JP2977241B2 - 大腸菌中での外来性タンパク製造のための最適化発酵法 - Google Patents
大腸菌中での外来性タンパク製造のための最適化発酵法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、lacプロモーター又は改良lacプロモーター
（例えばtac、trc）を使用して大腸菌中外来性タンパク
を製造するための最適化発酵法を記述する。炭素源とし
てグルコースを用いる初期増殖相の後、（１）グルコー
ス制限下IPTGによるか又は（２）ラクトースによるか又
は（３）ラクトース制限下IPTG及びラクトースにより生
成物形成の誘導が行われる。グルコース又はラクトース
の制限は、酸素分圧が10％を超えて保たれるようにす
る。
（例えばtac、trc）を使用して大腸菌中外来性タンパク
を製造するための最適化発酵法を記述する。炭素源とし
てグルコースを用いる初期増殖相の後、（１）グルコー
ス制限下IPTGによるか又は（２）ラクトースによるか又
は（３）ラクトース制限下IPTG及びラクトースにより生
成物形成の誘導が行われる。グルコース又はラクトース
の制限は、酸素分圧が10％を超えて保たれるようにす
る。
大腸菌中多種の遺伝子組替タンパクを商業的な量製造
することは原理的に周知である。これらのタンパクの発
現は、適当な配列をもつマルチコピイプラスミド中にコ
ードするcDNAをクローンすることによって可能となる。
することは原理的に周知である。これらのタンパクの発
現は、適当な配列をもつマルチコピイプラスミド中にコ
ードするcDNAをクローンすることによって可能となる。
このことについての発現実験は、普通振盪フラスコ中
実施される。この場合遺伝子組替タンパクの収量は、10
0ml未満の容量をもつ振盪フラスコ中の培養が用いられ
るとき普通50〜100mg/である。
実施される。この場合遺伝子組替タンパクの収量は、10
0ml未満の容量をもつ振盪フラスコ中の培養が用いられ
るとき普通50〜100mg/である。
これらの技術を用いて遺伝子組替タンパクの製造に成
功することは可能であるが、タンパク濃度及び製造可能
な量を明らかに増大させる技術の必要性がある。これら
の要件に適合する１つの試みが発酵法の開発である。従
って本発明の目的は、大腸菌中外来性タンパクの発現の
ための発酵法の最適化である。
功することは可能であるが、タンパク濃度及び製造可能
な量を明らかに増大させる技術の必要性がある。これら
の要件に適合する１つの試みが発酵法の開発である。従
って本発明の目的は、大腸菌中外来性タンパクの発現の
ための発酵法の最適化である。
該要件が少なくとも部分的には満足されているいくつ
かのこのような方法が文献に記載されている。これらの
場合lacプロモーターを使用することは、通常Ｎ−未端
β−ガラクトシダーゼタンパク（β−Gal）をもつ融合
タンパクが製造されたことを意味している。この発酵に
おける収量は普通リットルあたり融合タンパク0.1〜2.0
gである。融合型β−Galタンパクを考えるときには、実
際の生成物濃度は、該値の30％に低下することが多い。
更に、生成物からβ−Galタンパクを除去するため綿密
な精製処理を要する。
かのこのような方法が文献に記載されている。これらの
場合lacプロモーターを使用することは、通常Ｎ−未端
β−ガラクトシダーゼタンパク（β−Gal）をもつ融合
タンパクが製造されたことを意味している。この発酵に
おける収量は普通リットルあたり融合タンパク0.1〜2.0
gである。融合型β−Galタンパクを考えるときには、実
際の生成物濃度は、該値の30％に低下することが多い。
更に、生成物からβ−Galタンパクを除去するため綿密
な精製処理を要する。
本発明は、なかんずく、成熟した生成物の発現、即ち
後に再び除かなければならない融合生成物のない生成物
の発現を記述する。このような方法によって生成物の精
製が比較的単純に行われる。しかし、発酵ブロス中生成
物の特有及び容量収量（specific and volumetric yiel
