KR102078715B1 - 젖산 생산이 향상된 형질전환된 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 젖산 생산능이 향상된 사카로마이세스 속 (Saccharomyces) 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 sur1, erf2, bsd2, cit2 및 ncl1 유전자를 돌연변이시켜, 젖산을 생산능을 향상시킨 사카로마이세스 속 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 미생물의 젖산 생산능이 향상된 형질전환 미생물 및 이를 이용한 신규한 미생물을 개발하는 방법에 관한 것이다.
젖산은 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 젖산은 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 또한, 젖산은 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있다. 특히, 환경친화적인 대체 고분자 물질인 생분해성 플라스틱 폴리락타이드(polylactic acid, PLA)의 원료이다.
PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드(lactide)로 전환하여 개환 중합한 폴리에스터계 수지로 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리스틸렌(PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.
또한, 젖산은 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 젖산 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하므로, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목 받고 있다.
현재, 젖산은 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생 가능한 탄수화물을 기질로 하여 젖산을 제조할 수 있다.
일반 화학 반응식으로 여러 단계를 거쳐 얻을 수 있는 물질을 미생물을 이용하여 생산하는 경우 보다 효율적으로 원하는 물질을 생산할 수 있다. 이러한 경우 비용이나 시간면에서 일반 화학합성 공정보다 효율적이므로 이에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 미생물은 원하는 대사 산물만을 생성하지 않으며, 특정 대사 산물이 과량 생성될 경우 오히려 성장이 억제되거나 더 이상 원하는 대사 산물을 생성하지 않거나, 원하지 않는 부산물을 생성할 수 있다.
따라서, 이러한 문제점을 해소하고 젖산을 효율적으로 생산하는 균주 개발이 시급하다. 대한민국 공개공보 제2013-98603호에서는 특정 유전자를 넉아웃 시켜 D-형 젖산을 생산할 수 있는 형질전환 미생물에 대해 개시하고 있다.
본 발명자들은 젖산 생산능을 증진시킬 수 있는 미생물을 개발하던 중, 돌연변이된 SUR1 효소를 발현하는 미생물의 젖산 생산능이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 돌연변이된 SUR1 효소를 발현하고, ERF2, BSD2, CIT2 및 NCL1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 효소가 돌연변이된 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환 미생물을 기반으로 적응 진화 방법을 통하여 젖산 생산능이 향상된 신규한 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 재조합 SUR1 효소를 발현하는 젖산 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 SUR1 효소를 발현하고, ERF2, BSD2, CIT2 및 NCL1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 효소가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 젖산 생산능이 향상된 미생물을 제공한다.
또한, 상기 형질전환된 미생물을 높은 농도의 젖산 존재 하에 배양하는 단계; 및 젖산에 대한 저항성이 증가한 미생물을 선별하는 단계를 포함하는 젖산 생산능이 향상된 미생물을 수득하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 SUR1 단백질을 발현하는 젖산 생산능을 갖는 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양에 의해 생성된 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 젖산을 고효율로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제공하는 재조합 SUR1 단백질을 발현하고, ERF2, BSD2, CIT2 및 NCL1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 효소가 돌연변이된 것을 특징으로 하는 젖산 생산능이 향상된 미생물은 젖산 생산성이 향상될 뿐만 아니라, 고농도 젖산에 대해서도 저항성을 나타낸다. 따라서, 상기 형질전환 미생물을 이용하여 젖산을 생산할 경우 생산 효율이 증가하여 젖산 생산 단가를 낮출 수 있다. 따라서, 상기 미생물은 산업적으로 활용가능성이 많다.
도 1은 효모 균주에서 D형 젖산 생산 경로 및 경쟁 대사 산물인 에탄올과 글리세롤의 합성 경로를 도식화한 것이다.
도 2는 돌연변이된 균주의 증식(A), 글루코오즈 소비량(B), D형 젖산 생산량(C) 및 에탄올 생산량(D)을 나타낸 것이다. 이때, 형질전환된 균주의 유전형은 다음과 같다:
JHY5610은 젖산 생산능을 갖기 위해 Adh, Gpd 및 Dld 유전자가 넉아웃(knockout)되고, D-Ldh 유전자가 도입된 효모 균주를 의미한다.
JHY5612는 JHY5610에서 erf2 유전자 중 일부가 결실된 균주를 의미한다.
JHY5615는 JHY5610에서 SUR1I245S 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
JHY5617은 JHY5610에서 erf2 유전자 중 일부가 결실되고, SUR1I245S 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
JHY5710는 상기 JHY5610에서 erf2, bsd2, cit2 및 ncl1 유전자에 돌연변이가 발생하고, SUR1I245S를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
도 3은 1.0% 젖산 농도에서 형질전환된 균주의 생존성을 확인한 것이다.
도 4는 1.0% 젖산 농도에서 형질전환된 균주의 생존성을 확인한 것이다.
도 5는 형질전환된 균주의 증식(A), 글루코오즈 소비량(B), D형 젖산 생산량(C) 및 에탄올 생산량(D)을 나타낸 것이다. 이때, 형질전환된 균주의 유전형은 다음과 같다:
JHY5611은 JHY5610에서 bsd2 유전자 중 일부가 결실된 균주를 의미한다.
JHY5613은 JHY5610에서 CIT2V45F 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
JHY5614은 JHY5610에서 NCL1I626T 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
도 6은 PDC1이 추가적으로 결손된 균주의 증식(A), 글루코오즈 소비량(B), D형 젖산 생산량(C), 에탄올 생산량(D) 및 아세테이트 생산량(E)을 나타낸 것이다. 이때, 형질전환된 균주의 유전형은 다음과 같다:
JHY5720은 JHY5710에서 pdc1 유전자가 추가적으로 결손된 균주를 의미한다.
JHY5730은 JHY5710에서 pdc1 유전자가 결손되고 P TEF1 - Lm. ldhA - T CYC1 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
도 7은 18종 SUR1 I245 돌연변이주의 젖산에 대한 저항성을 나타낸 것이다. 이때, I는 이소류신(Ile), C는 시스테인(Cys), N은 아스파라긴(Asn), P는 프롤린(Pro), Q는 글루타민(Gln), S는 세린(Ser), T는 트레오닌(Thr), H는 히스티딘(His), K는 리신(Lys), R은 아르기닌(Arg), D는 아스파르트산(Asp), E는 글루탐산(Glu), A는 알라닌(Ala), G는 글리신(Gly), L은 류신(Leu), M은 메티오닌(Met), V는 발린(Val), W는 트립토판(Trp), Y는 티로신(Tyr)을 의미한다.
도 2는 돌연변이된 균주의 증식(A), 글루코오즈 소비량(B), D형 젖산 생산량(C) 및 에탄올 생산량(D)을 나타낸 것이다. 이때, 형질전환된 균주의 유전형은 다음과 같다:
JHY5610은 젖산 생산능을 갖기 위해 Adh, Gpd 및 Dld 유전자가 넉아웃(knockout)되고, D-Ldh 유전자가 도입된 효모 균주를 의미한다.
JHY5612는 JHY5610에서 erf2 유전자 중 일부가 결실된 균주를 의미한다.
JHY5615는 JHY5610에서 SUR1I245S 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
JHY5617은 JHY5610에서 erf2 유전자 중 일부가 결실되고, SUR1I245S 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
JHY5710는 상기 JHY5610에서 erf2, bsd2, cit2 및 ncl1 유전자에 돌연변이가 발생하고, SUR1I245S를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
도 3은 1.0% 젖산 농도에서 형질전환된 균주의 생존성을 확인한 것이다.
도 4는 1.0% 젖산 농도에서 형질전환된 균주의 생존성을 확인한 것이다.
도 5는 형질전환된 균주의 증식(A), 글루코오즈 소비량(B), D형 젖산 생산량(C) 및 에탄올 생산량(D)을 나타낸 것이다. 이때, 형질전환된 균주의 유전형은 다음과 같다:
JHY5611은 JHY5610에서 bsd2 유전자 중 일부가 결실된 균주를 의미한다.
JHY5613은 JHY5610에서 CIT2V45F 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
JHY5614은 JHY5610에서 NCL1I626T 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
도 6은 PDC1이 추가적으로 결손된 균주의 증식(A), 글루코오즈 소비량(B), D형 젖산 생산량(C), 에탄올 생산량(D) 및 아세테이트 생산량(E)을 나타낸 것이다. 이때, 형질전환된 균주의 유전형은 다음과 같다:
JHY5720은 JHY5710에서 pdc1 유전자가 추가적으로 결손된 균주를 의미한다.
JHY5730은 JHY5710에서 pdc1 유전자가 결손되고 P TEF1 - Lm. ldhA - T CYC1 를 코딩하는 유전자가 발현되는 균주를 의미한다.
도 7은 18종 SUR1 I245 돌연변이주의 젖산에 대한 저항성을 나타낸 것이다. 이때, I는 이소류신(Ile), C는 시스테인(Cys), N은 아스파라긴(Asn), P는 프롤린(Pro), Q는 글루타민(Gln), S는 세린(Ser), T는 트레오닌(Thr), H는 히스티딘(His), K는 리신(Lys), R은 아르기닌(Arg), D는 아스파르트산(Asp), E는 글루탐산(Glu), A는 알라닌(Ala), G는 글리신(Gly), L은 류신(Leu), M은 메티오닌(Met), V는 발린(Val), W는 트립토판(Trp), Y는 티로신(Tyr)을 의미한다.
본 발명의 일 측면으로, 재조합 SUR1 단백질을 발현하는 젖산 생산능을 갖는 미생물을 제공한다.
