HU202594B - Process for increasing yield of leucoquines - Google Patents
Process for increasing yield of leucoquines Download PDFInfo
- Publication number
- HU202594B HU202594B HU881049A HU104988A HU202594B HU 202594 B HU202594 B HU 202594B HU 881049 A HU881049 A HU 881049A HU 104988 A HU104988 A HU 104988A HU 202594 B HU202594 B HU 202594B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- production
- temperature
- incubation
- white blood
- blood cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 claims description 8
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 8
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 3
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 2
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 2
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 2
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 2
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 2
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- NVFFTUNXYBICLV-UHFFFAOYSA-N 2-[methyl(trihydroxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(O)(O)N(C)CC(O)=O NVFFTUNXYBICLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000537222 Betabaculovirus Species 0.000 description 1
- HIYAVKIYRIFSCZ-CVXKHCKVSA-N Calcimycin Chemical compound CC([C@H]1OC2([C@@H](C[C@H]1C)C)O[C@H]([C@H](CC2)C)CC=1OC2=CC=C(C(=C2N=1)C(O)=O)NC)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-CVXKHCKVSA-N 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001754 blood buffy coat Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N calcium ionophore A23187 Natural products N=1C2=C(C(O)=O)C(NC)=CC=C2OC=1CC(C(CC1)C)OC1(C(CC1C)C)OC1C(C)C(=O)C1=CC=CN1 HIYAVKIYRIFSCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- DLEDLHFNQDHEOJ-CSWXFLMBSA-N mezerein Chemical compound O([C@@H]1[C@H]([C@@]23[C@H]4[C@](C(C(C)=C4)=O)(O)[C@H](O)C4(CO)O[C@H]4[C@H]3[C@H]3OC(O2)(O[C@]31C(C)=C)C=1C=CC=CC=1)C)C(=O)\C=C\C=C\C1=CC=CC=C1 DLEDLHFNQDHEOJ-CSWXFLMBSA-N 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 1
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4721—Lipocortins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
Description
A találmány tárgya eljárás leukokinek fokozott menynyiségű előállítására oly módon, hogy az indukció és a termelés különböző pH- és/vagy hőmérsékleti értékek mellett történik.The present invention relates to a process for the increased production of leucokines by induction and production at various pH and / or temperature values.
A leukokinek fontos szerepet játszanak az élő szervezetek sejtjei, szövetei közötti kapcsolatban, működésük szabályozásában. A „leukokin” fogalom jelentése kiterjed minden olyan biológai aktivitással rendelkező molekulára, vagy molekulacsoportra, melyeket fehérvérsejtek állítanak elő és adott esetben a környezetükbe választanak ki. Ezek a teljesség igénye nélkül a következők lehetnek: interleukinok, interferonok, lipokortin.Leucokines play an important role in regulating the functioning of cells and tissues in living organisms. The term "leucokine" is intended to encompass any molecule or group of molecules having biological activity that is produced by white blood cells and optionally secreted into their environment. These include, but are not limited to, interleukins, interferons, lipocortin.
A fehérvérsejtek in vitro körülmények között is képesek leukokinek termelésére megfelelő indukáló szerek (például vírusok, lektinek, mitogének, dexametazon, forbol-észterek, ionofórok, szintetikus RNS-ek stb.) hatására. így vannak olyan eljárások, amelyek segítségével ipari méretekben lehet biológiailag aktív természetes anyagokat előállítani, ill. a sejtekkel termeltetni (géntechnológiai eljárások).White blood cells are also capable of producing leukocytes under in vitro conditions with appropriate inducing agents (e.g. viruses, lectins, mitogens, dexamethasone, phorbol esters, ionophores, synthetic RNAs, etc.). Thus, there are processes for the production and commercialization of biologically active natural materials on an industrial scale. cultured with cells (genetic engineering).
