DE60019411T2

DE60019411T2 - Phage-abhängige superproduktion von biologisch aktiven proteinen und peptiden

Info

Publication number: DE60019411T2
Application number: DE60019411T
Authority: DE
Inventors: A. Vitaliy KORDYUM; I. Svetlana CHERNYKH; Y. Irina SLAVCHENKO; F. Oleksandr VOZIANOV
Original assignee: Phage Biotechnology Corp
Current assignee: Cardiovascular Bio Therapeutics inc Las Vega Us; Phage Biotechnology Corp
Priority date: 1999-05-25
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: WO2000071731A1; US6794162B2; EP1180153B1; JP2003500059A; ATE293170T1; DE60019411D1; AU5049100A; US6268178B1; EP1180153A1; US20010044133A1

Description

Grundlagen der Erfindung
Erfindungsgebiet
Diese Erfindung betrifft die rekombinante DNA-Technologie und insbesondere ein neues Verfahren zur Steigerung der Produktion heterologer Proteine in bakteriellen Wirtszellen. Das offengelegte Verfahren umfasst das Infizieren von Wirtszellen, die ein das Gen von Interesse codierendes Plasmid enthalten, mit dem Bakteriophagen λ, um die Lyse der bakteriellen Wirtszellen zu induzieren. Eine Superproduktion kann in selektierten Wirtszellen erreicht werden, wenn sowohl das Plasmid als auch der Phage λ jeweils mindestens eine Kopie der heterologen DNA tragen.
Beschreibung der verwandten Techniken
Zurzeit ermöglichen gentechnische Verfahren die Bildung von Mikroorganismenstämmen, die in der Lage sind, wesentliche Mengen unterschiedlicher bioaktiver Substanzen mit wichtigen Anwendungen in der Medizin und Industrie zu produzieren. Typischerweise werden Plasmid-Vektoren verwendet, in die ein heterologes Gen inseriert worden ist, um bakterielle Wirtszellen zu transformieren. Verschiedene E. coli-Stämme werden häufig als Empfängerzellen verwendet. Unter Verwendung derartiger Plasmidabhängiger Transformationsverfahren sind E. coli-Stämme hergestellt worden, um eine Reihe wertvoller humaner Peptide und Proteine, einschließlich Insulin, γ-Interferon, mehrerer Interleukine, Superoxidismutase, Plasminogen-Aktivator, Tumor-Nekrose-Faktor, Erythropoietin etc. zu produzieren. Diese Substanzen werden entweder bereits in der medizinischen Praxis verwendet oder unterliegen unterschiedlichen Stadien klinischer Prüfungen.
Allerdings besitzt das Plasmidverfahren schwerwiegende Nachteile. Es ist technisch kompliziert, da das gewünschte Produkt nach der Biosynthese aus den Bakterienzellen extrahiert werden muss, was ein mehrstufiger Prozess ist. Zum Beispiel beinhaltet die Interferon-Extraktion die Zerstörung der Zellen, Pufferextraktion, Polyethylen-Imin-Behandlung, Klärung, Ammoniumsulfat-Fällung, Dialyse und Zentrifugation (Goeddel, EP 0043980 ). Die Notwendigkeit derartiger Extraktions- und Reinigungsschritte kompliziert nicht nur die Produktionstechnologie des rekombinanten Produkts, sondern führt ebenfalls zu wesentlichen Verlusten, besonders während der Industriellen Produktion im Großmaßstab.
Ein weiterer komplizierender Faktor ist, dass bei relativ hohen Expressionslevels der klonierten Gene, die gebildeten eukaryotischen Proteine dazu neigen, als unlösliche Aggregate, die häufig mit Zellmembranen assoziiert sind, im Cytoplasma von E. coli zu akkumulieren. Folglich müssen die oben diskutierten bereits schwierigen Extraktions- und Reinigungsverfahren mit zusätzlichen technischen Verfahren wegen der Extraktion der unlöslichen Einschlussköper ergänzt werden. Normalerweise werden unlösliche Proteine mit Hilfe ionischer Detergentien, wie beispielsweise SDS oder Laurylsarkosin, mit ansteigenden Temperaturen oder in Gegenwart von Denaturierungsmittel wie beispielsweise 8 M Harnstoff oder 6–8 M Guanidin-HCL solubilisiert.