본 명세서에서 사용한 용어, "SUR1 단백질"은 만노실이노시톨 포스포릴세라마이드 생성효소(mannosylinositol phosphorylceramide synthase)의 촉매소단위체(catalytic subunit)를 의미한다. 상기 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 갖는 아미노산일 수 있다. 또한, 상기 SUR1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어인 "재조합 SUR1 단백질"은 상기 서열번호 1의 야생형 SUR1 단백질의 어느 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태의 단백질을 의미한다. 구체적으로, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신(Ile)이 다른 아미노산으로 치환된 단백질 일 수 있다. 이때, 상기 아이소루신(Ile)은 세린(Ser), 리신(Lys), 아스파르트산(Asp), 알라닌(Ala), 루신(Leu), 발린(Val) 및 티로신(Tyr)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신이 세린으로 치환된 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신이 리신으로 치환된 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신이 아스파르트산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 40의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신이 알라닌으로 치환된 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 41의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신이 루신으로 치환된 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 42의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신이 발린으로 치환된 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 43의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신이 티로신으로 치환된 것일 수 있다. 상기 재조합 단백질은 서열번호 44의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, 재조합 SUR1 단백질을 발현하는 젖산 생산능을 갖는 미생물에 있어서, 상기 미생물은 ERF2, BSD2, CIT2 및 NCL1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질이 추가적으로 돌연변이된 것일 수 있다.
구체적으로, 젖산 생산능을 갖는 미생물은 하기에서 선택되는 어느 하나의 조합으로 단백질이 돌연변이 된 것일 수 있다: 1) SUR1, 2) SUR1 및 ERF2, 3) SUR1, ERF2, 및 BSD2, 4) SUR1, ERF2, 및 CIT2, 5) SUR1, ERF2, 및 NCL1, 6) SUR1, ERF2, BSD2, 및 CIT2, 7) SUR1, ERF2, BSD2, 및 NCL1, 8) SUR1, ERF2, CIT2, 및 NCL1, 및 9) SUR1, ERF2, BSD2, CIT2, 및 NCL1.
본 명세서에서 사용한 용어, "ERF2"는 팔미토일전이효소(palmitoyltransferase)의 소단위체(subunit)를 의미한다. ERF2는 Ras1/2와 같은 단백질의 팔미토일화(palmitoylation)를 통한 번역 후 변형(posttranslational modification)에 관여한다. 상기 ERF2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
이때, 돌연변이된 erf2 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열의 261번째 위치의 시토신이 결실된 것을 의미한다. 이러한 결실에 의한 프레임쉬프트(frameshift) 현상에 의해, 서열번호 5의 87번째 프롤린 이후의 아미노산 서열이 바뀌게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어, "BSD2"는 중금속 이온 항상성 단백질(heavy metal ion homeostasis protein)로 지칭한다. 상기 단백질은 카드뮴, 코발트, 및 구리와 같은 중금속 이온의 항상성에 필수적인 효소이다. 상기 BSD2 효소는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
이때, 돌연변이된 BSD2는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부의 결실, 외부 유전자의 삽입, 유전자의 일부의 치환 등에 의해 상기 단백질의 활성이 상실된 것을 의미한다. BSD2 돌연변이의 일 구체예로는 서열번호 8의 일부 핵산이 치환되어 종결 코돈으로 되어, 상기 단백질이 발현되지 않는 것일 수 있다.
본원 명세서에서 사용한 용어, "CIT2"는 시트레이트 합성효소(Citrate synthase)를 의미한다. 상기 CIT2 효소는 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
이때, 돌연변이된 CIT2는 서열번호 9의 45번째 위치의 발린(Val)이 다른 아미노산으로 치환된 효소를 의미한다. 이때, 치환 가능한 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 아이소루신(Ile), 루신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 및 시스테인(Cys)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
바람직하게, 돌연변이된 CIT2는 서열번호 9의 45번째 위치의 Val이 Phe으로 치환된 것일 수 있다. 상기 변이된 효소는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "NCL1"은 tRNA (cytosine-C5-)-methyltransferase를 의미한다. 상기 NCL1 효소는 서열번호 13의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
이때, 돌연변이된 NCL1은 서열번호 13의 626번째 위치의 아이소루신(Ile)이 다른 아미노산으로 치환된 효소를 의미한다. 이때, 치환 가능한 아미노산은 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 알라닌(Ala), 루신(Leu), 페닐알라닌(Phe), 메티오닌(Met), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 프롤린(Pro), 시스테인(Cys), 및 발린(Val)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
바람직하게, 돌연변이된 NCL1은 서열번호 13의 626번째 위치의 아이소루신이 트레오닌으로 치환된 것일 수 있다. 상기 변이된 효소는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 명세서 사용한 용어, "젖산 생산능을 갖는 미생물"은 본 발명의 목적상 젖산을 생산할 수 있는 미생물을 의미한다. 특히, 상기 미생물은 당을 젖산으로 전환시킬 수 있다. 상기 미생물의 일 구체예로는 자이모모나스(Zymomonas), 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 알칼리제네스(Alcaligenes), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 버크홀데리아(Burkholderia), 올리고트로파(Oligotropha), 클렙시엘라(Klebsiella), 피치아(Pichia), 칸디아(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 또는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속에 속하는 미생물일 수 있다. 바람직하게 상기 젖산 생산능을 갖는 미생물은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
이때, 상기 미생물은 야생형의 미생물일 수 있으나, 젖산을 효율적을 생산하도록 형질전환된 미생물일 수 있다. 형질전환은 미생물은 젖산 생산에 적합하도록 미생물 내의 유전자를 불활성화시키거나, 새로운 유전자가 도입된 것일 수 있다.
이때, 유전자를 불활성화시키는 방법은 목적 유전자의 일부 또는 전부 결실, 유전자의 일부를 치환하거나 유전자의 외부 핵산을 도입한 것일 수 있다. 변형대상이 되는 유전자는 미생물의 물질대사 경로에 작용하는 효소일 수 있다. 이러한 효소의 구체예로는 ADH(alcohol dehydrogenase), GPD(glycerol-3-phosphate dehydrogenase), DLD(D-lactate dehydrogenase), 및 PDC(pyruvate decarboxylase)에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예로, 형질전환된 미생물은 ADH의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 GPD의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 DLD의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다.
다른 구체예로, 형질전환된 미생물의 ADH 및 GPD의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 ADH 및 DLD의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 ADH 및 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 GPD 및 DLD의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 GPD 및 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 DLD 및 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다.
또 다른 구체예로, 형질전환된 미생물은 ADH, GPD 및 DLD의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 또한, 형질전환된 미생물은 ADH, GPD 및 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 형질전환된 미생물은 ADH, DLD 및 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다. 형질전환된 미생물은 GPD, DLD 및 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다.
또 다른 구체예로, 형질전환된 미생물은 ADH, GPD, DLD 및 PDC의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되어 젖산 생산능이 향상될 수 있다.
상기 "내재적 활성"은 미생물이 천연의 상태 또는 해당 효소의 변형 전에 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미한다. 또한, "효소의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화된"은 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 내재적 활성이 감소된 유전자는 상기 유전자의 일부 또는 전부 결실, 유전자 일부의 치환 또는 유전자에 외래 유전자를 도입하여 제작할 수 있다. 또한, 젖산 생산능을 강화하기 위해서 D-Ldh를 코딩하는 유전자를 추가적으로 도입시킬 수 있다. 이때, 형질전환된 미생물은 젖산에 대한 내성이 증가될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어, "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란, 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
상기 효모 발현 벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp: integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 일반적으로, 발현 벡터는 프로모터-유전자-전사 종결서열의 발현 컨스트럭트를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용한, 용어 "프로모터(promoter)"는 하류 유전자의 전사를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용된, 용어 "터미네이터(terminator)"는 전사의 종료를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다.
예를 들어, 숙주 세포가 효모인 경우, 상기 발현 컨스트럭트에서 이용가능한 프로모터는 TEF1 프로모터, GAL1 프로모터, ADH1 프로모터, PHO5 프로모터, GAL1-10 프로모터, TDH3 프로모터(GPD 프로모터), PGK1 프로모터, PYK2 프로모터, ENO1 프로모터, 및 TPI1 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예로는, 서열번호 37의 염기서열을 가지는 TDH3 프로모터일 수 있다.
