AT397812B - Verfahren zur expression von genen unter kontrolle des lac-operators - Google Patents

Description

AT 397 812 B

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Expression von Genen unter Kontrolle des lac· Operators oder eines Derivates davon in Escherichia coli.

Nicht-konstitutive Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli:

Rekombinante Proteine werden in E. coli meist nicht konstitutiv exprimiert, d.h. das entsprechende Gen wird unter Kontrolle eines Promotors gesetzt, der nur unter induzierten Bedingungen Proteinsynthese bewirkt, ansonsten aber wenig bis überhaupt keine spezifische Proteinsynthese hervorruft. Der Grund dafür ist einerseits, daß viele rekombinante Proteine das Wachstum der Zellen beeinträchtigen oder gar zum Zelltod führen, andererseits soll eine zu lange Verweilzeit des Proteins in der Zelle vermieden werden, um Abbau zu vermeiden.

Die meist verwendeten Induktionssysteme beruhen entweder auf dem Zusatz von Chemikalien (meist beruhend auf dem Induktionssystem des Lactose-Operons) oder auf Erhöhung der Inkubationstemperatur (Induktionssystem des lambda-Phagen). Die Vorteile der chemischen Induktionssysteme sind einfachere technologische Realisierung und geringere physiologische Effekte auf die Bakterien.

Das Induktionssystem des Lactose-Operons:

Im nichtinduzierten Zustand bindet ein Repressorprotein (das lacl Protein) an eine ca. 20 bp lange Sequenz (= Operator) nach dem Promotor und blockiert so die Transkription. Bestimmte Substanzen (Induktoren) binden an dem Repressorprotein und verändern seine Struktur so, daß es nicht mehr am Operator bindet und die Transkription dann stattfinden kann. Diese Induktoren sind Allolactose oder Strukturanaloga davon wie Isopropyl-ß-D-thio- galactosid (IPTG), aber nicht Gaiactose. Dieses Induktionssystem bleibt auch funktionell, wenn Teile vom oder der ganze lac-Promotor durch einen anderen ersetzt wird.

Induktion mit IPTG: IPTG ist eine schwefeihältige strukturanaloge Substanz zu Lactose, die lac-reprimierte Promotoren stärker induziert als Ailolactose und daher meist als Induktor für die Expression rekombinanter Proteine in E. coli eingesetzt wird. Sie hat aber wesentliche Nachteile für einen technologischen Einsatz: der hohe Preis bedeutet ein Vielfaches der restlichen Medienkosten. Die vollständige Entfernung von IPTG oder dessen Abbauprodukten aus dem rekombinanten Protein müßte für pharmazeutische Produkte nachgewiesen werden. Daher ist für viele technologische Anwendungen der Einsatz von IPTG als Induktor praktisch nicht möglich.

Bisher verwendetes Verfahren:

Zuerst wird im uninduzierten Zustand E. coli Biomasse produziert, anschließend wird durch die Zugabe von IPTG (Konzentration im Bereich Von 1 mmolar) induziert. Dadurch wird das rekombinante Gen stark transkribiert und rekombinantes Protein produziert. Allerdings kann die optimale Produktausbeute nur erzielt werden, wenn das Wachstum der Zellen noch einige Generationen lang aufrecht bleibt.

Die Nachteile des bisher verwendeten Verfahrens sind daher einerseits der hohe Preis und anderseits die potentiell toxische Substanz, deren Entfernung aus einem z.B. pharmazeutischen Produkt nachgewiesen werden muß. Dies bedeutet einen hohen analytischen Aufwand und ergibt nach wie vor das Risiko, ob diese pharmazeutische Substanz überhaupt bewilligt wird. Schließlich ist auch die Induktion mit IPTG so stark, daß bei hohen Produktbildungsraten das Wachstum zusammenbricht und damit die Ausbeuten nicht optimal sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, bei welchem in Escherichia coli eine Induktion mit einem nicht toxisch wirkenden, gleich gute Ausbeute ergebenden Induktor erfolgen kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß zur Expression der rekombinanten Proteine Galactose-negative Stamme von Escherichia coli eingesetzt werden, wobei die Induktion der Gene, die unter Kontrolle des lac-Operators stehen, mit Gaiactose vorgenommen wird.

Die natürliche Induktion des lac-Operons in E. coli beruht auf der Umwandlung der Lactose in Allolactose nach dem Eintreten in die Zelle. Lactose selbst bindet sehr schwach an den Repressor und wirkt vermutlich anti-induzierend, wogegen Allolactose sehr stark bindet und stark induzierend wirkt (2, 3). Dieses Verhalten ist unabhängig davon, ob die Zelle Gaiactose verwerten kann oder nicht, das heißt, die Induktionswirkung von Lactose ist in E. coli gleich in gal+ und gal“ Stämmen. 2

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Galactose bindet in vitro um den Faktor 1.000 schwächer an den E. coli lac-Repressor als IPTG oder Allolactose, was nach (2) und (3) bedeutet, daß sie auch um ca. den Faktor 1.000 schwächer induzierend wirkt.