Häufig beinhaltet der letzte Reinigungsschritt die Renaturierung und Reoxidation der solubilisierten Polypeptide, was für die Wiederherstellung der funktionalen Aktivität benötigt wird. Disulfidbindungen, die für eine korrekte Faltung des Proteins in seine native Konformation notwendig sind, müssen neu gebildet werden. Renaturierungsverfahren wie beispielsweise Disulfidaustausch können teure und relativ toxische Reagenzien wie Glutathion und oxidierter 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol benötigen. Außerdem kann die endgültige Ausbeute bioaktiver gentechnischer Proteine relativ gering sein. Darüber hinaus kann die Gegenwart von selbst geringsten Konzentrationen von toxischen Reagenzien, die zur Solubilisierung und dann zur Neubildung der Sekundär- oder Tertiärproteinstruktur benötigt werden, eine nachfolgende klinische Anwendung der Proteine verhindern. Folglich kompliziert die Bildung des Zielproteins in Form von unlöslichen Einschlusskörpern innerhalb der bakteriellen Wirtszellen nicht nur die Produktion rekombinanter Proteine und führt zu einer verminderten Ausbeute, sondern kann ebenfalls das Endprotein für eine klinische Verwendung ungeeignet machen. (Fisher, B., Sumner, I., Goodenough, P. Biotech. und Bioeng. 41:3–13, 1993).
Die technischen Schwierigkeiten, die mit der Extraktion von Proteinen verbunden sind, die mittels der Expression heterologer Gene von Plasmid-transformierten bakteriellen Wirtszellen hergestellt werden, können durch Infektion der transformierten bakteriellen Wirtszellen mit einem Bakteriophagen, dessen lytischer Weg zu einer Lyse der Trägerzellen führt, überwunden werden. Folglich kann das gewünschte Protein einfach in das Kulturmedium freigesetzt werden (Breeze, A.S. GB 2 143 238A ). Demgemäß veröffentlicht Breeze ein Verfahren zur Steigerung der Ausbeute eines in E. coli produzierten Enzyms durch Infizieren der Bakterienzellen mit dem Phagen λ, der eine temperatursensitive Mutation in cI trägt, um eine kontrollierte Lyse bereitzustellen. Das cI-Gen Produkt ist ein Repressor der frühen Transkription und blockiert folglich die Transkription der späten Region der Phagen-DNA, die für den Zusammenbau von Kopf und Schwanz und Zelllyse benötigt wird. (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambroock, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Bakteriophagen, die eine temperatursensitive Mutation im cI-Gen tragen, sind in der Lage, das lysogene Stadium zu etablieren und so lange aufrecht zu halten, wie die Zellen bei einer Temperatur vermehrt werden, die dem cI-Genprodukt ermöglicht, die Transkription der für das lytische Wachstum notwendigen Phagen-Gene zu reprimieren. Dementsprechend können die transformierten bakteriellen Wirtszellen bei 30°C kultiviert werden, wobei die cI-vermittelte Suppression der Phagen DNA-Transkription andauert und der Phage im lysogenen Stadium verbleibt, bis das Stadium der maximalen Enzymproduktion erreicht ist. Danach kann die Kulturtemperatur auf 42°C für 30 Minuten erhöht werden, um den cI Repressor zu inaktivieren und dem Phagen den Start seiner lytischen Entwicklung zu erlauben. Die Wirtszellen werden dann für 2–3 Stunden bei 30°C inkubiert, um eine vollständige Lyse und Freisetzung des Enzyms zu ermöglichen (Breeze A.S., GB 2 143 238A ).
Obwohl Breeze die Freisetzung von Proteinen aus den bakteriellen Produktionszellen zeigt, ist es notwendig, die Produzenten bei Temperaturen zu kultivieren, die 30°C nicht übersteigen, was nicht die optimale Wachstumstemperatur für E. coli Zellen ist. Eine Synthese bei der optimalen Temperatur (37°C) ist nicht möglich, da Zellen bei Temperaturen über 32°C einer Lyse unterliegen, bevor das Stadium der maximaler Enzymanreicherung aufgrund der Entwicklung des temperatursensitiven lytischen Phagen erreicht wird. Ferner kann eine Inkubation der bakteriellen Wirtszellen bei 42°C für 30 min., wie von Breeze offengelegt, Proteasen aktivieren, die das Zielprotein zerstören.