상기 발현 컨스트럭트에서 이용가능한 전사 종결서열은 ADH1 터미네이터, CYC1 터미네이터, GAL10 터미네이터, PGK1 터미네이터, PHO5 터미네이터, ENO1 터미네이터, ENO2 터미네이터 및 TPI1 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 일 구체예로는, 서열번호 37의 염기서열을 가지는 TDH3 프로모터와 서열번호 38의 염기서열을 가지는 CYC1 터미네이터일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예로는 사카로마이세스 세레비지에는 5종의 알코올 탈수소효소 (ADH), 2종의 글리세롤-3-인산 탈수소효소 (GPD), D형 젖산 탈수소효소 (DLD) 및 피루브산 탈탄산효소(PDC)에서 선택되는 효소 중 어느 하나 이상을 결손시킴으로써 젖산 생산능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "알코올 탈수소효소(ADH)"는 알코올에서 수소를 이탈시켜 알데히드 또는 케톤을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 활성을 가지는 단백질을 의미한다. 또한, 본원 명세서에서는 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, 또는 ADH5일 수 있으나, 상기 아형(isotype)에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 ADH1 효소는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 ADH2 효소는 서열번호 19의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 ADH3 효소는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 22의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 ADH4 효소는 서열번호 23의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 24의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 ADH5 효소는 서열번호 25의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 26의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "글리세롤-3-인산 탈수소효소(GPD)"는 미토콘드리아 내막에 분포하며 글리세롤-3-인산 및 FAD+에서 디하이드록시아세톤인산 및 FADH2로의 반응을 촉매하는 효소이다. 또한, 본원 명세서에서는 GPD1 또는 GPD2일 수 있다. 상기 GPD1은 서열번호 27의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 28의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. GPD2 효소는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 30의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "D형 젖산 탈수소효소(DLD)"는 D형 젖산을 탈수소화하여 피루베이트를 생성하는 활성을 가지는 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 구체적으로는 DLD1일 수 있으나, 상기 아형(isotype)에 한정되지 않는다. 상기 DLD1은 서열번호 31의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 32의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "피루베이트 탈탄산효소(PDC)"는 피루베이트에 작용하여 탄산과 아세트알데히드를 생성하는 반응을 매개하는 활성을 가지는 단백질을 의미한다. 본원 명세서에서는 구체적으로 PDC1, PDC5 또는 PDC6일 수 있으나, 상기 아형(isotype)에 한정되지 않는다. 구체적으로, 상기 PDC1은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 34의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "젖산 탈수소 효소(LDH)"는 젖산 발효에서 탄소 3개인 피루브산 1분자를 탄소 3개인 젖산 1분자로 바꾸면서 NADH를 NAD+ 1분자로 바꾸는 효소를 의미하며, L형 젖산 탈수소 효소(L-LDH), D형 젖산 탈수소 효소 등이 있다. 일 구체예로는 Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides ATCC 8293 유래의 D형 젖산 탈수소 효소를 이용하여 D형 젖산을 생산할 수 있는 효모 균주일 수 있다. 이때 상기 Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides ATCC 8293 유래의 D형 젖산 탈수소 효소는 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 36의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, 고농도의 젖산을 포함하는 배지에서 미생물을 배양하는 단계; 및 젖산에 대한 저항성이 증가한 미생물을 선별하는 단계를 포함하는 젖산 생산능이 향상된 미생물을 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 사카로마이세스 속 미생물을 이용하여 젖산을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
상기 배양은 젖산 농도가 점진적으로 증가된 배지에서 계대 배양을 통해 진행될 수 있다. 상기 젖산 농도는 1 g/L 에서 100 g/L, 2 g/L 내지 80 g/L, 5 g/L 내지 50 g/L, 또는 10 g/L 내지 40 g/L일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로는 ADH 및 GPD가 결손되고 DLD 위치에 서열번호 35의 아미노산 서열을 가지는 Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides ATCC 8293 유래의 D형 젖산 탈수소 효소를 삽입하여 제작한 D형 젖산 생산능을 갖는 효모 균주를 젖산 농도가 10 g/L에서 40 g/L로 점진적으로 증가한 배지에서 계대배양하여 상기 균주의 적응 진화를 유도할 수 있다. 이후, 적응 진화를 통해 젖산 생산능이 향상된 균주를 선별할 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면으로, 젖산 생산능을 갖는 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양에 의해 생성된 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 젖산을 고효율로 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 사카로마이세스 속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
탄소원의 예로는 수크로오스 또는 글루코오스가 포함될 수 있고, 수크로오스를 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적적량의 탄소원이 다양하게 이용될 수 있다.
질소원의 예로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 40℃, 구체적으로는 25℃ 내지 35℃, 더욱 구체적으로는 30℃일 수 있으나, 목적하는 목적에 따라 제한 없이 변경될 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량에 도달할 때까지 계속 할 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 젖산을 생산하는 방법은, 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 젖산을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 미생물 또는 배지로부터 젖산을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
I. 형질전환 미생물의 제작
제조예
1. 균주 준비 및 돌연변이 제작
하기 실시예에서 사용되는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주는 CEN. PK2-1C(MATa ura3 -52 trp1 -289 leu2 -3,112 his3Δ1 MAL2 -8C SUC2)(Euroscarf, 독일) 균주로부터 수득하였다. 또한, 특정 유전자가 결손되거나 삽입된 돌연변이는 Cre/loxP 재조합 시스템을 이용하여 제작하였다. 이때, 유전자 결손 및 삽입을 위한 카세트는 pUG6MCS, pUG27, 또는 pUG27MCS 플라스미드를 주형으로 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 통해 획득하였고, 이후 이를 효모 균주에 도입하여 특정 유전자의 돌연변이를 제작하였다.
제조예
2. 배지 및 배양 조건
하기 실시예에서 효모 균주는 YPD(Yeast Peptone Dextrose) 배지(20 g/L 또는 50 g/L 포도당, 10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto-peptone)에서 배양하였다. 배양은 진탕배양기를 이용하여 30℃에서 170 rpm의 속도로 진행하였다. D형 젖산을 생산하기 위해서는, 초기접종 세포농도를 OD600=1로 고정하여 50 ml의 코니컬 튜브(conical tube)에서 5 ml의 배지로 진행하였다.
제조예
3. 효모 균주의 적응 진화 유도
젖산에 대해 저항성을 갖는 효모 균주를 제작하기 위해, 젖산의 농도가 10 g/L에서 40 g/L로 점진적으로 증가된 YPD 액체 배지에서 균주를 총 15번 계대 배양하여 적응 진화를 유도하였다. 마지막 계대 배양 후, 40 g/L의 젖산이 포함된 고체배지에서 젖산에 대한 저항성을 갖는 콜로니들을 분리하였고 그 중 D형 젖산 생산능 및 포도당 소모능이 가장 효과적으로 향상된 균주를 선별하였다.
제조예
4. 호모 균주의 형질 전환
하기 실시예에서 사카로마이세스 세레비지에 효모 균주의 형질 전환을 위해 통상적으로 사용하고 있는 리튬 아세테이트를 이용한 화학적 형질전환 방법을 이용하였다.
제조예
5. 돌연변이 유전자를 포함하는 유전체 삽입용 플라스미드의 제작
돌연변이 유전자를 포함하는 유전체 삽입용 플라스미드를 제작하기 위해, 하기 실시예 1에서 제작된 적응 진화된 D형 젖산 생산 균주(JHY5710)의 genomic DNA를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 통해 각각의 프로모터와 터미네이터가 포함된 카세트를 획득한 후, BamHI 및 SalI 제한효소를 이용하여 pUG27MCS 벡터에 클로닝하였다. 이를 통해 얻어진 벡터는 각각 CIT2 V45F INT, pUG27MCS-NCL I626T INT, 및 pUG27MCS-SUR1 I245S INT로 명명하였다.
D형 젖산 탈수소효소 유전자를 발현하기 위해, TDH3 유전자의 프로모터와 CYC1 유전자의 터미네이터를 사용하였다. D형 젖산 탈수소효소 유전자 삽입용 플라스미드를 제작하기 위해, p425GPD-Lm. ldhA 플라스미드를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 통해 P TDH3 -Lm. ldhA -T CYC1 카세트를 획득한 후 ApaI 및 NheI 제한효소를 이용하여 pUG6MCS벡터(pUG6 벡터에 추가적으로 클로닝 사이트( PacI , NheI , BamH1 , SmaI , EcoRI, ApaI , KpnI , 및 AscI)가 도입된 벡터)에 클로닝 하였다. 이를 통해 얻어진 벡터는 pUG6MCS-GPD-Lm. ldhAINT로 명명하였다.
본 발명에서 사용한 균주 및 플라스미드를 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 이때, 표 1의 JHY605 균주의 출처는 다음과 같다: S. Kim, et al., 2015. Efficient production of 2,3-butanediol in Saccharomyces cerevisiae by eliminating ethanol and glycerol production and redox rebalancing. Metabolic Engineering. 31, 94-101.
| 균주명 | 유전자형 | 출처 |
| CEN.PK2-1C | MATa ura3 -52 trp1 -289 leu2 -3,112 his3Δ1 MAL2 -8C SUC2 | EUROSCARF |
| JHY605 | CEN .PK2-1C adh1Δ :: loxP adh2Δ :: loxP adh3Δ :: loxP adh4Δ ::loxP adh5Δ :: loxP gpd1Δ :: loxP gpd2Δ :: loxP | (S. Kim et al., 2015) |
| JHY5610 | JHY605 dld1Δ ::P TDH3 -Lm. ldhA -T CYC1 - loxP - kanMX - loxP | 본 발명 |
| JHY5611 | JHY5610 bsd2Δ :: loxP - his5 + - loxP | 본 발명 |
| JHY5612 | JHY5610 erf2Δ :: loxP - his5 + - loxP | 본 발명 |
| JHY5613 | JHY5610에서 CIT2를 CIT2 V45F 로 대체 | 본 발명 |
| JHY5614 | JHY5610에서 NCL1를 NCL1 I626T 로 대체 | 본 발명 |
| JHY5615 | JHY5610에서 SUR1를 SUR1 I245S 로 대체 | 본 발명 |
| JHY5617 | JHY5612 SUR1 I245S | 본 발명 |
| JHY5710 | JHY5610로부터 적응 진화된 균주 | 본 발명 |
| JHY5720 | JHY5710 pdc1Δ :: loxP - his5 +- loxP | 본 발명 |
| JHY5730 | JHY5710 pdc1Δ :: P TEF1 - Lm. ldhA - T CYC1 - loxP - Kl . ura3 - loxP | 본 발명 |
| 플라스미드 | 특징 | 출처 |
| pUG6 | loxP - kanMX - loxP 결실 카세트가 포함된 플라스미드 | EUROSCARF |
| pUG6MCS | 추가적인 제한 효소 위치가 포함된 pUG6 플라스미드 | 본 발명 |
| pUG6MCS-GPD-Lm.ldhA INT | P TDH3 -Lm. ldhA -T CYC1 를 적재한 pUG6MCS 플라스미드 | 본 발명 |
| pUG27 | loxP - his5 +- loxP 결실 카세트가 포함된 플라스미드 | EUROSCARF |
| pUG27MCS- CIT2 V45F INT | CIT2 V45F 가 적재된 pUG27MCS 플라스미드 | 본 발명 |
| pUG27MCS- NCL1 I626T INT | NCL1 I626T 가 적재된 pUG27MCS 플라스미드 | 본 발명 |
| pUG27MCS- SUR1 I245S INT | SUR1 I245S 가 적재된 pUG27MCS 플라스미드 | 본 발명 |
제조예
6. 분석 방법
효모 균주의 대사산물을 분석하기 위해, 상기 배양과정을 거친 800 ㎕의 효모 균주 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하고 이를 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 HPLC(high-performance liquid chromatography) 분석을 진행하였다. 이때, 상기 HPLC 분석은 UltiMate 3000 HPLC system(Thermo fishers scientific)을 이용하였고 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률검출기(RI detector)를 사용하였다. 이동상은 5 mM 황산을 사용하였고 유속은 0.6 ml/분, 온도는 60℃로 설정하였다. 세포 밀도는 Varian Cary50 UV/Vis spectrophotometer(Agilent)를 사용하여 600 nm의 파장에서 측정하였다.