ds）は普通かなり低い。この方法の生成物が可溶性かつ
生物学的に完全に活性な形態で製造されるときこのこと
が特にあてはまる。不活性でありかつ封入体として貯え
られるタンパクの生成と異なり、可溶性かつ生物学的に
活性な生成物は、細胞の代謝に介入し、生物（大腸菌）
中激しい妨害を生じることがあり、又大腸菌プロテアー
ゼによってかなり容易に分解されることがある。これら
の問題にもかかわらず、炭素源としてグルコースが用い
られ、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）が誘導の
ために使用された今日までの方法において生物学的に完
全に活性な生成物の200mg/の収量を得ることが可能で
あった。
後に再び除かなければならない融合生成物のない生成物
の発現を記述する。このような方法によって生成物の精
製が比較的単純に行われる。しかし、発酵ブロス中生成
物の特有及び容量収量（specific and volumetric yiel
ds）は普通かなり低い。この方法の生成物が可溶性かつ
生物学的に完全に活性な形態で製造されるときこのこと
が特にあてはまる。不活性でありかつ封入体として貯え
られるタンパクの生成と異なり、可溶性かつ生物学的に
活性な生成物は、細胞の代謝に介入し、生物（大腸菌）
中激しい妨害を生じることがあり、又大腸菌プロテアー
ゼによってかなり容易に分解されることがある。これら
の問題にもかかわらず、炭素源としてグルコースが用い
られ、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）が誘導の
ために使用された今日までの方法において生物学的に完
全に活性な生成物の200mg/の収量を得ることが可能で
あった。
発酵を最適化するために、本発明は増殖挙動及び生成
物形成の改善を課題とした。生成物は細胞の内部に形成
されるので、生成物の比濃度（specific product conce
ntration）（細胞あたり生成物の量）及び細胞数が重要
である。この２つの因子の積がリットルあたりグラム
（g/）の方法の容量生産法である。
物形成の改善を課題とした。生成物は細胞の内部に形成
されるので、生成物の比濃度（specific product conce
ntration）（細胞あたり生成物の量）及び細胞数が重要
である。この２つの因子の積がリットルあたりグラム
（g/）の方法の容量生産法である。
高細胞密度発酵は、遺伝子組替大腸菌株についてしば
しば文献に記載されている。リットル（）あたり乾燥
物（DM）30gまでの細胞密度がこれに関連して述べられ
ている。原理的に知られているいくつかの手段の組合せ
により、遺伝子組替大腸菌K12株を150A650に対応する50
gのDM/の細胞密度まで発酵させる方法を開発すること
が可能となっている。本発明において本質的な点は、取
入れ空気の酸素強化が後述される方法の１条件ではない
ことである。基質としての純酸素は高いコストを生じ、
その上、爆発防止手段を省くことが可能であるので、こ
のことは方法の経済性に有利な効果を有する。
しば文献に記載されている。リットル（）あたり乾燥
物（DM）30gまでの細胞密度がこれに関連して述べられ
ている。原理的に知られているいくつかの手段の組合せ
により、遺伝子組替大腸菌K12株を150A650に対応する50
gのDM/の細胞密度まで発酵させる方法を開発すること
が可能となっている。本発明において本質的な点は、取
入れ空気の酸素強化が後述される方法の１条件ではない
ことである。基質としての純酸素は高いコストを生じ、
その上、爆発防止手段を省くことが可能であるので、こ
のことは方法の経済性に有利な効果を有する。
高い用量生成物収量をもつ方法について重要な因子
は、プロモーターの最適誘導である。IPTGによる誘導
は、前述した低細胞密度の場合に実施されており、文献
に多数記載されている。IPTG（1mM〜10mM、好ましくは5
mM）による誘導及び酸素分圧が10％より大きいか又はそ