Auerbach et al. (U.S. Patent Nr. 4.637.980) verwendet ein DNA-Fragment des Phagen λ zur Induktion der lytischen Freisetzung von rekombinanten Produkten. In diesem Verfahren wurde, wie bei Breeze, die temperatursensitive Mutation in dem λ cI-Genprodukt verwendet, um eine Temperatur-abhängige Lyse der bakteriellen Wirtszellen bereitzustellen. Das λ-DNA-Fragment bei Auerbach beinhaltet die funktionalen Endolysin codierende Gene N, Q, R und S zur Herstellung von Lysozym nach einer Inaktivierung des cI Repressors bei 42°C. Die meisten der verbliebenen Phagen-Gene wurden deletiert; Mutationen in O und P Genen verhinderten eine Replikation der Phagen DNA. Folglich ist die λ-DNA kein vollständig funktionaler Phage, der zur Modulierung der Expression des Zielgens fähig ist. Darüber hinaus ist die λ-DNA bei Auerbach für eine Verwendung als ein Vektor zum Tragen von Zielgenen nicht geeignet. Ferner kann, wie oben diskutiert, die Inkubation der bakteriellen Wirtszellen bei 42°C bis 44°C für 90–120 min, wie von Auerbach offengelegt, Proteasen aktivieren, die das Zielprotein zerstören.
Zusätzlich zur Bereitstellung der lytischen Freisetzung von intaktem Protein aus bakteriellen Produzentenzellen, sind Bakteriophagen ebenfalls als eine Alternative zu Bakterienplasmid-basierenden Vektoren verwendet worden, um heterologe DNA in bakterielle Wirtszellen zu tragen. (Murray, N.E. und Murray, K., Nature 251: 476–481, 1974; Moir, A., Brammar, W.J., Molec. gen. Genet. 149:87–99, 1976) Typischerweise wird die Amplifikation der Gene und ihrer Produkte während des lytischen Wachstum des Phagens erreicht, wobei das Phagen-Genom in die bakterielle Wirts-DNA integriert ist (Panasenko, S.M., Cameron, J.R., Davis, R.V., Lehman, L.R., Science 196: 188–189, 1977; Murray, N.E. und Kelly, W.S., Molec. gen. Genet. 175: 77–87, 1979; Walter, F., Siegel, M., Malke, H., 1990, DD 276.694; Mary, Y., Revel, M., Chen, L., Sheldon, I.F., Yuti-Chernajovsky, 1983, GB 2.103.222A ). Üblicherweise werden entweder lysogene Kulturen des rekombinanten Phagen λ zur Infektion der bakteriellen Wirtszellen verwendet oder "warmed up" Bakterienkulturen, die bereits den rekombinanten lysogenen Phagen λ enthalten, werden angezogen, um die Expression der heterologen Gene zu amplifizieren.
Obgleich es Beispiele für die erfolgreiche Verwendung von λ Vektoren für eine Expression heterologer Gene gibt, sind λ Vektoren in erster Linie zur Gen-Klonierung verwendet worden. Sobald sie kloniert sind, werden die Gene in Plasmid-Vektoren für eine effektivere Expression transferiert. Zum Beispiel, wenn E. coli mit dem humanen β-Interferon Gen enthaltenden Phagen λ Charon 4A C15 infiziert ist, die Menge an Interferon im Zelllysat 7–8 × 10⁶ Einheiten/Liter. Nachdem das Zielgen tragende DNA-Fragment von Phagen ins Plasmid rekloniert war, stieg die β-Interferon-Ausbeute auf 1 × 10⁸ Einheiten/L. (Moir, A., Brammar, W.J., Molec. gen. Genet. 149: 87–99, 1976).
Um die Ausbeute von heterologem Protein zu steigern, das in bakteriellen Wirtszellen mittels rekombinanter λ Vektoren gebildet wird, wurden Mutationen in das Phagen-Genom eingeführt, die den Phagen λ veranlassen, seine Fähigkeit zu verlieren, die bakterielle Zelllyse zu initiieren. Eine erhöhte Ausbeute wird durch Verlängerung des Zeitraums erreicht, während dem das heterologe Gen von den bakteriellen Wirtszellen exprimiert wird. Folglich war zum Beispiel die Ausbeute an DNA-Ligase 1 in lysogenen Kulturen, die den λ gt4ligS Prophagen mit der amber-Mutation in dem S-Gen enthielten fünfmal höher als die Ausbeute an DNA-Ligase 1 in lysogenen Kulturen, die den λ gt4ligS Prophagen ohne die amber-Mutation in dem S-Gen enthielten. (Panasenko, S.M., Cameron, J.R., Davis, R.V., Lehman, L.R., Science 196: 188–189, 1977). Das S-Protein des Phagen λ ist für die Lyse erforderlich; deshalb akkumulieren S-Mutanten eine große Anzahl an intrazellulären Phagen-Nachkommen ebenso wie das Zielprotein, ohne die Wirtszellen zu lysieren (Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Ähnliche Steigerungen bei der Ausbeute von DNA-Polymerase 1 wurden von lysogenen Kulturen berichtet, die rekombinanten Phagen λ mit amber-Mutationen in dem S- und Q-Genen enthalten im Vergleich zu rekombinantem Phagen λ ohne die amber-Mutationen. Murray, N.E., und Kelley, W.S., Molec. gen. Genet. 175:77–87, 1979). Das Phage λ Q-Protein ist für die Transkription der späten Region der Phagen-DNA benötigt, die viele Gene umfasst, die am Zusammenbau von Kopf und Schwanz und an der Zelllyse beteiligt sind. (Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
In U.S. Patent Nr. 4.710.463, legt Murray die Lysogenisierung eines nichtsupprimierenden (Su°) E. coli Stamms mit dem Phagen λ offen, der die temperatursensitive Mutation in cI wie auch Mutationen in λ S und E-Genen enthält. Folglich führt die verlängerte Kultivierung der lysogenen E. coli bei 37°C zu einem hohen Produktionslevel an rekombinantem Protein, welches in den Zellen verbleibt, da diese nicht von den Phagen-Genprodukten auf dem üblichen Weg lysiert werden, und da das rekombinante Phagen-Genom nicht verpackt ist, bleibt es für die Transkription verfügbar.
Trotz der bei Verwendung von λ-Vektoren mit S- und E-Mutationen möglichen höheren Ausbeute an heterologen Proteinen können die potenziellen technischen Vorteile von Bakteriophagen-Vektoren, bezogen auf die lytische Freisetzung der Zielproteine, mit diesen Mutationen verloren gehen, weil die Zielproteine innerhalb der Bakteriezelle akkumulieren. Wenn folglich ein Lyse-defekter mutierter λ-Vektor für die Produktion heterologen Proteins verwendet wird, müssen die oben diskutierten Extraktions- und Reinigungsschritte für mit Plasmid-Vektoren transformierte bakterielle Zellen, auch mit den resultierenden Verlusten, durchgeführt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen und biologisch aktiven Proteins. Das Verfahren umfasst die Schritte der Transformation einer E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid, das mindesten eine Kopie eines exprimierbaren Gens besitzt, welches das Protein codiert. Die Wirtszelle ist mit einem Bakteriophagen λ infiziert, umfassend mindesten eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das besagtes Protein codiert, und in der Lage ist, ohne Lyse bei einer permissiven Temperatur zu wachsen, und ebenfalls in der Lage ist, bei einer restriktiven Temperatur eine Lyse zu vermitteln. Die Wirtszellen werden bei der permissiven Temperatur bis zu einem Protein-Produktionsniveau von mindestens 100 μg/ml kultiviert. Die Wirtszellen werden dann durch Kultivierung der Wirtszellen bei einer restriktiven Temperatur lysiert, um das lösliche und biologisch aktive Protein freizusetzen.
Der Bakteriophage λ besitzt eine temperatursensitive Mutation, vorzugsweise ist die temperatursensitive Mutation cI₈₅₇. Die restriktive Temperatur ist größer als 32°C. Die permissive Temperatur ist geringer als etwa 32°C.
In einem Aspekt des vorliegenden Verfahrens besitzt der Bakteriophage λ eine Mutation in mindestens einem Gen, dessen Expression bei der restriktiven Temperatur die Lyse der Wirtszelle vermittelt. Das mindestens eine Gen kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus N, Q und R.
In einem Aspekt des vorliegenden Verfahrens stellt die E. coli-Wirtszelle einen Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen her. Alternativ fehlt übereinstimmend mit einem anderen Aspekt des vorliegenden Verfahrens der E. coli-Wirtszelle ein Suppressor für die Reparatur von amber-Mutationen
Der infizierende Bakteriophage λ kann mit einer Infektionsmultiplizität in einem Bereich von 1 bis etwa 100 bereitgestellt werden. Noch bevorzugter wird der infizierende Bakteriophage λ mit einer Infektionsmultiplizität in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 25 bereitgestellt, wobei die Lyse der Wirtszelle bei der restriktiven Temperatur mit höheren Infektionsmultiplizitäten im Vergleich zu geringeren Infektionsmultiplizitäten verzögert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine E. coli-Wirtszelle, die adaptiert ist, ein lösliches und biologisch aktives Protein mit einer Konzentration von mindestens 100 μg/ml herzustellen. Die Wirtszelle besitzt ein Plasmid mit mindestens einer Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das das Protein codiert. Die Wirtszelle enthält ebenfalls einen Bakteriophagen λ, umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das besagtes Protein codiert, und in der Lage ist, ohne Lyse bei einer permissiven Temperatur zu wachsen, und ebenfalls in der Lage ist, eine Lyse bei einer restriktiven Temperatur zu vermitteln.
Der in der E. coli-Wirtszelle der vorliegenden Erfindung enthaltene Bakteriophage λ kann eine temperatursensitive Mutation besitzen, vorzugsweise ist die temperatursensitive Mutation cI₈₅₇.
Der in der E. coli-Wirtszelle enthaltene Bakteriophage λ kann ebenfalls ein Mutation in mindestens einem Gen besitzen, dessen Expression bei der restriktiven Temperatur die Lyse der Wirtszellen vermittelt. Das mindestens eine Gen kann aus der aus N, Q und R bestehenden Gruppe gewählt sein.
In einer bevorzugten Methode enthält die E. coli-Wirtszelle einen Bakteriophagen λ mit cI₈₅₇, Qam₁₁₇ und R_am54 Mutationen.
In einer bevorzugten Methode kann der E. coli-Wirtszelle ein Suppressor zur Reparatur der amber-Mutation fehlen. In einer anderen Methode kann die E. coli-Wirtszelle recA defizient sein.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung codiert das exprimierbare heterologe Gen humanes alpha-2b Interferon.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das ein Protein codiert, wobei die E. coli-Wirtszelle mit einem Bakteriohagen λ lytisch infiziert ist, wobei besagter Bakteriophage λ bei einer permissiven Temperatur zum Wachstum ohne Lyse fähig ist und zur Vermittlung der Lyse bei einer restriktiven Temperatur fähig ist und mindestens eine Kopie des besagten exprimierbaren heterologen Gens umfasst, das besagtes Protein codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnte Wirtszelle, wobei der Wirtszelle ein Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die oben erwähnten Wirtszellen, wobei die Wirtszelle recA-defizient ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei die Wirtszelle recA^–13 ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei der Bakteriophage außerdem eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei die temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei der Bakteriophage außerdem eine Mutation in mindestens einem Gen umfasst, dessen Expression bei der restriktiven Temperatur die Lyse der Wirtszelle vermittelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei das mindestens eine Gen aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R ausgewählt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei der Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und R_am54 Mutationen umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei das Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das ein Protein codiert, wobei besagte E. coli-Wirtszelle mit einem Bakteriophagen λ lytisch infiziert ist, umfassend mindestens ein mutiertes Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R und mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das besagtes Protein codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagter Bakteriophage eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagte temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnte Wirtszelle, wobei besagter Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und Ram₅₄ Mutationen umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagter Wirtszelle ein Suppressor für die Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagte Wirtszelle recA-defizient ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagte Wirtszelle recA^–13 ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagtes Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen und biologisch aktiven heterologen Proteins, umfassend:

– Transformation einer E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das besagtes Protein codiert;
– Infektion der transformierten Wirtszelle mit einem Bakteriophagen λ, der bei einer permisssiven Temperatur zum Wachstum ohne Lyse fähig ist und zur Vermittlung der Lyse bei einer restiktiven Temperatur fähig ist und mindestens eine Kopie des exprimierbaren heterologen Gens umfasst, das besagtes Protein codiert;
– Kultivierung der Wirtszelle bei der permissiven Temperatur und
– Lyse der infizierten Wirtszellen zur Freisetzung des löslichen und biologisch aktiven Proteins durch Kultivierung der Wirtszelle bei besagter restriktiver Temperatur.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das oben erwähnte Verfahren, wobei besagte Wirtszelle einen Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen produziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagter Wirtszelle ein Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagte Wirtszelle recA-defizient ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagte Wirtszelle recA^–13 ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das oben erwähnte Verfahren, wobei der Bakteriophage λ mindestens ein mutiertes Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagter Bakteriophage eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagte temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei das lytische Wachstum des Bakteriophagen bei einer Temperatur über 32°C induziert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagte permissive Temperatur weniger als etwa 32°C beträgt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Infektionsmultiplizität von etwa 1 bis etwa 100 bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Infektionsmultiplizität im Bereich von etwa 10 bis etwa 25 bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei die Lyse besagter Wirtszelle bei der restriktiven Temperatur bei höheren Infektionsmultiplizitäten im Vergleich zu geringeren Infektionsmultiplizitäten verzögert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagtes Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei der Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und R_am54 Mutationen umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen und biologisch aktiven heterologen Proteins, umfassend:

– Transformation einer E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das besagtes Protein codiert;
– Infektion der transformierten Wirtszelle mit einem Bakteriophagen λ, umfassend mindestens ein mutiertes Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R und mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das besagtes Protein codiert;
– Kultivierung der Wirtszelle bei der permissiven Temperatur und
– Lyse der infizierten Wirtszellen zur Freisetzung des löslichen und biologisch aktiven Proteins durch Kultivierung der Wirtszelle bei einer restriktiven Temperatur.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das oben erwähnte Verfahren, wobei besagte Wirtszelle einen Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen produziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls das oben erwähnte Verfahren, wobei besagter Wirtszelle ein Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagte Wirtszelle recA-defizient ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagte Wirtszelle recA^–13 ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagter Bakteriophage eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagte temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagter Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und R_am54 Mutationen umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei der infizierende Bakteriophage mit einer Infektionsmultiplizität von etwa 1 bis etwa 100 bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei der infizierende Bakteriophage mit einer Infektionsmultiplizität im Bereich von etwa 10 bis etwa 25 bereitgestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei die Lyse besagter Wirtszelle bei der restriktiven Temperatur bei höheren Infektionsmultiplizitäten im Vergleich zu geringeren Infektionsmultiplizitäten verzögert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagtes Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die oben erwähnten Verfahren, wobei besagtes Protein in einer Konzentration von mindestens 100 μg/ml hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der oben erwähnten Wirtszellen, um ein lösliches und biologisch aktives heterologes Protein herzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagtes Protein in einer Konzentration von mindestens 100 μg/ml hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der oben erwähnten Wirtszellen, wobei besagtes Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Anwendungsform
Der Bakteriophage λ ist als Vektor zweckdienlich, da mehr als 40% des viralen Genoms für das lytische Wachstum nicht essentiell sind. Dieser Bereich des λ-Genoms, lokalisiert in der zentralen Region der λ-DNA zwischen den Genen J und N, kann durch heterologe DNA, die ein gewünschtes Produkt codiert, ersetzt sein. Diese Region wird während der Infektion früh transkribiert.
Um die Expression eines Zielgens zu maximieren, dessen Synthese-Information im Bereich der frühen Phagen-Gene gespeichert ist, müssen spezielle Bedingungen für die Phagenentwicklung bereit gestellt werden, um eine korrekte Replikation sicher zu stellen. Außerdem sollte die Transkription des frühen Bereichs, der das Zielgen enthält, gefördert werden, während die Transkription der späten Gene, die bei der Zelllyse beteiligt sind, verzögert sein sollte. Dies verlangsamt die Reifung der λ-Partikel und nachfolgende Zelllyse. Folglich werden die frühen Phagenprodukte, einschließlich des Zielgen-Produkts, in den Bakterienzellen akkumuliert. Die Verzögerung der späten Transkription und folglich die Verlängerung der Expression des Zielgens kann bewerkstelligt werden durch: (1) Mutationen des Phagen-Genoms, die die Expression der späten Gene blockieren, (2) erhöhte Infektionsmultiplizität und/oder (3) Kultivierung der infizierten Bakterienzellen bei einer verminderten Temperatur.
Ein wichtiger Vorteil beim Infizieren von Produzenten-Zellen mit einem Bakteriophagen ist, dass der Phage eine grundlegende Neuordnung der gesamten makromolekularen Synthese in den bakteriellen Wirtszellen verursacht. Durch Abschalten der Transkription der bakteriellen Gene können Phagen das Kopieren des Zielgens steigern und folglich die Produktion des gewünschten Produkts erhöhen.
In einer bevorzugten Anwendung des vorliegenden Superproduktionssystems umfasst der Phage λ mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das besagtes Protein codiert, und mit amber-Mutationen, die die bakterielle Lyse verzögern (d. h., Q^–- und R^–Mutationen), werden in einem als Su° bezeichneten E. coli-Stamm bereitgestellt, dem der für die Korrektur der amber-Mutationen im Phagen λ verantwortliche Repressor fehlt. Um einen nicht-supprimierten (Su°) E. coli-Stamm zu erhalten, werden Su° Klone aus der Wildtyp Su^– – Population selektiert. Vorzugsweise ist ein Selektionsmarker in die Phagen-DNA inseriert z. B. eine Tetracyclin oder Ampicillin-Resistenz.
Selektion der Bakterienstämme
Die Selektion von nicht-supprimierenden (Su°) E. coli-Stämmen, zum Beispiel E. coli K 802, wurde mit Phagen λ cI₈₅₇ Nam7Nam53 bla tet (nachstehend λ bla N') durchgeführt. E. coli-Stamm C600 (λ bla N') diente als Phagenquelle. Dieser Phage wurde durch Insertion von Plasmid pCV 11 (bla tet) in die EcoRI Schnittstelle, in einen einzel-Schnittstelle-Vektor (EcoRI), der eine ts-Mutation im Repressorgen (cI₈₅₇) trägt, erhalten. Dann wurden zwei amber-Mutationen in das N-Gen des Phagen mittels in vivo Rekombination eingeführt.
Die Klone wurden auf nicht-Lysogenität mit Phagen λ klar getestet. Zusätzlich zu dem Phagen λ bla N' wurde Phage λ cI₈₅₇ Q_am117 R_am54 verwendet, um auf den Suppressor zu testen.
Medien – Flüssige Nährmedien, LB und M9 wie auch Agar LB-Medium, wurden für das Wachstum der Bakterienkulturen verwendet (Miller J.H., 1972, Experiments in molecular genetics, Spring Cold Harbor, N.Y.).
Herstellung des Phagenlysats – Lysogene Kulturen wurden in Nährmedium bei 28°C unter intensiver Belüftung bis zu einer Dichte von 2 × 10⁸ Zellen/ml angezogen, mit anschließender Inkubation bei 43°C für 20 min. Dann wurde die Kultur bei 37°C und intensiver Belüftung gehalten. Die Zellen lysierten in 60–80 min. und der Phage wurde in das Kulturmedium freigesetzt. Der Phagentiter wurde mit einer herkömmlichen zwei-Schicht-Technik bestimmt. In der Regel wurden 2 × 10¹⁰ PFU/ml Phagenlysat erhalten.
Es ist bekannt, dass die Mutante Phage λ N' nicht in der Lage ist, die Wirtszellen zu lysieren, und in den Zellen in Form von extrem instabilen Plasmiden vorhanden ist. Wenn die Wirtszellen einen Suppressor enthalten, wird die amber-Mutation phänotypisch korrigiert, das N-Protein synthetisiert und der Phage kann sich lytisch entwickeln. Dieser Unterschied der Lebensfähigkeit von mittels λ N' infizierten Su⁺- und Su°-Zellen wurde als Grundlage für die Selektion von spontan auftretenden Su°-Revertanten aus E. coli Su⁺-Zellpopulation verwendet. Der Phage λ mit einem inserierten Plasmid, das die Ampicillin und Tetracyclin Resistenzmarker in die Zellen einführte, wurde verwendet, um zu verhindern, dass die nichtlysierenden Su°-Zellen die Suche nach Mutanten verdecken. Der Phage enthält ebenfalls eine ts-Mutation in dem Repressorgen, die eine lytische Entwicklung derartiger Phagen, was zu einer Zelllyse führt, zu ermöglicht.
Falls das mit Ampicillin und Tetracyclin supplementierte Medium mit einer Su⁺-Kultur nach ihrer Infektion mit Phagen λ bla N' angeimpft wird, mit nachfolgenden Wachstum bei 43°C, müssen sich einzelne suppressorfreie Zellen, die den Phagen λ bla N' in Form von Plasmiden enthalten, auf den Platten entwickeln. Su°-Derivate der elterlichen Kulturen wurden mittels Heilung der Zellen von dem Phagen erhalten. Das Verfahren kann in mehrere Schritte unterteilt sein.