Baldauf et al. (1) beschreiben die Induktion des Klebsiella aerogenes lac-Operons mit Galactose in vivo. In dieser Arbeit wird mehrmals Bezug auf eine Ähnlichkeit des Klebsiella lac-Systems mit dem von E. coli genommen: * Einleitung letzter Absatz: "The Klebsiella System appears to resemble the analogous System in E. coli,..." - Das bezieht sich allerdings nur auf PTS-vermittelte Induktor-Ausschließung. * Diskussion 2. Absatz: "Galactose also acts as an inducer for E. coli lac, although less efficiently than allolactose (hier ist (3) zitiert)”. "Less efficiently" bedeutet - siehe oben - ca. drei Zehnerpotenzen.

Neben diesen festgestellten Ähnlichkeiten wird von Baldauf et al. mehrmals der Unterschied zwischen dem E. coli und K. aerogenes lac System herausgestrichen, gerade was die Induzierbarkeit mit verschiedenen Zuckern, darunter Galactose, betrifft. * Lactose wirkt in Klebsiella nur in gal- Stämmen induzierend, nicht in gal+. In E. coli besteht dagegen hier kein Unterschied (siehe oben). * Einleitung 2. Absatz: "... six amino acids thought to be critical for the interaction of the E. coli lac repressor with inducer are not conserved in the K. aerogenes lac repressor, suggesting that interaction of the repressor with inducers may be different." Das heißt, gerade an der Stelle, die wesentlich ist für die Induktionswirkung, besteht ein Unterschied zwischen E. coli und Klebsiella. ’ Melibiose wirkt in Klebsiella inhibierend, in E. coli induzierend.

Aus ihren Ergebnissen ziehen die Autoren dann den Schluß, "that the metabolite of lactose responsible for inducing the K. aerogenes lac operon is galactose." (p. 5590). Im Gegensatz dazu ist bei E. coli dieser Metabolit Allolactose (siehe oben), das wird von den Autoren auch auf Seite 5591 erwähnt: "In E. coli, allolactose (...) serves as a physiological inducer, ailowing full induction of lac even in gal+ strains."

Aufgrund dieser Unterschiede zwischen dem E. coli und dem Klebsiella lac-Operon, und aufgrund der Hinweise, daß Galactose das E. coli-System wesentlich schwächer induziert als z.B. IPTG, läßt sich nicht erwarten, daß - analog zum K. aerogenes System - die Induktionskraft von Galactose in gal" E. coli ähnlich stark sein könnte wie die von IPTG, wie das bei K. aerogenes der Fall ist.

Zu erwarten wäre, daß in E. coli die Induktionskraft von Galactose in jedem Fall (auch in gal- Stämmen) schwach ist, ca. um den Faktor 1.000 schwächer als die von IPTG.

Es konnte nun gezeigt werden, daß sich in gal“ E. coli-Stämmen der lac-Promotor fast ebenso stark durch Galactose induzieren läßt wie durch IPTG, obwohl er sich gerade darin vom K. aerogenes lac-Promotor unterscheidet.

Vorteiihafterweise können die eingesetzten E. coli-Stämme durch künstliche Mutation in Galactose-negative Stämme umgewandelt werden. Dadurch wird erreicht, daß nicht nur in komplizierten Auswahlverfahren aufgefundene Mikroorganismen, sondern auch sonstige Escherichia coli-Stämme verwendet werden können, welche hinsichtlich der Expression des Proteins die gewünschten Eigenschaften aufweisen. Die natürlich auftretenden Mutationen sind nämlich eher selten, sodaß es oft nicht ausreicht, um bestimmte Mutanten zu isolieren.

Die Mutation kann dabei auf herkömmliche Weise vorgenommen werden, und zwar wie folgt: 1. UV-Bestrahlung:

Zuerst wurde für jeden Stamm anhand einer Dosis-Effekt-Kurve die Einwirkungs-dauer ermittelt, bei der 99,9 % der Keime abgetötet werden. Dann wurde unter diesen Bedingungen mutiert und anschließend wie unten beschrieben selektiert. 2. Gamma-Bestrahlung:

Wie bei der UV-Bestrahlung wurde eine Dosis-Effekt-Kurve aufgestellt und die notwendige Dosis zur Abtötung von 99,9 % der Keime ermittelt, mit der dann mutiert wurde. 3. N-Methyl-N-nitroso-N'-nitroguanidin:

Die mutagene Behandlung erfolgte mit 100 ug/ml Nitrosoguanidin, 45 min bei 37 · C. 3

AT 397 812 B 4. Natürliche Mutationsrate:

Die natürliche Mutationsrate für einzelne Merkmale beträgt bei E. coii zwischen 10-G und 10—10, ist aber nicht bei allen Stämmen gleich. Bei manchen Stämmen genügte die natürliche Mutationsrate, um gal-Isolate selektieren zu können.