A leukokinek előállítása „természetes úton” is végezhető a géntechnológiai eljárások mellett. A természetes módszereknél az emberi vagy állati fehérvérsejtekhez inducereket adnak, és a tápoldatban élő sejtek ezek hatására termelik a leukokineket, és ezek a közegből kinyerhetők. így módszert írtak le lipolkortin előállítására glükokortikoid inducerrel [B. Rothhut et al: FEBS Lett. 279, 169 (1987)], B-sejt stimuláló faktor (IL-4) előállítására PMA inducerrel [Hu-Li, J. et al: J. Exp. Med. 765,157 (1987)], interleukin-2 előállítására ConA inducerrel [Kató K. et al: Biochem, Biophys, Rés, Commun. 727,182 (1985)], alfa-interferon előállítására Sendai-vírus inducerrel [Cantell, K. et al: Methods Enzymol 72, 29 (1981)] stb.The production of leucokines can also be done "naturally" in addition to genetic engineering. In natural methods, inducers are added to human or animal white blood cells, and the cells living in the culture medium thereby produce leucokines and can be recovered from the medium. Thus, a method for the preparation of lipolortin with a glucocorticoid inducer [B. Rothhut et al: FEBS Lett. 279, 169 (1987)], for the production of B-cell stimulating factor (IL-4) with PMA inducer (Hu-Li, J. et al., J. Exp. Med. 765, 157 (1987)), for the production of interleukin-2 with ConA inducer. Kató K. et al., Biochem, Biophys, Rés, Commun. 727,182 (1985)], for the preparation of interferon alpha with Sendai virus inducer (Cantell, K. et al., Methods Enzymol 72, 29 (1981)), etc.
A fent ismertetett eljárások közös sajátsága, hogy az indukció (indukciós fázis) és a leukokinek termelése (termelési fázis) azonos körülmények (állandó pH, hőmérséklet, indueer-koncentráciő) között történik.A common feature of the above-described processes is that the induction (induction phase) and the production of leucokines (production phase) are carried out under the same conditions (constant pH, temperature, induer concentration).
A találmány célja eljárás kidolgozása nem osztódó, szakaszos tenyészetben fenntartott fehérvérsejtek által termelt leukokinek hozamának' fokozására.SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method for increasing the yield of leukocytes produced by white blood cells maintained in non-dividing culture.
A leukokinek hozamának fokozására egyik lehetséges út a leukokin-szintézist gátló tényezők hatásának csökkentése, illetve a „feed-back” mechanizmus késleltetése.One of the possible ways to increase the yield of leucokines is to reduce the effect of inhibitors of leucokin synthesis and to delay the feed-back mechanism.
A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy nem osztódó, szakaszos tenyészetben fenntartott fehérvérsejtek esetében a leukokin termelést szabályozó „feedback” mechanizmus késleltethető, ha az indukciót és a termelést nem azonos - az indukció szempontjából optimális - körülmények mellett, hanem a termelést megfelelően megválasztott szuboptimális körülmények között végezzük (lásd 1. ábra). A leukokin bioszintézis exponenciális szakaszát követően felerősödnek azok a biokémiai folyamatok, melyek a szintézis lassulása irányába hatnak (feed-back). A leukokin bioszintézis az exponenciális szakaszt követő lineáris szakasztól kezdve kevésbé érzékeny az inkubálási körülmények megváltoztatására és kevésbé kerül gátlás alá, mint amennyire a szintézist fékező folyamatok gátlódnak. így alkalmas módosítással - a hőmérséklet csökkentésével és/vagy pH-változtatással, valamint a változtatás időpontjának megfelelő megválasztásával - a produkció időtartama jelentős mértékben meghosszabbítható.The present invention is based on the discovery that in non-dividing white blood cells maintained in batch culture, the feedback mechanism that regulates leukocine production can be delayed if induction and production are not under the same, optimum induction conditions, but are appropriately selected for suboptimal production. conditions (see Figure 1). Following the exponential phase of leucokine biosynthesis, the biochemical processes that act to slow the synthesis (feed-back) intensify. From the linear phase following the exponential phase, leucokin biosynthesis is less sensitive to alteration of incubation conditions and less inhibited than inhibition of synthesis-inhibiting processes. Thus, by suitable modification, by reducing the temperature and / or changing the pH and choosing the appropriate time of change, the duration of the production can be significantly extended.
A találmány szerinti eljárásban az inkubálási körülményeket, így a hőmérsékletet és/vagy pH-t az exponenciális szakaszban megváltoztatjuk, mégpedig csökkentjük, s ezáltal a gátló folyamatok hatása késleltethető és a hozam mintegy kétszeresére növelhető.In the process of the invention, the incubation conditions, such as temperature and / or pH, are altered during the exponential phase, thereby reducing the effect of inhibitory processes and increasing the yield by about twice.
