CN102471787A - 乳酸制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种乳酸制造方法,包括:使用乳酸生产微生物,在超过常压并且能够维持该乳酸生产微生物的乳酸生产活性的压力条件下,进行乳酸发酵,得到D-乳酸或L-乳酸。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸制造方法。
背景技术
D-乳酸作为与L-乳酸形成的立体络合物型聚乳酸的原料或药物中间体,近年来备受关注。在上述所有用途中,都要求作为原料的D-乳酸具有高光学纯度。
乳酸通常可以通过利用了微生物的发酵法进行工业制造。发酵工序为进行微生物的培养和以增殖的微生物作为催化剂的物质生产的工序,因此,在微生物的增殖中需要营养源。工业上通常作为营养源使用的廉价的玉米浆,是在玉米的加工过程中得到的含有较多氨基酸等的营养价值高的液体,但是由于含有L-乳酸、D-乳酸两者,所以成为导致光学纯度下降的原因之一。
从上述观点考虑,为了有效地制造乳酸、同时提高产品的光学纯度,正在研究使用不含L-乳酸的原料、或者削减来自原料或产物的L-乳酸量等。
例如,在日本特表2005-528111号公报中,使用不含L-乳酸的原料,使用每个特定微生物的氧摄取速度作为控制参数,进行调节使在生产期内维持所期望的每个微生物的氧摄取速度。已有报道指出其结果能够得到高乳酸生产速度和高乳酸收率。
日本特开2008-301766号公报中公开了使用不含L-乳酸的原料,为了提高乳酸收率向培养基中添加叶酸,由此可以得到高乳酸收率。
在国际公开第2005/033324号说明书中公开了如下内容,将微生物进行改变使其能够高选择性地以高生产率生产D-乳酸,使用该微生物能够有效地分解原料中含有的L-乳酸,从而光学纯度提高且D-乳酸的生产率提高。另外,还公开了虽然也可以完全不进行通气,但是也可以在常压下、0.1vvm~1vvm的通气量、50rpm~500rpm的搅拌速度的条件下,即以温度30℃的水作为对象时,在常压下、氧移动速度系数(kLa)为1/hr~400/hr的通气搅拌条件下培养。
如上所述的利用微生物的改变和原料的调节而获得的生产率的提高,虽然具有能够直接利用现有设备的优点,但是需要对乳酸生产微生物的生物活性进行研究,开发新的微生物反应体系有时花费时间。
另一方面,在日本特开平7-313174号公报中,作为不降低酶活性、且能够抑制反应中的细菌等微生物增殖的酶反应方法,公开了至少在1MPa的加压下、例如在100MPa或10MPa的条件下处理基质的方法。
在日本特开2002-78495号公报中,作为能够在短时间内有效地实施酶分解处理的酶处理方法,公开了有效地更换基质可以得到酶反应产物的酶处理方法。其中记载了,在该方法中通过加压使酶活化,同时提高酶自身的稳定性,能够在高于通常的酶反应温度的高温下处理,例如公开了在150MPa的条件下的酶处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通用性高且简便地提高乳酸的光学纯度的乳酸制造方法。
本发明如下所述。
[1]一种乳酸制造方法,包括:以糖作为原料,使用乳酸生产微生物,在超过常压并且能够维持该乳酸生产微生物的乳酸生产活性的压力条件下,进行乳酸发酵,得到D-乳酸或L-乳酸。
[2]如[1]所述的乳酸制造方法,其中,上述乳酸为D-乳酸。
[3]如[1]或[2]所述的乳酸制造方法,还包括回收所得的上述乳酸。
[4]如[1]~[3]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述压力条件通过氧或含有氧的混合气体进行调节。
[5]如[1]~[4]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述压力条件超过0.10MPa、并且为0.50MPa以下。
[6]如[1]~[5]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述压力条件为0.12MPa~0.16MPa。
[7]如[1]~[6]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述发酵中的氧移动速度(OTR)在超过0.0mmol-O2/L/hr、并且为15.0mmol-O2/L/hr以下的范围内。
[8]如[1]~[6]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述发酵中的氧移动速度(OTR)在1.0mmol-O2/L/hr~15.0mmol-O2/L/hr的范围内。