れに等しくなるような基質としてグルコースの制限の後
因数５、0.2g/から1.0g/までの容量収量の改善が達
成されることが見出された。
は、プロモーターの最適誘導である。IPTGによる誘導
は、前述した低細胞密度の場合に実施されており、文献
に多数記載されている。IPTG（1mM〜10mM、好ましくは5
mM）による誘導及び酸素分圧が10％より大きいか又はそ
れに等しくなるような基質としてグルコースの制限の後
因数５、0.2g/から1.0g/までの容量収量の改善が達
成されることが見出された。
本発明の第２の実施態様は、炭素源及び同時に天然イ
ンデューサーとしてラクトースを用いる増殖の場合の生
成物形成の誘導よりなる。酸素分圧は、ラクトースの添
加をコントロールすることによって上と同様に10％より
大きいか又はそれに等しい水準に保たれた。ラクトース
による誘導は、この操作がIPTG誘導より効率が低いとい
われているので、文献において最適に至らないと見なさ
れている。現在まで、ラクトースをインデューサーとし
て用いる効率のよい発酵法は記載されていない。本発明
による実験の試みは、おそい生成物の形成の方が大腸菌
の固有の代謝に対して小さい妨害効果を有しているの
で、弱い誘導、即ちおそい生成物の形成の方が生成物の
高い最終濃度を達成することができるという考察に基づ
いている。この試みは、上に比して２倍に相当する2g/
（＋／−10％）の生成物濃度が達成された適当な実験
において確かめられている。増殖の直線期においてグル
コースがラクトースに置き換えられた点で、この方法は
IPTGによって誘導される以前の方法と異なっている。発
酵の終末における高い代謝活性の範囲内では、10％を超
える酸素の分圧を達成するためにラクトースの添加も制
限されたとき、この方法の第３の変法においてラクトー
スによる誘導を更にIPTG添加によって助けることが可能
であった。この追加のIPTG誘導は、特定の選ばれた発酵
装置の入力が培養物に酸素を供給するのに不十分である
ときにのみ必要である。上述した第２の方法においてプ
ラスミド損失の増大が観察されるので、スケール−アッ
プの際には発酵容量が増大するに従って交差する点があ
り、ラクトースによる誘導の際プラスミド損失のわずか
な増大が観察されるので、その後最初は第２、次に第１
の方法の方が経済的である。
ンデューサーとしてラクトースを用いる増殖の場合の生
成物形成の誘導よりなる。酸素分圧は、ラクトースの添
加をコントロールすることによって上と同様に10％より
大きいか又はそれに等しい水準に保たれた。ラクトース
による誘導は、この操作がIPTG誘導より効率が低いとい
われているので、文献において最適に至らないと見なさ
れている。現在まで、ラクトースをインデューサーとし
て用いる効率のよい発酵法は記載されていない。本発明
による実験の試みは、おそい生成物の形成の方が大腸菌
の固有の代謝に対して小さい妨害効果を有しているの
で、弱い誘導、即ちおそい生成物の形成の方が生成物の
高い最終濃度を達成することができるという考察に基づ
いている。この試みは、上に比して２倍に相当する2g/
（＋／−10％）の生成物濃度が達成された適当な実験
において確かめられている。増殖の直線期においてグル
コースがラクトースに置き換えられた点で、この方法は
IPTGによって誘導される以前の方法と異なっている。発
酵の終末における高い代謝活性の範囲内では、10％を超
える酸素の分圧を達成するためにラクトースの添加も制
限されたとき、この方法の第３の変法においてラクトー
スによる誘導を更にIPTG添加によって助けることが可能
であった。この追加のIPTG誘導は、特定の選ばれた発酵
装置の入力が培養物に酸素を供給するのに不十分である
ときにのみ必要である。上述した第２の方法においてプ
ラスミド損失の増大が観察されるので、スケール−アッ
プの際には発酵容量が増大するに従って交差する点があ
り、ラクトースによる誘導の際プラスミド損失のわずか
な増大が観察されるので、その後最初は第２、次に第１
