PT94876B

PT94876B - Processo de fermentacao optimizado para a preparacao de proteinas estranhas em e. coli

Info

Publication number: PT94876B
Application number: PT94876A
Authority: PT
Inventors: Mathias Grote
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1989-08-02
Filing date: 1990-08-01
Publication date: 1997-04-30
Also published as: EP0411501B1; DE59007117D1; KR100190777B1; DK0411501T3; ATE111528T1; CA2022487A1; KR100190779B1; IE902785A1; EP0411501A1; JP2977241B2; IE65040B1; PT94876A; ES2060876T3; AU6000590A; CA2022487C; DE3925550C2; AU624982B2; JPH0376595A; DE3925550A1; KR100190778B1

Description

A presente invenção refere-se aos processos de fermentação optimizados para a preparação de proteínas estranhas em E. coli com utilização do promotor lac ou do promotor lac melhorado (por exemplo, tac , trc). Depois da fase de desenvolvimento usando a glucose como fonte de carbono, rea liza-se a indução da formação do produto (1) por passagem por IPTG com licitação de glucose ou (2) por lactose ou (3) por IPTG e lactose com limitação de lactose. A limitação de glucose ou de lactose realiza-se de tal maneira qúe a pressão parcial de oxigénio seja superior a 10%.

A preparação de quantidades comerciais de muitas proteínas recombinantes diversas em E. coli é, em princípio, bem conhecida. A expressão destas proteínas é possí vel clonando o cADN que a codifica num plasmídio de cópias múl tiplas com as correspondentes sequências.

Os ensaios de expressão usuais realizam-se, neste caso, em vasos sacudidos. Os rendimentos de proteínas recombinantes estão neste caso compreendidos em geral entre 50 e 100 mg/1, se as culturas nos balões sacudidos são empregadas com volumes menores do que 100 ml.

Muito embora com estas técnicas sè possam preparar com êxito proteínas recombinantes, existe a necessidade de técnicas com as quais as concentrações de proteína e as quantidades que se podem preparar sejam nitidamente aumentadas. Uma mistura reaccional que obedece a esses requisitos é o desenvolvimento do processo de fermentação. A invenção tem como objectivo a optimização dos processos de fermentação para a expressão de proteínas estranhas em E. coli.

Na literatura, descreveram-se já vários processos deste tipo com os quais se satisfazem pelo menos par cialmente as exigências mencionadas. Com o promotor lac utilizado, no processo da presente invenção, preparam-se, na maior parte das vezes, proteínas de fusão com uma parte de beta-galactosidade se na extremidade de N (beta-Gal). Os rendimentos da fermentação ficam ^eraliente compreendidos entre 0,1 e 2,0 g de proteína de fusão por litro. No caso de se tomarem consideração a proporção de fusão de beta-Gal, a concentração do produto propriamente dito reduz-se frequentemente para 30% do valor mencionado. Ainda são necessárias operações de purificação dispendiosas para separar a propoi-ção de beta-Gal do produto .

Na presente invenção, descreve-se, entre outros, a expressão de um produto maduro, isto é, a expres são de um produto sem proporção de fusão que precisa de ser separado posteriormente. Os processos deste tipo possibilitam uma purificação relativamente simples do produto. Na fermentação, são menores, no entanto, os rendimentos específicos, como também os rendimentos volumétricos dos produtos. Isto aplica-se especialmente se, pelo processo, o produto se preparar sob uma forma solúvel e biologicamente completamente activa. Ao contrario d. formação de proteína inactiva obtida sob a forma de corpos de inclusão, o produto solúvel e activo pode inter ferir no metabolismo de substâncias das células e podem verificar-se perturbações drásticas no organismo (E. coli) e pode interferir de maneira essencialmente mais simples pelas protea ses de E. coli. Se não se atender a esta problemática, nos pro cessos até agora utilizados e se utilizar a glucose como fonte de carbono e a isopropil-tiogalactósido (IPTG) para indução, podem-se atingir-se rendimentos de 200 mg/litro de produto biologicamente completamente activo.

Para optimizar a fermentação, realizaram-se beneficiações no comportamento de crescimento e da formação de produto de acordo com a presente invenção. Como o pro duto se forma intracelularmente, é importante a concentração específica do produto (quantidade de produto por célula) e o número de células. A partir do produto obtido com ambos os factores, calcula-se a produtividade volumétrica do processo em gramas por litro (g/1).