[9]如[1]~[8]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述乳酸发酵在pH7.0~pH8.0的范围内进行。
[10]如[1]~[9]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述乳酸生产微生物为乳酸生产大肠杆菌。
[11]如[1]~[10]中任一项所述的乳酸制造方法,其中,上述乳酸生产微生物为乳酸生产大肠杆菌,所述乳酸生产大肠杆菌以D-乳酸及L-乳酸中的一方作为目标产物的生产机制被强化,并且该目标产物的分解机制被缺失或减弱。
[12]如[1]~[11]所述的乳酸制造方法,其中,上述乳酸生产微生物为D-乳酸生产大肠杆菌,所述D-乳酸生产大肠杆菌的D-乳酸生产机制被强化,并且作为分解机制的dld被缺失或减弱。
根据本发明,可以提供一种通用性高且简便地提高乳酸的光学纯度的乳酸制造方法。
附图说明
[图1]为本发明的实施例中使用的发酵装置的简图。
具体实施方式
本发明的乳酸制造方法包括:以糖作为原料,使用乳酸生产微生物,在超过常压并且能够维持该乳酸生产微生物的乳酸生产活性的压力条件下,进行乳酸发酵,得到D-乳酸或L-乳酸。
本发明中,以糖作为原料使用乳酸生产微生物进行乳酸发酵时,由于在超过常压并且能够维持该乳酸生产微生物的乳酸生产活性的压力条件下进行乳酸发酵,所以与在常压(0.10MPa)下进行乳酸发酵相比,能够提高作为目标的D-乳酸或L-乳酸的光学纯度。
由此,可以提供一种提高光学纯度的方法,所述方法不需要大幅度地变更设备,通过简单的操作就能够提高作为目标的化合物的光学纯度,同时具有也能够应用于具有使用成就的微生物反应体系的通用性。
需要说明的是,本发明中所谓“提高乳酸的光学纯度”,是指增加在回收产物中作为目标的光学异构体(L-乳酸或D-乳酸)的比例。所谓增加作为目标的光学异构体的比例,并不限定于作为目标之一的光学异构体的产量增加的情况,也包括抑制作为目标之一的光学异构体的分解的情况、促进另一种光学异构体的分解的情况和抑制其它副产物的生成的情况等。
另外,本发明中所谓“超过常压并且能够维持该乳酸生产微生物的乳酸生产活性的加压条件下”,是指相对于常压为加压的状态,能够维持乳酸生产微生物的与乳酸生产相关的通常活性的程度的加压状态。
本说明书中,术语“工序”不仅为独立的工序,也可以为不能与其他工序明确区别的情况,只要能实现本工序所期望的作用,则包含在本术语中。
另外,本说明书中使用“~”表示的数值范围,表示含有“~”前后记载的数值分别作为最小值及最大值的范围。
以下,对本发明进行说明。
本发明中能够使用的乳酸生产微生物没有特别限制,只要为能够生产L-乳酸或D-乳酸的微生物即可,可以为任意微生物。
其中,优选为生产D-乳酸或被强化后生产D-乳酸的微生物,更优选具有作为光学异构体的L-乳酸的分解能力的微生物及具有促进L-乳酸分解作用的微生物。通过使用上述微生物,能够更有效地提高D-乳酸的光学纯度。
作为上述微生物,可以为乳酸菌等野生型的、生产乳酸的微生物,但优选通过遗传修饰等能够进行乳酸生产或强化乳酸生产的微生物,进而,从L-乳酸分解性的观点考虑,更优选在微需氧至需氧条件下能够生产乳酸的微生物。作为上述微生物,例如可以举出酵母、大肠杆菌、乳酸菌等,较优选为遗传修饰成效丰富的大肠杆菌。
作为上述乳酸生产大肠杆菌的遗传修饰大肠杆菌,只要为进行修饰以提高乳酸例如D-乳酸的生产的大肠杆菌即可,可以没有特别限制地使用。作为上述乳酸生产大肠杆菌,例如可以举出使FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(dld)活性灭活或降低的大肠杆菌、强化了编码D-乳酸脱氢酶的基因(例如ldhA)的表达(例如导入甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)启动子)的大肠杆菌、使丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)的活性灭活或降低的异型乳酸发酵细菌等(APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Jan.2003,p.399-407)。也可以为将上述遗传修饰组合进行的微生物。
作为进行修饰以提高L-乳酸生产的微生物,也优选使用下述微生物:将主要催化由丙酮酸合成L-乳酸的反应的NAD型L-乳酸脱氢酶(例如Ldh2)导入·强化的微生物;和独立于上述导入·强化或与其进行组合,使主要对分解L-乳酸的反应进行催化的FMN型L-乳酸脱氢酶(例如lldD)灭活或降低的微生物等。