の方法の方が経済的である。
生成物の濃度が最大になる時点で発酵を停止する。当
業者に知られている処理を使用して生物体を濃縮（例え
ば分離器中）、崩壊（例えば高圧ホモジナイザー中）さ
せる。細胞フラグメントの沈降の後では、生成物の大部
分は透明になった上清中に含まれている。
業者に知られている処理を使用して生物体を濃縮（例え
ば分離器中）、崩壊（例えば高圧ホモジナイザー中）さ
せる。細胞フラグメントの沈降の後では、生成物の大部
分は透明になった上清中に含まれている。
従って、本発明は、lacプロモーター又は最適化lacプ
ロモーターのコントロール下大腸菌中外来性遺伝子の発
現のための最適化発酵法であって、 （１）IPTG、同時に基質制限されたグルコース添加、そ
してグルコース添加の制限によって酸素分圧が10％を超
えて保たれることによるか、 （２）又は炭素源及び同時に天然インデューサーとして
ラクトース、ラクトース添加の制限によって酸素分圧が
10％を超えて保たれることによるか、 （３）又は炭素源及び同時に天然インデューサーとして
ラクトース、そして更にIPTG、ラクトース添加の制限に
よって酸素分圧が10％を超えて保たれること によって対数増殖期の終末において誘導が行われる方法
に関する。
ロモーターのコントロール下大腸菌中外来性遺伝子の発
現のための最適化発酵法であって、 （１）IPTG、同時に基質制限されたグルコース添加、そ
してグルコース添加の制限によって酸素分圧が10％を超
えて保たれることによるか、 （２）又は炭素源及び同時に天然インデューサーとして
ラクトース、ラクトース添加の制限によって酸素分圧が
10％を超えて保たれることによるか、 （３）又は炭素源及び同時に天然インデューサーとして
ラクトース、そして更にIPTG、ラクトース添加の制限に
よって酸素分圧が10％を超えて保たれること によって対数増殖期の終末において誘導が行われる方法
に関する。
この方法の好ましい変法においては、各々の場合酸素
分圧を次の手段のうち１つ又はそれ以上によって増大さ
せる： （ａ）好ましくは２バールまでの、超大気圧下の発酵 （ｂ）入力（撹拌速度を増大させること）及び通気速度
（2vvmまでの）のコントロールされた追跡 （ｃ）Henry係数の改善及び代謝活性の低下により、酸
素移行速度を増大させかつ酸素取込み速度を低下させる
（バッチの大きさ（＝容器）が増大すると共に比入力
（specific powerinput）が減少するので1,000を超え
るスケール−アップの際必要）ために温度を37℃から30
℃に至るまで低下させること。
分圧を次の手段のうち１つ又はそれ以上によって増大さ
せる： （ａ）好ましくは２バールまでの、超大気圧下の発酵 （ｂ）入力（撹拌速度を増大させること）及び通気速度
（2vvmまでの）のコントロールされた追跡 （ｃ）Henry係数の改善及び代謝活性の低下により、酸
素移行速度を増大させかつ酸素取込み速度を低下させる
（バッチの大きさ（＝容器）が増大すると共に比入力
（specific powerinput）が減少するので1,000を超え
るスケール−アップの際必要）ために温度を37℃から30
℃に至るまで低下させること。
炭素源として糖基質の添加が最大値５〜10g/にコン
トロールされること及び全発酵期間pHがpH6.7〜pH7.3の
範囲にNH4OH及びH3PO4の添加によってコントロールされ
ることは、この方法の変法のすべてに共通である。
トロールされること及び全発酵期間pHがpH6.7〜pH7.3の
範囲にNH4OH及びH3PO4の添加によってコントロールされ
ることは、この方法の変法のすべてに共通である。
上述した方法は、タンパクPP4及びPP4−ｘ（これらは
リポコルチンに属する（Grundmannら、Proc.Natl.Acad.
Sci.85（1985）3708〜3712））、ならびにそれらの突然
変異体（mutant）及び変異体（variant）の遺伝子工学
的製造に好ましく用いられる。
リポコルチンに属する（Grundmannら、Proc.Natl.Acad.
