DE3907114A1 - Process for the preparation of cytokines - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cytokinen in erhöhter Ausbeute.The invention relates to a method for manufacturing of cytokines in increased yield.
Die Cytokine spielen in den Beziehungen zwischen den Geweben und Zellen des lebenden Organismus, in der Regelung ihrer Funktion eine wichtige Rolle. Der Begriff "Cytokin" umfaßt alle biologisch aktiven Moleküle oder Molekülgruppen, die von lebenden Zellen hergestellt und dann in die Umgebung ausgeschieden werden. Ohne jeden Anspruch auf Vollständigkeit seien als Beispiele die folgenden genannt: Interleucine, Interferone, Lipocortin und Tumornekrosefaktor.The cytokines play in the relationships between the Tissues and cells of the living organism, in the scheme an important role in their function. The term "Cytokine" includes all biologically active molecules or Molecular groups made by living cells and then be excreted into the environment. Without any claim for completeness, the following are examples called: Interleucine, Interferone, Lipocortin and tumor necrosis factor.
Die lebenden Zellen vermögen auch unter in vitro-Bedingungen Cytokine zu erzeugen, wenn sie dazu durch entsprechende Induktionsmittel, wie Viren, Lektine, Mitogene, Dexamethason, Phorbolester, Ionophore und synthetische RNA, induziert werden. Auf diese Weise können mit einem geeigneten Verfahren biologisch aktive natürliche Stoffe in technischem beziehungsweise industriellem Maßstab hergestellt werden.The living cells are also able to function under in vitro conditions Generate cytokines if done through appropriate Induction agents, such as viruses, lectins, mitogens, Dexamethasone, phorbol esters, ionophores and synthetic RNA can be induced. That way, with one suitable processes biologically active natural substances manufactured on a technical or industrial scale will.
Neben gentechnologischen Verfahren sind zur Herstellung der Cytokine auch sogenannte natürliche Verfahren bekannt. Bei den natürlichen Verfahren wird den menschlichen oder tierischen Zellen ein Induktionsmittel zugesetzt, durch dessen Wirkung die in der Nährlösung lebenden Zellen Cytokine erzeugen, die dann aus dem Medium abgetrennt werden können. Ein solches Verfahren, bei welchem Glycocorticoid als Induktionsmittel verwendet wird, ist zur Herstellung von Lipocortin beschrieben worden (B. Rothhut und Mitarbeiter: FEBS Lett. 219 [1987], 169). Zur Herstellung des zellstimulierenden Faktors B (IL-4) wird mit PMA (Hu-Li, J. und Mitarbeiter: J. Exp. Med. 165 [1987], 157), zur Herstellung von Interleucin 2 mit ConA (Kato K. und Mitarbeiter: Biochem. Biophys. Res. Commun. 127 [1985], 182), zur Herstellung von α-Interferon mit Sendei-Viren (Cantell, K. und Mitarbeiter: Methods Enzymol. 72 [1981], 29), induziert.In addition to genetic engineering processes, so-called natural processes are also known for producing the cytokines. In the natural methods, an induction agent is added to the human or animal cells, through the action of which the cells living in the nutrient solution produce cytokines which can then be separated from the medium. Such a method, in which glycocorticoid is used as an induction agent, has been described for the production of lipocortin (B. Rothhut and co-workers: FEBS Lett. 219 [1987], 169). For the production of the cell stimulating factor B (IL-4) with PMA (Hu-Li, J. and co-workers: J. Exp. Med. 165 [1987], 157), for the production of interleucine 2 with ConA (Kato K. and Co-workers: Biochem. Biophys. Res. Commun. 127 [1985], 182), for the production of α- interferon with Sendei viruses (Cantell, K. and co-workers: Methods Enzymol. 72 [1981], 29).
Den aufgeführten Verfahren ist gemeinsam, daß die Induktion und die Erzeugung der Cytokine unter identischen Bedingungen durchgeführt werden. Im allgemeinen werden Cytokine in der Weise hergestellt, daß die entsprechenden Zellen mit einem geeigneten Induktionsmittel behandelt und dann eine bestimmte Zeit lang bebrütet werden. Die in die umgebende Nährlösung abgegebenen Cytokine können dann nach einer geeigneten Verfahrensweise abgetrennt werden.The listed methods have in common that the induction and the generation of the cytokines among identical Conditions. Generally will Cytokines produced in such a way that the corresponding Treated cells with a suitable induction agent and then be incubated for a period of time. The in the cytokines released into the surrounding nutrient solution can then be a suitable procedure are separated.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Cytokinen, durch welches diese durch Beseitigung der die Cytokinsynthese hemmenden Faktoren in höherer Ausbeute erhalten werden können, zu schaffen.The invention has for its object a method for the production of cytokines by which these by eliminating the factors that inhibit cytokine synthesis can be obtained in higher yield.