제조예
7. 유전적으로 재조합된 D형 젖산 생산용 효모(
Saccharomyces
cerevisiae
) 균주 제작
젖산 생산에 있어 경쟁 대사 산물인 에탄올 및 글리세롤의 합성 경로를 차단하기 위하여, 5종의 알코올 탈수소효소 (ADH) 및 2 종의 글리세롤-3-인산 탈수소효소(GPD)가 결손된 균주를 플랫폼 균주로 사용하였다. 이때, 상기 5종의 알코올 탈수소효소는 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4 및 ADH5이며, 상기 2종의 글리세롤-3-인산 탈수소효소는 GPD1 및 GPD2이다. 상기 균주의 D형 젖산 탈수소효소(DLD) 위치에 Leuconostoc mesenteroides subsp . mesenteroides ATCC 8293 유래의 D형 젖산 탈수소 효소(ldhA)를 삽입하여 D형 젖산을 생산할 수 있는 효모 균주 JHY5610를 제작하였다. 효모 균주에서 D형 젖산 생산 경로 및 경쟁 대사산물인 에탄올과 글리세롤의 합성 경로를 도 1에 나타내었다.
상기 D형 젖산 생산용 효모 균주 JHY5610의 젖산 생산능을 확인하기 위해, 상기 균주를 50 g/L의 포도당이 포함된 YPD 배지에서 배양하였고, 젖산 생산능을 평가하였다. 이를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, JHY5610 균주는 최종적으로 약 38.8 g/L의 포도당을 소모하여 약 24.7 g/L의 D형 젖산을 생산하였다.
II. 젖산
생산능이
향상된 형질전환 미생물의 제작 및 유전형 분석
실시예
1. 적응 진화를 통한 D형 젖산
생산능이
향상된 효모 균주 선별
상기 제조예 7의 D형 젖산 생산용 효모 균주 JHY5610은 젖산을 생산함에 따라 세포 성장이 저해되는 현상 (inhibitory effect)과 제한된 포도당 소모능을 보이게 되는데, 이는 고농도의 젖산을 생산하는데 있어 한계점으로 작용한다. 이를 극복하기 위해 적응 진화를 유도하여 D형 젖산 생산능이 향상된 균주를 제작하였다. 적응 진화를 유도하기 위해, JHY5610 균주를 10 g/L에서 40 g/L로 젖산 농도가 점진적으로 증가된 배지에서 계대 배양하였고 총 15번의 연속적인 계대 배양을 통해 D형 젖산 생산능이 향상된 균주 JHY5710를 선별하였다. YPD 배지 및 1.0%의 젖산이 포함된 YPD 배지에서, 상기 선별된 JHY5710 균주와 적응 진화 전의 JHY5610 균주의 세포 성장을 비교하였다. 이를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 상기 선별된 균주 JHY5710 균주는 적응 진화 전의 JHY5610 균주에 비해 YPD 배지 및 1.0%의 젖산이 포함된 YPD 배지에서 세포 성장이 향상되었다. 이를 통해 JHY5710 균주의 젖산에 대한 저항성이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이, JHY5710 균주의 포도당 소모능이 증가하였고 이에 따라 D형 젖산 생산량이 약 30% 증가하였다.
실시예
2. 선별된 균주의 유전체 염기 서열 분석을 통한 유전자 돌연변이 확인
상기 실시예 1에서 적응 진화를 통해 선별된 균주 JHY5710의 젖산 생산능 및 저항성 향상에 기여하는 유전자를 찾기 위해, 효모 균주의 유전체 염기 서열 분석(whole genome sequencing)을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에 나타난 바와 같이, JHY5710 균주는 적응 진화를 통해 총 5개의 유전자가 변이되었다.
이때, ERF2 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는다. 이때, 상기 ERF2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다. 또한, BSD2 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는다. 이때, BSD2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.
또한, CIT2 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는다. 이때, 상기 CIT2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다. 상기 CIT2 단백질의 아미노산 서열에서 45번째 위치인 발린(Val, V)이 페닐알라닌(Phe, F)으로 치환된 재조합 CIT2 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지며, 상기 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.
또한, NCL1 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는다. 이때, 상기 NCL1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다. 상기 NCL1 단백질의 아미노산 서열에서 626번째 위치인 이소류신(Ile, I)이 트레오닌(Thr, T)으로 치환된 재조합 NCL1 단백질은 서열번호 15의 아미노산 서열을 가진다. 이때, 재조합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 가진다.
| 유전자 | 돌연변이 유형 | 뉴클레오티드 변화 | 아미노산 변화 |
| bsd2 | Nonsense (AGA → TGA) | 724A → T | Arg242 → Stop |
| erf2 | Frameshift | Δ261C | Pro87 이후 frameshift |
| cit2 | Missense (GTT → TTT) | 133G → T | Val45 → Phe |
| ncl1 | Missense (ATC → ACC) | 1877T → C | Ile626 → Thr |
| sur1 | Missense (ATT → AGT) | 734T → G | Ile245 → Ser |
III. 돌연변이 유전자와 젖산
생산능과의
관련성 확인
실시예
3. 돌연변이 유전자들의 젖산
생산능
및 저항성에 대한 효과 확인
상기 실시예 2의 적응 진화된 젖산 생산 균주인 JHY5710에서 발견된 돌연변이 유전자들의 기능을 확인하기 위해, 적응 진화 전 균주인 JHY5610에 상기 유전자들의 돌연변이를 각각 도입하였다. 이때, bsd2 유전자의 넌센스(nonsense) 돌연변이와 erf2 유전자의 틀이동(frameshift) 돌연변이는 각 유전자를 결손시키는 것으로 대체하였다.
실시예
3.1. 젖산에 대한 저항성 확인
상기 JHY5710 균주에서 발견된 각 유전자들의 돌연변이를 JHY5610 균주에 도입하여 제작된 5종 변이주들의 젖산에 대한 저항성 효과를 확인하기 위해, 각 변이주들을 1.0%의 젖산이 포함된 YPD 고체 배지에서 배양하였고, 젖산에 대한 저항성을 확인하였다. 이를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, sur1 유전자의 돌연변이가 도입되어 제작된 JHY5615(SUR1 I245S ) 변이주의 경우, 적응 진화 전의 JHY5610 균주에 비해 젖산에 대한 저항성이 증가하였다. 나머지 4종의 변이주들의 경우, 젖산에 대한 저항성이 감소하였다.
실시예
3.2. 젖산
생산능
확인
상기 제작된 5종 변이주들의 D형 젖산 생산능을 평가하였다. 이를 도 2 및 도 5에 나타내었다. 도 2 및 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 erf2 및 sur1 유전자의 돌연변이가 도입되어 제작된 JHY5612(erf2) 및 JHY5615(SUR1 I245S ) 변이주의 경우, 적응 진화 전의 균주 JHY5610에 비해 포도당 소모능이 증가함에 따라 D형 젖산 생산량이 증가하였다. 나머지 변이주들의 경우 적응 진화 전 균주인 JHY5610과 비교하여 D형 젖산 생산능이 비슷한 수준이거나 약간 감소하였다.
젖산에 대한 저항성과 생산능 향상에 효과를 나타낸 돌연변이 2종(JHY5612 및 JHY5615)의 시너지 효과를 확인하기 위해, JHY5617(erf2 , SUR1 I245S ) 변이주를 제작하였다. 상기 JHY5617(erf2 , SUR1 I245S ) 변이주의 젖산에 대한 저항성 및 생산능을 평가하였고, 이를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 상기 JHY5617(erf2 , SUR1 I245S ) 변이주의 젖산에 대한 저항성 및 생산능이 적응 진화 균주 JHY5710 수준으로 증가하였다. 이를 통해 2종의 돌연변이가 적응 진화 균주의 젖산 생산능 향상에 주요 기여 인자임을 확인하였다. 또한, JHY5615(SUR1 I245S ) 변이주의 젖산에 대한 저항성 및 생산능이 증가한 반면, JHY5612(erf2)의 경우 젖산에 대한 저항성의 증대 없이 젖산 생산능만 증가하였다. 이는 젖산에 대한 저항성 및 생산능이 증대된 적응 진화 균주 JHY5710의 경우 우성 돌연변이(dominant mutation)가 아닌 서로 다른 기능을 가진 다중 돌연변이(multiple mutation)가 복합적으로 균주 특성에 영향을 미치는 것을 의미한다.