A fentiek alapján a találmány eljárás interferonok, interleukinok és Üpokortin fokozott mennyiségű előállítására buffy-coat tisztításával kapott, nem osztódó, szakaszos tenyészetben fenntartott fehérvérsejtek megfelelő tápoldatban megfelelő inducerrel történő kezelése útján, amely abban áll, hogy az inkubációs pH-t és/vagy hőmérsékletet a leukokinszintézis megindulását követően, annak exponenciális szakaszában csökkentjük.Accordingly, the present invention provides a process for the production of an increased amount of interferons, interleukins and Üpocortin by treating buffy coat non-dividing white blood cells retained in batch culture with an appropriate nutrient medium comprising adjusting the incubation pH and / or temperature. after the initiation of leucokin synthesis, in the exponential phase.
A fent leírt felismerésünk rendszeres, üzemi méretű termelés esetében is igaznak bizonyult, így eljárásunk alkalmazásával jelentős mértékben - mintegy kétszeresére - növelhető a fehérvérsejtek in vitro körülmények közötti leukokin-hozama.Our discovery, as described above, has been found to be true for regular, commercial-scale production, so that our method significantly increases leukocyte yield of leukocytes in vitro, about two-fold.
A találmány szerinti eljárásban előnyösen úgy járunk el, hogy alfa-inteferon termelés esetén a hőmérsékletet és pH-t is csökkentjük célszerűen 32 ’C-ra, illetve 7-es értékre és ezen megváltoztatott körülmények között további 10-20 órán át folytatjuk az inkubálásL Gammainterferon és interleukin-2 termelés esetén elegendő a hőmérséklet csökkentése, mégpedig célszerűen 30 ’Cra, függetlenül attól, hogy milyen inducert használunk.Preferably, the process of the present invention is carried out by reducing the temperature and pH to 32 ° C and 7, respectively, in the presence of interferon alpha, and incubating the gammainterferon for another 10-20 hours under these changed conditions. and in the case of interleukin-2 production, it is sufficient to reduce the temperature, preferably to 30 'C, whatever inducer is used.
Lipokortin termelés esetében célszerűen úgy járunk el, hogy 2 órás indukciós periódus után (37 ‘C-on) a hőmérsékletet 28 ’C-ra csökkentjük és az inkubálási ezen a hőmérsékleten folytatjuk további 15-20 órán át. A fehérvérsejteket a tápoldatból centrifugálással távolijuk el, majd meghatározzuk a felülúszó leukokin-tartalmát. Lipokortin esetén a felülúszó gyulladásgátló hatását határoztuk meg kanragenin ödéma teszten.For lipocortin production, it is convenient to lower the temperature to 28 'C after an induction period of 2 hours (at 37' C) and continue incubation at this temperature for an additional 15-20 hours. The white blood cells are removed from the culture medium by centrifugation and the supernatant leukocin content is determined. In the case of lipocortin, the anti-inflammatory activity of the supernatant was determined in a canragenin edema test.
A találmány szerinti eljárás előnye, hogy a kapott termékek összetételében változás nem lép fel, állandó minőségű és növelt mennyiségű biológiailag aktív termékek állíthatók elő ipari méretben is.The process according to the invention has the advantage that the composition of the obtained products does not change, and constant quality and increased quantities of biologically active products can be prepared on an industrial scale.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk.The invention is illustrated by the following examples, which are not intended to limit the invention in any way.
1. példaExample 1
Humán leukocita alfa-interferon termelés a Cantell-féle referencia eljárás szerint [Methods Enzymol. 72, 29 (1981)]Human leukocyte alpha interferon production according to the Cantell reference procedure [Methods Enzymol. 72, 29 (1981)].
A friss emberi vérből származó fehérvérsejtdús frakciót (buffy coat) a szennyező vörösvértestektől többszöri, 0,83%-os ammónium-klorid-oldattal történő hemolízissel megtisztítjuk, majd az így nyert fehérvérsejteket Cantell-féle tápoldatban, amely ásványi sókat és glküzót, valamint gamma-globulinmentes humán szérumot 2,5 mg/ml koncentrációban tartalmaz és pH-ja 7,2-7,4, szuszpendáljuk lxlO7 sejt/ml koncentrációban.The buffy coat fraction of fresh human blood is purified from contaminating erythrocytes by repeated hemolysis with 0.83% ammonium chloride solution, and the resulting white blood cells in Cantell's medium containing mineral salts and gamma- human serum globulin in a concentration of 2.5 mg / ml and a pH of 7.2-7.4, lxlO suspended at a concentration of 7 cells / ml.
