CN1856577A - 用于生产d－乳酸的生物催化剂 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是提供D－乳酸的高效生产方法，另外，还提供光学纯度高、有机酸副产物少的高选择性D－乳酸生产方法。培养丙酮酸甲酸裂解酶失活或活性降低、且来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D－乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强的微生物、FAD依赖性D－乳酸脱氢酶失活或活性降低的微生物、或除上述微生物所述特征以外、具有TCA循环、且苹果酸脱氢酶失活或活性降低、且天冬氨酸解氨酶失活或活性降低的微生物，生产D－乳酸。在基因组上将编码ldhA的基因与控制涉及糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成的蛋白质表达的基因的启动子连接来增强ldhA活性。

Description

用于生产D-乳酸的生物催化剂

技术领域

本发明涉及高选择性地高效生产D-乳酸的微生物及使用该微生物生产D-乳酸的方法。详细而言，涉及高效生产纯度高的乳酸的方法，特别涉及丙酮酸的生成蓄积量少的有效的D-乳酸制造方法。

本发明还涉及D-乳酸的生产方法，其特征在于，该方法使用FAD依赖性D-乳酸脱氢酶失活或活性降低的微生物。

另外，本发明还涉及生产D-乳酸的微生物及使用该微生物的D-乳酸生产方法，所述微生物在生产D-乳酸时不产生杂质琥珀酸或富马酸。

背景技术

生物分解性聚合物聚乳酸引发CO₂问题、能源问题显著化的同时，作为可持续性(sustainability)、LCA(生命周期评估(life cycleassessment))对应型产品也备受瞩目，因此正寻找作为其原料的乳酸的有效且廉价的制造方法。

顺便提一下，目前工业生产的聚乳酸是L-乳酸聚合物，乳酸有L-乳酸和D-乳酸，近年来，D-乳酸作为聚合物原料或农药、医药的中间体而受到关注。但在任一用途中，都要求作为原料的乳酸具有高光学纯度。

自然界中存在乳酸菌或丝状菌等有效生产乳酸的微生物，在使用上述菌制造乳酸的方法中，已经有实用化的方法。例如，作为能有效生产L-乳酸的微生物已知有Lactbacillus delbrueckii等，作为能有效生产D-乳酸的微生物已知有Sporolactobacillus属的微生物等。任一种情况下乳酸的蓄积量都达到了高水平，但纯化培养液中含有的乳酸以外的副产物例如醋酸、乙醇、乙偶姻、丙酮酸等化合物在纯化过程中无法完全除去，导致最终产物乳酸的品质下降。另外，由于光学异构体的混入导致光学纯度下降也变成严重的问题。

为了避免如上所述的乳酸纯度下降，降低利用微生物生产时的副产物量是有效的方法。如果利用近年来开发的基因重组技术破坏微生物的特定基因，就可能特异性阻碍副产物的生产。但是目前，基因破坏法并不能容易地适用于任一种微生物，所以在乳酸菌或丝状菌等原来能高效生产乳酸的微生物中不容易适用。其原因是上述微生物基因组信息不充分，而且作为基因重组的宿主也不能广泛使用。

与此相对，利用基因组信息丰富、作为基因重组宿主的实际成果充分的大肠埃希菌、酵母、人培养细胞等，能比较容易地进行基因破坏。特别是从增殖迅速或培养容易方面考虑，最优选大肠埃希菌。由于大肠埃希菌生产的乳酸只有D-型，所以在得到光学纯度高的D-乳酸时，是合适的宿主。但是，野生型的大肠埃希菌的D-乳酸生产率低，而且产生D-乳酸以外的各种有机酸副产物。为了解决该问题，曾经尝试利用基因重组改变大肠埃希菌的代谢途径，选择性地高效生产D-乳酸。

Chang等人(Chang，D.-E.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.65(4)，pp1384-1389(1999))使用含有5％葡萄糖、及氨基酸的培养基，将大肠埃希菌的磷酸转乙酰酶(以下简称为pta)、及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下简称为ppc)2种变异株先利用通气培养使菌体增殖，然后进行厌氧培养，同时，追加葡萄糖，使培养基中的葡萄糖不超过5％，进行培养，经60小时产生62.2g/L的D-乳酸。此时，由葡萄糖转化成D-乳酸的转化率为76％。

Zhou等人(Zhou，S.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.69(1)，pp399-407(2003))制备破坏丙酮酸甲酸裂解酶(以下简称为pfl)、富马酸还原酶(以下简称为frd)、醇/醛脱氢酶(以下简称为adeE)、以及醋酸激酶(以下简称为ackA)4种酶的大肠埃希菌，将其在含有5％葡萄糖的无机盐培养基中厌氧培养168小时，产生48.5g/L的D-乳酸，而不生成甲酸、琥珀酸、乙醇以及醋酸副产物。但是，在该试验中虽然能成功地高选择性生产D-乳酸，但生产率低，为0.29g/L/hr，所以不能同时满足选择率和生产率两方面的要求。另外，没有提及副产物丙酮酸，其减少效果也不清楚。由于丙酮酸是D-乳酸的代谢反应基质，因此与其他副产物有机酸不同，如果过度抑制其生成，则导致D-乳酸本身的生成被抑制。所以，难以将丙酮酸的产生抑制在最低限。通常，在丙酮酸以杂质的形式包含在乳酸单体原料中的情况下，出现聚合物聚合率降低等不希望出现的问题，这是本领域技术人员熟知的事实，由此可知，丙酮酸是必须减少的副产物之一。但过去没有关于既保持D-乳酸的高效生产率，又能成功抑制丙酮酸副产物生成的报告。

总之，目前已知的大肠埃希菌的D-乳酸最大蓄积量是62.2g/L，其生产时间为60小时。另一方面，考虑到L-乳酸的工业化生产中使用的乳酸菌或丝状菌的L-乳酸生产率为蓄积量大于或等于100g/L，生产时间在24小时以内，则不得不认为大肠埃希菌的D-乳酸蓄积量和生产时间仍然处于低水平。过去没有关于大肠埃希菌能实现与乳酸菌或丝状菌同等的乳酸生产率的报告，而且，也没有暗示使用大肠埃希菌能否使D-乳酸的蓄积量超过100g/L的数据。

使用大肠菌进行D-乳酸发酵时，通常不优选酶的存在。原因是如果存在酶等电子受体，则大肠菌不发酵而进行呼吸。只有在酶等电子受体不存在的情况下，大肠菌才能仅通过基质水平的磷酸化得到能量(ATP)，利用糖酵解中得到的还原能力(NADH)，生产乳酸等还原性有机酸。基于上述理由，以往的利用大肠菌的D-乳酸发酵几乎都是通过厌氧培养进行。虽然少数是通过前半段为通气培养、后半段为厌氧培养的二段式培养进行，但通过上述前半段的通气培养是为了确保足够的菌体量，最终的乳酸发酵仍然是通过厌氧培养进行的。但实际的工业生产时，在添加到培养基中的廉价的氨基酸源谷物浸提液(以下简称为CSL)等中，不仅含有有机酸杂质，而且还含有D-型、L-型两种乳酸，但如果是厌氧培养，则L-乳酸不被代谢，而残留在培养基中。由L-型生成丙酮酸的反应的催化酶L-乳酸脱氢酶(以下简称为lld)在通气条件下表达，因此，如果有在通气条件下也能高效地进行乳酸发酵的方法，则能通过使用该方法使菌体代谢包含在培养基中的L-型，生成光学纯度高的D-型，但是，目前为止，还没有能够实现上述目的的技术。

关于使用pfl破坏菌株的乳酸生产，在Zhou等的报告中首先报告了以下内容。即，Contag等人(Contag，P.R.，et.al.，Appl.Environ.Microiol.，Vol.56(12)，pp3760-3765(1990))公开了pfl非变异大肠埃希菌株生成35mM的乳酸，而在pfl变异株中，乳酸的生产率提高，生成45mM的乳酸。即，在大肠埃希菌中，由于pfl失活，D-乳酸的生产率提高，这通过Contag等公开的数据已经成为公知内容。

D-乳酸脱氢酶根据对辅酶的依赖性的不同，分为NADH依赖性和FAD依赖性。NADH依赖性D-乳酸脱氢酶在生物体内催化丙酮酸生成D-乳酸的反应。来源于大肠菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶被特别称为ldhA。

Yang等(Yang，Y.T.，et.al.，Metab.Eng.，Vol.1(2)，pp141-152(1999))报道了将组装了ldhA基因的表达载体导入大肠埃希菌，由此使D-乳酸蓄积量提高了8g/L左右，尽管很低。即，由Yang等公开的数据可知，在大肠埃希菌中，通过强化ldhA活性，能提高D-乳酸的生产率。

另外，根据Bunch等[Bunch，PK.，Microbiology，Vol.143(Pt 1)，187-195(1997)]的报告，导入来源于大肠埃希菌的ldhA基因的表达载体的大肠埃希菌由于表达载体的导入而阻碍其增殖。

另外，作为使来源于大肠菌以外的细菌的D-乳酸脱氢酶(以下简称为ldh)在大肠菌中过剩表达的例子，可以举出作为来源于Lactobacillus helveticus的ldh的表达例的Kochhar等[Kochhar，S.，Eur.J.Biochem.，(1992)208，799-805]的报告或作为来源于Lactobacillusbulgaricus的ldh的表达例的Kochhar等[Kochhar，S.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(1992)185，705-712]的报告，任一例都研究了表达的酶的物理化学性质，但都没有提及D-型或丙酮酸的蓄积量。