Selektion von gal~ Mutanten:

Zur Selektion wurden Medien verwendet, die Glycerin als einzige Kohlenstoffquelle sowie 2-Desoxy-D-galactose enthielten. In Zellen, die Galactokinase (das erste Enzym des Abbauweges von Galactose) enthalten, wird Desoxygalactose zu Desoxygalactosephosphat umgewandelt, diese Substanz verhindert das Wachstum auf Giycerinnährböden. Auf den Selektionsplatten können daher nur Bakterien wachsen, die entweder keine Galactokinase produzieren, oder die Galactose nicht aufnehmen können.

Um zu prüfen, ob die erhaltenen Mutanten Galactokinase produzieren oder nicht, wurde aus Lysaten der entsprechenden Isolate die Aktivität dieses Enzyms bestimmt. Nur Isolate, die keine Galactokinase enthielten, wurden als gal“ Mutanten weiterverwendet.

Als günstig für die Selektion erwies sich folgendes Medium:

Na2HPO* 6 g/l KH2PO* 3 g/l NaCI 0,5 g/l NH* CI 1 g/l MgCfe 0,1 g/l Glycerin 2 g/l 2-Desoxy-D-galactose 2 g/l

Dabei kann als E. coli-Stamm der unter DSM 7096 hinterlegte Stamm HMS 174 (DE3) gal" eingesetzt werden. Die Vorteile dieses Stammes werden nachstehend anhand der Produktionsrate noch näher erläutert werden.

Bei einem besonders vorteilhaften Verfahren kann in der Zulaufphase die Wachstumsrate der Biomasse durch Substratlimitierung, insbesondere der C-Quelle, reguliert werden. Damit kann in einfacher Weise der Biomasse-Zuwachs im Fermenter gesteuert werden. In weiterer Folge kann in der Produktionsphase über die Wachstumsrate die Produktbildung gesteuert werden, wodurch ein optimales Verhältnis zwischen Biomasse-Zuwachs und Produktbildung erreicht wird.

Kurz zusammengefaßt, besteht die Erfindung darin, daß ein E. coli-Stamm verwendet wird, der Galactose nicht als Kohlenstoffquelle verwerten kann, und zwar ein Stamm, der entweder durch natürliche oder Künstliche Mutation diese Eigenschaft erhalten hat. Es wird bei diesem Verfahren nun uninduzierte Biomasse produziert, anschließend durch Zugabe von Galactose induziert und bei gleichbleibender Wachstumsrate mehrere Stunden weiterfermentiert. Dadurch kann die zugewachsene Biomasse die maximale Menge an rekombinantem Protein anhäufen. Damit wird erreicht, daß Galactose als billiger Induktor eingesetzt werden kann, welcher als physiologischer Zucker keine Probleme mit der Zulassung des Medikaments oder des Nahrungsmittels aufweist, wobei auch bei hoher Produktivität das Wachstum aufrecht bleibt und daher eine optimale Ausbeute erzielt wird. Es konnte dabei nämlich nachgewiesen werden, daß lac-reprimierte Promotoren in E. coli-Stämmen, die Galactose nicht als Kohlenstoffquelle verwerten können, durch Galactose induziert werden können, aber nicht in Galactose verwertenden Stämmen. Das bedeutet, daß die Vorteile der lac-lnduktion genützt werden können, ohne die Nachteile von IPTG in Kauf nehmen zu müssen. Weiters konnte gezeigt werden, daß die Induktion mit Galactose gezielter gesteuert werden kann, sodaß auch bei stark exprimierenden Systemen das Zellwachstum bei hoher spezifischer Produktivität aufrechterhalten werden kann und so höhere Ausbeuten erzielt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend unter anderem auch anhand von Beispielen näher erläutert.

