Asn Glu Cys Lys Ala Arg Asn Ile Ala Val 85 90 95 Ser Asn Thr Pro Asp Val Ser Thr Asp Ser Val Ala Glu Leu Thr Val 100 105 110 Thr Leu Leu Leu Val Cys Gly Arg Arg Ile Met Asp Ser Ala Asn Ala 115 120 125 Ile Lys Asn Gly Glu Trp Ile Tyr Ser Trp Ser Pro Leu Trp Leu Cys 130 135 140 Gly Arg Gly Leu Thr Asn Ser Thr Ile Gly Ile Val Gly Met Gly Arg 145 150 155 160 Ile Gly Gln Ala Val Met Lys Arg Leu Leu Pro Phe Gly Val Lys Lys 165 170 175 Val Leu Tyr Tyr Asp Leu Phe His Pro Ile Lys Pro Ala Glu Asp Met 180 185 190 Gly Ala Gln Tyr Val Glu Phe Glu Glu Leu Leu Lys Glu Ser Asp Phe 195 200 205 Val Val Ala Met Cys Asn Leu Ser Glu Gln Thr Lys Glu Leu Phe Asn 210 215 220 Ala Lys Ala Phe Ser Gln Met Lys Pro Thr Ala Val Phe Val Asn Thr 225 230 235 240 Ser Arg Gly Gly Val Val Gln Gln Asp Asp Leu Tyr Glu Ala Leu Lys 245 250 255 Asn Gly Lys Ile Arg Ala Ala Gly Leu Asp Val Met Ile Pro Glu Pro 260 265 270 Leu Pro Arg Asp His Lys Leu Thr Thr Leu Pro Asn Ile Val Leu Leu 275 280 285 Pro His Val Gly Ser Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ile Glu Met Ala Thr 290 295 300 Leu Ala Ala Lys Asn Ile Leu Ser Val Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val 305 310 315 320 Thr Pro Val Pro Met Pro 325 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> Limulus polyphemus <400> 2 Met Ser Lys Pro Lys Val Phe Val Thr Arg Pro Asp Val Pro Gln Ala 1 5 10 15 Gly Ile Asp Leu Leu Lys Glu Lys Cys Asp Val Glu Ile Tyr Asp Gln 20 25 30 Pro Met Pro Ile Pro His Asp Ala Leu Ile Lys Gly Val Gln Gly Lys 35 40 45 Asp Ala Leu Tyr Cys Leu Leu Thr Asp Lys Ile Asp Lys Asp Val Met 50 55 60 Asp Ala Ala Gly Pro Gln Leu Lys Val Ile Ala Thr Met Ser Val Gly 65 70 75 80 Tyr Asp His Ile Asp Leu Asn Glu Cys Lys Ala Arg Asn Ile Val Val 85 90 95 Ser Asn Thr Pro Asp Val Ser Thr Asp Ser Val Ala Glu Leu Thr Val 100 105 110 Thr Leu Leu Leu Val Val Gly Arg Arg Ile Phe Asp Ser Ala Cys Ala 115 120 125 Ile Lys Asn Gly Glu Trp Ile Tyr Ser Trp Ser Pro Leu Trp Leu Cys 130 135 140 Gly Arg Gly Leu Thr Asn Ser Thr Val Gly Ile Val Gly Met Gly Arg 145 150 155 160 Ile Gly Gln Ala Val Met Lys Arg Leu Leu Pro Phe Gly Val Lys Lys 165 170 175 Ile Leu Tyr Phe Asp Leu Phe His Pro Ile Lys Pro Ala Glu Asp Met 180 185 190 Gly Ala Gln Phe Val Glu Phe Glu Glu Leu Leu Lys Glu Ser Asp Phe 195 200 205 Val Val Ala Met Cys Asn Leu Ser Glu Glu Thr Lys Glu Ile Phe Asn 210 215 220 Ala Lys Ala Phe Ser Leu Met Lys Pro Thr Ala Val Phe Ile Asn Thr 225 230 235 240 Ser Arg Gly Gly Val Val Gln Gln Asp Asp Leu Tyr Glu Ala Leu Lys 245 250 255 Asn Gly Val Ile Arg Gly Ala Gly Leu Asp Val Met Val Pro Glu Pro 260 265 270 Leu Pro Arg Asp His Lys Leu Thr Thr Leu Pro Asn Ile Ile Leu Leu 275 280 285 Pro His Val Gly Ser Ala Glu Glu Ala Ala Arg Thr Glu Met Ala Thr 290 295 300 Leu Ala Ala Lys Asn Ile Leu Ser Val Leu Asp Gly Lys Pro Leu Leu 305 310 315 320 Thr Pro Val Gln Met Pro 325 <210> 3 <211> 981 <212> DNA <213> Limulus polyphemus <400> 3 atgagcaaac caaaggtatt tgtaaccaga ccagacgttc ctcaagcagg aattgacctt 60 ttaaaggaaa aatgtgatgt agaaatttac gaccagccga tgccgattcc acgagatgcc 120 ttaattaaag gagttcaggg taaggatgct ctttattgtc ttctcacgga caaaattgac 180 aaggatgtga tggatgcagc aggaccccag ctaaaggtaa tagcgaccat gtctgttgga 240 tttgaccata ttgaccttaa cgaatgtaag gcaagaaata ttgcggtcag caacactccc 300 gatgtttcca ctgactccgt agctgagctg actgtcacac tattgttggt ttgtggcaga 360 agaatcatgg attctgcaaa cgctattaaa aatggagagt ggatctactc ttggagtcca 420 ctgtggctat gtggtagagg attaaccaac agcacaatag gaattgtagg aatgggtaga 480 attggccaag ctgtcatgaa acgcctgttg cctttcggtg taaagaaggt tttgtattat 540 gatctatttc acccaatcaa acccgctgaa gacatgggag ctcagtatgt tgagtttgaa 600 gagttattga aagagtcaga ctttgtagtc gcaatgtgca atttatcaga