Na literatura, descrevem-se frequentemente fermentação de elevada densidade de células (high cell density fermentations) para estirpes recombinantes de E. coli. Neste caso, indicam-se como r gra geral densidades de células de até 30 gramas de substâncias aicas (TS) por litro (1). Mediante uma combinação de várias medidas em principio em si conhecidas, foi possível desenvolver-se um processo de acordo com o qual a estirpe E. coli K12 recombinante foi fermentada com até concentrações de células de 50 g TS/1 que corresponde a 150 · á essencial, neste caso, que o processo em seguida descrito não provoque nenhum enriquecimento do ar com oxigénio. Isso influencia o aspecto económico do processo de maneira positiva porque 0 oxigénio puro como substrato ori_oina ''levados custos e adiei nel^cnce ooriga a renunciar a medidas de protecção contra explosões.

- 3 Um factor importante para um processo com elevado rendimento volumétrico de produto é a indução opti ma do promotor. Ha literatura, descreve-se muitas vezes e indução realizada com IPTG no caso das pequenas densidades de células anteriormente mencionadas.

Verificou-se que, depois de indução por IPTG (1 mil a 10 mM, de preferência, e mil) e limitação de glucose como substrato, acontece que a pressão parcial de oxigénio é maior/igual a 10%, se atinge um melhoramento de rendimen tos volumétricos de um factor de 5 de 0,2 g/1 para 1,0 g/1.

Uma segunda forma de realização da invenção consiste na indução da formação do produto com lactose como fonte de carbono e simultaneamente como indutor natural.

Na regulação da adição de lactose foi igualmente garantida, tal como acima, uma pressão pacial de oxigénio maior/igual a

A indução por lactose é considerada na literatura como sub-óptima porque esta maneira de proceder do processo em comparação com a indução por IGTP apresenta nominalmente melhor grau de acção. Até agora, não foram descritos processos de fermentação eficientes em que a lactose tenha sido utilizada como indutor.

princípio do ensaio de acordo com a presente invenção consiste na suposição de que, por meio de uma indução mais suave e, portanto, de uma formação do produto mais lenta, se possa atingir uma maior concentração final de produto porque, mediante a mais lenta produção do produto, o metabolismo de substâncias própria de Ξ. coli é influenciado de maneira menos perturbadora. Esta verificação de sobreposição pôde ser detectada em correspondentes ensaios, nos quais de atingiram concentrações de produto iguais a 2 g/1 (+/- 10%) que corresponde a uma duplicação em relação ao valor que acima se indica.

processo diferencia-se dos processos induzidos por IGTP anteriormente mencionados pelo facto de, na fase de desenvolvimento linear, se ter substituído a glucose por lactose. Na zona de maiores actividades de metabolismo de substâncias no fim da fermentação, em que também se adicionou lactose de maneira limitada para manter a pressão parcial de oxigénio maior do que 10%, pôde verificar-se, numa terceira variante do processo, a indução por lactose adicionalmente com adição de IPTG. Este indução adicional de IPTG é específica do equipamento e só é necessária se a introdução na carga no fermentador escolhido não for suficiente, a cultura tem de ser alimentada com oxigénio.

Como no segundo processo descrito se observa uma elevada perda de plasmídio, verifica-se no scale up um ponto de incompatibilidade pelo aumento dos volumes de fermentação, depois do que só o segundo e então o primeiro pro. cesso são económicos porque, no caso da indução com lactose, se observa uma perda de plasmídio ligeiramente maior.

Ao atingir o ponto de concentração máximo de roduto, termina-se a fermentação. A biomassa é concen trada por um processo conhecido dos peritos (por exemplo, sepa rador) e é aberta (por exemplo, num homogeneizador de alta pressão). Depois da sedimentação dos fragmentos das células, encontra-se a parte principal do produto no sobrenadante clari ficado.

À invenção refere-se, portanto, a um procBsao de fermentação optimizado para a expressão de genes estranhos em E. coli sob controlo do promotor lac ou do promotor lac optimizado, em que a indução, no fim da fase de desenvolvimento exponencial, se realiza

- 5 1) por meio de IPT& com adição simultânea de glucose em quantidade limitada de substrato por limitação da adição de glucose se mantém a pressão parcial de oxigénio maior do que 10%;

2) ou utilizar lactose como fonte de carbono e simultaneamente como indutor natural, em que, pela limitação da adição de lactose, se mantém a pressão parcial de oxigénio num valor superior a 10%;

3) ou por acção de lactose como fonte de carbono e simultânea mente como indutor natural, assim como com IPTG· adicional, em que, por limitação da adiçao de lactose, se mantém a pressão parcial de oxigénio inferior a 10%.