A szuszpenzuióhoz 200IU humán leukocita alfa-interferont adunk milliliterenként, majd 37 ’C-on 2 órán át inkubáljuk. A sejtekhez 100 HAegység/ml Sendai-vírust adunk és 37 ‘C-on minimum 20 órán át inkubáljuk.To the suspension is added 200 µl / ml human leukocyte alpha interferon and incubated at 37 ° C for 2 hours. The cells are supplemented with 100 HAU / ml Sendai virus and incubated at 37 ° C for a minimum of 20 hours.
Az inkubálási idő elteltével a tápoldatból a fehérvérsejteket centrifugálással eltávolítjuk. A kapott alfa-interferon termék aktivitása: 9x10* IU/ml W. E. Stewart szerint mérve [The Interferon System, 13. o., SpringerVcrlag, Wien, New York (1979)].After the incubation time, white blood cells are removed from the medium by centrifugation. The activity of the resulting alpha-interferon product was 9x10 * IU / ml as measured by W.E. Stewart (The Interferon System, p. 13, Springer Vcrlag, Vienna, New York, 1979).
HU 202 594 ΒHU 202 594 Β
2. példaExample 2
Humán leukocita alfa-interferon termelés fokozása az inkubálási pH és hőmérséklet változtatásávalEnhance human leukocyte alpha interferon production by changing incubation pH and temperature
Azonos módon járunk el, mint az 1. példánál, azzal a különbséggel, hogy a Sendai-vírus hozzáadását követő 5The procedure is the same as in Example 1, except that after the addition of the Sendai virus,
2. órában a sejtszuszpenziót tartalmazó edényekbe annyi tricin/N-trisz-[hidroxi-metil]-metil-glicin/-puffert (gyártó: Sigma) adagolunk, hogy a pH 7,0 legyen, továbbá a hőmérsékletet 32 ’C-ra csökkentjük. (Megjegyzendő, hogy a tricin-puffer az eredeti Cantell-féle eljá- 10 rásnál is szerepel a tápoldatban.) Az inkubálást ezen megváltoztatott körülmények között további 10-20 órán át folytatjuk. A sejtek elválasztása után a felülúszó Ι,δχΙΟ5 IU/ml alfa-interferont tartalmaz.At 2 hours, tricine / N-tris-hydroxymethyl-methylglycine / buffer (manufactured by Sigma) was added to the cell suspension wells to bring the pH to 7.0 and the temperature was lowered to 32 ° C. . (Note that the tricine buffer is also present in the culture medium in the original Cantell procedure.) Incubation is continued under these changed conditions for an additional 10-20 hours. After cell separation, the supernatant contains Ι, δχΙΟ 5 IU / ml interferon alpha.
3. példaExample 3
Humán leukocita gamma-interferon és interleukin-2 termelés fokozása az inkubálási hőmérséklet és a pH változtatásával 20Enhancement of human leukocyte interferon gamma and interleukin-2 production by changing incubation temperature and pH 20
A gamma-IFN és az interleukin-2 egyidejűleg előállítható azonos sejtkultúrában.Gamma IFN and interleukin-2 can be produced simultaneously in the same cell culture.
A termeléshez mind friss buffy coatból nyert, mind az α-IFN termelésben már felhasznált fehérvérsejtek alkalmazhatók. A fehérvérsejt-szuszpenzió előállítása azo- 25 nos módon történik az 1. példában leírtakkal.White blood cells obtained from fresh buffy coat and already used in α-IFN production can be used for production. The white blood cell suspension is prepared in the same manner as in Example 1.
A fehérvérsejteket 1 mg/ml humán gammaglobulinmentes szérumot is tartalmazó MSKD-tápoldatban szuszpendáljuk, l-2xl07 sejt/ml koncentrációban.White blood cells are suspended in MSKD medium containing 1 mg / ml human gamma globulin-free serum at a concentration of 1 to 2x10 7 cells / ml.