但是，关于使pfl失活或活性降低，且使ldhA活性加强的微生物的D-乳酸生产率仍然不是很清楚。

通常，在使用表达载体的基因强化方法中，会发生以下不便：载体脱落、目的基因的表达量下降、进一步导致目的物质的生产率降低。因此，在应用于D-乳酸工业生产时，使用表达载体的ldh基因的强化方法中存在几个应该解决的课题，期待取代利用表达载体的基因强化方法。但是，还没有与上述相关的报告。

作为取代表达载体的基因强化方法，可以举出Solem等(Solem，C.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.68(5)，pp2397-2403(2002))报道的通过将基因组上的某一基因的启动子区域置换成任意的启动子来强化该基因的方法。但是，如果在使用上述ldhA基因的D-乳酸制造中应用本技术，则由于利用该方法强化的ldhA基因仅是基因组上的单拷贝基因，与利用表达多拷贝基因的表达载体的强化方法比较，ldhA活性提高幅度小，所以，即使本领域技术人员也难以推测D-乳酸生产率与使用表达载体时比较能得到提高。

另外，通过解析利用大肠菌纯化的酶可知，FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(以下简称为dld)主要催化与NADH依赖性D-乳酸脱氢酶所催化的反应的逆反应，即，由D-乳酸生成丙酮酸的反应。虽然Shaw等人得到了dld被破坏的大肠菌株JS150和JS151，但没有提及上述菌株中的D-乳酸生产率或丙酮酸生产率(Shaw，L.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.121(3)，pp1047-1055(1975))。另外，Barnes等人报道了dld与各种氨基酸或糖类的摄入有关(Barnes，E.M.，et.al.，J.Biol.Chem.，Vol.246(17)，pp5518-5522(1971))，但没有提及与D-乳酸或丙酮酸的生成的关系。

而且，在作为大肠菌株保藏机构之一的Yale大学附属E.coliGenetic Stock Center(CGSC)的数据库中，如果检索dld和pfl两种变异菌株，则会检索到Mat-Jan等的论文(Mat-Jan，F.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.171(1)，pp342-348(1989))，但实际上仔细阅读后发现，该论文中没有与dld和pfl两种破坏菌株相关的说明。

关于上述D-乳酸，目前没有在利用微生物的发酵生产中同时实现符合工业水平的生产率和选择性的报告，例如，没有既能维持D-乳酸的高生产率，又能减少作为主要有机酸副产物的琥珀酸或富马酸的先例。

所以，申请人以不损害D-乳酸的生产率又能抑制琥珀酸产生为目的，进行了深入研究，结果发现通过在厌氧条件下，破坏作为催化草酰乙酸生成苹果酸的反应的酶苹果酸脱氢酶(以下简称为mdh)的基因，能在不损害D-乳酸生产率的前提下完全抑制琥珀酸的生成。但是，由于仍然生成富马酸副产物，所以发现破坏天冬氨酸解氨酶(以下简称为aspA)的基因，也能降低富马酸副产物的量。

1970年的Courtright等的论文公开了mdh失活的效果(Courtright，J.B.et.al.，J.Baceriol.，Vol.102(3)，pp722-728(1970))。其公开内容是在mdh失活的大肠埃希菌中，虽然在厌氧条件下，草酰乙酸生成苹果酸的反应活性为零，但是天冬氨酸生成富马酸的反应活性反而提高了。即，在厌氧条件下，生成琥珀酸的途径包括以下2种途径：由草酰乙酸经由苹果酸生成富马酸、琥珀酸的途径和由草酰乙酸经由天冬氨酸生成富马酸、琥珀酸的途径，如果mdh失活，则前一种途径被中止，后一种途径被进一步活化。所以，Courtrifhght等的论文没有公开通过使mdh失活中止琥珀酸的生成。

另外一个关于mdh失活的效果的现有技术是关于破坏mdh基因的酵母的技术(特开平11-056361号公报)。本专利是通过破坏酵母的mdh基因，改变生成的苹果酸量，但没有提到琥珀酸的生成量受到何种影响。

即便是本领域技术人员也难以从现有的知识预见到通过灭活微生物的mdh能完全抑制琥珀酸的生成。

另外，关于aspA失活的效果，过去只公开了在鼠疫耶尔森菌的情况(Dreyfus，L.A.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.136(2)，pp757-764(1978))。但是，本论文的主旨是由于aspA失活使天冬氨酸或谷氨酰胺在细胞内难以分解，并没有对富马酸的生成量进行研究。

专利文献1：特开平11-056361号公报

非专利文献1：Chang，D.-E.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.65(4)，pp1384-1389(1999)

非专利文献2：Zhou，S.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.69(1)，pp399-407(2003)

非专利文献3：Contag，P.R.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.56(12)，pp3760-3765(1990)

非专利文献4：Yang，Y.T.，et.al.，Metab.Eng.，Vol.1(2)，pp141-152(1999)

非专利文献5：Bunch，P.K.，et.al.，Microbiology，Vol.143(pt 1)，pp187-195(1997)

非专利文献6：Kochhar，S.，et.al.，Eur.J.Biochem.，Vol.208(3)，pp799-805(1992)

非专利文献7：Kochhar，S.，et.al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.185(2)，pp705-712(1992)

非专利文献8：Solem，C.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.68(5)，pp2397-2403(2002)

非专利文献9：Shaw，L.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.121(3)，pp1047-1055(1975)

非专利文献10：Barnes，E.M.，et.al.，J.Biol.Chem.，Vol.246(17)，pp5518-5522(1971)

非专利文献11：Mat-Jan，F.，et.al.，Bacteriol.，Vol.171(1)，pp342-348(1989)

非专利文献12：Courtright，J.B.et.al.，Bacteriol.，Vol.102(3)，pp722-728(1970)

非专利文献13：Dreyfus，L. A.，et.al.，J.Bacteriol.，Vol.136(2)，pp757-764(1978)

发明内容

本发明的课题之一是提供高效生产D-乳酸的方法，本发明的其他课题是提供光学纯度高、有机酸副产物少的高选择性的D-乳酸生产方法。

本发明的其他课题是提供D-乳酸的生产方法，该方法能减少作为有机酸杂质的不容易从以往利用微生物使乳酸蓄积的培养基中除去的丙酮酸的蓄积量。

本发明的其他课题是提供使用异型乳酸发酵细菌有效地生产乳酸的乳酸生产方法。本发明的其他课题是提供使用异型乳酸发酵细菌有效地生产光学纯度高的乳酸的乳酸生产方法。

本发明的其他课题是提供不降低目的物质的生产率、且抑制副产物琥珀酸和/或富马酸的生成的D-乳酸生产方法。

本发明的其他课题是提供取代使用表达载体的强化方法的稳定的D-乳酸脱氢酶基因强化方法，另外，还提供更高效地生产D-乳酸的方法。

为解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果发现丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低，且来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强的细菌能在比以往短的时间内生产D-乳酸，而且能实现至今未达到的高蓄积量。特别是关于ldhA活性增强的方法，利用在基因组上将编码ldhA的基因和控制与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子连接而使其表达的微生物，由此能在比使用表达载体的基因表达强化方法短的时间内生成大量的D-乳酸。D-乳酸脱氢酶的细胞内表达量在使用表达载体的方法中比本发明的方法多，但没有任何理由证明高的酶表达量与D-乳酸的高效生产直接相关，而且，令人吃惊的是，在本发明中，即使细胞内的酶表达量没有那么高，D-乳酸的生产率也显著提高。

接下来，本发明人等发现微生物培养液中存在的丙酮酸的一部分实际上是dld催化D-乳酸生成的，而且，通过培养dld基因实质上失活或活性降低的微生物，与宿主比较，该微生物的增殖没有被抑制，而且得到培养基中的丙酮酸浓度下降的含有高品质D-乳酸的培养液。通过培养Pfl失活或活性降低、且/或ldhA活性增强、且dld基因实质上失活或活性降低的微生物，能得到培养基中的丙酮酸浓度下降的高品质D-乳酸。

而且，本发明人通过使用具有TCA循环、且苹果酸脱氢酶(mdh)失活或活性降低、且天冬氨酸解氨酶(aspA)失活或活性降低的上述微生物，不仅能维持高的D-乳酸生产率，还能抑制琥珀酸和富马酸的副生成，由此实现了本发明。

即，本发明包括以下内容。

[1]一种乳酸的生产方法，其特征在于，在添加了2种或2种以上氨基酸的培养基中培养丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的异型乳酸发酵细菌，从得到的培养物中回收乳酸。

[2][1]所述的乳酸的生产方法，其特征在于，异型乳酸发酵细菌是大肠埃希菌。

[3][2]所述的乳酸的生产方法，其特征在于，大肠埃希菌是MT-10934(FERM BP-10057)。

[4]一种D-乳酸的生产方法，其特征在于，培养来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强、且丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的细菌，从得到的培养物中回收D-乳酸。

[5][4]所述的D-乳酸的生产方法，其中，细菌是大肠埃希菌。

[6][4]或[5]所述的D-乳酸的生产方法，其特征在于，在添加了2种或2种以上氨基酸的培养基中进行培养。

[7]一种微生物，该微生物是其本来具有的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低的微生物，其特征在于，丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强。