Nas variantes de processo, eleva-se respectivamente a pressão parcial de oxigénio por meio de uma ou mais das seguintes medidas:

a) fermentação sob pressão, de preferência, até 2 bar;

b) processo posterior regulado da introdução da carga (aumento do número de rotações do agitador) e aumento da taxa de gaseamento (até 2 vvm);

c) diminuição da temperatura de 37°C para 30°C passando por um coeficiente de Henry melhorado e actividade de metabolismo de substâncias reduzida, com aumento das taxas de transferência de oxigénio e diminuição das taxas de absorção de oxigénio (indispensável no scale-up para 1.000 li tros porque a introdução de carga específica diminui com o tamanho da mistura reaccional (= recipiente)).

Sm todas as variantes do processo, é utilizada a adição re_oulada de suosirato de açúcar como fonte de carbono cara valores no -.láximo iguais a 5 - 10 g/1 e uma regulação de pH por adição de NH^OE e E-,P0^ para um intervalo de ρΕ de 6,9 a 7,3 durante todo o período de fermentação.

Os processos anteriormente descritos são empregados, de preferência, para a preparação por tecnologia genética nas proteínas que pertencem ao grupo das lipocortinas pp4 e pp4-x (Grundmann e col., Proc. Natl. Acad. Sei. 85

') (1985), 3708 - 3712), assim como os seus mutantes e variantes.

A invenção é ainda descrita nos Exemlos e nas reivindicações da patente.

EXEIíPLO

No seguinte Exemplo, descreve-se a fermentação da estirpe V7311O lac IQ de E. coli E12 (Brent e Ptashne (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 4204 - 4208), em que esta estirpe foi transformada com o plasmídio pTrc99A-pp4 (Amann e col. (1988), Gene 691 301 - 315) ou pelo plasmídio pTrc99A-pp4-X (Grundmann e col. (1988), Behring Inst. Mitt. 82, 59 - 67).

meio apropriado é indicado na Tabela

1.

TABELA 1

Composição do Meio de Desenvolvimento a Título Ae Exemplo (teores indicados em g ou em mg por litro)

Fonte de carbono (açúcar) de acordo com as necessidades g

NaH^PO^ x H₂0	1,2	g
Na₂RP0₄ x 2 H₂0	8,5	g
KCl	1,0	g
MgSO₄ x 7 H₂0	2,0	g
Ácido cítrico	0,25	g
nh₄ci	5,0	g
Tiamina	5,0	mg
H_ZBO_Z	2,0	mg
(NH₄)₆M_Oçp₂₄x4 H₂0	0,8	mg
Cu S0₄ x 5H₂	0,16	mg
Kl	0,4	mg
Mn S0₄ x 7 H₂0	2,02	mg
ZnSO₄ x 7 H₂0	1,6	mg

Realizou-se a fermentação num fermenta dor E. Biostat de dez litros (fabricante: Braun Melsungen) carregado com um volume de 8 litros de mistura de fermentação

Durante a fermentação, não se utilizou qualquer pressão de selecção sobre as células contendo plasmí dio, isto é, a fermentação realizou-se sem adição de antibiótico . Vacinou-se o fermentador com uma cultura prévia realizada em balão sob sacudimento durante a noite. Na fase de

início de desenvolvimento, empregou-se glucose como fonte de carbono , em que a glucose foi adicionada doseadanente de maneira a nesta í...co se formar menos do cue 0,1 1. le ácido acético.

Elevadas concentrações de acetato ori_&inara- si_onií'icativaaente menores rendimentos de produto. Depois de 10 a 15 horas, atinoira.»-s.e concentrações cie células n- de.se de desenvolvi.sento prévio de cerca de 50 DO^-r-^ e a in'ução da formação le produbo reeliss.-se altern. tivamente utilizando três tipos de processos diferentes

1) Doseamento Posterior de 1-lucose depois da Adição de 1 - 1Ç nlí de IPTG (de preferência, p mH de IrDO)

Do fim da fase de desenvolvicmto, inlua formação do produto por adição de 1-10 mil de IPTG :ferencia, 5 mi» de IPTG) soo do-oansnto posterior ie glucose como fonte le carbono (substrato). Deste caso, verifica-se nítido d' :ó — u. “ ο ζ (de oo .tido d-.pondencis ia velocidades de fornççao lo ;onc on bo. ção ac òual ie _lucoss . ^lu₀~ou cone ?--to :·.-.? rance são c .nsiderao^el e i±?j como suo:

u.u)S uOS.uvô C One u —Όn /ami;

a a cuomn s ooer td-inui d_; oociel até c--mpletssente . Do ;oncçfm· oç ~o ’o Jan.o' Uj u? mammu 1: 1 y le nP-b e uc<