실시예
4. 피루브산
탈탄산효소
(PDC) 유전자의 추가 결손을 통한 젖산 생산 증가 확인
상기 실시예 1에서 적응 진화된 젖산 생산 균주 (JHY5710)의 경우 에탄올 생산량의 감소와 함께 D형 젖산 생산량이 증가하였으나 아세트산의 생산량이 증가하였다 (약 2.9 g/L). 따라서 피루브산으로부터 아세트알데히드를 통해 형성되는 아세트산의 생산량을 감소시키기 위해, PDC1 유전자가 추가적으로 결손된 균주 JHY5720을 제작하였다. 상기 제작된 균주의 젖산 생산능을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 상기 PDC1 유전자가 추가적으로 결손된 균주 JHY5720에서 아세트산 생산이 감소할 뿐만 아니라 에탄올 생산의 감소 및 D형 젖산의 생산이 증가하였다.
실시예
5. 젖산
생산능
및 저항성 증대에 기여한 유전자
SUR1의
돌연변이 부위가 지닌 일반성 확인 및 치환된 아미노산 별 저항성 증대 확인
상기 실시예 3에서 적응 진화 전 균주(JHY5610)와 비교하여 JHY5615(SUR1 I245S ) 변이주가 젖산에 대한 저항성이 증가되었음을 확인하였다. 상기 돌연변이 부위(SUR1의 245번째 아미노산)가 지닌 일반성을 확인하기 위해, 적응 진화 전 균주(JHY5610)의 SUR1의 245번째 아미노산을 세린(serine, S) 및 세린 이외의 나머지 17가지의 아미노산(C, N, P, Q, T, H, K, R, D, E, A, G, L, M, V, W 및 Y)으로 돌연변이한 총 18가지의 균주를 제작하였고, 각 변이주들의 젖산에 대한 저항성 증대를 확인하였다.
상기 제작된 18종 변이주들의 젖산에 대한 저항성 효과를 확인하기 위해 150 mM 및 300 mM의 젖산이 포함된 두 종류의 YPD(yeast peptone dextrose) 고체 배지에서 배양하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 적응 진화 전 균주(JHY5610)와 비교하여 18종의 변이주들 모두 젖산에 대한 저항성이 증가되었다. 이는 SUR1의 245번째 아미노산인 이소류신(isoleucine, I)(SUR1 I245 )의 돌연변이가 젖산 저항성을 증대시키는 일반성을 지니고 있음을 나타낸다. 또한, 18종의 변이주 중에는 JHY5615(SUR1 I245S ) 변이주(S 균주)보다 젖산에 대한 저항성이 더 높은 균주가 존재함을 확인하였다(K, D, A, V, L, Y 변이주). 이는 앞서 제작한 젖산 생산 균주(JHY5720)에 추가 적용 시 젖산 생산량을 더욱 증대시킬 가능성이 있음을 시사한다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> TRANSFORMED MICROORGANISM WITH ENHANCED PRODUCTIVITY OF LACTIC
ACID
<130> FPD/201805-0025
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<151> 2017-07-17
<160> 44
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1
<400> 1
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1 5 10 15
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Leu Leu Ala Arg Gln Gln Lys Arg Leu Arg Lys Asp Ser Asn Thr Asn
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Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Arg Lys Ser Asp Val Tyr Asp Leu Glu
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<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1
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gatctacatc cagattacaa gtacatccta tggacggacg agatggccta tgagtttata 300
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atggggtcta ctggtccgtt gtttttaagt gttatttgga agcagtacaa aagatggcgc 660
atacctaaga acgggacagt aagaatccta caacctgctt actacaagat gcatagttat 720
tcatttttct ccattactaa aggctcttca tggcatttag atgatgcaaa attgatgaaa 780
gcactagaaa accacatctt atcctgcgtc gttaccggat ttatttttgg cttctttatc 840
ctatatggtg aattcacgtt ctattgctgg ttgtgttcca agaatttcag taatctaacc 900
aaaaattgga aacttaatgc tataaaagta agatttgtca caattctaaa ttcattaggc 960
ttaagactaa agttgagtaa aagtaccagt gatactgcca gtgccacttt gctggcaagg 1020
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1 I245S
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Glu Asn Glu Lys Trp Glu Lys Tyr Tyr Lys Thr Leu Ala Leu Phe Pro
35 40 45
Glu Asp Gln Trp Glu Glu Phe Lys Lys Thr Cys Gln Ala Pro Leu Pro
50 55 60
Leu Thr Phe Arg Ile Thr Gly Ser Arg Lys His Ala Gly Glu Val Leu
65 70 75 80
Asn Leu Phe Lys Glu Arg His Leu Pro Asn Leu Thr Asn Val Glu Phe
85 90 95
Glu Gly Glu Lys Ile Lys Ala Pro Val Glu Leu Pro Trp Tyr Pro Asp
100 105 110
His Leu Ala Trp Gln Leu Asp Val Pro Lys Thr Val Ile Arg Lys Asn
115 120 125
Glu Gln Phe Ala Lys Thr Gln Arg Phe Leu Val Val Glu Asn Ala Val
130 135 140
Gly Asn Ile Ser Arg Gln Glu Ala Val Ser Met Ile Pro Pro Ile Val
145 150 155 160
Leu Glu Val Lys Pro His His Thr Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ser Lys Thr Ala Gln Leu Ile Glu Ala Leu His Lys Asp Thr Asp
180 185 190
Glu Pro Ser Gly Phe Val Val Ala Asn Asp Ala Asp Ala Arg Arg Ser
195 200 205
His Met Leu Val His Gln Leu Lys Arg Leu Asn Ser Ala Asn Leu Met
210 215 220
Val Val Asn His Asp Ala Gln Phe Phe Pro Arg Ile Arg Leu His Gly
225 230 235 240
Asn Ser Asn Asn Lys Asn Asp Val Leu Lys Phe Asp Arg Ile Leu Cys
245 250 255
Asp Val Pro Cys Ser Gly Asp Gly Thr Met Arg Lys Asn Val Asn Val
260 265 270
Trp Lys Asp Trp Asn Thr Gln Ala Gly Leu Gly Leu His Ala Val Gln
275 280 285
Leu Asn Ile Leu Asn Arg Gly Leu His Leu Leu Lys Asn Asn Gly Arg
290 295 300
Leu Val Tyr Ser Thr Cys Ser Leu Asn Pro Ile Glu Asn Glu Ala Val
305 310 315 320
Val Ala Glu Ala Leu Arg Lys Trp Gly Asp Lys Ile Arg Leu Val Asn
325 330 335
Cys Asp Asp Lys Leu Pro Gly Leu Ile Arg Ser Lys Gly Val Ser Lys
340 345 350
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Gly Pro Gln Thr Lys Lys Ile Lys Val Glu Glu Val Gln Lys Lys Glu
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Gln His Glu Ala Leu Lys Val Cys Trp Asp Phe Tyr Gly Ile Asp Asn
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Ile Phe Asp Arg Asn Thr Cys Leu Val Arg Asn Ala Thr Gly Glu Pro
485 490 495
Thr Arg Val Val Tyr Thr Val Cys Pro Ala Leu Lys Asp Val Ile Gln
500 505 510
Ala Asn Asp Asp Arg Leu Lys Ile Ile Tyr Ser Gly Val Lys Leu Phe
515 520 525
Val Ser Gln Arg Ser Asp Ile Glu Cys Ser Trp Arg Ile Gln Ser Glu
530 535 540
Ser Leu Pro Ile Met Lys His His Met Lys Ser Asn Arg Ile Val Glu
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Ala Asn Leu Glu Met Leu Lys His Leu Leu Ile Glu Ser Phe Pro Asn
565 570 575
Phe Asp Asp Ile Arg Ser Lys Asn Ile Asp Asn Asp Phe Val Glu Lys
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Met Thr Lys Leu Ser Ser Gly Cys Ala Phe Ile Asp Val Ser Arg Asn
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Thr Gly Thr Ser Thr Glu Ala Pro Ser Ala Ala Asn
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<211> 2055
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of Saccharomyces cerevisiae NCL1 I626T
<400> 16
atggctagaa gaaagaattt caaaaaaggg aacaagaaga cttttggtgc tcgtgatgac 60
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tataagactt tagctctttt cccagaagat caatgggaag aatttaaaaa gacatgtcaa 180
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aatttgttta aagaaagaca tctaccaaac ttgactaatg ttgagtttga aggtgagaag 300
attaaggccc ctgtagaatt accttggtat ccagaccatc ttgcttggca attggacgtt 360
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gctcaattaa tcgaagcctt gcacaaggat acagatgaac catctggttt cgttgtagct 600
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aactcaaata acaagaatga tgttttaaaa tttgacagaa tcctgtgtga cgttccatgt 780
tctggtgatg gtaccatgag gaaaaatgtt aatgtttgga aagactggaa cacacaagca 840
ggtcttggtt tgcatgctgt tcagctgaat atattaaaca ggggtttgca tcttctaaag 900
aacaacggta gattggttta ctcaacctgt tctttaaatc ctattgaaaa tgaagcggtt 960
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cttcctggcc taataagatc caagggtgta tccaaatggc ctgtctatga cagaaatttg 1080
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ggcggatttt tcattactgt tttcgaaaaa gtcgaagata gcactgaggc ggctacagag 1260
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agcgctgcta attga 2055
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<211> 348
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH1
<400> 17
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Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
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Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
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Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
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His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
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Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
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Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH1
<400> 18
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<211> 348
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH2
<400> 19
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Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH2
<400> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH3
<400> 21
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Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Glu
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Ala Asp Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile Ser Gly Ala Ala Gly