Prozeßbeschreibung:

Die Produktion der rekombinanten Proteine erfolgt in einem Zuiaufverfahren (fed-batch). Die erste Phase des Verfahrens (batch-Phase) dient der Anzucht einer Biomasse für die Zulaufphase. In der Zulaufphase wird das Wachstum der Biomasse durch Substratlimitierung (Limitierung der C-Quelle) regu- 4

AT 397 812 B liert. Im batch wächst die Kultur in der exponentiellen Phase mit konstantem, maximalem u (relative Wachstumsrate). Dabei erfolgt die Zunahme der Biomasse exponentiell nach x2 = x1 ’eu*’ (1) dx = xr(eu"'t-1) (2) x1 Biomassekonzentration zu Beginn x2 Biomassekonzentration nach Zuwachs über Zeit t t Zeitdauer, in der Biomassekonzentration von x1 auf x2 ansteigt μ Wachstumsgeschwindigkeit dx Zunahme der Biomasse e Euler'sche Zahl

Dabei wird eine bestimmte Menge Substrat (ds) entsprechend dem Ertragskoeffizienten Yx,s verbraucht, dx = Yx/S’ds (3) ds = ds1’(eu*'-1) (4)

Legt man diese Verhältnisse auf ein Zulaufverfahren um, müßte man das Substrat gemäß Gleichung 4 zuführen, um die maximal mögliche Wachstumsrate aufrecht zu erhalten. Das heißt, durch Reduzierung der Substratzulaufrate kann direkt Einfluß auf die Wachstumsrate genommen werden. Mit Hilfe computergestützter Prozeßführung ist man in der Lage, jede gewünschte Zulaufrate und in der Folge jede Wachstumsrate zwischen 0 und umax einzustellen. Diese Zusammenhänge besitzen nur bei eindeutiger Limitierung durch eine Substratkomponente (meistens C-Quelle) Gültigkeit. Durch Wahl der jeweiligen submaximalen Zulaufrate stellt sich eine submaximale Wachstumsrate entsprechend der Monod-Kinetik ein. U = iWS/(Ks + S) (5) u Wachstumsrate

Umax maximale Wachstumsrate S Substratkonzentration K§ jene Substratkonzentration, die bei umax/2 voriiegt

Die Monod Kinetik gibt den Zusammenhang zwischen Wachstumsrate und Substratkonzentration wieder, u.zw. sinkt gemäß dieser Funktion die Wachstumsrate mit abnehmender Substratkonzentration ab.

Aus dieser Gleichung ergibt sich, daß es einen, für jede Kultur spezifischen, Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und Wachstumsgeschwindigkeit gibt. In der Praxis kann ein exponentieller Zulauf mit konstanter Zulaufrate nur durch computergestützte Prozeßleitung realisiert werden, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist.

Durch den Algorithmus wird vom Computer die theoretische Gewichtsabnahme des Vorratsgefäßes gemäß Gleichung 4 berechnet. Nach Vergleich dieses Sollwertes mit dem Istwert wird über einen PID-Regelalgorithmus die jeweilige Förderleistung der Substratpumpe eingestellt.

Mit diesem Verfahren ist man in der Lage, die für den jeweiligen Prozeß optimalen Bedingungen für Wachstum und Produktbildung zu gewährleisten. Die gebildete Biomasse wird durch die Menge an vorgelegtem Substrat festgelegt. Der Zeitpunkt der Induktion richtet sich nach den Produktionseigenschaften des jeweiligen rekombinanten Mikroorganismus. Daraus werden die Dauer der Vorzucht und der Produktionsphase abgeleitet. Die Wachstumsrate wird in beiden Phasen auf das jeweilige Optimum eingestellt.

Weitere Fermentationsbedingungen und Nährmedium

Die weiteren Parameter der Fermentation entsprechen den Standardparametern einer E. coli-Fermenta-tion. pH-Wert: 7

Temperatur: 37° C p02: geregelt auf 30% Sättigung über Rührerdrehzahl und Zuluft

Die Konzentration und Menge des Nährmediums richten sich nach der gewünschten Gesamtbiomasse und dem gewünschten Endvolumen im Fermenter. Die folgenden Angaben beziehen sich auf eine Fermentation mit einem Endvolumen von 10 I (4 I batch, 6 I Zulauf) bei einer erreichten Gesamtbiomasse von 100 g BTS. 5

AT 397 812 B Nährmedium: Alle Angaben in Gramm, außer Spurenelementelösung in ml. batch fed-batch Glucose 8.6 266.4 Trypton 1.8 48.5 Hefeextrakt 0.8 24.2 KH2P04 9.0 18.0 K2HP04*3H20 18.0 36.0 MgS04*7H20 0.31 9.7 CaCI2*2H20 0.031 0.97 (NH4)2S04 1.06 32.9 NH4CI 0.86 26.8 Tri Na-Citrat 0.8 24.2 Spurenelementlösung 4 6

Zusammenhänge zwischen Wachstum und rekombinanter Produktbildung:

Der Ablauf der Biosynthese rekombinanter Proteine erfolgt nach denselben Mechanismen wie die der zelleigenen Proteine.