另外,上述乳酸生产大肠杆菌可以进行修饰以减少除乳酸之外的化合物(副产物)的生产。作为上述遗传修饰大肠杆菌,可以举出苹果酸脱氢酶(mdh)活性被灭活或降低、且天冬氨酸氨裂合酶(aspA)活性被灭活或降低的大肠杆菌。
日本特开2005-102625号、WO2005/033324号等中公开了上述大肠杆菌。从D-乳酸的生产效率的观点考虑,特别优选WO2005/033324号中记载的能微需氧发酵的大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株/GAPldhA基因组株,但并不限定于此,通过突变处理等强化D-乳酸的生产活性或L-乳酸的分解活性的其它菌株也包含在其发明的范围内。
需要说明的是,如上所述使用乳酸菌等野生型的、生产乳酸的微生物时,可以将促进其它光学异构体的分解活性的遗传修饰、和降低副产物的生产的遗传修饰单独或组合导入,而不伴有能够生产乳酸的遗传修饰或强化乳酸生产的遗传修饰。
本乳酸制造方法包括:以糖作为原料,使用乳酸生产微生物,在超过常压并且能够维持该乳酸生产微生物的乳酸生产活性的压力条件下,进行乳酸发酵,得到乳酸(以下有时简单称作“发酵工序”)。
发酵工序在超过常压的压力条件下、即超过0.10MPa的压力条件下进行。
上述压力条件高于在通常的大气压下的发酵条件,意外地发现在利用微生物的乳酸生产中,在上述压力条件下,乳酸的光学纯度提高。
作为发酵工序中的压力条件,从所得乳酸的光学纯度的观点考虑,优选超过0.10MPa并且为0.50MPa以下,较优选高于0.10MPa、且为0.20MPa以下,更优选为0.12MPa~0.16MPa。为超过0.10MPa的压力时,能够提高乳酸的光学纯度,故优选。另一方面,为0.50MPa以下的压力时,微生物因压力所受到的负荷小,故优选。另外,如果为上述范围的压力条件,则为所谓“微加压”的条件,对于在通常的发酵工序中所用的发酵装置,可以直接使用或者以追加加压结构的程度的微小的装置变更进行使用。
压力条件的调节可以通过向发酵槽中注入气体(通气)简便地进行。
此处,作为使用的气体,可以举出氧或含有氧的混合气体、氮、碳酸(二氧化碳)等。作为含有氧的混合气体,例如可以为含有1容量%以上氧的混合气体,例如为空气。其中,从微生物的生长的观点和光学纯度的观点考虑,优选氧或含有氧的混合气体。需要说明的是,为混合气体的情况下,从氧的分散性的观点考虑,优选含有10容量%~50容量%氧的混合气体。
氧或含有氧的混合气体的通气可以在发酵工序的整个过程中进行,也可以仅在某一时期进行。仅在发酵工序的某一时期通气时,可以在微生物的生长期的一部分进行氧或含有氧的混合气体的通气。通过将通气条件转换为氮、碳酸等气体或无通气,可以简便地实施。仅在某一时期进行通气时,具体而言优选将氧或含有氧的混合气体从发酵开始通气1小时以上。此处所谓生长期是微生物生长、发酵槽内的微生物浓度变高的期间。
另外,作为发酵工序中的反应体系的pH,可以为pH6.0~pH9.0的通常发酵条件,但从光学纯度的观点考虑,优选为pH7.0~pH8.0,更优选为pH7.4~pH7.6。pH可以使用碱中和剂进行调节,能够使用的中和剂的种类没有任何限定,只要不是使微生物死亡的物质或使D-乳酸的生产停止的物质即可。例如可以举出NaOH、NH3、Ca(OH)2、CaCO3等。
关于发酵工序中的通气,不一定必需使气体在发酵液中通过,根据发酵槽的形状,也包括一边适度搅拌发酵液一边使发酵液上的气相进行换气的上面通气,意味着使气体流入发酵槽的内部。另外,加压可以向发酵槽中填充气体而不通气,在这种情况下,为了满足加压条件,例如可以向密闭的发酵槽中填充上述氧或含有氧的混合气体。
作为发酵工序中的通气量,可以为0vvm~5vvm的通常的通气量,但从高光学纯度的观点考虑,优选高于0vvm的通气量,从乳酸生产效率的观点考虑,优选为2vvm以下,较优选为1.5vvm以下。
需要说明的是,本发明中有时使用标记vvm作为通气量。本说明书中所谓“vvm”,表示1分钟内为液容量几倍的通气,例如相对于10L的发酵液进行2vvm的通气,表示每分钟进行20L的通气。
向液体中通气时,根据内压、搅拌桨叶位置、搅拌桨叶形状、搅拌速度的组合,氧在液体中的溶解速度发生变化,因此,能够以乳酸的生产率及除乳酸之外的有机酸量等为指标设定各种条件。需要说明的是,对于设定的通气条件,不必从发酵初期到结束始终如一地进行,通过在发酵工序的一部分中执行上述条件,也可以得到优选的结果。通过如上所述进行通气,可以实现乳酸生产率的提高、目标以外的光学异构体的减少。