Das Obige wurde überraschenderweise durch die Erfindung erreicht.The above was surprisingly accomplished by the invention reached.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß unter Bedingungen, welche für die Induktion optimal sind, auch die die Erzeugung regelnden Hemmfaktoren schneller entstehen, dem jedoch durch geeignete Modifizierung der Bedingungen entgegenwirkt werden kann.The invention is based on the surprising finding that that under conditions which are optimal for induction are also the inhibiting factors regulating production emerge more quickly, but through appropriate modification the conditions can be counteracted.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Cytokinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die Induktion und Erzeugung bei unterschiedlichen pH- und/oder Temperaturwerten durchgeführt werden. The invention therefore relates to a method for Production of cytokines, which is characterized is that the induction and generation at different pH and / or temperature values are carried out.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Ausbeute an Cytokinen verschiedener Zellen in vitro bedeutend erhöht werden.With the method according to the invention, the yield on cytokines of different cells significantly increased in vitro will.
Vorzugsweise wird beziehungsweise werden während der Erzeugung der Bebrütungs-pH-Wert und/oder die Bebrütungstemperatur niedriger als während der Induktion gewählt. Besonders bevorzugt wird beziehungsweise werden während der Erzeugung ein pH-Wert von 7 und/oder eine Temperatur von 15 bis 40°C, ganz besonders 20 bis 35°C, vor allem 25 bis 32°C, eingestellt. Bei der vorangehenden Induktion und Bebrütung wird vorzugsweise der pH-Wert zu etwa 7,2 bis 7,4, das heißt der physiologische pH-Wert, gewählt und/oder die Temperatur auf 35 bis 40°C, insbesondere 37°C, eingestellt. Zwingend ist jedoch, daß mindestens 1 dieser Parameter bei der Erzeugung anders, vorzugsweise niedriger, als bei der vorangehenden Induktion eingestellt wird.Preferably, during the Generation of the incubation pH and / or the incubation temperature lower than chosen during induction. Is or will be particularly preferred during generating a pH of 7 and / or one Temperature of 15 to 40 ° C, especially 20 to 35 ° C, especially 25 to 32 ° C, set. With the previous one Induction and incubation will preferably increase the pH about 7.2 to 7.4, i.e. the physiological pH, selected and / or the temperature to 35 to 40 ° C, in particular 37 ° C. However, it is imperative that at least 1 of these parameters different when generating, preferably lower than set for the previous induction becomes.
Aus eigenen Untersuchungen ergab sich, daß nach dem exponentiellen Abschnitt der Cytokin-Synthese die in Richtung einer Verlangsamung der Synthese wirkenden biochemischen Prozesse stärker werden. Die Cytokin-Synthese ist ab dem Beginn des exponentiellen Abschnittes weniger empfindlich gegen Änderungen der Umgebungsparameter, sie wird weniger gehemmt als die die Synthese bremsenden Prozesse. Auf diese Weise kann durch geeignete Modifizierung und durch geeignete Wahl des Zeitpunktes der Veränderung die Dauer der Erzeugung verlängert werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird beziehungsweise werden daher der pH-Wert und/oder die Bebrütungstemperatur im exponentiellen Abschnitt der Cytokin-Synthese verändert.From our own investigations it was found that after the exponential section of the cytokine synthesis heading towards a slowdown in synthesis acting biochemical Processes get stronger. The cytokine synthesis is less from the beginning of the exponential section sensitive to changes in environmental parameters, she is less inhibited than the processes that slow down synthesis. In this way, by appropriate modification and by appropriate selection of the time of the change the duration of production will be extended. According to a preferred Embodiment of the method according to the invention the pH value and / or the Incubation temperature in the exponential section of the Cytokine synthesis changed.