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH3
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aacgcctacg ttaaatcaga ggtattctct catgtggtga agtccatcaa tatcaagggt 960
tcttatgttg gtaacagagc tgatacgaga gaagccttag acttctttag cagaggtttg 1020
atcaaatcac caatcaaaat tgttggatta tctgaattac caaaggttta tgacttgatg 1080
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<210> 23
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH4
<400> 23
Met Ser Ser Val Thr Gly Phe Tyr Ile Pro Pro Ile Ser Phe Phe Gly
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Glu Met Thr Arg Phe Thr Ile Ile Ser Asn Glu Glu Lys Lys Ile
145 150 155 160
Lys Met Ala Ile Ile Asp Asn Asn Val Thr Pro Ala Val Ala Val Asn
165 170 175
Asp Pro Ser Thr Met Phe Gly Leu Pro Pro Ala Leu Thr Ala Ala Thr
180 185 190
Gly Leu Asp Ala Leu Thr His Cys Ile Glu Ala Tyr Val Ser Thr Ala
195 200 205
Ser Asn Pro Ile Thr Asp Ala Cys Ala Leu Lys Gly Ile Asp Leu Ile
210 215 220
Asn Glu Ser Leu Val Ala Ala Tyr Lys Asp Gly Lys Asp Lys Lys Ala
225 230 235 240
Arg Thr Asp Met Cys Tyr Ala Glu Tyr Leu Ala Gly Met Ala Phe Asn
245 250 255
Asn Ala Ser Leu Gly Tyr Val His Ala Leu Ala His Gln Leu Gly Gly
260 265 270
Phe Tyr His Leu Pro His Gly Val Cys Asn Ala Val Leu Leu Pro His
275 280 285
Val Gln Glu Ala Asn Met Gln Cys Pro Lys Ala Lys Lys Arg Leu Gly
290 295 300
Glu Ile Ala Leu His Cys Gly Ala Ser Gln Glu Asp Pro Glu Glu Thr
305 310 315 320
Ile Lys Ala Leu His Val Leu Asn Arg Thr Met Asn Ile Pro Arg Asn
325 330 335
Leu Lys Asp Leu Gly Val Lys Thr Glu Asp Phe Asp Ile Leu Ala Glu
340 345 350
His Ala Met His Asp Ala Cys His Leu Thr Asn Pro Val Gln Phe Thr
355 360 365
Lys Glu Gln Val Val Ala Ile Ile Lys Lys Ala Tyr Glu Tyr
370 375 380
<210> 24
<211> 1149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of Saccharomyces cerevisiae ADH4
<400> 24
atgtcttccg ttactgggtt ttacattcca ccaatctctt tctttggtga aggtgcttta 60
gaagaaaccg ctgattacat caaaaacaag gattacaaaa aggctttgat cgttactgat 120
cctggtattg cagctattgg tctctccggt agagtccaaa agatgttgga agaacgtggc 180
ttaaacgttg ctatctatga caaaactcaa ccaaacccaa atattgccaa tgtcacagct 240
ggtttgaagg ttttgaagga agaaaactct gaaattgtcg tttccattgg tggtggttct 300
gctcacgaca atgctaaggc cattgcttta ttggctacta acggtgggga aattggagat 360
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tag 1323
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275 280 285
Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys
290 295 300
Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr
305 310 315 320
Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Thr
325 330 335
Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg
340 345 350
Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu
355 360 365
Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val
370 375 380
Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe
385 390 395 400
Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly
405 410 415
Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile
420 425 430
Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln
435 440 445
Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro
450 455 460
Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile
465 470 475 480
His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu
485 490 495
Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val
500 505 510
Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn
515 520 525
Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Ile Met Leu Pro Val Phe Asp
530 535 540
Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn
545 550 555 560
Ala Lys Gln
<210> 34
<211> 1692
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of Saccharomyces cerevisiae PDC1
<400> 34
atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60
accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120
gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180
tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240
gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300
gtcccatcca tctctgctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420
gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480
agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540
ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600
attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660
tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720
ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780
ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840
ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900
tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960
ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020
gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080
gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140
ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200
ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260
gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320
ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380
ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440
cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500
actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560
ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620
ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680
gctaagcaat aa 1692
<210> 35
<211> 331
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of ldhA originated from Leuconostoc
mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293
<400> 35
Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Ser Leu
1 5 10 15
Glu Glu Trp Lys Ala Ala Asn Pro Glu Ile Glu Val Asp Tyr Thr Gln
20 25 30
Glu Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ser Asp Ser
35 40 45
Ala Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala
50 55 60
Leu Ala Asn Val Gly Val Thr Asn Leu Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr
65 70 75 80
Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asn Phe Asn Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met Ile
100 105 110
Gln Leu Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys Ile
115 120 125
Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg
130 135 140
Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val Ala
145 150 155 160
Ile Asn Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Lys
165 170 175
Tyr Pro Asn Ala Glu Leu Gln Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ala Ile Ser Leu Tyr Val Pro Gly
195 200 205
Val Pro Glu Asn His His Leu Ile Asn Ala Asp Ala Ile Ala Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Val Val Ile Met Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Met Asp
225 230 235 240
Ile Asp Ala Ile Ile Asp Gly Leu Asn Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe
245 250 255
Gly Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp Trp
260 265 270
Ser Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ala Arg
275 280 285
Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala
290 295 300
Val Leu Glu Met Val His Gln Ser Phe Asp Ala Ala Val Ala Phe Ala
305 310 315 320
Lys Gly Glu Lys Pro Ala Ile Ala Val Glu Tyr
325 330
<210> 36
<211> 996
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene sequence of ldhA originated from Leuconostoc mesenteroides
subsp. mesenteroides ATCC 8293
<400> 36
atgaagattt ttgcttacgg cattcgtgat gatgaaaagc catcacttga agaatggaaa 60
gcggctaacc cagagattga agtggactac acacaagaat tattgacacc tgaaacagct 120
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaa 180
acattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtaca 240
gataacattg attttgatgc agcacgtgaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtt 300
tattcaccaa atgctattgc agaacactca atgattcaat tatctcgttt gctacgtcgc 360
acgaaagcat tggatgccaa aattgctaag cacgacttgc gttgggcacc aacaattgga 420
cgtgaaatgc gtatgcaaac agttggtgtt attggtacag gtcatattgg ccgtgttgct 480
attaacattt tgaaaggctt tggggccaag gttattgctt atgacaagta cccaaatgct 540
gaattacaag cagaaggttt gtacgttgac acattagacg aattatatgc acaagctgat 600
gcaatttcat tgtatgttcc tggtgtacct gaaaaccatc atctaatcaa tgcagatgct 660
attgctaaga tgaaggatgg tgtggttatc atgaacgctg cgcgtggtaa tttgatggac 720