Die Wirtszelle stellt die Prekursoren für die Synthese der spezifischen mRNA und das rekombinante Protein, den Proteinsyntheseapparat und die für die Knüpfung der Monomeren notwendige Energie zur Verfügung.

Der Proteingehalt der Zelle ist in einem Bereich der Wachstumsrate weitgehend konstant, somit ist die Proteinsyntheserate stark gekoppelt mit der Wachstumsrate, daher muß in schnell wachsenden Zellen die Proteinsyntheserate entsprechend höher sein - folglich ist sie streng wachstumsassoziiert, wobei die Wachstumsrate (= Gesamtsyntheserate der Biomasse) eine Funktion des Nährstoffangebots ist.

Die Proteinsynthese nimmt den Hauptteil (60%) der aus dem Stoffwechsel freiwerdenden Energie in Anspruch.

In ruhenden Zellen beschränken sich die Zellfunktionen auf den Erhaltungsstoffwechsel, somit kann in dieser Phase keine Protein-Nettosynthese stattfinden. Diese Verhältnisse treffen auch auf Zellen in der stationären Wachstumsphase zu.

Der Übergang der Zellen in den stationären Zustand ist eindeutig als Folge von Nährstofflimitierungen zu betrachten, sofern Wachstum nach der Monod Kinetik vorliegt.

Diese grundsätzlichen Mechanismen gelten auch für die rekombinante Proteinsynthese. In der Literatur gibt es keine Hinweise, daß ein rekombinantes Protein zusätzlich zu den zelleigenen gebildet wird. Wie anfänglich erwähnt, ist der Proteingehalt der Zelle weitgehend konstant, unterliegt aber in Abhängigkeit von Umwelteinflüssen starken Schwankungen in der Zusammensetzung. Die Zelle ist in der Lage, unter Aufrechterhaltung des Wachstums stärke Veränderungen in der Expressionshöhe der einzelnen Proteine zu tolerieren - dieser Spielraum steht auch für die Produktion von rekombinanten Proteinen, die keinen Nutzen für die Zelle bringen, zur Verfügung. Wie die Praxis zeigt, gibt es viele Systeme, bei denen neben der rekombinanten Produktbildung Wachstum aufrecht erhalten werden kann. Die maximal mögliche Wachstumsgeschwindigkeit wird dabei in Abhängigkeit von Expressionshöhe, Anzahl der Plasmide etc. reduziert. Dabei stellt sich ein Gleichgewicht zwischen Produktion des zelleigenen und des rekombinanten Proteins ein, und man ist dadurch in der Lage, durch kinetische Analysen eine exakte Voraussage für das Erreichen einer maximalen Produktkonzentration zu machen. Der Gehalt des Fremdproteins (FP) ergibt sich aus dem Verhältnis von spezifischer Produktionsrate (qP) zur Wachstumsrate (u.) FP=qP/u

Vom Zeitpunkt der Induktion müssen einige Zellteilungen abgewartet werden, um die maximal mögliche Fremdproteinkonzentration auch zu erreichen (mind. 3-4). Wäre qP vollkommen wachstumsassoziiert, könnte man durch Veränderung der Wachstumsrate keine Veränderung des Gehaltes an Fremdprotein in der Zelle bewirken. Die spezifische Produktbildungsrate qP zeigt aber in Abhängigkeit von den Eigenschaften der Mikroorganismen keine absolute Korrelation zur Wachstumsrate. Bei sehr tiefen Wachstumsraten kommt es oft zu einer Erhöhung des Verhältnisses qP/u und damit zu einem Ansteigen des FP Gehaltes der Zellen, wenn dieser Zustand über mehrere Generatio- 6

AT 397 812 B nen aufrecht erhalten werden kann.

Wie schon erwähnt, kommt es durch die rekombinante Produktbiidung grundsätzlich zu einer Verminderung der maximal möglichen Wachstumsrate.

Bei sehr starken Expressionssystemen führt dies nach der Induktion innerhalb kurzer Zeit zur vollkommenen Einstellung des Zellwachstums, da ein Großteil der Proteinbiosynthesekapazität für die Bildung des rekombinanten Proteins verwendet wird. Damit ist die Zelle nicht mehr in der Lage, die für die Teilung notwendigen Bausteine zu synthetisieren und stirbt schließlich ab. D.h., für die Produktion des rekombinanten Proteins steht nur eine relativ kurze Phase, in der noch Wachstumsvorgänge stattfinden, zur Verfügung. Man ist bei derartigen Expressionssystemen nicht in der Lage, durch die Prozeßführung eine Verlängerung der Wachstums- und damit der Produktbildungsphase zu erreichen. Unter diesen Umständen wird oftmals nicht die maximal mögliche Expressionshöhe erreicht.