[8][7]所述的微生物，该微生物为细菌。

[9][8]所述的微生物，所述细菌是大肠埃希菌。

[10]一种D-乳酸的生产方法，其特征在于，在液体培养基中培养[7]～[9]任一项所述的微生物，使D-乳酸在培养液中生成并蓄积，从培养液中分离D-乳酸。

[11][10]所述的D-乳酸的制造方法，其特征在于，在添加了2种或2种以上氨基酸的培养基中进行培养。

[12]一种D-乳酸的生产方法，其特征在于，在液体培养基中培养FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低的微生物，使D-乳酸在培养液中生成并蓄积，从培养液中分离D-乳酸。

[13][12]所述的方法，其中，微生物是细菌。

[14][13]所述的方法，其中，细菌是大肠埃希菌。

[15]一种微生物，在该微生物的基因组上，编码来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的基因通过使用控制与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子来表达该NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)。

[16][15]所述的微生物，该微生物是大肠埃希菌。

[17][15]或[16]所述的微生物，其特征在于，该微生物本来具有的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低。

[18]一种大肠埃希菌，在大肠埃希菌的基因组中，使用控制来源于大肠埃希菌的与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子取代编码来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的基因的启动子，表达该NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)。

[19][18]所述的大肠埃希菌，其中，控制与大肠埃希菌的糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子是来源于大肠埃希菌的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的启动子。

[20][18]或[19]所述的大肠埃希菌，其特征在于，该大肠埃希菌本来具有的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低。

[21]一种生产方法，该方法是利用培养基培养[15]～[20]中任一项所述的微生物生产D-乳酸的方法。

[22]一种微生物，该微生物具有TCA循环、且苹果酸脱氢酶(mdh)失活或活性降低，其特征在于，该微生物的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低，且/或FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低。

[23][22]所述的微生物，其中，该微生物本来具有的天冬氨酸解氨酶(aspA)失活或活性降低。

[24][22]或[23]所述的微生物，该微生物是细菌。

[25][24]所述的微生物，其中，细菌是大肠埃希菌。

[26][25]所述的微生物，其中，来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强。

[27]一种生产方法，该方法是利用培养基培养[22]～[26]中任一项所述的微生物，由此生产TCA循环中产生的有机酸以外的化合物的方法。

[28][27]所述的生产方法，其中，有机酸以外的化合物是D-乳酸。

[29][1]～[6]、[10]～[14]、[21]、[28]中任一项所述的乳酸的生产方法，其特征在于，该方法是在通气条件下培养。

[30][29]所述的乳酸的生产方法，其特征在于，所述通气条件为，在以温度为30℃的水为对象的情况下，通过供给氧气使常压下氧气体积传质系数K_La在大于或等于1h^-1、小于或等于400h^-1范围内的条件。

[31][1]～[6]、[10]～[14]、[21]、[28]～[30]中任一项所述的乳酸的生产方法，其特征在于，培养pH为6～8。

利用本发明能提供具有高D-乳酸生产率和D-乳酸选择性的微生物。而且，培养由本发明制备的微生物，生产D-乳酸，与现有方法比较能更经济地生产高纯度的D-乳酸。

另外，利用本发明能提供生产丙酮酸生成量少的D-乳酸的细菌。而且，培养由本发明制备的菌株，生产D-乳酸，与现有方法比较能更经济地生产化学纯度和光学纯度高的D-乳酸。

另外，使用本发明制备的菌株生产乳酸，能制造与以往的方法比较作为杂质的丙酮酸含量下降、纯化操作少的高品质D-乳酸发酵液。

利用本发明不会导致TCA循环中产生的有机酸以外的化合物的生产率降低，能抑制琥珀酸和/或富马酸的副生成。特别是在以工业生产TCA循环中产生的有机酸以外的化合物为目的的情况下，通过减少副产物的种类和量，能降低目标产物的纯化成本。

附图说明

图1是表示实施例20的培养液中D-乳酸蓄积量经时变化的曲线图。图中，具有三角形的曲线表示MG1655△pfl△dld菌株(实施例15)的结果，具有四边形的曲线表示MG1655△pfl△dld/pGAPldhA菌株(实施例18)的结果，具有圆形的曲线表示MG1655△pfl△dld/GAPpldh基因组插入株(实施例19)的结果。

图2是表示实施例24的培养液中乳酸蓄积浓度经时变化的曲线图。图中，具有十字形的曲线表示△pf1△dld菌株的结果，具有圆形的曲线表示△pfl△dld△mdh菌株的结果，具有三角形的曲线表示△pfl△dld△ppc菌株的结果，具有四边形的曲线表示△pfl△dld△frd菌株的结果。

图3是表示实施例24的培养液中琥珀酸蓄积浓度经时变化的曲线图。图中，具有十字形的曲线表示△pfl△dld菌株的结果，具有圆形的曲线表示△pfl△dld△mdh菌株的结果，具有三角形的曲线表示△pfl△dld△ppc菌株的结果，具有四边形的曲线表示△pfl△dld△frd菌株的结果。

图4是表示实施例25的培养液中乳酸蓄积浓度经时变化的曲线图。图中，具有圆形的曲线表示△pfl△dld△mdh△asp菌株的结果，具有三角形的曲线表示△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因组插入株的结果，具有四边形的曲线表示△pfl△dld△mdh菌株的结果。

图5是表示实施例25的培养液中富马酸蓄积浓度的经时变化的曲线图。图中，具有圆形的曲线表示△pfl△dld△mdh△asp菌株的结果，具有三角形的曲线表示△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因组插入株的结果，具有四边形的曲线表示△pfl△dld△mdh菌株的结果。

具体实施方式

下面详细说明本发明。

本发明中的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号2.3.1.54的酶，也称为甲酸乙酰基转移酶。该酶是指可逆催化由丙酮酸生成甲酸的反应的酶的总称。

本发明中所谓的失活是指利用现有的测定系统测定的该酶的活性在检测限以下的状态。

本发明中所谓的降低是指由于编码该酶的基因的突变和/或基因重组，与处理前的状态比较，该酶活性明显下降的状态。

本发明中所谓的异型发酵细菌是指具有发酵分解糖类、生成乳酸以外的选自甲酸、乙酸、琥珀酸、乙醇中的至少1种或1种以上的能力的细菌。具体而言，作为本发明中的异型发酵细菌，优选大肠埃希菌，作为丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的异型发酵细菌，可以举出能够利用本发明实施例所示的方法等制备的任意大肠埃希菌野生株的pfl基因的破坏株或大肠埃希菌MT-10934。

上述MT-10934是已经确认pfl活性降低的菌株，能容易地实施本发明。基于涉及用于专利程序的微生物保藏等国际认证的布达佩斯条约，本菌株于平成14年11月8日以保藏编号为FERM BP-10057保藏在日本茨城县筑波市东1丁目1番1号中央6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。

关于pfl的单独变异株，由于MT-10934具有HfrC的性质，因此只要与任意的具有F-性质的野生株、例如MG1655、W3110等在LB培养基中混合2小时后，稀释，得到单菌落，从中选择希望的变异株即可。pfl变异株在厌氧培养中，与野生株比较，甲酸的生成量降低，因此可以将其作为指标进行选择而得到

本发明中所谓的培养是使用培养基培养本发明中的微生物。作为使用的培养基，只要是包含碳源、氮源、无机离子、和用于生产乳酸的微生物所要求的有机微量元素、核酸、维生素类等的培养基即可，没有特别限定。

本发明中所谓的添加有2种或2种以上氨基酸的培养基是指含有天然存在的各种氨基酸中的至少2种或2种以上的培养基，还包括含有酵母浸膏、酪蛋白水解物、蛋白胨、乳清、废糖蜜、谷物浸提液等天然物质或天然物质提取物的水解物的培养基。为了得到较优选的结果，优选含有0.5％～20％、更优选含有2％～15％的选自酵母浸膏、蛋白胨、乳清、废糖蜜、谷物浸提液中的至少1种或其混合物的培养基。尤其是谷物浸提液的添加能得到明显的效果，此时不添加硫酸铵等盐的培养基反而得到更好的结果。培养基为通常的液体培养基。

培养条件根据制备的菌体、培养装置的不同而改变，例如，使用pfl活性降低的MT-10934时，培养温度优选为20℃～40℃，较优选在25℃～35℃下进行培养，pH优选利用NaOH、NH₃等调至6.0～7.2、更优选为6.5～6.9，进行培养。培养时间没有特别限定，是菌体充分增殖、且乳酸生成所需要的时间。

另外，使用pfl失活的大肠埃希菌野生株MG1655的pfl基因破坏株时，在中性或比中性稍偏碱性的pH下能得到最大的生产率，培养pH为6.9～7.4，较优选7.1～7.3。培养温度可以高于MT-10934的温度，在33℃～42℃下培养能得到最大的生产率。

培养时通常使用能控制温度、pH、通气条件、搅拌速度的培养槽，但本发明的培养并不限于使用培养槽。使用培养槽培养时，根据需要也可以预先进行作为预培养的种培养，然后接种到预先调制了需要量的培养槽内的培养基中。

MT-10934在pH7～7.5的pH区域内生成甲酸，而MG1655的pfl基因破坏菌株利用本发明的培养方法并没有生成甲酸。所以，作为异型发酵性细菌使用大肠埃希菌的情况下，在接近中性的pH的培养基中使采用的菌体产生乳酸时，如果像MT-10934一样，能观察到甲酸的生成，则在实际制造乳酸时，培养基的pH被控制在比中性稍偏酸性侧，如果像MG1655的pfl基因破坏株一样，没有观察到甲酸的生成，则在实际制造乳酸时，培养基的pH被控制在中性或稍偏碱性侧，由此能得到最大生产率。