作为本发酵工序中的条件,从高光学纯度的乳酸生产效率的观点考虑,优选在氧移动速度(OTR)大于0.0mmol-O2/L/hr、且为15.0mmol-O2/L/hr以下的条件下进行发酵(以下称作微需氧条件),进而,从光学纯度、乳酸生产率的观点考虑,较优选为1.0mmol-O2/L/hr~15.0mmol-O2/L/hr,更优选为1.0mmol-O2/L/hr~10.0mmol-O2/L/hr,进一步优选为1.0mmol-O2/L/hr~5.0mmol-O2/L/hr。需要说明的是,OTR可以是在乳酸生产期测定的值。此处,所述乳酸生产期,是指发酵开始后、经过微生物培养的适应期微生物开始增殖生产乳酸的时期。另外,将微生物的培养与乳酸生产分开实施时,是指乳酸生产工序。
本发明中的所谓氧移动速度(OTR)为发酵液的每单位体积的氧移动速度,即也称作微生物的氧摄取速度。OTR使用通过排气分析法由以下的式1求出的值。
(式1)
OTR=7.22×106/VL×(QiPiyi/Ti-QoPoyo/To)
VL:发酵槽中的液量(L)
Qi及Qo:空气入口及出口的空气流量(L/min)
Pi及Po:空气入口及出口的空气压(MPa)
Ti及To:空气入口及出口的绝对温度(K)
yi及yo:空气入口及出口的氧的摩尔分率
需要说明的是,基于上述式1计算OTR时,空气流量、空气压、绝对温度的值在空气入口及出口的差仅为可以忽视的程度时,可以使用在1处的测定值。另外,本发明中所述的压力及空气压是指绝对压力。
由于菌体量和每个菌体的氧消耗量在发酵期间变化,所以OTR根据通气量、搅拌旋转速度、温度、压力、pH等发生变动。因此,为了调节OTR在上述范围内,可以适当调节空气流量、空气压等。
另外,上述OTR也可以换算为其他指标。作为上述其他指标,可以举出液膜容量系数(volumetric coefficient of liquid film)(kLa)。液膜容量系数(kLa)为通气量·搅拌旋转速度的函数,已知以下关系(式2,Richards,J.W.1961,Prog.Ind.Micro.3,143-172)
(式2)
kLa∝(Pg/V)0.4Vs0.5N0.5
Pg:通气搅拌槽的动力消耗
V:槽中装入的液量
VS:表观的空气线速度(通气量/槽截面积)
N:搅拌旋转速度
OTR和kLa的相关性用以下式3表示。本发明的发酵工序中的kLa使用下述关系式计算的值优选大于0/h、小于68/h,较优选为4.5/h~45/h。
(式3)
kLa=OTR/([DO]*-[DO])
[DO]*:与气相中的氧分压平衡的发酵液中的溶解氧浓度
[DO]:实际的溶解氧
[DO]*与槽内的压力成比例变化。因此,为了保持槽内的OTR恒定不受压力的影响,需要根据压力改变kLa,具体而言改变通气量和搅拌旋转速度。例如,由于加压时[DO]*上升,所以为了使OTR恒定,可以降低通气量或搅拌旋转速度进行调节。
本发明的乳酸制造方法中,在超过常压并且能够维持该乳酸生产微生物的乳酸生产活性的加压条件下的发酵中,即使基于加压降低kLa使OTR与常压条件下相同时,与常压条件下的生产相比,也可以提高作为目标的乳酸的光学纯度。
本发酵工序中,可以分别组合上述压力条件、pH及OTR进行应用。此时,可以适当组合关于各条件记载的优选范围进行应用。
本发明的乳酸制造方法中,可以使用通常作为制造乳酸的原料使用的糖作为原料。作为用作原料的糖,只要是通常使用的碳源即可,作为通常的糖,可以举出淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类、或含有大量上述成分的草本木本植物降解产物或纤维素水解物等。进而,在原料中含有本发明的碳源的同时,还可以含有来自植物油的甘油或脂肪酸。
作为本发明的原料的糖,可以以单体的形式利用,也可以使用来自植物的原料本身作为用作原料的糖。作为上述来自植物原料的例子,优选可以举出谷物等农作物、玉米、大米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等或它们的组合,作为所述原料的使用形态,可以为未加工品、榨汁、粉碎物等,没有特别限定。另外,可以为仅包括上述碳源的形态。
来自植物原料与乳酸生产细菌的混合根据乳酸生产细菌的活性而不同,作为培养基中的来自植物原料的浓度,通常可以使换算为葡萄糖的最初的糖浓度相对于混合物的总质量为20质量%以下,从细菌的耐糖性的观点考虑,可以优选使最初的糖浓度为15质量%以下。其它各成分可以以通常添加的量添加在微生物的培养基中,没有特别限制。