attgacgcta ttattgatgg tttgaattct ggtaagattt cagacttcgg tatggacgtt 780
tatgaaaatg aagttggctt gttcaatgaa gattggtctg gtaaagaatt cccagatgct 840
aagattgctg acttgattgc acgcgaaaat gtattggtta cgccacacac ggctttctat 900
acaactaaag ctgttctaga aatggttcac caatcatttg atgcagcagt tgctttcgcc 960
aagggtgaga agccagctat tgctgttgaa tattaa 996
<210> 37
<211> 644
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of TDH3 promoter
<400> 37
tcattatcaa tactcgccat ttcaaagaat acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct 60
aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa 120
tagggggcgg gttacacaga atatataaca tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc 180
tggcatccac taaatataat ggagcccgct ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa 240
tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc aaccatcagt tcataggtcc attctcttag 300
cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg 360
atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac aaggcaattg acccacgcat gtatctatct 420
cattttctta caccttctat taccttctgc tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa 480
aggttgaaac cagttccctg aaattattcc cctacttgac taataagtat ataaagacgg 540
taggtattga ttgtaattct gtaaatctat ttcttaaact tcttaaattc tacttttata 600
gttagtcttt tttttagttt taaaacacca gaacttagtt tcga 644
<210> 38
<211> 393
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of CYC1 terminator
<400> 38
aaaaagaatc atgattgaat gaagatatta tttttttgaa ttatattttt taaattttat 60
ataaagacat ggtttttctt ttcaactcaa ataaagattt ataagttact taaataacat 120
acattttata aggtattcta taaaaagagt attatgttat tgttaacctt tttgtctcca 180
attgtcgtca taacgatgag gtgttgcatt tttggaaacg agattgacat agagtcaaaa 240
tttgctaaat ttgatccctc ccatcgcaag ataatcttcc ctcaaggtta tcatgattat 300
caggatggcg aaaggatacg ctaaaaattc aataaaaaat tcaatataat tttcgtttcc 360
caagaactaa cttggaaggt tatacatggg tac 393
<210> 39
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1 I245K
<400> 39
Met Arg Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Ile Cys Phe Asn Ile Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ile Tyr Tyr Thr Phe Asp Leu Leu Thr Leu Cys Ile Asp
20 25 30
Asp Thr Val Lys Asp Ala Ile Leu Glu Glu Asp Leu Asn Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Gln Leu Ile Pro Lys Ile Ile His Gln Thr Tyr Lys
50 55 60
Thr Glu Asp Ile Pro Glu His Trp Lys Glu Gly Arg Gln Lys Cys Leu
65 70 75 80
Asp Leu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Ile Leu Trp Thr Asp Glu Met Ala
85 90 95
Tyr Glu Phe Ile Lys Glu Glu Tyr Pro Trp Phe Leu Asp Thr Phe Glu
100 105 110
Asn Tyr Lys Tyr Pro Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Phe Ile
115 120 125
Leu Ser His Tyr Gly Gly Val Tyr Ile Asp Leu Asp Asp Gly Cys Glu
130 135 140
Arg Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ala Phe Pro Ala Phe Leu Arg Lys Thr
145 150 155 160
Ser Pro Leu Gly Val Ser Asn Asp Val Met Gly Ser Val Pro Arg His
165 170 175
Pro Phe Phe Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Lys His Tyr Asp Lys Tyr
180 185 190
Trp Phe Ile Pro Tyr Met Thr Ile Met Gly Ser Thr Gly Pro Leu Phe
195 200 205
Leu Ser Val Ile Trp Lys Gln Tyr Lys Arg Trp Arg Ile Pro Lys Asn
210 215 220
Gly Thr Val Arg Ile Leu Gln Pro Ala Tyr Tyr Lys Met His Ser Tyr
225 230 235 240
Ser Phe Phe Ser Lys Thr Lys Gly Ser Ser Trp His Leu Asp Asp Ala
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Leu Glu Asn His Ile Leu Ser Cys Val Val Thr
260 265 270
Gly Phe Ile Phe Gly Phe Phe Ile Leu Tyr Gly Glu Phe Thr Phe Tyr
275 280 285
Cys Trp Leu Cys Ser Lys Asn Phe Ser Asn Leu Thr Lys Asn Trp Lys
290 295 300
Leu Asn Ala Ile Lys Val Arg Phe Val Thr Ile Leu Asn Ser Leu Gly
305 310 315 320
Leu Arg Leu Lys Leu Ser Lys Ser Thr Ser Asp Thr Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Leu Leu Ala Arg Gln Gln Lys Arg Leu Arg Lys Asp Ser Asn Thr Asn
340 345 350
Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Arg Lys Ser Asp Val Tyr Asp Leu Glu
355 360 365
Lys Asn Asp Ser Ser Lys Tyr Ser Leu Gly Asn Asn Ser Ser
370 375 380
<210> 40
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1 I245D
<400> 40
Met Arg Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Ile Cys Phe Asn Ile Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ile Tyr Tyr Thr Phe Asp Leu Leu Thr Leu Cys Ile Asp
20 25 30
Asp Thr Val Lys Asp Ala Ile Leu Glu Glu Asp Leu Asn Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Gln Leu Ile Pro Lys Ile Ile His Gln Thr Tyr Lys
50 55 60
Thr Glu Asp Ile Pro Glu His Trp Lys Glu Gly Arg Gln Lys Cys Leu
65 70 75 80
Asp Leu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Ile Leu Trp Thr Asp Glu Met Ala
85 90 95
Tyr Glu Phe Ile Lys Glu Glu Tyr Pro Trp Phe Leu Asp Thr Phe Glu
100 105 110
Asn Tyr Lys Tyr Pro Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Phe Ile
115 120 125
Leu Ser His Tyr Gly Gly Val Tyr Ile Asp Leu Asp Asp Gly Cys Glu
130 135 140
Arg Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ala Phe Pro Ala Phe Leu Arg Lys Thr
145 150 155 160
Ser Pro Leu Gly Val Ser Asn Asp Val Met Gly Ser Val Pro Arg His
165 170 175
Pro Phe Phe Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Lys His Tyr Asp Lys Tyr
180 185 190
Trp Phe Ile Pro Tyr Met Thr Ile Met Gly Ser Thr Gly Pro Leu Phe
195 200 205
Leu Ser Val Ile Trp Lys Gln Tyr Lys Arg Trp Arg Ile Pro Lys Asn
210 215 220
Gly Thr Val Arg Ile Leu Gln Pro Ala Tyr Tyr Lys Met His Ser Tyr
225 230 235 240
Ser Phe Phe Ser Asp Thr Lys Gly Ser Ser Trp His Leu Asp Asp Ala
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Leu Glu Asn His Ile Leu Ser Cys Val Val Thr
260 265 270
Gly Phe Ile Phe Gly Phe Phe Ile Leu Tyr Gly Glu Phe Thr Phe Tyr
275 280 285
Cys Trp Leu Cys Ser Lys Asn Phe Ser Asn Leu Thr Lys Asn Trp Lys
290 295 300
Leu Asn Ala Ile Lys Val Arg Phe Val Thr Ile Leu Asn Ser Leu Gly
305 310 315 320
Leu Arg Leu Lys Leu Ser Lys Ser Thr Ser Asp Thr Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Leu Leu Ala Arg Gln Gln Lys Arg Leu Arg Lys Asp Ser Asn Thr Asn
340 345 350
Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Arg Lys Ser Asp Val Tyr Asp Leu Glu
355 360 365
Lys Asn Asp Ser Ser Lys Tyr Ser Leu Gly Asn Asn Ser Ser
370 375 380
<210> 41
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1 I245A
<400> 41
Met Arg Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Ile Cys Phe Asn Ile Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ile Tyr Tyr Thr Phe Asp Leu Leu Thr Leu Cys Ile Asp
20 25 30
Asp Thr Val Lys Asp Ala Ile Leu Glu Glu Asp Leu Asn Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Gln Leu Ile Pro Lys Ile Ile His Gln Thr Tyr Lys
50 55 60
Thr Glu Asp Ile Pro Glu His Trp Lys Glu Gly Arg Gln Lys Cys Leu
65 70 75 80
Asp Leu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Ile Leu Trp Thr Asp Glu Met Ala
85 90 95
Tyr Glu Phe Ile Lys Glu Glu Tyr Pro Trp Phe Leu Asp Thr Phe Glu
100 105 110
Asn Tyr Lys Tyr Pro Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Phe Ile
115 120 125
Leu Ser His Tyr Gly Gly Val Tyr Ile Asp Leu Asp Asp Gly Cys Glu
130 135 140
Arg Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ala Phe Pro Ala Phe Leu Arg Lys Thr
145 150 155 160
Ser Pro Leu Gly Val Ser Asn Asp Val Met Gly Ser Val Pro Arg His
165 170 175
Pro Phe Phe Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Lys His Tyr Asp Lys Tyr
180 185 190
Trp Phe Ile Pro Tyr Met Thr Ile Met Gly Ser Thr Gly Pro Leu Phe
195 200 205
Leu Ser Val Ile Trp Lys Gln Tyr Lys Arg Trp Arg Ile Pro Lys Asn
210 215 220
Gly Thr Val Arg Ile Leu Gln Pro Ala Tyr Tyr Lys Met His Ser Tyr
225 230 235 240
Ser Phe Phe Ser Ala Thr Lys Gly Ser Ser Trp His Leu Asp Asp Ala
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Leu Glu Asn His Ile Leu Ser Cys Val Val Thr
260 265 270
Gly Phe Ile Phe Gly Phe Phe Ile Leu Tyr Gly Glu Phe Thr Phe Tyr
275 280 285
Cys Trp Leu Cys Ser Lys Asn Phe Ser Asn Leu Thr Lys Asn Trp Lys
290 295 300
Leu Asn Ala Ile Lys Val Arg Phe Val Thr Ile Leu Asn Ser Leu Gly
305 310 315 320
Leu Arg Leu Lys Leu Ser Lys Ser Thr Ser Asp Thr Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Leu Leu Ala Arg Gln Gln Lys Arg Leu Arg Lys Asp Ser Asn Thr Asn
340 345 350
Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Arg Lys Ser Asp Val Tyr Asp Leu Glu
355 360 365
Lys Asn Asp Ser Ser Lys Tyr Ser Leu Gly Asn Asn Ser Ser
370 375 380
<210> 42
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1 I245L
<400> 42
Met Arg Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Ile Cys Phe Asn Ile Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ile Tyr Tyr Thr Phe Asp Leu Leu Thr Leu Cys Ile Asp
20 25 30
Asp Thr Val Lys Asp Ala Ile Leu Glu Glu Asp Leu Asn Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Gln Leu Ile Pro Lys Ile Ile His Gln Thr Tyr Lys
50 55 60
Thr Glu Asp Ile Pro Glu His Trp Lys Glu Gly Arg Gln Lys Cys Leu
65 70 75 80
Asp Leu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Ile Leu Trp Thr Asp Glu Met Ala
85 90 95
Tyr Glu Phe Ile Lys Glu Glu Tyr Pro Trp Phe Leu Asp Thr Phe Glu
100 105 110
Asn Tyr Lys Tyr Pro Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Phe Ile
115 120 125
Leu Ser His Tyr Gly Gly Val Tyr Ile Asp Leu Asp Asp Gly Cys Glu
130 135 140
Arg Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ala Phe Pro Ala Phe Leu Arg Lys Thr
145 150 155 160
Ser Pro Leu Gly Val Ser Asn Asp Val Met Gly Ser Val Pro Arg His
165 170 175
Pro Phe Phe Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Lys His Tyr Asp Lys Tyr
180 185 190
Trp Phe Ile Pro Tyr Met Thr Ile Met Gly Ser Thr Gly Pro Leu Phe
195 200 205
Leu Ser Val Ile Trp Lys Gln Tyr Lys Arg Trp Arg Ile Pro Lys Asn
210 215 220
Gly Thr Val Arg Ile Leu Gln Pro Ala Tyr Tyr Lys Met His Ser Tyr
225 230 235 240
Ser Phe Phe Ser Leu Thr Lys Gly Ser Ser Trp His Leu Asp Asp Ala
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Leu Glu Asn His Ile Leu Ser Cys Val Val Thr
260 265 270
Gly Phe Ile Phe Gly Phe Phe Ile Leu Tyr Gly Glu Phe Thr Phe Tyr
275 280 285
Cys Trp Leu Cys Ser Lys Asn Phe Ser Asn Leu Thr Lys Asn Trp Lys
290 295 300
Leu Asn Ala Ile Lys Val Arg Phe Val Thr Ile Leu Asn Ser Leu Gly
305 310 315 320
Leu Arg Leu Lys Leu Ser Lys Ser Thr Ser Asp Thr Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Leu Leu Ala Arg Gln Gln Lys Arg Leu Arg Lys Asp Ser Asn Thr Asn
340 345 350
Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Arg Lys Ser Asp Val Tyr Asp Leu Glu
355 360 365
Lys Asn Asp Ser Ser Lys Tyr Ser Leu Gly Asn Asn Ser Ser
370 375 380
<210> 43
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1 I245V
<400> 43
Met Arg Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Ile Cys Phe Asn Ile Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ile Tyr Tyr Thr Phe Asp Leu Leu Thr Leu Cys Ile Asp
20 25 30
Asp Thr Val Lys Asp Ala Ile Leu Glu Glu Asp Leu Asn Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Gln Leu Ile Pro Lys Ile Ile His Gln Thr Tyr Lys
50 55 60
Thr Glu Asp Ile Pro Glu His Trp Lys Glu Gly Arg Gln Lys Cys Leu
65 70 75 80
Asp Leu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Ile Leu Trp Thr Asp Glu Met Ala
85 90 95
Tyr Glu Phe Ile Lys Glu Glu Tyr Pro Trp Phe Leu Asp Thr Phe Glu
100 105 110
Asn Tyr Lys Tyr Pro Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Phe Ile
115 120 125
Leu Ser His Tyr Gly Gly Val Tyr Ile Asp Leu Asp Asp Gly Cys Glu
130 135 140
Arg Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ala Phe Pro Ala Phe Leu Arg Lys Thr
145 150 155 160
Ser Pro Leu Gly Val Ser Asn Asp Val Met Gly Ser Val Pro Arg His
165 170 175
Pro Phe Phe Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Lys His Tyr Asp Lys Tyr
180 185 190
Trp Phe Ile Pro Tyr Met Thr Ile Met Gly Ser Thr Gly Pro Leu Phe
195 200 205
Leu Ser Val Ile Trp Lys Gln Tyr Lys Arg Trp Arg Ile Pro Lys Asn
210 215 220
Gly Thr Val Arg Ile Leu Gln Pro Ala Tyr Tyr Lys Met His Ser Tyr
225 230 235 240
Ser Phe Phe Ser Val Thr Lys Gly Ser Ser Trp His Leu Asp Asp Ala
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Leu Glu Asn His Ile Leu Ser Cys Val Val Thr
260 265 270
Gly Phe Ile Phe Gly Phe Phe Ile Leu Tyr Gly Glu Phe Thr Phe Tyr
275 280 285
Cys Trp Leu Cys Ser Lys Asn Phe Ser Asn Leu Thr Lys Asn Trp Lys
290 295 300
Leu Asn Ala Ile Lys Val Arg Phe Val Thr Ile Leu Asn Ser Leu Gly
305 310 315 320
Leu Arg Leu Lys Leu Ser Lys Ser Thr Ser Asp Thr Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Leu Leu Ala Arg Gln Gln Lys Arg Leu Arg Lys Asp Ser Asn Thr Asn
340 345 350
Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Arg Lys Ser Asp Val Tyr Asp Leu Glu
355 360 365
Lys Asn Asp Ser Ser Lys Tyr Ser Leu Gly Asn Asn Ser Ser
370 375 380
<210> 44
<211> 382
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein sequence of Saccharomyces cerevisiae SUR1 I245Y
<400> 44
Met Arg Lys Glu Leu Lys Tyr Leu Ile Cys Phe Asn Ile Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Ile Ile Tyr Tyr Thr Phe Asp Leu Leu Thr Leu Cys Ile Asp
20 25 30
Asp Thr Val Lys Asp Ala Ile Leu Glu Glu Asp Leu Asn Pro Asp Ala
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Gln Leu Ile Pro Lys Ile Ile His Gln Thr Tyr Lys
50 55 60
Thr Glu Asp Ile Pro Glu His Trp Lys Glu Gly Arg Gln Lys Cys Leu
65 70 75 80
Asp Leu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Ile Leu Trp Thr Asp Glu Met Ala
85 90 95
Tyr Glu Phe Ile Lys Glu Glu Tyr Pro Trp Phe Leu Asp Thr Phe Glu
100 105 110
Asn Tyr Lys Tyr Pro Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ile Arg Tyr Phe Ile
115 120 125
Leu Ser His Tyr Gly Gly Val Tyr Ile Asp Leu Asp Asp Gly Cys Glu
130 135 140
Arg Lys Leu Asp Pro Leu Leu Ala Phe Pro Ala Phe Leu Arg Lys Thr
145 150 155 160
Ser Pro Leu Gly Val Ser Asn Asp Val Met Gly Ser Val Pro Arg His
165 170 175
Pro Phe Phe Leu Lys Ala Leu Lys Ser Leu Lys His Tyr Asp Lys Tyr
180 185 190
Trp Phe Ile Pro Tyr Met Thr Ile Met Gly Ser Thr Gly Pro Leu Phe
195 200 205
Leu Ser Val Ile Trp Lys Gln Tyr Lys Arg Trp Arg Ile Pro Lys Asn
210 215 220
Gly Thr Val Arg Ile Leu Gln Pro Ala Tyr Tyr Lys Met His Ser Tyr
225 230 235 240
Ser Phe Phe Ser Tyr Thr Lys Gly Ser Ser Trp His Leu Asp Asp Ala
245 250 255
Lys Leu Met Lys Ala Leu Glu Asn His Ile Leu Ser Cys Val Val Thr
260 265 270
Gly Phe Ile Phe Gly Phe Phe Ile Leu Tyr Gly Glu Phe Thr Phe Tyr
275 280 285
Cys Trp Leu Cys Ser Lys Asn Phe Ser Asn Leu Thr Lys Asn Trp Lys
290 295 300
Leu Asn Ala Ile Lys Val Arg Phe Val Thr Ile Leu Asn Ser Leu Gly
305 310 315 320
Leu Arg Leu Lys Leu Ser Lys Ser Thr Ser Asp Thr Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Leu Leu Ala Arg Gln Gln Lys Arg Leu Arg Lys Asp Ser Asn Thr Asn
340 345 350
Ile Val Leu Leu Lys Ser Ser Arg Lys Ser Asp Val Tyr Asp Leu Glu
355 360 365
Lys Asn Asp Ser Ser Lys Tyr Ser Leu Gly Asn Asn Ser Ser
370 375 380
Claims (13)
- 재조합 SUR1 단백질을 발현하는 젖산 생산능을 갖는 미생물로서, 상기 재조합 SUR1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 245번째 위치의 아이소루신(Ile)이 다른 아미노산으로 치환된 것이고, 상기 미생물은 사카로마이세스(Saccharomyces)인 것인, 젖산 생산능을 갖는 미생물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 아이소루신(Ile)은 세린(Ser), 리신(Lys), 아스파르트산(Asp), 알라닌(Ala), 루신(Leu), 발린(Val) 및 티로신(Tyr)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 치환된 것인, 젖산 생산능을 갖는 미생물. - 제1항에 있어서,
상기 미생물은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 것인, 젖산 생산능을 갖는 미생물. - 제1항에 있어서,
상기 미생물은 ERF2, BSD2, CIT2 및 NCL1으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질이 돌연변이된 것으로서,
상기 ERF2의 돌연변이는 서열번호 5의 87번째 위치의 프롤린(Pro) 이후 아미노산이 결실된 것이고,
상기 BSD2의 돌연변이는 서열번호 7의 242번째 위치의 아르기닌(Arg)이 종결코돈으로 치환된 것이며,
상기 CIT2의 돌연변이는 서열번호 9의 45번째 위치의 발린(Val)이 페닐알라닌(Phe)으로 치환된 것이고,
상기 NCL1의 돌연변이는 서열번호 13의 626번째 위치의 아이소루신(Ile)이 트레오닌(Thr)으로 치환된 것인, 젖산 생산능을 갖는 미생물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서,
상기 사카로마이세스 세레비지에는 ADH(alcohol dehydrogenase), GPD(glycerol-3-phosphate dehydrogenase), DLD(D-lactate dehydrogenase), 및 PDC(pyruvate decarboxylase)에서 선택되는 유전자 중 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 억제된 것인, 젖산 생산능을 갖는 미생물. - 제1항, 제3항 내지 제5항 또는 제10항에 따른 미생물 중 어느 하나의 미생물을 1 g/L 내지 100 g/L의 젖산 존재하에 배양하는 단계; 및
젖산에 대한 저항성이 증가한 미생물을 선별하는 단계를 포함하는, 젖산 생산능이 향상된 미생물을 수득하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 배양은 젖산 농도가 10 g/L에서 40 g/L로 점진적으로 증가된 배지에서 계대 배양을 통해 진행되는 것인, 젖산 생산능이 향상된 미생물을 수득하는 방법. - 제1항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 배양에 의해 생성된 젖산을 회수하는 단계를 포함하는, 젖산의 고효율 생산 방법.
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