acaaaccaag 660 gaattgttta atgccaaggc tttcagccaa atgaagccta cagcagtttt cgttaatact 720 agtcgcggag gagttgttca acaagatgac ctctatgagg ccctcaagaa tggcaagatc 780 cgtgctgcag ggcttgacgt aatgattcct gagcctctac cccgggatca caagcttact 840 actttaccaa acatagttct tcttccacat gttggcagtg ctgaggaagc agcaagaata 900 gaaatggcaa ccttggcagc taagaacatc ttgtccgttt tagatggaaa gcctcttgta 960 actcctgttc ccatgccata a 981 <210> 4 <211> 981 <212> DNA <213> Limulus polyphemus <400> 4 atgagcaagc ccaaagtatt tgtcactaga cctgatgttc ctcaggcagg aattgatctt 60 ttgaaagaga aatgcgatgt cgaaatctat gatcagccta tgccaattcc acatgatgct 120 cttattaaag gagtgcaggg taaggacgct ctttattgtc tcctcaccga taagattgat 180 aaagatgtta tggatgcagc tgggcctcag ctaaaagtta tagctaccat gtctgttgga 240 tatgaccata ttgaccttaa tgaatgtaag gcaagaaata tagttgtaag taacactcct 300 gacgtatcca ctgactcagt agcagaactt actgttacac ttttattggt tgttggtaga 360 agaatttttg attctgcctg tgccattaaa aatggagagt ggatttactc atggagtcct 420 ttgtggttgt gtggtcgagg attgaccaac agcaccgtag gaattgttgg tatgggaaga 480 attggtcaag cagtcatgaa gagacttcta ccgtttggag ttaagaaaat tttatacttt 540 gacctgtttc atccaatcaa gcctgcagaa gatatgggag ctcagtttgt tgaatttgaa 600 gagctgttga aagaatctga ttttgtagtt gccatgtgta atctgtctga ggaaacaaag 660 gagatattta acgccaaggc tttcagtcta atgaagccta ctgcagtttt tataaatacc 720 agccgtggtg gagttgtgca gcaggatgac ttgtatgaag cccttaagaa tggcgtgatc 780 cgtggggccg gactggacgt gatggttcct gagcctttac cccgggacca caaactcaca 840 acactaccaa acataattct tctcccgcat gttggcagtg ctgaggaagc agcaagaaca 900 gaaatggcaa ctctggcagc caaaaacatc ctttccgttt tagatgggaa gccacttttg 960 actccagttc aaatgccata a 981 <210> 5 <211> 1000 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 aaaatgaagg ccaaatcaag gcgggaaggg acaaccagga cgtaaagggt agcctcccca 60 taacataaac tcaataaaat atatagtctt caacttgaaa aaggaacaag ctcatgcaaa 120 gaggtggtac ccgcacgccg aaatgcatgc aagtaaccta ttcaaagtaa tatctcatac 180 atgtttcatg agggtaacaa catgcgactg ggtgagcata tgttccgctg atgtgatgtg 240 caagataaac aagcaaggca gaaactaact tcttcttcat gtaataaaca caccccgcgt 300 ttatttacct atctctaaac ttcaacacct tatatcataa ctaatatttc ttgagataag 360 cacactgcac ccataccttc cttaaaaacg tagcttccag tttttggtgg ttccggcttc 420 cttcccgatt ccgcccgcta aacgcatatt tttgttgcct ggtggcattt gcaaaatgca 480 taacctatgc atttaaaaga ttatgtatgc tcttctgact tttcgtgtga tgaggctcgt 540 ggaaaaaatg aataatttat gaatttgaga acaattttgt gttgttacgg tattttacta 600 tggaataatc aatcaattga ggattttatg caaatatcgt ttgaatattt ttccgaccct 660 ttgagtactt ttcttcataa ttgcataata ttgtccgctg cccctttttc tgttagacgg 720 tgtcttgatc tacttgctat cgttcaacac caccttattt tctaactatt ttttttttag 780 ctcatttgaa tcagcttatg gtgatggcac atttttgcat aaacctagct gtcctcgttg 840 aacataggaa aaaaaaatat ataaacaagg ctctttcact ctccttgcaa tcagatttgg 900 gtttgttccc tttattttca tatttcttgt catattcctt tctcaattat tattttctac 960 tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 1000 <210> 6 <211> 1000 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 aggattttaa tctgttggag ttaaggtgaa tacgtttttc catattgggg tatgcagctc 60 gaacctaaag tggtatgtac acatcccctc aagcacaccc attaccctta taggattaat 120 gtaagcaaca gcttacacgg aattggaaat actattcaac gatccatgca tctgccagat 180 tcggacatgc atattcccca attggatata gaaaattaac gtaaggcagt atcttttcac 240 aatgtacttg caacgcggcg acttaaagtt gaagtacaac ctgcagcagc ggctttttgt 300 acggtacgcc aaactgtcaa tggataatat tgcgtagacc gaaaaaggta atcctcaaca 360 ctacccgtgg tggatgacct aaagcagtaa tattggttgg aattatctcc cagacggcac 420 cgtctccccg agaaagctta gccccgaggt ctaccttcca tacaccactg attgctccac 480 gtcatgcggc cttctttcga ggacaaaaag gcatatatcg ctaaaattag ccatcagaac 540 cgttattgtt attatatttt cattacgaaa gaggagaggg cccagcgcgc cagagcacac 600 acggtcattg attactttat ttggctaaag