Eine ideale Strategie für die rekombinante Produktbildung wäre es, von der Gesamtproteinsynthesekapazität nur so viel für die Fp Bildung wegzunehmen, daß die Zelle in der Lage ist, eine für die Prozeßfühtrung ausreichend hohe Wachstumsrate aufrecht zu erhalten. Daraus ergibt sich, daß es notwendig ist, regulierbare Expressionssysteme zur Verfügung zu haben. Durch Induktion mit Galaktose kann z.B. ein zu starkes Expressionssystem angeschwächt werden. Damit können die oben geforderten Bedingungen für die Entwicklung einer optimalen Prozeßführung erfüllt werden.

Zusammenfassung der Beispiele:

Die Beispiele zeigen die Gültigkeit des beschriebenen Verfahrens ’ für E. coli K12- und E. coli B-Stämme * für verschiedene Promotoren (lac UV5 und tac) * für chromosomal und Plasmid-Iokalisierte Gene ’ für cytopiasmatisch und periplasmatisch exprimierte Proteine * für verschiedene Gene unterschiedlicher Herkunft

Beispiele:

Beispiel 1: HMS 174 (pAR1219) HMS 174 ist ein K12 Derivat. Durch Mutation (siehe Punkt 2) wurden gal-negative Klone hergestellt. Im Plasmid pAR 1219 steht die Expression der T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lac UV5-Promotors. Die gal-negativen Klone zeigten mit Galactose ähnlich starke Induzierbarkeit wie mit IPTG. Der Wildstamm konnte nicht mit Galactose induziert werden (siehe Tab. 2).

Beispiel 2: HMS 174 (DE3) ist ein Derivat von HMS 174, das lysogen den lambda-Phagen DE3 trägt, der das Gen für T7 RNA Polymerase unter Kontrolle des E. coli lac UV5-Promotors enthält.

Durch Inkubation mit Nitrosoguanidin wurden Mutanten erzeugt, die durch Selektion auf 2-Desoxy-Galactose und Glycerin isoliert werden konnten. Diese Selektion ist spezifisch für Galactokinase-Defekte. Sechs Klone davon wurden hinsichtlich ihrer Induzierbarkeit mit Galactose im Vergleich zum Wildstamm getestet. Alle gal-negativen Klone zeigten mit Galactose ähnlich starke Induzierbarkeit wie mit IPTG, wogegen der Wildstamm nicht mit Galactose induzierbar war (Tab.1, Fig. 2). Enzymbestimmungen aus Lysat eines ausgewählten Klons (Nr.1) sowie des Wildstammes ergab, daß die Mutante keine Galactokina-se- und keine Galactose-1-phosphat-UridyI-Transferase-Aktivität besitzt (Tab.5).

Beispiel 3: BL21 (pAR 1219) BL21 ist galK und galT negativ. Im Plasmid pAR1219 steht das Gen für Expression von T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lac UV5-Promotors. Die Expression von T7-RNA-Polymerase ist durch Galactose induzierbar (siehe Tab.2 und Fig.3)..

Beispiel 4: BL21 (DE3) ist Stamm BL21 mit Phagen DE3 wie in Beispiel 2. Ist gal-negativ. Die Expression der T7 RNA-Polymerase ist ebenso mit Galactose induzierbar wie bei HMS 174 (DE3) (Tab. 1, Fig. 2). 7

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Beispiel 5: JM105 (rhSOD)

Das E. coli K12 Derivat, Stamm JM105 mit dem Plasmid rhSOD (kodiert für humane Superoxiddismuta-se unter Kontrolle des tac-Promotors) wurde zufallsmutiert und auf 2-D-gal und Gly selektiert. Ein galnegativer Klon wurde ausgewählt, auf Enzymaktivität und auf Galactose-Induzierbarkeit getestet. Der Klon ist galK negativ und galT positiv. Die Expression der rhSOD war mit Galactose induzierbar im Gegensatz zum Wildtyp (Tab. 4).

Beispiel 6: JM105 (pJK5APSc)

Das Plasmid trägt das Gen für ein Fusionsprotein aus E. coli alkalischer Phosphatase und einem anti-HlV-single Chain Antikörper, kontrolliert vom tac-Promotor. Da das Strukturgen am Beginn einen Leader trägt, wird das Fusionsprotein in das Periplasma ausgeschieden. Nach einem periplasmatischen Aufschluß (Inkubation in hypertonischer Lösung und anschließender osmotischer Schock in hypotonischer Lösung) kann das Protein durch native Elektrophorese und Phosphatase-Färbung spezifisch nachgewiesen werden.