Sci.85（1985）3708〜3712））、ならびにそれらの突然
変異体（mutant）及び変異体（variant）の遺伝子工学
的製造に好ましく用いられる。
本発明は、実施例及び特許請求の範囲において更に説
明されている。
明されている。
実施例 次の実施例は大腸菌K12株W3110 lac IQ（Brent及びPt
ashne（1981）Proc.Acad.Natl.Sci.USA78,4204〜4208）
の発酵を記述するもので、この菌株は、プラスミドpTrc
99A−PP4（Amannら（1988）Gene69,301〜315）又はpTrc
99A−PP4−ｘ（Grundmannら（1988）Behring Inst.Mit
t.82,59〜67）を用いて形質変換されている。
ashne（1981）Proc.Acad.Natl.Sci.USA78,4204〜4208）
の発酵を記述するもので、この菌株は、プラスミドpTrc
99A−PP4（Amannら（1988）Gene69,301〜315）又はpTrc
99A−PP4−ｘ（Grundmannら（1988）Behring Inst.Mit
t.82,59〜67）を用いて形質変換されている。
表１は極めて適している培地を示す。
発酵は８の発酵容量をもつ10のBiostat Eファー
メンター（製作者:Braun Melsungen）中実施された。
メンター（製作者:Braun Melsungen）中実施された。
発酵の間プラスミド含有細胞に対して選択圧力はかけ
なかった。即ち発酵は抗生物質の添加なしに実施され
た。ファーメンターに一夜の振盪フラスコ前培養物を接
種した。増殖の初期相において炭素源としてグルコース
を用い、この相において0.1M未満の酢酸が生成するよう
にグルコースをはかり入れた。酢酸濃度が増大すると生
成物の収量は有意に低下した。増殖の初期相中10〜15時
間後、約50OD650の細胞濃度が達成され、生成物形成の
誘導は次の３つの異なった別の方式で行われた。
なかった。即ち発酵は抗生物質の添加なしに実施され
た。ファーメンターに一夜の振盪フラスコ前培養物を接
種した。増殖の初期相において炭素源としてグルコース
を用い、この相において0.1M未満の酢酸が生成するよう
にグルコースをはかり入れた。酢酸濃度が増大すると生
成物の収量は有意に低下した。増殖の初期相中10〜15時
間後、約50OD650の細胞濃度が達成され、生成物形成の
誘導は次の３つの異なった別の方式で行われた。
（１）１〜10mMのIPTG（好ましくは5mMのIPTG）の添加
後グルコースのはかり入れを継続 増殖の初期相の終末において、炭素源としてグルコー
ス（「基質」）のはかり入れを継続しながら１〜10mMの
IPTG（好ましくは5mMのIPTG）を添加することによって
生成物の形成を誘導した。この場合生成物形成の速度
は、その時におけるグルコース濃度への明らかな依存性
を示した。実際の基質としてグルコース及び外見上の基
質としてIPTGは競合する基質と思われ、ジオキシーの法
則に従って、グルコースはlacオペロンの活性化を部分
的又は完全に抑制した。この場合1g/のPP4又はPP4−
ｘの収量がグルコース制限系（0.1g/未満のグルコー
ス濃度）において得られた。
後グルコースのはかり入れを継続 増殖の初期相の終末において、炭素源としてグルコー
ス（「基質」）のはかり入れを継続しながら１〜10mMの
IPTG（好ましくは5mMのIPTG）を添加することによって
生成物の形成を誘導した。この場合生成物形成の速度
は、その時におけるグルコース濃度への明らかな依存性
を示した。実際の基質としてグルコース及び外見上の基
質としてIPTGは競合する基質と思われ、ジオキシーの法
則に従って、グルコースはlacオペロンの活性化を部分
的又は完全に抑制した。この場合1g/のPP4又はPP4−
ｘの収量がグルコース制限系（0.1g/未満のグルコー
ス濃度）において得られた。
グルコースの制限は、ポントを設置することによるか
又はオン−ラインHPLC測定を用いて実施された。細胞の
増殖速度は、非制限系中誘導によって低下しなかった
が、予期されたとおり制限系中グルコース濃度の関数と
して細胞の増殖速度が低下した。関連増殖速度によっ
て、100〜150OD650の細胞密度に達した。
又はオン−ラインHPLC測定を用いて実施された。細胞の
増殖速度は、非制限系中誘導によって低下しなかった