atccatccct tctcgatgtc atctctttcc 660 attcttgtgt atttttgatt gaaaatgatt ttttgtccac taatttctaa aaataagaca 720 aaaagccttt aagcagtttt tcatccattt tactacggta aaatgaatta gtacggtatg 780 gctcccagtc gcattatttt tagattggcc gtaggggctg gggtagaact agagtaagga 840 acattgctct gccctctttt gaactgtcat ataaatacct gacctatttt attctccatt 900 atcgtattat ctcacctctc tttttctatt ctcttgtaat tattgattta tagtcgtaac 960 tacaaagaca agcaaaataa aatacgttcg ctctattaag 1000 <210> 7 <211> 1000 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 ctattttcga ggaccttgtc accttgagcc caagagagcc aagatttaaa ttttcctatg 60 acttgatgca aattcccaaa gctaataaca tgcaagacac gtacggtcaa gaagacatat 120 ttgacctctt aacaggttca gacgcgactg cctcatcagt aagacccgtt gaaaagaact 180 tacctgaaaa aaacgaatat atactagcgt tgaatgttag cgtcaacaac aagaagttta 240 atgacgcgga ggccaaggca aaaagattcc ttgattacgt aagggagtta gaatcatttt 300 gaataaaaaa cacgcttttt cagttcgagt ttatcattat caatactgcc atttcaaaga 360 atacgtaaat aattaatagt agtgattttc ctaactttat ttagtcaaaa aattagcctt 420 ttaattctgc tgtaacccgt acatgcccaa aatagggggc gggttacaca gaatatataa 480 catcgtaggt gtctgggtga acagtttatt cctggcatcc actaaatata atggagcccg 540 ctttttaagc tggcatccag aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca 600 ccaaccatca gttcataggt ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac 660 aggcaaaaaa cgggcacaac ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac 720 acaaggcaat tgacccacgc atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct 780 gctctctctg atttggaaaa agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt 840 cccctacttg actaataagt atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct 900 atttcttaaa cttcttaaat tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac 960 caagaactta gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa 1000 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 8 atcdchacya tstcbgtggg 20 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 9 ggytcdggva ccatyac 17 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 10 ttgccattct tgagggcctc atagagg 27 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 11 gctgcacaac tccaccacgg ctgg 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 12 tcagctcagc tacggagtca gtgg 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 13 actattgttg gtttgtggca gaag 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 14 taagttctgc tactgagtca gtgg 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 15 tagaagaatt tttgattctg cctg 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 aacatcggga gtgttgctga ccgc 24 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 agagtggatc tactcttgga gtccac 26 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 tacgtcagga gtgttactta caac 24 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 agagtggatc tactcttgga gtccac 26 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 atgcctcgag atgagcaaac caaaggtatt 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 atgcgcggcc gcttatggca tgggaacagg 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 22 atgcctcgag atgagcaagc ccaaagtatt 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 23 atgcgcggcc gcttatggca tttgaactgg 30 <210> 24 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 24 attattattt tctactcata acctcacgca aaataacaca gtcaaatcaa tcaaaatgag 60 caaaccaaag gtatt 75 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 25 aggcgtatca cgaggccctt 20 <210> 26 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 attattattt tctactcata acctcacgca aaataacaca gtcaaatcaa tcaaaatgag 60 caagcccaaa gtatt 75 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct agattgtact gagagtgcac 60 <210> 28 