本发明中所谓的培养物是指利用上述方法生产的菌体、培养液、及其处理物。

从如上所述得到的培养液等培养物中回收乳酸的方法，例如，如果是从培养液中，则可以利用通常已知的方法，例如，可以采用酸化后直接蒸馏的方法、形成丙交酯后进行蒸馏的方法、加入醇和催化剂进行酯化后进行蒸馏的方法、用有机溶剂萃取的方法、利用离子交换柱分离的方法、利用电透析浓缩分离的方法等或将上述方法组合的方法。另外，利用本发明的方法制备的菌体由于能产生适合乳酸生产的酶组，所以利用该酶组进一步生产、回收乳酸，被认为是从培养物中回收乳酸的方法的一部分。

本发明中所谓的来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)是利用丙酮酸和NADH生成D-乳酸和NAD的来源于大肠埃希菌的酶，具体而言，可以列举由Bunch等(Microbiology 143(Pt 1)，187-195(1997))得到的基因，或具有以大肠埃希菌的基因组DNA为模板、利用序列号3和序列号4进行PCR扩增的DNA片段所包含的序列的基因产生的酶。

本发明中所谓的ldhA活性增强，是指通过编码ldhA的基因的突变和/或基因重组，使由编码ldhA的基因生产的酶的活性明显比进行上述处理前的状态增强的状态。

本发明中的细菌是通常的原核细胞微生物。

在本发明中，作为ldhA活性被增强、且pfl失活或活性降低的细菌的例子，可以举出本发明实施例中所述的MT-10934/pGlyldhA。本菌株可以优选用于具有如上述[1]所述的特征的乳酸的生产方法，即，在添加有2种或2种以上氨基酸的培养基中培养丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的异型乳酸发酵细菌，从得到的培养物中回收乳酸。

作为增强本发明中的ldhA活性的方法之一，下面的方法是有效的，即，将编码ldhA的基因和控制与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子连接，在该状态下组装到表达质粒中，再将质粒导入所希望的细菌。此种情况下的控制与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子是指通常在细菌内、优选在大肠埃希菌内发挥作用的强启动子，且即使在葡萄糖存在下，其表达也不易受抑制的启动子，具体而言，可以列举甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)启动子。如上所述得到的细菌在通气条件下产生D-乳酸时，与ldhA的表达未被增强时比较，能提高D-乳酸的蓄积量，并降低作为杂质的丙酮酸浓度，同时，提高D-乳酸的光学纯度。

本发明中的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)是指在作为辅酶的氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸的存在下，催化由D-乳酸生成丙酮酸的反应的酶的总称。

本发明中的微生物只要是具有产生D-乳酸的能力大微生物即可，没有特别限定，还包括虽然是不具有产生D-乳酸能力的微生物、但是通过施加某种改变能变成具有产生D-乳酸能力的微生物。

作为本发明中的以dld失活或活性降低、且/或pfl失活或活性降低、且/或ldhA活性被增强为特征的微生物，可以列举大肠埃希菌MT-10994(FERM BP-10058)菌株。

本发明中控制与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子是指通常在微生物内发挥作用的强启动子，且即使在葡萄糖存在下，其表达也不易受抑制的启动子，具体而言，可以列举甘油醛-3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶启动子。

本发明中的启动子是指具有σ因子的RNA聚合酶结合并开始转录的部位。例如，来源于大肠埃希菌的GAPDH启动子在GenBankaccession number X02662的碱基序列信息中，被记为碱基号397-440。

编码本发明的ldhA的基因通过在基因组上使用控制与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子，表达该ldhA，使pfl失活或活性降低，且/或使dld失活或活性降低，以上述为特征的微生物，可以列举大肠埃希菌MT-10994(FERM BP-10058)菌株。

大肠埃希菌MT-10994菌株通过ldhA基因在基因组上与GAPDH启动子功能性连接而进行表达，或通过基因破坏使pflB、dld灭活，所以使用该菌株能容易地实施本发明。本菌株基于用于专利程序的微生物保藏等国际上承认的布达佩斯条约，于平成16年3月19日以保藏编号为FERM BP-10058保藏在日本茨城县筑波市东1丁目1番1号中央6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。

本发明中的TCA循环是指最终完全氧化糖、脂肪酸、多种氨基酸等大型碳骨架的代谢路径，也称为三羧酸循环、克雷布斯循环。

本发明中的苹果酸脱氢酶(mdh)是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号1.1.1.37，在作为辅酶的氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸的存在下，可逆地催化由苹果酸生成草酰乙酸的反应的酶的总称。

作为本发明中的mdh失活或活性降低、pfl失活或降低、且/或dld失活或活性降低的微生物，可以列举大肠埃希菌MT-10994菌株。本菌株可以优选用于具有如上述[1]所述的特征的乳酸的生产方法，即，在添加有2种或2种以上氨基酸的培养基中培养丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的异型乳酸发酵细菌，从得到的培养物中回收乳酸。

本发明中的天冬氨酸解氨酶(aspA)基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号4.3.1.1，也称为天冬氨酸酶。该酶是可逆地催化由L-天冬氨酸生成富马酸的反应的酶的总称。

培养本发明中得到的微生物生成乳酸时，虽然可以完全不进行通气，但为了得到较优选的结果最好进行通气。所述通气条件下并不一定要向培养液中通入空气，也包括上面通气，即，根据培养槽的形状，一边适度地搅拌培养液，一边更换培养液上面的空气层，使包含氧气的气体流入培养槽的内部。在向液体中通气的情况下，通过内压、搅拌翼位置、搅拌翼形状、搅拌速度的组合来改变溶解氧浓度，由此能以乳酸的生产率和乳酸以外的有机酸量等作为指标求出下述最适条件。例如，将大肠埃希菌MT-10934菌株在ABLE社制培养装置BMJ-01等比较小型的培养槽中培养时，使用500g培养液时，在通气条件为常压下0.01vvm～1vvm、搅拌速度50rpm～500rpm、较优选常压下0.1vvm～0.5vvm、搅拌速度100rpm～400rpm时，能得到优选结果。其条件为，在以温度30℃的水作为对象的情况下，通过供给氧气使常压下的氧气体积传质系数K_La在大于或等于1h^-1、400h^-1的范围内。

另外，作为最适通气条件的其他指标还包括，通过调节通气量、搅拌速度，从而能够使利用厌氧培养MT-10934菌株产生的甲酸、乙酸、琥珀酸、乙醇的含量小于或等于5.0g/L、进一步优选小于或等于1.0g/L，并且能够产生乳酸。

另外，作为最适通气条件的其他指标还包括，通过调节通气量、搅拌速度，在含有0.3％的光学异构体L-乳酸的培养基中培养MT-10934时，在10～100小时以内使L-乳酸的浓度降低到小于或等于0.02％。

不必从培养初期至结束始终保持上述通气条件，在部分培养工序中实施即可得到优选结果。

另外，通过进行上述通气，能提高乳酸的生产率，并能减少光学异构体。

下面，利用实施例表示本发明的一个例子，但上述实施例对本发明并无任何限定。

[实施例1]利用MT-10364菌株生产乳酸

用于培养的培养基的组成如下表1所示。

表1

培养基组成

葡萄糖	10％
		谷物浸提物(日本食品化工制)硫酸铵磷酸氢二钠·12水合物磷酸二氢钾氯化钠硫酸镁·7水合物Adecanol LG126	5％0.5％0.3％0.15％0.15％0.1％0.1％

在本培养基中，含有来源于谷物浸提物的酸水解后的还原糖0.34％、D-乳酸0.31％、L-乳酸0.31％、游离氨基酸0.33％以及微量的各种有机酸。

作为预培养是在装有25ml LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的三角烧瓶中进行大肠埃希菌MT-10934的植菌，以120rpm的速度搅拌培养过夜，然后在装有475g上述组成的培养基的1L容积的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中，进行全量植菌。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为150rpm、培养温度为31℃、pH为6.7(利用NaOH调节)的条件下，培养至葡萄糖完全消耗掉。

培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定得到的培养液中有机酸的含量和光学纯度。结果如表2所示。

表2

	MG1655(wild)	MT-10934
			D-乳酸蓄积量培养液回收量干燥菌体重量D-乳酸光学纯度琥珀酸甲酸乙酸乙醇培养开始50hr后的D-乳酸蓄积量	54.9g/kg培养液540g3.5g/L≥99.9％ee6.2g/L1.8g/L2.4g/L0.8g/L46.5g/kg	90.5g/kg培养液570g2.2g/L≥99.9％eeN.D＜0.2g/LN.D＜0.1g/LN.D＜0.1g/LN.D＜0.1g/L58.2g/kg

                                                  N.D：Not detected

在上述结果中，总乳酸量超过培养开始时加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的还原糖、有机酸、氨基酸，也能达到90％或90％以上的转换率。另外，即使使用培养基中含有有机酸杂质或乳酸的光学异构体的培养液，也能制造有机酸杂质少、光学纯度高的乳酸。

需要说明的是，MG1655可以作为ATCC47076从美国模式菌种收集中心(ATCC)购入。

[实施例2]ldhA表达载体和乳酸产生菌的构建

为得到丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyl transferase)(glyA)启动子，以大肠菌基因组DNA作为模板、以序列号1、及序列号2为探针，利用PCR法进行扩增，并用限制性内切酶EcoRI切割得到的片段，由此得到约850bp的编码glyA启动子的片段。而且，为得到ldhA的结构基因，以大肠埃希菌的基因组DNA作为模板，以序列号3、及序列号4为探针，利用PCR法进行扩增，并用限制性内切酶EcoRI和HindIII切割得到的片段，由此得到约1.0kbp的ldhA结构基因片段。将上述2个片段与利用限制性内切酶EcoRI和HindIII切割质粒pUC18得到的片段混合，并利用DNA连接酶连接，然后转化到大肠菌中，得到质粒pGlyldhA。