Die gal-negative Mutante war mit Galactose etwa gleich stark induzierbar wie mit IPTG, ohne Induktion zeigte sie etwa ein Zehntel der Aktivität (Fig. 4). Die optische Dichte der markierten Banden wurde gemessen und integriert und ergab nach Korrektur folgende relative Intensität: (Tab. 3).

Als Kontrolle wurde der gal-positive Wildstamm mit und ohne Plasmid pJKSAPSc ebenso behandelt. Das Ergebnis (Fig. 4) zeigt, daß hier Galaktose nicht induzierend wirkt.

Beispiel 7: BL21 (DE3) und HMS 174 (DE3) jeweils mit Plasmid pET3aSOD

Das Plasmid pET3aSOD trägt das Gen für die humane Superoxiddismutase unter der Kontrolle des T7 phi 10 Promotors, der hochspezifisch von T7-RNA-Polymerase erkannt wird. Die Expression von rhSOD ist in Stamm BL21 (DE3) und HMS 174 (DE3) (gal-negativ) durch Galactose induzierbar. Beim Wildstamm HMS 174 (DE3) (gal-positiv) ist die Expression von rhSOD nicht durch Galactose induzierbar. Die quantitative Bestimmung von rhSOD erfolgt direkt aus dem Lysat enzymatisch aufgeschlossener Zellen mittels ELISA (siehe Tab. 4).

Tabellen:

Tab. 1 zu Beispiel 2 und 4: relative Expression von T7-RNA-Polymerase, ermittelt aus der optischen Dichte der markierten Banden (Fig. 2), korrigiert auf die eingesetzte Probenmenge und relativiert auf IPTG-induktion.

Stamm IPTG-ind. Gal.-ind. nicht-ind. HMS 174 (DE3) gal + 100 % n.d. n.d. HMS 174 (DE3) gal- 100 % 68% n.d. BL21 (DE3) 100 % 63% 10% n.d. nicht detektierbar

Tab. 2 zu Beispiel 1 und 3: relative Expressionsraten von T7-RNA-Polymerase mit Stamm BL21 (pAR1219) und Stamm HMS 174 (pAR1219), ermittelt aus der optischen Dichte der markierten Banden (Fig. 3), korrigiert auf die eingesetzte Probenmenge und relativiert auf IPTG-Induktion.

Stamm IPTG-ind. Gal.-ind. nicht-ind. BL21 100% 54% 24% HMS 174 gal- 100% 65% 10% HMS 174 gal + 100 % 14% 12%

Tab. 3 zu Beispiel 6: relative Expression des AP-Sc Fusionsproteins. Ermittelt aus der optischen Dichte der markierten Banden aus den Spuren 3-5 und 8-10, korrigiert um den Verdünnungsfaktor, relativiert auf IPTG-Induktion. 8

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Stamm Induktor rel. Expressionsrate JM105 gal + IPTG 100 % Galaktose 3 % n.i. 8 % JM105 gal- IPTG 100 % Galaktose 70 % n.i. 9 % n.i. nicht induziert

Tab. 4 zu Beispiel 5 und 7: Expressionshöhe von rhSOD mit Stamm JM105, BL21 (DE3) und HMS 174 (DE3), ermittelt aus dem Lysat enzymatisch aufgeschlossener Zellen mittels ELISA. Die Werte sind in mg SOD pro g Bakterientrockenmasse angegeben.

Stamm IPTG-ind. Gal.-ind. nicht-ind. JM105 gal + 3.8 0.8 0.5 JM105 gal- 4.6 2.7 0.6 HMS 174 (DE3) gal + 89 35 35 HMS 174 (DE3) gal- 95 80 30 BL21 (DE3) 93 87 18

Tab. 5

Galactokinase- und Uridyltransferase-Aktivität von gal + und gal- Stämmen. Stamm Plasmid Kinase (U/g Prot.) Transferase (U/g Prot.) BL21 g- pAR1219 0 0 HMS 174 (DE3) g + - 22 68 HMS 174 (DE3) g- - 1 5 JM105 g + pRHSOD 23 106 JM105 g- pRHSOD 1 116 JM105 g + pJK5APSc 23 106 JM105 g- pJK5APSc 0 181

Zur Erläutetung wird in den angeschlossenen Figuren das Verfahren und dessen Ergebnisse nochmals näher graphisch dargestellt.

Fig. 1 zeigt das Prozeßschema für ein computergesteuertes Zulaufverfahren.

Fig. 2 gibt mit anti-T7RNA-Polymerase Antiserum entwickelten Western Blot nach SDS-PAGE von enzymatisch aufgeschlossenen Zellen wieder. Die in den einzelnen Linien aufgegebenen Substanzen sind wie folgt: (1) Molekulargewichtsmarker (2) HMS 174 (DE3) gal + , induziert mit Galaktose

(3) wie (1), induziert mit IPTG (4) wie (1), nicht induziert (5) Molekulargewichtsmarker

(6) HMS 174 (DE3) gal-, induziert mit IPTG (7) wie (6), induziert mit Galaktose (8) wie (6), nicht induziert (9) Molekulargewichtsmarker (10) BL21 (DE3) gal-, nicht induziert

(11) wie (10), induziert mit IPTG (12) wie (10), induziert mit Galaktose

Fig. 3 gibt eine SDS-PAGE von enzymatisch aufgeschlossenen Zellen mit anschließender Coomassie 9

Claims (6)

1. AT 397 812 B brillant blue Färbung wieder. Die einzelnen Linie der Gelelektrophorese bedeuten folgendes: (1) BL21 (pAR1219), nicht induziert (2) wie (1), induziert mit Galactose (3) wie (1), induziert mit IPTG (4) Molekulargewichtsmarker Fig. 4 veranschaulicht eine native PAGE von periplasmatischen Aufschlüssen mit anschließender Phosphatase-Färbung mit NBT und BCIP. Die in der Gelelektrophorese aufscheinenden Linien bedeuten dabei wie folgt: (1) JM105 gal + (pJK5APSc), induziert mit IPTG (2) wie (1), induziert mit Galaktose (3) wie (1), nicht induziert (4) - (6) wie (1) - (3), 1:10 verdünnt (7) JM105 gal- (pJK5APSc), induziert mit IPTG (8) wie (7), induziert mit Galaktose (9) wie (7), nicht induziert (10) - (12) wie (7) - (9), 1:10 verdünnt Fig. 5 zeigt den Verlauf der Gesamtbiomasse und der Wachstumsrate einer fed-batch-Fermentation. Der Zulauf wird in der Verzögerungsphase des batch, bei Erreichen der gewünschten Wachstumsrate, gestartet. Die gebildete Gesamtbiomasse im Fermenter ergibt sich aus dem Volumen und der Konzentration des zugepumpten Substrates. Fig. 6 zeigt den Verlauf der Gesamtbiomasse und des gesamten produzierten rekombinanten Proteins im Fermenter während der Induktionsphase einer fed-batch-Fermentation (a und b). Die Induktion beginnt bei Stunde 11, wobei der Substratzulauf so gesteuert wird, daß die Zellen mit konstanter submaximaler Wachstumsrate wachsen können. Die Abbildung zeigt, daß die Zellen, die mit IPTG induziert wurden, schon bald nach der Induktion das Wachstum einstellen, während die mit Galaktose induzierten Zellen die vorgegebene konstante Wachstumsrate aufrecht erhalten können. Mit dem Wachstum wird bei den IPTG-induzierten Zellen auch die Produktion an rekombinantem Protein eingestellt (c). Die Galaktose-induzierten Zellen können eine annähernd konstante Produktions- und Wachs-tumsrate aufrecht erhalten (d), dadurch ergibt sich eine höhere volumetrische Ausbeute im Fermenter. Literaturverzeichnis 1) Baldauf S.L., Cardani M.A., Bender R.A. 1988. Regulation of the galactoseinducible lac operon and the histidine utilization operons in pts mutants of Klebsiella aerogenes. J. Bacteriol. 170(12), 5588-5593 2) Barkley M.D., Riggs A.D., Jobe A. Bourgeois S. 1975. Interaction of effecting ligands with lac repressor and repressor-operator complex. Biochemistry 14(8), 1700-1712 3) Barkley M.D., Bourgeois S. 1978. Repressor recognition of operator and effectors. In: Miller J.H. and Reznikoff W.S. (eds,), The operon. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. pp. 177-220 Patentansprüche 1. Verfahren zur Expression von Genen unter Kontrolle des lac-Operators oder eines Derivates davon in E. coli, dadurch gekennzeichnet, daß zur Expression der rekombinanten Proteine gar-Stämme von E. coli eingesetzt werden, wobei die Induktion der Genexpression mit Galactose vorgenommen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten E. coli-Stämme durch künstliche Mutation in gar-Stämme umgewandelt werden.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als E. coli Stamm der unter DSM 7096 hinterlegte Stamm HMS 174 (DE3) gal" eingesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zulaufphase die Wachstumsrate der Biomasse durch Substratiimitierung, insbesondere der C-Quelle, reguliert wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß in der Produktionsphase über die Wachstumsrate die Produktbildung gesteuert wird. 10 AT 397 812 B Hiezu
6. 6 Blatt Zeichnungen 11