Az MSKD jelű tápoldat összetétele és készítésének le- 30 írása a 184 972 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban található meg. Az indukciót 15 pg/ml concanavalin A-val 37 ’C-on végezzük. Az indukciót közel azonos eredménnyel végezhetjük még 1-10 ng/ml fitohemagglutininnel, vagy 20-100 ng/ml mezereinnel, vagy 35 0,5-2 pg/ml A 23187 jelzésű kereskedelmi néven „calcimycin” ionofórral, vagy 5-30 ng/ml forbol-mirisztát-acetát alkalmazásával is. Az inducer hozzáadását követően három óra elteltével a fehérvérsejteket tartalmazó lombikot 30 ’C-os termosztátba helyezzük és a pH érté- 40 két 1(2-k állítjuk be, majd inkubáljuk. Az inkubációs idő elteltével a sejteket a tápoldatbói centrifugálással távolítjuk el. A tápoldat 10 000IU gamma-interferont és 800 IU IL-2-t tartalmaz milliliterenként.The composition and the preparation of MSKD medium are described in Hungarian Patent Application No. 184,972. Induction was performed with 15 pg / ml concanavalin A at 37 'C. Induction can be achieved with almost the same result with 1-10 ng / ml phytohemagglutinin, or 20-100 ng / ml meserein, or with 0.5-2-2 pg / ml of the commercially available calcimycin ionophore, or 5-30 ng / ml. ml of phorbol myristate acetate. Three hours after the addition of the inducer, the flask containing the white blood cells was placed in a 30 ° C thermostat and the pH was adjusted to 1 (2) and incubated. After incubation, the cells were removed from the medium by centrifugation. It contains 10,000 IU of interferon gamma and 800 IU of IL-2 per milliliter.
4. példaExample 4
Lipokortin termelés fokozása az inkubálási hőmérséklet változtatásávalIncreasing lipocortin production by changing incubation temperature
Friss emberi vérből származó buffy coat-ot a szennyező vörösvértestektől többszöri 0,83%-os ammónium-kloridos hemolízissel megtisztítunk, majd az így nyert tiszta fehérvérsejt frakciót 107 sejt/ml koncentrációban szérumot nem tartalmazó tápoldatba szuszpendáljuk, majd 1 pM decametazonnal kezelve 2 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. Ezt követően az inkubálási hőmérsékletet 28 ’C-ra csökkentjük. Az inkubálást ezen a hőmérsékleten további 15-20 órán át folytatjuk. Ezután a fehérvérsejteket centrifugálással eltávolítjuk a tápoldatból. Az így nyert felülúszónak, amely egy nyers lipokortin-készítmény, erős karragenin-gyulladásgátló hatása van. A példa szerint eljárva a kapott lipokortin tennék karragenín-teszten mért gyuliadásgátló hatása 2-szerese az azonos indukciós és termelési körülmények között nyert lipokortinénak.Fresh human blood buffy coat was purified from contaminating erythrocytes by repeated 0.83% ammonium chloride hemolysis, and the resulting pure white blood cell fraction was suspended in 10 7 cells / ml of serum-free medium and treated with 1 µM decamethasone for 1 hour. incubate at 37 ° C. The incubation temperature was then reduced to 28 ° C. The incubation was continued at this temperature for an additional 15-20 hours. The white blood cells are then removed from the medium by centrifugation. The resulting supernatant, which is a crude lipocortin formulation, has a strong carrageenan anti-inflammatory activity. By way of example, the resulting lipocortin product had an anti-inflammatory activity 2 times that of lipocortin obtained under the same induction and production conditions as measured by the carrageenan test.