Nach einer anderen zweckmäßigen Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens wird beziehungsweise werden
der pH-Wert und/oder die Bebrütungstemperatur nach dem Beginn
der Cytokin-Synthese verändert.
According to another expedient embodiment of the method according to the invention, the pH and / or the incubation temperature is or are changed after the start of the cytokine synthesis.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated by the following examples explained in more detail.
Eine aus frischem menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Fraktion [buffy coat] wird durch mehrfach wiederholte Hämolyse mit einer 0,83 gew.-%igen Ammoniumchloridlösung von den begleitenden Erythrocyten befreit. Die gewonnenen Leukozyten werden in einem geeigneten Mineralsalze, Glucose und in einer Konzentration von 1 mg/ml gammaglobulinfreies menschliches Serum enthaltenden Nährmedium suspendiert, wobei eine Konzentration von 1.10⁷ Zellen/ml eingestellt wird.A leukocyte-rich human blood Fraction [buffy coat] is repeated several times Hemolysis with a 0.83% by weight ammonium chloride solution freed from the accompanying erythrocytes. The leukocytes obtained are in a suitable mineral salt, Glucose and in a concentration of Containing 1 mg / ml gamma globulin free human serum Culture medium suspended, with a concentration of 1.10⁷ cells / ml is set.
Zu der bei einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4, das heißt bei physiologischen pH-Wert, befindlichen Suspension werden pro ml 200 IE α-Interferon aus menschlichen Leukozyten gegeben, und der Ansatz wird bei 37°C 2 Stunden lang bebrütet. Dann werden Sendei-Viren in einer Menge von 100 HA-Einheiten (Hämagglutinin- Einheiten) pro ml zugesetzt und der Ansatz wird weitere 2 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Danach wird der Zellsuspension so viel TRIS.HCl-Puffer zugesetzt, daß sich ein pH-Wert von 7 einstellt. Die Suspension wird weitere 20 Stunden lang bebrütet. Anschließend werden die Leukozyten durch Zentrifugieren von der Nährlösung abgetrennt. Der antivirale Titer des auf diese Weise gewonnenen Interferons beträgt 200 000 IE/ml. Das ist das Doppelte von derjenigen Ausbeute, die ohne Puffern des pH-Wertes erzielt werden kann.200 ml of α- interferon from human leukocytes per ml are added to the suspension, which is at a pH of 7.2 to 7.4, that is to say at a physiological pH, and the mixture is stirred at 37 ° C. for 2 hours incubated. Then send egg viruses are added in an amount of 100 HA units (hemagglutinin units) per ml and the mixture is incubated at 37 ° C. for a further 2 hours. Then enough TRIS.HCl buffer is added to the cell suspension so that a pH of 7 is established. The suspension is incubated for an additional 20 hours. The leukocytes are then separated from the nutrient solution by centrifugation. The antiviral titer of the interferon obtained in this way is 200,000 IU / ml. This is twice the yield that can be achieved without buffering the pH.
γ-IFN und Interleucin 2 können in ein und derselben Zellkultur gleichzeitig hergestellt werden. Zur Produktion sind sowohl aus einer aus frischem menschlichem Blut stammenden, leukozytenreichen Fraktion (frischem buffy coat) gewonnene als auch zur IFN-Herstellung bereits einmal ausgenutzte Leukozyten geeignet. Die Suspension kann auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt werden. γ- IFN and interleucin 2 can be produced simultaneously in one and the same cell culture. Both leukocytes obtained from a fresh leukocyte-rich fraction (fresh buffy coat) and those already used for IFN production are suitable for production. The suspension can be prepared in the manner described in Example 1.