が、予期されたとおり制限系中グルコース濃度の関数と
して細胞の増殖速度が低下した。関連増殖速度によっ
て、100〜150OD650の細胞密度に達した。
（２）ラクトースのはかり入れを継続 初期増殖相の終末において、炭素源としてグルコース
をラクトースに置き換えることによって生成物の形成を
誘導した。ラクトースはlacオペロンの生理的誘導因子
であるが、IPTGより小さい完全誘導をもたらす。この誘
導相の間、細胞は100OD650の細胞密度になるまで増殖し
続けた。生成物濃度は1.5g/の値に達した。
をラクトースに置き換えることによって生成物の形成を
誘導した。ラクトースはlacオペロンの生理的誘導因子
であるが、IPTGより小さい完全誘導をもたらす。この誘
導相の間、細胞は100OD650の細胞密度になるまで増殖し
続けた。生成物濃度は1.5g/の値に達した。
（３）ラクトースのはかり入れ継続及び１〜10mMのIPTG
（好ましくは5mM）の添加 初期増殖相の終末において、炭素源としてグルコース
をラクトースに置き換え、更にIPTGを添加することによ
って生成物の形成を誘導した。この場合には、IPTGによ
って強い誘導がもたらされ、同時に生理的基質ラクトー
スが利用される。グルコース＋IPTGと異なり、この場合
には炭素源の正確なはかり入れは不必要である。30g/
までの過剰のラクトースは生産性に悪影響がない。この
誘導の間細胞は同様に100OD650の細胞密度になるまで増
殖し続けた。発酵の終末における生成物濃度は2.0g/
であった。
（好ましくは5mM）の添加 初期増殖相の終末において、炭素源としてグルコース
をラクトースに置き換え、更にIPTGを添加することによ
って生成物の形成を誘導した。この場合には、IPTGによ
って強い誘導がもたらされ、同時に生理的基質ラクトー
スが利用される。グルコース＋IPTGと異なり、この場合
には炭素源の正確なはかり入れは不必要である。30g/
までの過剰のラクトースは生産性に悪影響がない。この
誘導の間細胞は同様に100OD650の細胞密度になるまで増
殖し続けた。発酵の終末における生成物濃度は2.0g/
であった。
プラスミドの安定性は（１）から（３）まで低下する
ので、特定の発酵バッチサイズの関数としてこれらの方
法の１つによって誘導が実施される。
ので、特定の発酵バッチサイズの関数としてこれらの方
法の１つによって誘導が実施される。
上述した実験において選ばれた発酵パラメーターを表
２に要約する。
２に要約する。
Claims (6)
- 【請求項１】ラクトースによって誘導可能なプロモータ
ーを使用する大腸菌中での外来性タンパクの製法であっ
て、IPTGによる誘導及び炭素源としてグルコースを用い
る場合に、酸素分圧が10％より大きいか又はそれに等し
くなるようにグルコース濃度をコントロールすることを
特徴とする上記の方法。 - 【請求項２】ラクトースによって誘導可能なプロモータ
ーを使用する大腸菌中外来性タンパクの製法であって、
炭素源及び天然誘導因子としてラクトースが使用される
場合に、酸素分圧が10％より大きいか又はそれに等しく
なるようにラクトース濃度をコントロールすることを特
徴とする方法。 - 【請求項３】ラクトースによって誘導可能なプロモータ
ーを使用する大腸菌中外来性タンパクの製法であって、
炭素源及び天然誘導因子としてラクトースが使用され、
更に誘導因子としてIPTGが使用される場合に、酸素分圧
が10％より大きいか又はそれに等しくなるようにラクト
ース濃度をコントロールすることを特徴とする方法。 - 【請求項４】次の方法の構成要素の少なくとも１つが適
用される請求項１、２又は３記載の方法。 （ａ）好ましくは２バールまでの、超大気圧下の発酵、 （ｂ）入力（撹拌速度は増大させること）及び通気速度
（2vvmまで）のコントロールされた追跡、 （ｃ）温度を37℃から30℃のような温度まで低下させる
こと、 （ｄ）最大値５〜10g/までの炭素源としての基質のコ
ントロールされた添加、 （ｅ）pH6.7〜pH7.3の値にpHをコントロールすること。 - 【請求項５】リポコルチンのcDNAを含有する大腸菌株を
発酵させる請求項１、２、３又は４記載の方法。 - 【請求項６】cDNAがPP4、PP4−ｘ又はPP4の突然変異体
及び変異体をコードする請求項５記載の方法。
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