将得到的质粒pGlyldhA转化到大肠埃希菌MT-10934菌株中，得到乳酸产生菌MT-10934/pGlyldhA菌株。

另外，pUC18可以利用常规方法从购自美国模式菌种收集中心的ATCC37253中提取得到。MT-10934菌株是于平成14年11月8日以上述保藏编号保藏在日本茨城县筑波市东1丁目1番1号中央6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。

[实施例3]利用乳酸产生菌MT-10934/pGlyldhA菌株的乳酸生成

作为预培养是在装有25ml LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的三角烧瓶中进行实施例2得到的乳酸产生菌MT-10934/pGlyldhA菌株的植菌，利用与实施例1相同的方法进行培养。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定乳酸的含量和光学纯度。结果如表3所示。

表3

D-乳酸蓄积量	94g/kg培养液
		培养液回收量	570g
干燥菌体重量	2.0g
		D-乳酸光学纯度	≥99.9％ee
培养开始50hr后的D-乳酸蓄积量	65.2g/g

在上述结果中，总乳酸量超过培养开始时加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的还原糖、有机酸、氨基酸，也能达到90％或90％以上的转换率。

[实施例4]大肠埃希菌pfl基因的附近区域的克隆

大肠埃希菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，编码大肠埃希菌的丙酮酸甲酸裂解酶(以下也称为pfl)的基因的碱基序列也被报道(GenBank accession numberAE000192)。为了克隆编码pfl的基因(2283bp)的碱基序列的附近区域，合成序列号5、6、7和8所示的4种低聚核苷酸引物。序列号6、7的引物在5’末端处具有Sph I识别部位。

根据Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)所述的方法制备大肠埃希菌MG1655菌株的基因组DNA，利用得到的基因组DNA1μg与具有序列号5的碱基序列的引物、具有序列号6的碱基序列的引物、具有序列号7的碱基序列的引物和具有序列号8的碱基序列的引物的组合，使用上述引物DNA各100pmol，在通常的条件下进行PCR，扩增约1.8kb(以下也称为pflB-L片段)、及约1.3kp(以下也称为pflB-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，利用HindIII和Sph I切割pflB-L片段，利用Sph I和Pst I切割pflB-R。利用T4DNA连接酶使上述2种切割片段与温度感受性质粒pTH18csl(GenBank accession number AB019610)(Hashimoto-Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.24(1)，pp185-191(2000))的HindIII和Pst I切割物反应后，转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞(competent cell)中，从而得到包含编码pflB的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，命名为pTH△pfl。

[实施例5]大肠埃希菌MG-1655菌株pfl基因破坏菌株的制备

将实施例4得到的质粒pTH△pfl转化到大肠埃希菌MG1655菌株中，在细胞能保持温度感受性质粒的30℃下，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养过夜，得转化体。将得到的转化体在LB培养基中于30℃培养3小时～过夜，然后，用LB液体培养基或生理盐水适当稀释，涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上。将上述LB琼脂板在不能维持温度感受性质粒的42℃下培养，将形成的转化体通过基因组外-基因组间相同重组，得到将质粒全长组装到大肠埃希菌基因组的菌株。

由该菌株获得基因组DNA，以其作为模型进行PCR扩增，发现在基因组上存在pTH18csl所具有的耐氯霉素基因，以及与编码pflB的基因的5’端附近区域和3’端附近区域分别相同的区域，从而确认该菌株是将质粒全长组装到大肠埃希菌上的菌株。

将质粒全长组装到大肠埃希菌上的菌株植入装有20ml不含有氯霉素的LB液体培养基的100ml设有缓冲板的烧瓶中，将其在30℃下振摇培养4小时。用不含氯霉素的LB液体培养基适当稀释上述培养液，然后，涂布到不含氯霉素的LB琼脂培养基上。任意挑选96个将其在42℃下培养繁殖的菌落，使其分别在不含有氯霉素的LB琼脂培养基上和含有氯霉素的LB琼脂培养基上繁殖，挑选氯霉素感受性的菌株。

从挑选的菌株中获得基因组DNA，以其为模型进行PCR扩增，挑选编码pfl的基因缺损的菌株，将其命名为MG1655△pflB菌株。

[实施例6]利用使用酪蛋白水解物的MG1655△pfl菌株生产乳酸

作为预培养是准备多个装有250g LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的三角烧瓶，在其中分别植入乳酸生产菌MG1655、MG1655△pfl菌株、以及将实施例2所述的质粒pGlyldhA按照常规方法组装入MG1655△pfl菌株得到的MG1655△pfl/pGlyldhA 3种菌株，于30℃下，以120rpm的速度搅拌培养过夜后，分别在装有475g表4所示培养基的1L容积的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中进行全量植菌。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为200rpm、培养温度为31℃、pH为6.7(利用NaOH调节)的条件下，培养50小时。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定所得培养液中乳酸的含量和光学纯度。结果如表5所示。

表4

培养基组成

Glucose	100g/L
		Na2HPO4·12H2O	6.0g/L
(NH4)2SO4	6.0g/L
		KH2PO4	3.0g/L
NaCl	3.0g/L
		MgSO4·7aq	0.1g/L
酵母浸膏	0.5g/L
		酪蛋白水解物	5.0g/L

表5

	MG1655	MG1655△pfl	MG1655△pfl/pGlyldhA
				D-乳酸蓄积量	28g/L	58g/L	63.7g/L

[实施例7]使用谷物浸提物的利用MG1655△pfl菌株的乳酸的产生

作为预培养是分别将MG1655、MG1655△pfl、以及MG1655△pfl/pGlyldhA植入装有25g培养液的三角烧瓶中，于30℃下，以120rpm的速度搅拌培养过夜后，分别在1L容积的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中装入475g表6所示培养基的培养装置中进行全量植菌。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为300rpm、培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养24小时。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定所得培养液中的乳酸和丙酮酸。结果如表7所示。

表6

培养基组成

葡萄糖	10％
		谷物浸提物(日本食品化工制)Adecanol LG126	5％0.1％

表7

	MG1655	MG1655△pfl	MG1655△pfl/pGlyldhA
				D-乳酸蓄积量培养液回收量干燥菌体重量丙酮酸培养时间	52g/L520g2.5g/L1.1g/L24小时	95g/kg培养液560g2.5g/L1.1g/L24小时	95g/kg培养液560g2.5g/L0.3g/L24小时

在上述结果中，总乳酸量超过培养开始时加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的还原糖、有机酸、氨基酸，也能达到90％或90％以上的转换率。

[实施例8]高葡萄糖浓度下利用MG1655△pfl菌株的乳酸的高蓄积生产

作为预培养是将MG1655△pfl植入装有25g培养液的三角烧瓶中，以120rpm的速度搅拌培养过夜后，在装有475g如表8所示的葡萄糖浓度由10％变化至15％的培养基的ABLE社制培养装置BMJ-01的培养槽中进行全量植菌。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为300rpm、培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养至葡萄糖被消耗掉。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定乳酸。结果如表9所示。

表8

培养基组成

葡萄糖	10％	12％	15％
				谷物浸提物(日本食品化工制)Adecanol LG126	5％0.1％

表9

葡萄糖浓度	10％	12％	15％
				D-乳酸蓄积量培养液回收量干燥菌体重量	95g/kg培养液560g2.5g/L	112g/kg培养液567g2.5g/L	130g/kg培养液580g2.5g/L

总乳酸量超过培养开始时加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的还原糖、有机酸、氨基酸，也能达到90％或90％以上的转换率，而且达到130g/L这一至今未曾实现的高蓄积量。

[实施例9]利用MG1655△pfl菌株研究谷物浸提物添加量

作为预培养是将MG1655△pfl植入装有25g培养液的三角烧瓶中，以120rpm的速度搅拌培养过夜后，在装有475g如表10所示的谷物浸提物浓度由1％变化至10％的培养基的ABLE社制培养装置BMJ-01代培养槽中进行全量植菌。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为300rpm、培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养24小时。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定乳酸。结果如表11所示。

表10

培养基组成

葡萄糖	10％
					CSL(日本食品化工制)Adecanol LG126	1％0.1％	2.5％	5％	10％

表11

CSL	1％	2.5％	5％	10％
					D-乳酸蓄积量	55g/L	90g/L	94g/L	96g/L

在1％谷物浸提物添加区域可观察到生产速度下降，但在24小时内仍然达到了55g/L这一至今未曾实现的生产速度。另外，相对于使用的葡萄糖，乳酸转换率维持在大于或等于90％的水平。

[实施例10]利用MG1655△pfl菌株研究通气条件对糖酵解速度的影响

作为预培养是将MG1655△pfl植入装有25g培养液的三角烧瓶中，以120rpm的速度搅拌培养过夜后，在装有475g表12所示培养基的ABLE社制培养装置BMJ-01的培养槽中进行全量植菌。在大气压下、并以表13所示条件为通气条件，培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养24小时。利用glucose CII-testwako(和光纯药工业)测定葡萄糖的残存量。