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc 60 ctgtgcggta tttcacaccg 80 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 gacaattctg gttaggtcca agag 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 ttaagctgct gcggagcttc cacg 24 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 ccctcgagat gaagattttt gcttacggc 29 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 ccgcggccgc ttaatattca acagcaatag c 31 <210> 33 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 tctcaattat tattttctac tcataacctc acgcaaaata acacagtcaa atcaatcaaa 60 atgaagattt ttgcttacgg cattc 85 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 atggattcta gaacagttgg ta 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 ttacttgttt tctagataag ct 22 <210> 36 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 ttagttttaa aacaccaaga acttagtttc gaataaacac acataaacaa acaaaatgag 60 caaaccaaag gtatt 75 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 37 atgtctgccc ctaagaagat cg 22 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 38 ttaagcaagg attttcttaa cttc 24 <210> 39 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 39 atttatagtc gtaactacaa agacaagcaa aataaaatac gttcgctcta ttaagatgag 60 caaaccaaag gtatt 75 <210> 40 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 40 actcgcgcgc aagatctaag cggccgctaa tggatccaat aatcgatgct gtctttcttc 60 ttcatggg 68 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 41 actcgcgcgc aagatctgaa cttctccaac aggtagc 37 <210> 42 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 42 cggccgccag ctgaagcttc gtacgctgca ggtcgacaac ccttaatata acttcgtata 60 atgtatgcta tacgaagtta tcctttgctg tgttctacc 99 <210> 43 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 43 tcgatcagaa acttctcgac agacgtcgcg gtgagttcag gctttttcat ctttatccgc 60 cagtatgt 68 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 44 atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga 50 <210> 45 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 45 catgaggatc ataatttata acgtaatccc ataaataaaa gtcatacaat ctattccttt 60 gccctcgga 69 <210> 46 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 46 attgtatgac ttttatttat gggattacgt tataaattat gatcctcatg 50 <210> 47 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 47 taggccacta gtggatctga tatcacctaa taacttcgta tagcatacat tatacgaagt 60 tattcattca tccctcacta tcg 83 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 48 ggccgccagc tgaagcttcg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 49 aggccactag tggatctgat 20 <210> 50 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 50 actcggatcc ctgcaagcta ctttgtaatt aaacaaataa cggg 44 <210> 51 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 51 ggagactctt cacactgttg gcgtctatga ttcaagattg tcagtttcca tcgtggattg 60 gaatagatct ggtgaccttg 80 <210> 52 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 52 acaactattc caatccacga tggaaactga caatcttgaa tcatagacgc caacagtgtg 60 aagagtctcc agctgaagct tcgtacgctg 90 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 53 actcggccgg ccatcgatca ctagtggatc tgatatcacc 40 <210> 54 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 54 actcgcggcc gctctagaca ccaactttga agataggg 38 <210> 55 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 55 aatacctttg gtttgctcat ggtatcgatt gttttagttt tgtttgtttg ttgtgtataa 60 cggg 64 <210> 56 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 56 cccgttatac acaacaaaca aacaaaacta aaacaatcga taccatgagc aaaccaaagg 60 tatt 64 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 57 actcagatct tcattatggc atgggaacag gagtt 35 <210> 58 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 58 ccgtaagcaa aaatcttcat ggtatcgatt gttttagttt tgtttgtttg ttgtgtataa 60 cggg 64 <210> 59 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 59 cccgttatac acaacaaaca aacaaaacta aaacaatcga taccatgaag atttttgctt 60 acgg 64 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 60 actcagatct tcattaatat tcaacagcaa tagct 35

Claims

하기 (A)?(C) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
(A) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드
(B) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 몇개의 아미노산은 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드
(C) 서열 번호 1 또는 2에 기재된 아미노산 서열과의 서열동일성이 적어도 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드
하기 (a)?(e) 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
(a) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드
(b) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열에 있어서 1개 또는 몇개의 염기가 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 염기서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
(c) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 그 상보쇄의 전체 또는 그 일부와 엄격한 조건으로 하이브리다이징하는 폴리뉴클레오티드이며, D-LDH 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
(d) 서열 번호 3 또는 4에 기재된 염기서열과의 서열동일성이 적어도 80% 이상인 염기서열로 이루어지고, D-락트산 탈수소효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
(e) 제 1 항에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
제 2 항에 기재된 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터를 연결시킨 것을 특징으로 하는 DNA 구축물.
제 3 항에 있어서,
상기 프로모터는 피루브산 탈탄산효소1 유전자(PDC1 유전자), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1 유전자) 또는 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소3 유전자(TDH3 유전자)의 프로모터인 것을 특징으로 하는 DNA 구축물.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
상기 프로모터는 하기 (Ⅰ)?(Ⅲ) 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 구축물.
(Ⅰ) 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어지는 프로모터
(Ⅱ) 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열 또는 그 일부를 포함하는 염기서열과 엄격한 조건으로 하이브리다이징하는 염기서열로 이루어지는 프로모터
(Ⅲ) 서열 번호 5?7 중 어느 하나에 기재된 염기서열에 있어서 1개 또는 몇개의 염기가 결실, 치환 및/또는 부가된 염기서열로 이루어지는 프로모터
제 2 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 구축물이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 2 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 하나에 기재된 DNA 구축물이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환 효모.
제 7 항에 있어서,
상기 형질 전환 효모는 그 피루브산 탈탄산효소1 유전자(PDC1 유전자), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1 유전자) 및 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소3 유전자(TDH3 유전자) 중 적어도 1종류의 유전자가 제 2 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 청구항 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 하나에 기재된 DNA 구축물로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환 효모.
제 8 항에 있어서,
상기 유전자 중 적어도 1종류는 PDC1 유전자인 것을 특징으로 하는 형질 전환 효모.
제 6 항에 기재된 형질 전환체 또는 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 하나에 기재된 형질 전환 효모를 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 D-락트산의 제조 방법.
투구게과로부터 유래된 D-락트산 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터가 연결된 DNA 구축물이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
미국 투구게속으로부터 유래된 D-락트산 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터가 연결된 DNA 구축물이 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환 효모.
제 12 항에 있어서,
상기 형질 전환 효모는 그 피루브산 탈탄산효소1 유전자(PDC1 유전자), 서프레션 오브 엑스포넨셜 디펙트1 유전자(SED1 유전자) 및 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소3 유전자(TDH3 유전자) 중 적어도 1개의 유전자가 상기 투구게과로부터 유래된 D-락트산 탈수소효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 상기 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 프로모터가 연결된 DNA 구축물로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 형질 전환 효모.
제 11 항에 기재된 형질 전환체 또는 제 12 항 또는 제 13 항에 기재된 형질 전환 효모를 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 D-락트산의 제조 방법.