Die Leukozyten werden in einer an sich bekannten Nährlösung, die pro ml 1 mg gammaglobulinfreies menschliches Serum enthält, suspendiert, wobei eine Konzentration von 1 bis 2.10⁷ Zellen/ml eingestellt wird. Der pH-Wert beträgt etwa 7,2 bis 7,4, er ist also der physiologische, und bleibt bei der folgenden Induktion und Bebrütung so. Induziert werden kann mit 10 bis 20 µg/ml Concanavalin A (Merck Index, 10th Edition, 1983, Nr. 2460) beziehungsweise Concavalin A oder 1 bis 10 µg/ml Phytohämagglutinin oder 20 bis 100 g/ml Meserein oder 0,5 bis 2 µg/ml Ionophor A₂₃₁₈₇ oder 5 bis 30 ng/ml Phorbolmyristatacetat bei 37°C. Drei Stunden nach Zugabe des Induktionsmittels wird der Ansatz bei 30°C thermostatisiert, sein pH-Wert wird auf 7 eingestellt und der Ansatz bebrütet. Nach Ablauf der Bebrütungszeit werden die Leukozyten durch Zentrifugieren aus der Nährlösung entfernt. Das Produkt hat einen antiviralen γ-IFN-Titer von 15 000 IE/ml und einen IL-2-Titer von 1300 IE/ml. Das ist das 2 bis 2,5fache dessen, was erzielt werden kann, wenn bei konstanter Temperatur und ungepuffertem pH-Wert produziert wird.The leukocytes are suspended in a nutrient solution known per se which contains 1 mg of gamma-globulin-free human serum per ml, a concentration of 1 to 2.10⁷ cells / ml being set. The pH is about 7.2 to 7.4, so it is the physiological one, and remains so in the subsequent induction and incubation. Induction can be with 10 to 20 µg / ml Concanavalin A (Merck Index, 10 th Edition, 1983, No. 2460) or Concavalin A or 1 to 10 µg / ml phytohemagglutinin or 20 to 100 g / ml Meseinein or 0.5 to 2 µg / ml ionophore A₂₃₁₈₇ or 5 to 30 ng / ml phorbol myristate acetate at 37 ° C. Three hours after the addition of the induction agent, the batch is thermostatted at 30 ° C., its pH is adjusted to 7 and the batch is incubated. After the incubation period, the leukocytes are removed from the nutrient solution by centrifugation. The product has an antiviral γ- IFN titer of 15,000 IU / ml and an IL-2 titer of 1300 IU / ml. That is 2 to 2.5 times what can be achieved if production is carried out at constant temperature and unbuffered pH.
Eine aus frischem menschlichem Blut stammende, leukozytenreiche Fraktion (buffy coat) wird durch mehrfach wiederholte Hämolyse mit einer 0,83 gew.-%igen Ammoniumchloridlösung von den begleitenden Erythrozyten befreit. Die erhaltenen Leukozyten werden in einer Konzentration von 10⁷ Zellen/ml in einer kein Serum enthaltenden Nährlösung suspendiert, wobei sich ein pH-Wert von etwa 7,2 bis 7,4, das heißt der physiologische, einstellt und nach Zusatz von 1 µM Dexamethason 2 Stunden lang bei 37°C bebrütet. Anschließend wird die Bebrütungstemperatur auf einen Wert zwischen 30 und 32°C gesenkt. Bei dieser Temperatur wird weitere 15 bis 20 Stunden lang bebrütet. Dann werden die Leukozyten durch Zentrifugieren aus der Nährlösung entfernt. Der erhaltene Überstand (rohes Lipocortin-Präparat) hat am Carraghenin-Modell eine stark entzündungshemmende Wirkung (untersucht am durch Carraghenin hervorgerufenen Pfotenödem von Ratten nach Winter et al.: Prac. Soc. Exp. Biol. Med. 111, 544 [1962]). Das bei nicht konstanter Temperatur erzeugte Lipocortin hat eine 2 bis 2,5mal so starke Wirkung wie das bei konstanter Temperatur hergestellte Präparat.A leukocyte-rich human blood Fraction (buffy coat) is repeated several times Hemolysis with a 0.83% by weight ammonium chloride solution freed from the accompanying erythrocytes. The received Leukocytes are in a concentration of 10⁷ Cells / ml in a nutrient solution containing no serum suspended, with a pH of about 7.2 to 7.4, that is the physiological, adjusts and after adding 1 µM dexamethasone 2 hours incubated for long at 37 ° C. Then the incubation temperature reduced to a value between 30 and 32 ° C. At this temperature it will take another 15 to 20 hours long incubated. Then the leukocytes are centrifuged removed from the nutrient solution. The supernatant obtained (crude lipocortin preparation) has the carraghenin model a strong anti-inflammatory effect (examined on by Carraghenin-induced paw edema of rats after winter et al .: Prac. Soc. Exp. Biol. Med. 111, 544 [1962]). That at Lipocortin has a constant temperature 2 to 2.5 times the effect as that with constant Temperature-prepared preparation.
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