Claims (2)
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU881049A HU202594B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for increasing yield of leucoquines |
| IT8919632A IT1229193B (en) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | PROCEDURE FOR INCREASING THE YIELD OF CITOCINE. |
| AT481/89A AT392800B (en) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | METHOD FOR INCREASING THE EXPLOITATION OF CYTOKINES |
| JP1050209A JPH0724595B2 (en) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | Method for producing cytokine |
| CN89102021.7A CN1036794A (en) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | A kind of method that increases yield of cytokins |
| DE3907114A DE3907114A1 (en) | 1988-03-04 | 1989-03-06 | Process for the preparation of cytokines |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU881049A HU202594B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for increasing yield of leucoquines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT50218A HUT50218A (en) | 1989-12-28 |
| HU202594B true HU202594B (en) | 1991-03-28 |
Family
ID=10952631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU881049A HU202594B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for increasing yield of leucoquines |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0724595B2 (en) |
| CN (1) | CN1036794A (en) |
| AT (1) | AT392800B (en) |
| DE (1) | DE3907114A1 (en) |
| HU (1) | HU202594B (en) |
| IT (1) | IT1229193B (en) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2906160A1 (en) * | 1979-02-17 | 1980-09-04 | Thomae Gmbh Dr K | Interferon prodn. - using stimulators to increase yields |
| US4357422A (en) * | 1980-08-14 | 1982-11-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Method of enhancing interferon production |
| JPS57105195A (en) * | 1980-10-24 | 1982-06-30 | Nat Res Dev | Production of interferon |
| JPS6296083A (en) * | 1985-10-21 | 1987-05-02 | Toray Ind Inc | Culture of antimal cell |
-
1988
- 1988-03-04 HU HU881049A patent/HU202594B/en not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-03-03 JP JP1050209A patent/JPH0724595B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-03 IT IT8919632A patent/IT1229193B/en active
- 1989-03-03 CN CN89102021.7A patent/CN1036794A/en active Pending
- 1989-03-03 AT AT481/89A patent/AT392800B/en not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 DE DE3907114A patent/DE3907114A1/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA48189A (en) | 1990-11-15 |
| DE3907114A1 (en) | 1989-09-14 |
| IT8919632A0 (en) | 1989-03-03 |
| IT1229193B (en) | 1991-07-25 |
| HUT50218A (en) | 1989-12-28 |
| DE3907114C2 (en) | 1991-12-19 |
| CN1036794A (en) | 1989-11-01 |
| AT392800B (en) | 1991-06-10 |
| JPH0724595B2 (en) | 1995-03-22 |
| JPH01281095A (en) | 1989-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6159712A (en) | Methods for enhancing the production of interferon in cell culture | |
| US4376821A (en) | Production of human IFN-gamma (immune) interferon | |
| KR920006868B1 (en) | Method for producing interferons | |
| US4357422A (en) | Method of enhancing interferon production | |
| US4376822A (en) | Production of human IFN- γ (immune) interferon | |
| Paul | Quiescent SV40 virus transformed 3T3 cells in culture | |
| Doudney | Macromolecular synthesis in bacterial recovery from ultra-violet light | |
| EP0017570A1 (en) | Process for the preparation of interferon and culture medium composition used in it | |
| WO1998006822A1 (en) | Culture medium and use of the same | |
| US4680261A (en) | Process for producing interferon | |
| HU202594B (en) | Process for increasing yield of leucoquines | |
| US5468635A (en) | In vitro method for stimulating cell growth by culturing cells in a serum-free culture medium comprising human lysozyme | |
| Samuel et al. | Mechanism of interferon action. Kinetics of decay of the antiviral state and protein phosphorylation in mouse fibroblasts treated with natural and cloned interferons. | |
| HU189706B (en) | Improved process for the production of interferon | |
| Curriden et al. | Inhibition of growth of proline‐requiring Chinese hamster ovary cells (CHO‐K1) resulting from antagonism by a system amino acids | |
| US4452893A (en) | Cell growth medium supplement | |
| JPS6251114B2 (en) | ||
| Lucki-Lange et al. | Conditions for the production of recombinant IL-2 in stirred suspension culture using a protein free medium | |
| Hirai et al. | Characterization of a human basophil-like cell promoting activity. | |
| JP2990805B2 (en) | Serum-free medium, method for culturing animal cells, and method for producing heterologous protein | |
| Sugama et al. | 2‐Mercaptoethanol acts at the restricted stage of interleukin‐2 dependent lymphocyte proliferation | |
| US6855519B2 (en) | Methods for enhancing the production of interferon in cell culture | |
| JP2749011B2 (en) | Cells that can be subcultured in serum-free medium and method for obtaining the same | |
| CA2354025C (en) | Modification of interferon alpha production | |
| JPS63196268A (en) | Transformant cell capable of being subjected to passage multiplication in serum-free medium, breeding thereof and production of protein by said cell |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HC9A | Change of name, address |
Owner name: EGIS GYOGYSZERGYAR NYRT., HU Free format text: FORMER OWNER(S): EGIS GYOGYSZERGYAR, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |