AT392800B - Verfahren zur erhoehung der ausbeute von cytokinen - Google Patents

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Description

AT 392 800 B
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cytokinen mittels menschlicher oder tierischer Zellen, indem die Zellen zur Induktion der Cytokinbildung mit einem Induktionsmittel behandelt und zur Cytokinproduktion inkubiert werden, worauf die Cytokine abgetrennt werden.
Die Cytokine spielen in den Beziehungen zwischen den Geweben und Zellen des lebenden Organismus, in der Regulierung ihrer Funktion eine wichtige Rolle. Der Begriff "Cytokin" umfaßt alle biologisch aktiven Moleküle oder Molekülgruppen, die von lebenden Zellen hergestellt und dann in die Umgebung ausgeschieden werden. Ohne jeden Anspruch auf Vollständigkeit seien die folgenden genannt: Interleucine, Interferone, Lipocortin, Tumornekrosefaktor usw.
Die lebenden Zellen sind auch unter in vitro Bedingungen fähig Cytokine zu produzieren, wenn sie dazu durch entsprechende Induktionsmittel (Viren, Lektine, Mitogene, Dexamethazon, Phorbolester, Calcimycin, synthetische RNA usw.) induziert werden. Auf diese Weise können mit einem geeigneten Verfahren biologisch aktive natürliche Stoffe in industriellem Maßstab hergestellt werden.
Neben gentechnologischen Methoden sind zur Herstellung der Cytokine auch sog. natürliche Methoden bekannt. Bei den natürlichen Methoden wird den menschlichen oder tierischen Zellen ein Induktionsmittel zugesetzt, durch dessen Wirkung die in der Nährlösung lebenden Zellen Cytokine produzieren, die dann aus dem Medium abgetrennt werden können. Eine derartige Methode ist zur Herstellung von Lipocortin beschrieben worden (B. Rothhut et al: FEBS Lett. 219.169/1987), wobei Glycocorticoid als Induktionsmittel verwendet wird. Zur Herstellung des zellstimulierenden Faktors B (IL-4) wird mit PMA (Hu-Li, J. et al.: J. Exp. Med. 165. 157/1987), zur Herstellung von Interleucin 2 mit ConA (Kato K. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 127. 182/1985), zur Herstellung von α-Interferon mit Sendai-Viren (Cantell, K. et al.: Methode Enzymol. 72. 29/1981 induziert.
Die aufgeführten Verfahren haben miteinander gemeinsam, daß Induktion und Produktion der Cytokine unter identischen Bedingungen verlaufen. Im allgemeinen werden Cytokine hergestellt, indem die entsprechenden Zellen mit einem geeigneten Induktionsmittel behandelt und dann eine bestimmte Zeit lang inkubiert werden. Die in die umgebende Nährlösung abgegebenen Cytokine können dann mit einem geeigneten Verfahren abgetrennt werden.
Aus der DE-A- 29 06160 ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Humaninterferon bekannt, wobei vor oder während der Induktion der produzierenden Zellen diese Zellen mit Stimulatoren behandelt werden. Durch diese Vorbehandlung kann die Produktion der Interferonmenge gesteigert werden. Die Induktion wird bei einer Temperatur von 37 °C und die Produktion bei einer Temperatur von 35,5 °C und einem pH von 7,3 durchgeführt. Über die pH-Bedingungen während der Induktionsphase wird nichts ausgesagt
Auch die US-A-4,357,422 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Interferon, das bei unterschiedlichen Temperaturen durchgefuhrt wird.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art zu stellen, das eine höhere Ausbeute an Cytokinen erlaubt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß so gelöst, daß Induktion und Produktion bei unterschiedlichen pH- und Temperaturwerten vorgenommen werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Ausbeute an Cytokinen unterschiedlicher Zellen in vitro bedeutend erhöht werden.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Produktion bei einem niedrigeren pH-Wert und bei einer niedrigeren Temperatur vorgenommen wird, als die Induktion, wobei die Produktion am besten bei einem pH-Wert von 7 und bei einer Temperatur zwischen 15 und 40 °C, vorzugsweise zwischen 20 und 35 °C, insbesondere zwischen 25 und 32 °C, vorgenommen wird.
Eine weitere vorteilhafte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß pH-Wert und Inkubationstemperatur nach Beginn der Cytokinproduktion verändert werden.
Der pH-Wert und die Inkubationstemperatur werden vorteilhaft im exponentiellen Abschnitt der Cytokinproduktion verändert.
Es hat sich nämlich gezeigt, daß nach dem exponentiellen Abschnitt der Cytokin-Synthese die in Richtung einer Verlangsamung der Synthese wirkenden biochemischen Prozesse stärker werden. Die Cytokin-Synthese ist ab dem Beginn des exponentiellen Abschnittes weniger empfindlich gegen Änderungen der Umgebungsparameter und wird weniger gehemmt als die die Synthese bremsenden Prozesse. Auf diese Weise kann durch geeignete Modifizierung und durch geeignete Wahl des Zeitpunktes der Veränderung die Dauer der Produktion verlängert werden.
Die Einzelheiten des Verfahrens werden an Hand des folgenden Beispieles näher erläutert
Beispiel:
Steigerung der Produktion von Gamma-Interferon (Gamma-IFN) und Interleucin 2 in menschlichen Leukozyten durch Veränderung der Inkubationstemperatur und des pH-Wertes.
Gamma-IFN und Interleucin 2 können in ein und derselben Zellkultur gleichzeitig hergestellt werden. Zur Produktion sind sowohl aus frischem Buffy coat gewonnene, wie auch zur IFN-Herstellung bereits einmal ausgenutzte Leukozyten geeignet
Zur Herstellung der Suspension wird Buffy coat durch mehrfach wiederholte Hämolyse gegen 0,83 %ige -2-

Claims (5)

  1. AT 392 800 B Ammoniumchloridlösung von den begleitenden Erythrocyten befreit. Die gewonnenen Leukozyten werden in einem geeigneten, Mineralsalze, Glucose und in einer Konzentration von 1 mg/ml gammaglobulinfreies menschliches Serum enthaltenden Nährmedium suspendiert, wobei eine Konzentration von 1 - 2 x 10^ Zellen/ml eingestellt wird. Der pH-Wert beträgt 7,2 - 7,4. Induziert werden kann mit 10 - 20 μg/ml Concanavalin A oder 1-10 pg/ml Phytohämagglutinin oder 20 - 100 ng/ml Meserein oder 0,5 - 2 μg/ml Calcimycin (C29H37N30g) oder 5-30 ng/ml Phorbolmiristatacetat bei 37 °C. Drei Stunden nach Zugabe des Induktionsmittels wird der Ansatz bei 30 °C thermostatisiert, sein pH-Wert wird auf 7 eingestellt und der Ansatz inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Leukozyten durch Zentrifugieren aus der Nährlösung entfernt Das Produkt hat einen antiviralen Gamma-IFN-Titer von 15 000 IE/ml und einen IL-2-Titer von 1300 IE/ml. Das ist das 2 - 2,5fache dessen, was erzielt werden kann, wenn bei konstant» Temperatur und ungepuffertem pH-Wert produziert wird. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Cytokinen mittels menschlicher oder tierischer Zellen, indem die Zellen zur Induktion der Cytokinbildung mit einem Induktionsmittel behandelt und zur Cytokinproduktion inkubiert werden, worauf die Cytokine abgetrennt werden, dadurch gekennzeichnet, daß Induktion und Produktion bei unterschiedlichen pH- und Temperaturwerten voigenommen weiden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion bei einem niedrigeren pH-Wert und bei einer niedrigeren Temperatur vorgenommen wild, als die Induktion.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Produktion bei einem pH-Wert von 7 und bei einer Temperatur zwischen 15 und 40 °C, vorzugsweise zwischen 20 und 35 °C, insbesondere zwischen 25 und 32 °C, vorgenommen wird.
  4. 4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß pH-Wert und Inkubationstemperatur nach Beginn der Cytokinproduktion verändert werden.
  5. 5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert und die Inkubationstemperatur im exponentiellen Abschnitt der Cytokinproduktion verändert werden. -3-
AT481/89A 1988-03-04 1989-03-03 Verfahren zur erhoehung der ausbeute von cytokinen AT392800B (de)

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