本发明中的所谓“发酵”,是指使用培养基培养本发明的微生物、或生产目标物。微生物的培养和目标物的生产可以同时实施,也可以在培养微生物后,使用取得的微生物生产目标物。此时,作为使用的培养基,只要为含有上述碳源、氮源、无机离子及微生物为了生产乳酸所必需的有机微量元素、核酸、维生素类等的培养基即可,没有特别限制。
其中,从生产速度的观点考虑,优选在添加有2种以上氨基酸的培养基中发酵。本发明中的所谓添加有2种以上氨基酸的培养基,是指含有天然存在的各种氨基酸中的至少2种以上的培养基,也包括含有酵母提取物、酪蛋白氨基酸、胨、乳清、糖蜜、玉米浆等天然物或天然物提取物的水解物的培养基。为了得到更优选的结果,优选含有选自酵母提取物、胨、乳清、糖蜜、玉米浆中的至少一种、或它们的混合物0.5质量%~20质量%的培养基,更优选2质量%~15质量%。特别是添加玉米浆能获得较显著的效果。培养基或反应体系为通常液体培养基。
需要说明的是,与组合物中的各成分相当的物质存在多种时,除非另作说明,上述浓度是指组合物中存在的所述多个物质的总量。
发酵条件根据所得微生物、发酵装置而变动,例如发酵温度为0℃~60℃,从微生物增殖的观点考虑,优选在20℃~40℃的范围内,较优选在25℃~35℃的范围内。
发酵时间没有特别限定,只要为菌体充分增殖、并且乳酸生成需要的时间即可,例如可以为15小时以上。
在发酵时,通常一般情况使用能够控制温度、pH、通气条件、搅拌速度的发酵槽,但本发明在发酵时并不限于使用发酵槽。使用发酵槽发酵时,根据需要可以预先进行种菌体的培养作为前培养,将其接种到预先制备了需要量的发酵槽内的培养基中。
作为在种菌体的培养基中的接种量,与通常微生物的培养相同,只要能生产目标物即可,没有特别限定。通常可以接种相对于培养基为0.05容量%~15容量%的前培养液。需要说明的是,作为乳酸生产细菌可以使用多种。
本发明中的所谓发酵物,是指使用上述方法生产的菌体、发酵液及它们的处理物。
本发明的乳酸制造方法还可以包括回收在发酵工序中得到的上述乳酸(以下有时简单称作“回收工序”)。
从如上所述得到的发酵液等发酵物中回收乳酸的方法,例如可以利用能够用于从发酵液中回收乳酸的通常已知的方法,例如可以采用酸化后直接蒸馏的方法、形成丙交酯蒸馏的方法、加入乙醇和催化剂进行酯化后蒸馏的方法、在有机溶剂中提取的方法、用离子交换柱分离的方法、通过电渗析浓缩分离的方法等或将它们组合的方法。另外,本发明的方法中所使用的菌体生产酶组,该酶组适用于乳酸生产,因此,利用上述酶组进一步生产乳酸、进行回收也被视为从发酵物中回收乳酸的方法的一部分。
本发明的乳酸制造方法中,由于能够生产光学纯度高的乳酸,所以通过回收发酵工序后得到的发酵物中含有的乳酸,能够纯度良好地得到D-乳酸或L-乳酸。
本发明的乳酸制造方法中,可以使用常规方法的HPLC或F-试剂盒D-/L-乳酸(J.K.International,产品编号:1112821)确认光学纯度。
实施例
以下利用实施例详细说明本发明。但是,本发明并不限定于以下实施例。需要说明的是,只要没有特殊说明,则“%”及“份”为质量基准。
[实施例1]
<前培养>
向锥形瓶中加入烧瓶容量的1/5量的LB培养基(DifcoTM LBBroth Miller),在121℃下进行高压釜杀菌15分钟。在高压釜杀菌后的培养基中接种0.1vol%的WO05/033324记载的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株/GAPldhA基因组株。在35℃的恒温室内进行振动培养16hr,使种菌体增殖。
<发酵>
接下来,在1L发酵槽(ABLE公司制BML-01PI)中接种25mL上述前培养液,所述发酵槽中加有500mL表1所示组成的经高压釜杀菌的培养基。发酵被控制在压力0.12MPa、搅拌旋转速度260rpm、空气通气量0.26vvm、发酵温度35℃、pH7.5(用NaOH调节),实施48hr。
[表1]
葡萄糖(WAKO) | 12wt% |
玉米浆(日本食品化工) | 3.0wt% |
ADEKANOL LG126(ADEKA) | 0.03wt% |
(用25wt/vol%NaOH调节pH7.5)
图1表示发酵中使用的发酵装置10。
在发酵装置10中设置有发酵槽12。通过质量流量计14从空气入口向所述发酵槽12中供给空气(箭头A),另一方面,通过冷凝器16将槽内的空气从排气口排出(箭头B)。冷凝器(condenser)16与排气口之间连接有槽内压力计18及排气分析计20,能够分别测定槽内的压力及出口的氧摩尔分压。在发酵槽12上分别配置有温度传感器22、DO传感器24及pH传感器26,能够测定发酵槽12内的反应液中的温度、DO(溶解氧)及pH。另外,在发酵槽12中配置作为搅拌机的圆盘涡轮桨28,圆盘涡轮桨28用磁力搅拌器44进行搅拌·控制。
另外,在发酵槽12的周围具有带式加热器32,在内部具有冷却棒40,冷却棒40上连接有冷却循环装置42、冷却水路控制用电磁阀46。在发酵槽12的外侧设置有填充了pH调节剂的pH调节部34。pH调节部34能够通过泵36向发酵槽12供给pH调节剂。
在发酵槽12中具有控制整体的控制器38,与温度传感器22、DO传感器24及pH传感器26连接,能够输入来自各个传感器的信息。另外,控制器38与带式加热器32和冷却水路控制用电磁阀46连接。控制器38根据来自各种传感器的信息,使带式加热器32、冷却水路控制用电磁阀46开动、控制温度,同时通过开动泵36进行pH控制。
本实施例中,空气入口的空气流量采用质量流量计14的值,另外,假设由氧消耗产生的减少量为可以忽视的范围,则出口的空气流量也采用质量流量计14的值。同样地空气入口及出口的空气压均采用槽内压力计18的值。另外,空气入口及出口的绝对温度均采用槽内的温度传感器22的值。假设空气入口的氧摩尔分率为0.21,出口的氧摩尔分率采用排气分析计20的值。
本实施例中,空气入口及出口的空气流量为0.13L/min,空气入口及出口的空气压为0.12MPa,空气入口及出口的温度为35℃。另外,假设空气入口的氧摩尔分率为0.21,出口的氧摩尔分率采用测定的氧摩尔分率的值(0.21~0.18)。此处,使用每1分钟记录的各值,将按照上述式1算出的值的平均值作为OTR。此时,槽内的溶解氧浓度(DO)从发酵开始3hr以后几乎为0ppm。
所得发酵液中的乳酸浓度使用HPLC按照常规方法进行测定。(柱:ULTRON PS-80H,洗脱液:高氯酸水溶液(pH2.1))。另外,对于乳酸的光学纯度,使用HPLC按照常规方法测定D-乳酸、L-乳酸量(柱:SUMICHIRAL OA-5000,洗脱液:2mM硫酸铜),带入下式求出。
光学纯度(%ee)
=(D乳酸浓度-L乳酸浓度)/(D乳酸浓度+L乳酸浓度)×100
48hr发酵后的结果示于表2。
[实施例2]
除在压力0.14MPa下进行之外,用与实施例1相同的方法实施发酵,得到目标物。结果示于表2。
[实施例3]
除在压力0.16MPa下进行之外,用与实施例2相同的方法实施发酵,得到目标物。结果示于表2。
[比较例1]
在常压下、在空气通气0.32vvm下与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。48hr后的结果示于表2。
[表2]
如表2所示,由该结果可知,通过加压能够得到与常压的情况相比具有更高光学纯度的D-乳酸。
[实施例4]
在压力0.12MPa、搅拌旋转速度200rpm、空气通气量0.35vvm下,与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表3。
[实施例5]
在压力0.12MPa、pH7.4(用NaOH调节)、搅拌旋转速度200rpm、空气通气量0.35vvm下,与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表3。
[实施例6]
在压力0.12MPa、pH7.6(用NaOH调节)、搅拌旋转速度200rpm、空气通气量0.35vvm下,与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表3。
[实施例7]
在压力0.12MPa、pH7.0(用NaOH调节)、搅拌旋转速度200rpm、空气通气量0.35vvm下,与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表3。
[实施例8]
在压力0.12MPa、pH8.0(用NaOH调节)、搅拌旋转速度200rpm、空气通气量0.35vvm下,与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表3。
[比较例2]
在常压、pH7.0(用NaOH调节)、搅拌旋转速度200rpm、空气通气量0.45vvm下,与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表3。
[比较例3]
在常压、pH8.0(用NaOH调节)、搅拌旋转速度200rpm、空气通气量0.45vvm下,与实施例1同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表3。
[表3]
由表3的结果可知,通过控制发酵的pH为pH7.0~pH8.0、特别为pH7.4~pH7.6,可以在维持高D-乳酸生产率的同时,得到高光学纯度的D-乳酸。
[实施例9]
在10L发酵槽中接种250mL实施例1所述的前培养液,所述10L发酵槽中加有5L组成如表4所示的经高压釜杀菌的培养基。发酵控制在压力0.12MPa、搅拌旋转速度150rpm、空气通气量0.24vvm、发酵温度35℃、pH7.5(用NaOH调节),实施48hr。48hr后的结果示于表5。
[表4]
葡萄糖 | 12wt% |
玉米浆 | 3.0wt% |
ADEKANOL LG126 | 0.03wt% |
(用25wt/vol%的NaOH调节为pH7.5)
[实施例10]
在搅拌旋转速度150rpm、空气通气量0.80vvm下,与实施例9同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表5。
[实施例11]
在搅拌旋转速度150rpm、空气通气量1.50vvm下,与实施例9同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表5。
[实施例12]
在搅拌旋转速度100rpm、空气通气量0.20vvm下,与实施例9同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表5。
[实施例13]
在搅拌旋转速度260rpm、空气通气量1.00vvm下,与实施例9同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表5。
[比较例4]
在常压、搅拌旋转速度100rpm、空气通气量0.25vvm下,与实施例9同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表5。
[比较例5]
在常压、搅拌旋转速度260rpm、空气通气量1.20vvm下,与实施例9同样地实施发酵,得到目标物。结果示于表5。
[表5]
由表5的结果可知,通过控制在OTR=0.9mmol-O2/L/hr~15.0mmol-O2/L/hr、特别在OTR=1.0mmol-O2/L/hr~10.0mmol-O2/L/hr的范围内,可以得到高光学纯度的D-乳酸。
因此,根据本发明,可以通用性高且简便地提高乳酸的光学纯度。
将2009年7月28日申请的日本申请号第2009-175757号公开的全部内容作为参照,引入本说明书中。
本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术标准,与各文献、专利申请及技术标准具体且分别地作为参照引入的情况同程度地,作为参照引入本说明书中。
Claims (12)
1.一种乳酸制造方法,包括:以糖作为原料,使用乳酸生产微生物,在超过常压并且能够维持所述乳酸生产微生物的乳酸生产活性的压力条件下,进行乳酸发酵,得到D-乳酸或L-乳酸。
2.如权利要求1所述的乳酸制造方法,其中,所述乳酸为D-乳酸。
3.如权利要求1或权利要求2所述的乳酸制造方法,还包括回收得到的所述乳酸。
4.如权利要求1~3中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述压力条件通过氧或含有氧的混合气体进行调节。
5.如权利要求1~4中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述压力条件超过0.10MPa并且为0.50MPa以下。
6.如权利要求1~5中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述压力条件为0.12MPa~0.16MPa。
7.如权利要求1~6中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述发酵中的氧移动速度(OTR)在超过0.0mmol-O2/L/hr并且为15.0mmol-O2/L/hr以下的范围内。
8.如权利要求1~6中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述发酵中的氧移动速度(OTR)在1.0mmol-O2/L/hr~15.0mmol-O2/L/hr的范围内。
9.如权利要求1~8中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述乳酸发酵在pH7.0~pH8.0的范围内进行。
10.如权利要求1~9中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述乳酸生产微生物为乳酸生产大肠杆菌。
11.如权利要求1~10中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述乳酸生产微生物为乳酸生产大肠杆菌,所述乳酸生产大肠杆菌的以D-乳酸及L-乳酸中的一方作为目标产物的生产机制被强化,并且所述目标产物的分解机制被缺失或减弱。
12.如权利要求1~11中任一项所述的乳酸制造方法,其中,所述乳酸生产微生物为D-乳酸生产大肠杆菌,所述D-乳酸生产大肠杆菌的D-乳酸生产机制被强化,并且作为分解机制的dld被缺失或减弱。
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TWI760548B (zh) * | 2018-08-16 | 2022-04-11 | 葡萄王生技股份有限公司 | 包含胚芽乳酸桿菌gkm3之組合物之延緩老化之用途 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1219203A (zh) * | 1995-12-11 | 1999-06-09 | 默克专利股份有限公司 | 通过高细胞密度发酵在大肠杆菌中制备重组蛋白质的方法 |
JP2977241B2 (ja) * | 1989-08-02 | 1999-11-15 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト | 大腸菌中での外来性タンパク製造のための最適化発酵法 |
CN1735683A (zh) * | 2002-05-30 | 2006-02-15 | 卡吉尔道有限责任公司 | 在酵母中生产d-乳酸的方法与材料 |
CN1856577A (zh) * | 2003-09-30 | 2006-11-01 | 三井化学株式会社 | 用于生产d-乳酸的生物催化剂 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2974737B2 (ja) * | 1990-08-16 | 1999-11-10 | 三菱レイヨン株式会社 | 光学活性乳酸の製造法 |
US5541094A (en) | 1992-09-25 | 1996-07-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures prepared using a microbial transformant |
BR9408601A (pt) | 1993-03-03 | 1997-11-25 | Du Pont | Processo para preparação de uma mistura de ácido glioxilico e ácido aminometilfosfónico |
JPH07313174A (ja) * | 1994-05-25 | 1995-12-05 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 酵素反応方法 |
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KR100921644B1 (ko) * | 2004-10-07 | 2009-10-14 | 아지노모토 가부시키가이샤 | 염기성 물질의 제조법 |
JP2009142256A (ja) * | 2007-03-19 | 2009-07-02 | Sumitomo Chemical Co Ltd | D−乳酸の製造方法 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2977241B2 (ja) * | 1989-08-02 | 1999-11-15 | ヘキスト・アクチエンゲゼルシヤフト | 大腸菌中での外来性タンパク製造のための最適化発酵法 |
CN1219203A (zh) * | 1995-12-11 | 1999-06-09 | 默克专利股份有限公司 | 通过高细胞密度发酵在大肠杆菌中制备重组蛋白质的方法 |
CN1735683A (zh) * | 2002-05-30 | 2006-02-15 | 卡吉尔道有限责任公司 | 在酵母中生产d-乳酸的方法与材料 |
CN1856577A (zh) * | 2003-09-30 | 2006-11-01 | 三井化学株式会社 | 用于生产d-乳酸的生物催化剂 |
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