η b

Ί -Ç p _b/i ; , octivers;

A limitação da glucose efectuou-se por regulação da bomba ou por meio de uma medição de HPLC on lia~ A velocidade de crescimento das células foi reduzida por indução em sistemas não limitados, em sistemas limitados a velocidade de crescimento das células reduziu-se em dependência da concentração de glucose, como era de esperar. Dependendo das correspondentes velocidades de desenvolvimento, conseguiram-se densidades de células compreendidas entre 100 e 150 ΏΟθ^θ

- 9 —ssaAi «·Τ~'

2) Doseamento Posterior da Lactose

Ro fim da fase de desenvolvimento, induziu-se a formação de produto por substituição da glucose usada como fonte de carbono por lactose. A lactose é o indutor fisiológico da operação lac, mas não realiza nenhuma indução tão completa como IPTG. Durante a fase de indução, as células desenvolveram-se até densidades de células de 100 A concentração do produto atingiu valores de 1,5 g/1.

3) Doseamento Posterior de Lactose e Adição de 1 - 100 mM de IPTG (de Preferência 5 mM)

No fim da fase de desenvolvimento, induziu-se a formação de produto por substituição da glucose usa da como fonte de carbono por lactose e adição adicional de IPTG Neste caso, a intensa indução por IPTG verificou-se e, simultaneamente, utilizou-se o substrato fisiológico de lactose. 0 doseamento exacto da fonte de carbono não é neste caso necessá rio, ao contrário de glucose + influencia a produtividade. Durante a indução, as células desenvolvem-se igualmente até se obterem densidades de células correspondentes a 100 ΡΟθ^θ.

A concentração de produto no fim da fermentação é igual a 2,0 g/1 ·

Dependendo dos respectivos tamanhos dos volumes das misturas de fermentação, realiza-se a indução de acordo com um dos processos porque a estabilidade do plasmídio diminui de 1) até 3) .

Os parâmetros da fermentação escolhidos para os ensaios descritos estão reunidos na Tabela 2:

TABELA 2

Parâmetros da Fermentação pH

Taxa de adição de gases Número de rotações

Tempratura

Sobrepressão

Concentração de substrato

Oxigénio dissolvido

7,0 (regulado por adição de H₅P0₄ e NH^OH)

0,5 - 2,0 wm

1.500 rotações por minuto 37°O (até 30°C) até 2,0 bar glucose regulada para menos do que 5 »0 g/1, limitada pela absorção de oxigénio dissolvido; lactose regulada no doseamento posterior (menor do que 30 g/1), limitada pela diminuição do oxigénio dissolvido maior do que 10%.

Claims

- lê Processo de fermentação optimizado para a preparação de proteínas estranhas em E. coli com utilização de um promotor que pode ser induzido por lactose, caracterizado pelo facto de, por indução com isopropiltiogalactósido (IPTG) e com glucose como fonte de carbono, se regular a concentração de glucose de tal modo que a pressão parcial de oxigénio seja maior ou igual a 10%.

22**- 2B Processo para a preparação de proteína: estranhas em E. coli com utilização de um promotor que pode se:? induzido por lactose, caracterizdo pelo facto de, por introdução de lactose como fonte de carbono e de indutor natural, se regular a concentração de lactose de tal maneira que a pressão parcial do oxigénio seja maior ou igual a 10%.

_ Processo para a preparação de proteínas estranhas em E. coli com utilização de um promotor que pode se:: induzido por lactose, caracterizado pelo facto de, por introdu ção de lactose como fonte de carbono e de indutor natural assin. como de IPTG como indutor, se regular a concentração de lactose de tal maneira que a pressão parcial de oxigénio seja maior ou igual a 10%.

- 4S Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de compreender pelo menos uma das seguintes operações

a) fermentação sob pressão superior à pressão atmosférica, de preferência, inferior a 2 bar,

b) prossecução regulada da alimentação de energia (aumento do número de rotações do agitador) e da taxa de arejamento (até 2 wm) ,

c) diminuição datemperatura de 37° para um valor máximo de 50 °0,

d) adição regulada de substrato como fonte de carbono de maneira a obter-se valores máximos de 5 a 10 g/litro, e

e) regulação dos valores de pH de modo a estar compreendido entre pH 6,7 até pH 7,3.

- 5fi Processo cie acordo com as reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo facto de se fermentar estirpes de E. coli que contêm cADN de lipocortinas.

- 6â Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de cADN codificar PP4, PP4-X ou mutantes e variantes de PP4.

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 2 de Agosto de 1989, sob o N2. P 39 25 550.6.