表12

培养基组成

葡萄糖	12％
		CSL(日本食品化工制)Adecanol LG126	5％0.1％

表13

试验区域	1	2	3	4
					通气量(vvm)	0	0.5	0.5	0.5
搅拌速度(rpm)	200	200	400	600

表14

试验区域	1	2	3	4
					葡萄糖残存量(g/L)	59.4	39.4	21.7	67.9

由该试验可知，随着通气条件的提高，糖酵解速度也提高，如果过度提高通气条件，则糖分解速度降低。

[实施例11]利用MG1655△pfl/pGlyldhA菌株研究谷物浸提物添加量

作为预培养是将MG1655△pflB/pGlyldhA植入装有25g培养液的三角烧瓶中，以120rpm的速度搅拌培养过夜后，在装有475g如表15所示的谷物浸提物浓度由1％变化至10％的培养基的ABLE社制培养装置BMJ-01的培养槽中进行全量植菌。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为300rpm、培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养24小时。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定D-乳酸。结果如表16所示。

表15

培养基组成

葡萄糖	10％
					CSL(日本食品化工制)Adecanol LG126	1％0.1％	2.5％	5％	10％

表16

CSL	1％	2.5％	5％	10％
					D-乳酸蓄积量	58g/	92g/L	96g/L	97g/L

在1％谷物浸提物添加区域生产率最低，但在24小时内达到以往没有的58g/L的生产速度。另外，相对于使用的葡萄糖，乳酸转换率维持在大于或等于90％的水平。

[实施例12]利用MG1655△pfl/pGlyldhA菌株研究通气条件对糖酵解速度的影响

作为预培养是将MG1655△pflB/pGlyldhA植入装有25g培养液的三角烧瓶中，以120rpm的速度搅拌培养过夜后，在装有475g表17所示培养基的ABLE社制培养装置BMJ-01的培养槽中进行全量植菌。在大气压下、并以表18所示条件为通气条件，培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养24小时。利用glucoseCII-testwako(和光纯药工业)测定葡萄糖的残存量。

表17

培养基组成

葡萄糖	12％
		CSL(日本食品化工制)Adecanol LG126	5％0.1％

表18

试验区域	1	2	3	4
					通气量(vvm)	0	0.5	0.5	0.5
搅拌速度(rpm)	200	200	400	600

表19

试验区域	1	2	3	4
					葡萄糖残存量(g/L)	59.4	36.6	20.1	54.5

由该试验可知，随着通气条件的提高，糖酵解速度也提高，如果过度提高通气条件，则糖酵解速度降低。

[实施例13]大肠埃希菌MG1655株dld基因缺失菌株的制备

利用基于来源于MG1655菌株的基因组DNA的dld基因附近区域的基因信息制备的CAACACCAAGCTTTCGCG(序列号9)和TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列号10)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列号11)和TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列号12)进行PCR扩增。将得到的片段分别用限制性内切酶HindIII和Pst I、Pst I和Xba I切割，由此分别得到约1140bp的片段。将该片段与温度感受性质粒pTH18csl(Hashimoto-Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.241(1)，pp185-191(2000))经HindIII、Xba I切割得到的片段混合，使用连接酶连接后，于30℃转化到DH5α菌株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上殖的转化体。将得到的菌落于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养过夜，从得到的菌体中回收质粒。将该质粒于30℃转化到MG1655菌株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上殖的转化体。将得到的转化体涂布在琼脂平板上，于30℃培养过夜。然后，将上述培养菌体涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃殖的菌落。

再一次进行得到于42℃殖的单菌落的操作，通过相同重组挑选质粒整体被组装到染色体中的克隆体。该克隆体的细胞质中不具有质粒。

接下来，将该克隆体涂布在LB琼脂平板上，于30℃下培养过夜后，接种到LB液体培养基(3ml/试管)中，于42℃下培养3～4小时，振摇培养。为得到单菌落，将该培养液适当稀释(10^-2～10^-6左右)，涂布在LB琼脂平板上，于42℃下培养过夜，得菌落。在出现的菌落中任意挑选100个菌落，使其分别在LB琼脂平板上和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上殖，挑选只在LB琼脂平板上殖的氯霉素感受性克隆体。再利用PCR扩增上述目的克隆体的染色体DNA中含有dld的约2.0kb的片段，选择dld基因区域缺失的菌株，以满足上述条件的克隆体作为dld缺失菌株，并将所得的菌株命名为MG1655△dld菌株。

[实施例14]利用MG1655△dld菌株生产D-乳酸

作为预培养是在装有25ml LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的三角烧瓶中植入MG1655菌株或MG1655△dld菌株，以120rpm的速度搅拌培养过夜。将各种预培养液整体转移到装有475g如表20所示组成的培养基的ABLE社制培养装置BMJ-01的培养槽中，进行培养。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为200rpm、培养温度为31℃、pH为6.7(利用NaOH调节)的条件下，培养96小时。按照常规方法，利用HPLC测定48小时后以及培养结束后的乳酸、丙酮酸、甲酸以及乙酸的含量。MG1655菌株、MG1655△dld菌株分别标记为Wild、△dld，48小时后的结果如表21所示，培养结束时的结果如表22所示。

表20

培养基组成

Glucose	100g/L
		Na2HPO4·12H2O	6.0g/L
(NH4)2SO4	6.0g/L
		KH2PO4	3.0g/L
NaCl	3.0g/L
		MgSO4·7aq	0.1g/L
酵母浸膏	0.5g/L
		酪蛋白水解物	5.0g/L

表21

48小时后的结果

	wild	△dld
			D-乳酸蓄积量丙酮酸蓄积量甲酸蓄积量乙酸蓄积量	26g/L4.5g/L5.0g/L14g/L	22g/L1.1g/L1.55g/L9.5g/L

表22

96小时后的结果

	wild	△dld
			D-乳酸蓄积量丙酮酸蓄积量甲酸蓄积量乙酸蓄积量	36g/L5.84g/L3.4g/L12g/L	41g/L1.26g/L0g/L11g/L

[实施例15]大肠埃希菌MG1655pfl、dld基因缺失菌株的制备

将实施例4中得到的质粒pTH△pfl转化到MG1655△dld菌株中，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上殖，得到转化体。将所得转化体涂布在琼脂平板上，于30℃下培养过夜。然后，为得到上述培养菌体，将其涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到42℃下殖的菌落。通过与实施例5相同地进行操作而从所得菌落得到MG1655dld、pfl基因缺失菌株，将其命名为MG1655△pfl△dld菌株。

[实施例16]ldhA表达载体转化到MG1655△dld菌株、MG1655△pfl△dld菌株中

通过将实施例2中得到的质粒pGlyldhA转化到MG1655△dld菌株、MG1655△pfl△dld菌株中，得到MG1655△dld/pGlyldhA菌株、MG1655△pfl△dld/pGlyldhA菌株。

[实施例17]利用MG1655菌株、MG1655△dld菌株、MG1655△pfl菌株、MG1655△pfl△dld菌株、MG1655△dld/pGlyldhA菌株、MG1655△pfl△dld/pGlyldhA菌株生产D-乳酸

作为预培养是在装有25ml LB Broth，Miller培养液的三角烧瓶中植入MG1655菌株、MG1655△dld菌株、MG1655△pfl菌株、MG1655△pfl△dld菌株、MG1655△dld/pGlyldhA菌株、MG1655△pfl△dld/pGlyldhA菌株，以120rpm的速度搅拌培养过夜。将各种预培养液整体转移到装有475g如表20所示组成的培养基的ABLE社制培养装置BMJ-01的培养槽中，进行培养。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为200rpm、培养温度为31℃、pH为6.7(利用NaOH调节)的条件下，培养96小时。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定乳酸、丙酮酸、甲酸以及乙酸的含量。96小时后的结果如表23所示。菌株名分别表示为A、B、C、D、E、F。

表23

培养液中的各种有机酸浓度(表中的数值单位都是g/L)

	A	B	C	D	E	F
							D-乳酸蓄积量丙酮酸蓄积量甲酸蓄积量乙酸蓄积量	402.74.011	41.51.03.57.3	602.3ND4.4	611.1ND4.3	430.93.57.0	650.7ND4.2

[实施例18]GAPDH启动子控制下ldhA表达载体和ldhA表达载体转化体的构建

大肠埃希菌的ldhA基因的碱基序列是公知的(GenBank accessionnumber U36928)。为了获得甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，以大肠埃希菌MG1655菌株的基因组DNA为模板，利用AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列号13)、以及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号14)进行PCR扩增，利用限制性内切酶EcoRI切割得到的DNA片段，由此得到约100bp的编码GAPDH启动子的片段。接下来，为得到D-乳酸脱氢酶结构基因(ldhA)，以大肠埃希菌MG1655菌株的基因组DNA为模板，利用GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(序列号15)、以及CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序列号16)进行PCR扩增，利用限制性内切酶EcoRI和HindIII切割得到的DNA片段，由此获得约1.0kbp的D-乳酸脱氢酶结构基因(ldh)片段。将上述2个DNA片段与利用限制性内切酶EcoRI和HindIII切割质粒pUC18得到的片段混合，并利用连接酶连接，然后转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞(TAKARA BIO社制)中，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基上，于30℃下培养过夜，从得到的菌体中回收质粒pGAPldhA。将该质粒pGAPldhA转化到MG1655△pfl△dld菌株中，通过于37℃下在含有1μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养过夜，得到MG1655△pfl△dld/pGA PldhA菌株。

[实施例19]大肠埃希菌MG1655△pfl△dld菌株的基因组上ldhA启动子对GAPDH启动子的取代

大肠埃希菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠埃希菌的ldhA基因的碱基序列也被报道(GenBank accession number U36928)。使用基于来源于大肠埃希菌MG1655菌株的ldhA基因的5’附近区域的基因信息制备的AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列号17)和GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列号18)，以大肠埃希菌基因组DNA为模板进行PCR，由此来扩增约1000bp的DNA片段。

另外，利用基于大肠埃希菌MG1655菌株的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子的序列信息制备的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列号19)和基于大肠埃希菌MG1655菌株的ldhA基因的序列信息制备的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列号20)，以实施例18中制备的表达载体pGAPldhA为模型，进行PCR扩增，得到由GAPDH启动子和ldhA基因的起始密码子附近区域组成的约850bp的DNA片段。

分别利用限制性内切酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI切割上述得到的片段，将该片段与利用KpnI和PstI切割温度感受性质粒pTH18csl得到的片段混合，并利用连接酶连接，然后于30℃下转化到DH5α感受态细胞(TAKARA BIO社制)中，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，得到转化体。将得到的菌落于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上培养过夜，从得到的菌体中回收质粒，并命名为pTH-GAPldhA。将pTH-GAPldhA于30℃下转化到MG1655△pfl△dld菌株，并于30℃在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养过夜，得到转化体。将得到的转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上，于30℃培养过夜。接下来，为得到上述培养菌体，将其涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，42℃下繁殖，得到菌落。将所得菌落在不含有药剂的LB液体培养基中于30℃培养过夜，然后再涂布到不含药剂的LB琼脂平板上，42℃下繁殖，得到菌落。

从出现的菌落中任意挑选100个菌落，使其分别在不含有药剂的LB琼脂平板上和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，挑选氯霉素感受性的克隆体。然后利用PCR扩增上述目的克隆体的染色体DNA中的包含GAPDH启动子和ldhA基因的约800bp的片段，挑选ldhA启动子区域被GAPDH启动子取代的菌株，将满足以上条件的克隆体命名为MG1655△pfl△dld/GAPldhA基因组插入株。

[实施例20]利用MG1655△pfl△dld菌株、MG1655△pfl△dld/pGAPldhA菌株、MG1655△pfl△dld/GAPldhA基因组插入株生产D-乳酸

作为预培养是在装有25ml LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的三角烧瓶中植入MG1655△pfl△dld菌株、MG1655△pfl△dld/pGAPldhA菌株、MG1655△pfl△dld&pflB/GAPldhA基因组插入株，以120rpm的速度搅拌培养过夜。将各种预培养液整体转移到装有475g由120g/L葡萄糖、5％谷物浸提物(日本食品化工制)组成的培养基的1L容积的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中，进行培养。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为200rpm、培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养至葡萄糖被消耗掉。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定所得培养液中的D-乳酸蓄积量。结果如图1所示。D-乳酸蓄积生产率分别为MG1655△pfl△dld菌株在48小时为109.0g/L、MG1655△pfl△dld/pGAPldhA菌株在48小时为115.6g/L、MG1655△pfl△dld/GAPldhA基因组插入株在30小时为113.5g/L。

[实施例21]大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh菌株的制备

大肠埃希菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠埃希菌的mdh基因的碱基序列也被报道(GenBank accession number AE000403)。为了克隆编码mdh的基因(939bp)的碱基序列附近区域，合成4种序列号21、序列号22、序列号23及24所示的低聚核苷酸引物。具有序列号21的碱基序列的引物在5’末端处具有Kpn I识别部位、具有序列号22、23的碱基序列的引物在5’末端处具有BamH I识别部位、具有序列号24的碱基序列的引物在5’末端处具有Xba I识别部位。

根据Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons)所述的方法制备大肠埃希菌MG1655菌株的基因组DNA，利用得到的基因组DNA 1μg与序列号21和序列号22、序列号23和序列号24的组合，且上述引物DNA各使用100pmol，在通常的条件下进行PCR，扩增约800bp(以下也称为mdh-L片段)、及约1000bp(以下也称为mdh-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，利用Kpn I和BamH I切割mdh-L片段，利用BamH I和Xba I切割mdh-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种切割片段与温度感受性质粒pTH18csl(GenBank accession number AB019610)(Hashimoto-Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.241(1)，pp185-191(2000))经Kpn I和Xba I切割的产物反应后，转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞(TAKARA BIO社制)中，从而得到具有编码mdh的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段2个片段的质粒，将其命名为pTH△mdh。

将质粒pTH△mdh转化到大肠埃希菌MG1655△pfl△dld菌株中，利用与实施例5相同的方法，获得mdh基因被破坏的MG1655△pfl△dld菌株。将该菌株命名为MG1655△pfl△dld△mdh菌株。

[比较例1]大肠埃希菌MG1655△pflB△dld△ppc菌株的制备

大肠埃希菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠埃希菌的ppc基因的碱基序列也被报道(GenBank accession number AE000496)。为了克隆编码ppc的基因(2652bp)的碱基序列附近区域，合成4种具有序列号25、26、27和28所示的碱基序列的低聚核苷酸引物。序列号26、27的引物在5’末端处具有Xba I识别部位、序列号28的引物在5’末端处具有Sac I识别部位。

利用大肠埃希菌MG1655菌株的基因组DNA 1μg与序列号25和序列号26、序列号27和序列号28的组合，且上述引物DNA各使用100pmol，在通常的条件下进行PCR，扩增约1450bp(以下也称为ppc-L片段)、及约750bp(以下也称为ppc-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，利用HindIII和Xba I切割ppc-L片段，利用Xba I和SacI切割ppc-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种切割片段与温度感受性质粒pTH18csl经HindIII和SacI切割的产物反应后，转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞(TAKARA BIO社制)中，从而得到含有编码ppc的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段2个片段的质粒，将其命名为pTH△ppc。

将质粒pTH△ppc转化到大肠埃希菌MG1655△pfl△dld菌株中，最后获得ppc基因被破坏的MG1655△pfl△dld菌株。将该菌株命名为MG1655△pflB△dld△ppc菌株。需要说明的是，获得本菌株的详细方法基于本发明的实施例5中所述的方法。

[比较例2]大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△frd菌株的制备

大肠埃希菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠埃希菌的frd基因的碱基序列也被报道(GenBank accession number AE000487)。本实施例中缺失的frd基因是含有编码frdA的基因(1809bp)、编码frdB的基因(735bp)、编码frdC的基因(396bp)、编码frdD的基因(360bp)4种基因的基因。为了克隆frd基因的碱基序列附近区域，合成4种具有序列号29、30、31和32所示的碱基序列的低聚核苷酸引物。序列号29的引物在5’末端处具有EcoR I识别部位，序列号30、31的引物在5’末端处具有BamH I识别部位，序列号32的引物在其内部具有HindIII识别部位。

利用大肠埃希菌MG1655菌株的基因组DNA 1μg与序列号29和序列号30、序列号31和序列号32的组合，且上述引物DNA各100pmol，在通常的条件下进行PCR，扩增约600bp(以下也称为frd-L片段)、及约800bp(以下也称为frd-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，利用EcoR I和BamH I切割frd-L片段，利用BamH I和HindIII切割frd-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种切割片段与温度感受性质粒pTH18csl经EcoR I和HindIII切割的产物反应后，转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞(TAKARABIO社制)中，从而得到具有编码frd的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段2个片段的质粒，将其命名为pTH△frd。

将质粒pTH△frd转化到大肠埃希菌MG1655△pfl△dld菌株中，最后获得frd基因组被破坏的MG1655△pfl△dld菌株。将该菌株命名为MG1655△pfl△dld△frd菌株。获得本菌株的详细方法基于本发明实施例5中所述的方法。

[实施例22]大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh△asp菌株的制备

大肠埃希菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠埃希菌的aspA基因的碱基序列也被报道(GenBank accession number AE000486)。为了克隆编码aspA的基因(1482bp)的碱基序列附近区域，合成4种序列号33、34、35和36所示的低聚核苷酸引物。

利用大肠埃希菌MG1655菌株的基因组DNA 1μg与序列号33和序列号34、序列号35和序列号36的组合，且上述引物DNA各使用100pmol，在通常的条件下进行PCR，扩增约910bp(以下也称为aspA-L片段)、及约1100bp(以下也称为aspA-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，利用DNA BluntingKit(TAKARA BIO社制)将aspA-L片段和aspA-R片段的末端平滑化后，利用T4多核苷酸激酶，按照常规方法磷酸化5’末端。另一方面，温度感受性质粒pTH18csl经Sma I切割后，利用碱性磷酸酶进行脱磷酸处理。利用T4DNA连接酶使上述磷酸化的2种片段与脱磷酸化的质粒反应后，转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞(TAKARABIO社制)中，从而得到含有编码aspA的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段2个片段的质粒，将其命名为pTH△asp。

将质粒pTH△asp转化到大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh菌株中，最后获得aspA基因组被破坏的MG1655△pfl△dld△mdh菌株。将该菌株命名为MG1655△pfl△dld△mdh△asp菌株。获得本菌株的详细方法基于本发明实施例5中所述的方法。

[实施例23]大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh△asp菌株/GAPldhA基因组插入株的制备

将实施例19中得到的质粒pTH-GAPldhA于30℃下转化到MG1655△pfl△dld△mdh△asp菌株中，并在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上于30℃下培养过夜，得转化体。将得到的转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，于30℃培养过夜。接下来，为了得到上述培养菌体，将其涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，42℃下繁殖，得到菌落。将所得菌落于30℃下在不含药剂的LB液体培养基中培养过夜，然后涂布到不含药剂的LB琼脂平板上，42℃下繁殖，得到菌落。

从出现的菌落中任意挑选100个菌落，分别在不含有药剂的LB琼脂平板上和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，挑选氯霉素感受性的克隆体。然后利用PCR扩增上述目的克隆体的染色体DNA中的包含GAPDH启动子和ldhA基因的约800bp的片段，挑选ldhA启动子区域被GAPDH启动子取代的菌株，将满足以上条件的克隆体命名为MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因组插入株。

[实施例24]利用大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh菌株生产D-乳酸、及琥珀酸

作为预培养是在4个装有25ml LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的三角烧瓶中，分别植入实施例15中得到的大肠埃希菌MG1655△pfl△dld菌株、实施例21中得到的大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh菌株、比较例1中得到的大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△ppc菌株、比较例2中得到的大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△frd菌株，于30℃下以120rpm的速度搅拌培养过夜。然后，在4个装有475g表24所示培养基的1L容积的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中分别植入上述烧瓶的全部内容物。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为200rpm、培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养32小时。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定得到的培养液中的乳酸、及琥珀酸的浓度。乳酸蓄积结果如图2所示，琥珀酸的蓄积结果如图3所示。

关于乳酸，△pfl△dld△mdh菌株32小时的蓄积量为89g/L，显示了与△pfl△dld菌株同等的蓄积程度，而在△pfl△dld△ppc菌株、△pfl△dld△frd菌株中，分别为56g/L、71g/L。

关于琥珀酸，△pfl△dld菌株32小时的蓄积量为3.8g/L，而其余3种菌株都未见蓄积。

表24

培养基组成

葡萄糖	12％
		谷物浸提物(日本食品化工制)	5％

(剩余部分：水)

[实施例25]利用大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh△asp菌株及MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因组插入株生产D-乳酸、及富马酸

作为预培养是在3个装有25ml LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的三角烧瓶中，分别植入实施例22中得到的大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh△asp菌株、实施例23中得到的大肠埃希菌MG1655△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因组插入株、及实施例21中得到的△pfl△dld△mdh，于30℃下以120rpm的速度搅拌培养过夜。然后，在3个装有475g表24所示的培养基的1L容积的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中分别植入上述烧瓶的全部内容物。在大气压下、通气量为0.5vvm、搅拌速度为200rpm、培养温度为35℃、pH为7.2(利用NaOH调节)的条件下，培养48小时。培养结束后，按照常规方法，利用HPLC测定得到的培养液中的乳酸、及富马酸的浓度。乳酸蓄积结果如图4所示，富马酸的蓄积结果如图5所示。

关于乳酸，△pfl△dld△mdh△asp菌株48小时的蓄积量为91g/L，△pfl△dld△mdh菌株48小时的蓄积量为90g/L，二者显示了同等的蓄积程度，而在△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因组插入株中，24小时的蓄积量为98g/L。

关于富马酸，在△pfl△dld△mdh菌株中，48小时的蓄积量为0.037g/L，而在△pfl△dld△mdh△asp菌株和△pfl△dld△mdh△asp/GAPldhA基因组插入株中，48小时的蓄积量为0.01g/L。

                         序列表

<110>三井化学株式会社

<120>D-乳酸生产用生物催化剂

<130>F000364

<160>36

<210>1

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>1

ggaattcgtc gaccggctcc agttcgaagc tggt 34

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>2

ggaattctga ctcagctaac aataaaattt tt 32

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>3

ggaattccgg agaaagtctt atgaaact 28

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

cccaagcttt taaaccagtt cgttcgggc 29

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

gcacgaaagc tttgattacg 20

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

ttattgcatg cttagatttg actgaaatcg 30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

ttattgcatg cttatttact gcgtacttcg 30

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

aaggcctacg aaaagctgca g 21

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

caacaccaag ctttcgcg 18

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>10

ttccactcct tgtggtggc 19

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>11

aactgcagaa attacggatg gcagag 26

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>21

tgttctagaa agttctttga c 21

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>13

aacgaattct cgcaatgatt gacacgattc 30

<210>14

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>14

acagaattcg ctatttgtta gtgaataaaa gg 32

<210>15

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>15

ggaattccgg agaaagtctt atgaaact 28

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>16

cccaagcttt taaaccagtt cgttcggggc 30

<210>17

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>17

aaggtaccac cagagcgttc tcaagc 26

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>18

gctctagatt ctccagtgat gttgaatcac 30

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>19

ggtctagagc aatgattcac acgattcg 28

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>20

aactgcaggt tcgttctcat acacgtcc 28

<210>21

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>21

aaaggtacca gaataccttc tgctttgccc 30

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>22

aaaggatccc ctaaactcct tattatattg 30

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>23

aaaggatcca aaccggagca cagactccgg 30

<210>24

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>24

aaatctagaa tcagatcatc gtcgccttac 30

<210>25

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>25

acggagcatg acggcaagc 19

<210>26

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>26

aatctagaca ccccatctta tcgtttg 27

<210>27

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>27

tttctagatc ttcctcttct gcaaaccc 28

<210>28

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>28

ctttgagctc acgcgaggcc aggttatc 28

<210>29

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>29

agtgaattct cacagccagt gcgccga 27

<210>30

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>30

agtggatccc gcatcgccaa tgtaaatcc 29

<210>31

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>31

agtggatccg acattcctcc agattgtttt t 31

<210>32

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>32

ataacgcaag aaagcttgtt ga 22

<210>33

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>33

ttttgagctc gatcaggatt gcgttggtgg 30

<210>34

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>34

cgaacagtaa tcgtacaggg 20

<210>35

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>35

tacgattact gttcggcatc gaccgaatac ccgag 35

<210>36

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>36

tttttctaga cctggcacgc ctctcttctc 30

Claims (31)

1、一种乳酸的生产方法，其特征在于，在添加了2种或2种以上氨基酸的培养基中培养丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的异型乳酸发酵细菌，从得到的培养物中回收乳酸。

2、如权利要求1所述的乳酸的生产方法，其特征在于，异型乳酸发酵细菌是大肠埃希菌。

3、如权利要求2所述的乳酸的生产方法，其特征在于，大肠埃希菌是MT-10934(FERM BP-10057)。

4、一种D-乳酸的生产方法，其特征在于，培养来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强、且丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的细菌，从得到的培养物中回收D-乳酸。

5、如权利要求4所述的D-乳酸的生产方法，其中，细菌是大肠埃希菌。

6、如权利要求4或5所述的D-乳酸的生产方法，其特征在于，在添加了2种或2种以上氨基酸的培养基中进行培养。

7、一种微生物，该微生物是其本来具有的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低的微生物，其特征在于，丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强。

8、如权利要求7所述的微生物，该微生物为细菌。

9、如权利要求8所述的微生物，所述细菌是大肠埃希菌。

10、一种D-乳酸的生产方法，其特征在于，在液体培养基中培养如权利要求7～9任一项所述的微生物，使D-乳酸在培养液中生成并蓄积，从培养液中分离D-乳酸。

11、如权利要求10所述的D-乳酸的制造方法，其特征在于，在添加了2种或2种以上氨基酸的培养基中进行培养。

12、一种D-乳酸的生产方法，其特征在于，在液体培养基中培养FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低的微生物，使D-乳酸在培养液中生成并蓄积，从培养液中分离D-乳酸。

13、如权利要求12所述的方法，其中，微生物是细菌。

14、如权利要求13所述的方法，其中，细菌是大肠埃希菌。

15、一种微生物，在该微生物的基因组上编码来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的基因通过使用控制与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子，表达该NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)。

16、如权利要求15所述的微生物，该微生物是大肠埃希菌。

17、如权利要求15或16所述的微生物，其特征在于，该微生物本来具有的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低。

18、一种大肠埃希菌，在大肠埃希菌的基因组中，使用控制来源于大肠埃希菌的与糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子取代编码来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的基因的启动子，表达该NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)。

19、如权利要求18所述的大肠埃希菌，其中，控制与大肠埃希菌的糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相关的蛋白质表达的基因的启动子是来源于大肠埃希菌的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的启动子。

20、如权利要求18或19所述的大肠埃希菌，其特征在于，该大肠埃希菌本来具有的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低。

21、一种生产乳酸的方法，是利用培养基培养如权利要求15～20中任一项所述的微生物生产D-乳酸的方法。

22、一种微生物，该微生物具有TCA循环、且苹果酸脱氢酶(mdh)失活或活性降低，其特征在于，该微生物的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低，且/或FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)失活或活性降低。

23、如权利要求22所述的微生物，其中，该微生物本来具有的天冬氨酸解氨酶(aspA)失活或活性降低。

24、如权利要求22或23所述的微生物，该微生物是细菌。

25、如权利要求24所述的微生物，其中，细菌是大肠埃希菌。

26、如权利要求25所述的微生物，其中，来源于大肠埃希菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(ldhA)的活性被增强。

27、一种生产TCA循环中产生的有机酸以外的化合物的方法，该方法利用培养基培养如权利要求22～26中任一项所述的微生物，由此生产TCA循环中产生的有机酸以外的化合物。

28、如权利要求27所述的生产方法，其中，有机酸以外的化合物是D-乳酸。

29、如权利要求1～6、10～14、21、28中任一项所述的乳酸的生产方法，其特征在于，在通气条件下进行培养。

30、如权利要求29所述的乳酸的生产方法，其特征在于，所述通气条件为，在以温度为30℃的水为对象的情况下，通过供给氧气使常压下氧气体积传质系数K_La在大于或等于1h^-1、小于或等于400h^-1的范围内的条件。

31、如权利要求1～6、10～14、21、28～30中任一项所述的乳酸的生产方法，其特征在于，培养pH为6～8。

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