1. Infektion der Kultur mit Phagen λ bla N'
Die E. coli Su⁺-Kultur wurde bei 37°C in M9-Medium mit Maltose unter intensiver Belüftung bis zu einer Dichte von 1–2 × 10⁸ Zellen/ml angezogen. Die Zellen wurden mit dem Phagen λ bla N' mit einer Multiplizität von 5–10 Partikeln pro Zelle infiziert und 20 min bei 20°C inkubiert. Unter den gegebenen Bedingungen beträgt die Infektionseffizienz etwa 100%, zusätzlich zu der Hauptmenge an Su⁺-Zellen infiziert der Phage ebenfalls einzelne Su°-Zellen.
2. Selektion der suppressorfreien Zellen, die den Markerphagen enthalten
Nach Infektion wurden die Zellen auf Agar-Medium, das mit 12 γ/ml Tetracyclin und 20 γ/ml Ampicillin supplementiert war, ausplattiert und bei 43°C angezogen. In 24 h entwickelten sich Einzelkolonien, die erneut auf Agar-Medium mit Antibiotika ausplattiert und bei 37°C angezogen wurden.
3. Heilung der ausgewählten Klone vom Phagen λ bla N'
Da der Phage λ bla N' in den E. coli Su°-Zellen in Form extrem instabiler Plasmide vorliegt, wurden die selektierten Klone, um sie von dem Phagen zu heilen, auf selektiven Agar-Medium ohne Antibiotika ausplattiert und bei 37°C angezogen. Die Anzahl an Zellen, die den Phagen in der ersten Passage auf dem Medium ohne Antibiotika verloren hatten, betrug 12–35%. Die Selektion derartiger Zellen wurde mittels Monitoring des Verlusts der Antibiotika-Resistenz und der Erwerb einer Sensivität für Phagen λ klar durchgeführt.
4. Testen der Zellen auf Repressor
Die Fähigkeit des Phagen λ mit amber-Mutationen Plaques auf Bakterienrasen aus geheilten Klonen zu bilden, wurde überprüft. Isogene suppressorfreie Derivate der elterlichen E. coli Su⁺-Stämme sind Klone, auf denen der Phage λ bla N' keine Plaques bildete, Phage λ cI₈₅₇ Q_am117 R_am54 produzierte 1–3 × 10⁵ PFU/ml und Phage λ cI₈₅₇ ohne Mutationen in den Genen Q und R produzierte 1 × 10¹⁰ PFU/ml.
Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden Su° Revertanten von E. coli K 802 Su⁺ erhalten. Ausgehend von der Zellzahl zum Zeitpunkt der Infektion und der Anzahl an Su° Revertanten unter ihnen, war die Häufigkeit des Auftretens von suppressorfreien Zellen etwa 3 × 10^–7.
Die Verwendung supprimierender (Su⁺) und nicht-supprimierender (Su°) Wirtsstämme zusammen mit Phage λ, um eine Superproduktion von heterologen Proteinen und Peptiden zu erreichen, kann noch besser mit den nachfolgenden Arbeitsbeispielen verstanden werden.
Beispiel 1
Erhöhte Synthese von β-Lactamase in E. coli, das mit dem β-Lactamase-Gen (bla) tragenden pBR322 transformiert ist, nach Infektion mit Phagen λ
Bakterienzellen, E. coli C-600 Su⁺, wurden mit Plasmid pBR322-bla transformiert und in Aminopeptid Medium (von der Leningrader Fleischverabreitungs- und Verpackungsfabrik hergestellt, 1:1 in 0,15 M NaCl verdünnt) kultiviert. Die C-600 Su⁺/pBR322-bla Transformanten wurden dann bei 37°C bis zu einer Dichte von 1 × 10⁸ Zellen/ml angezogen und in drei Portionen aufgeteilt. Die Kontrollportion blieb intakt. Die zweite Portion wurde mit Phagen λ mit der temperatursensitiven Mutation in cI, als λcI857 bezeichnet, infiziert und die dritte Portion wurde mit Phagen λ mit der temperatursensitiven Mutation in cI wie auch mit amber-Mutationen in den Q und R-Genen, als λ cI₈₅₇ Q_am117 R_am54 bezeichnet, infiziert. Phagenmutationen wurden mit Hilfe von Standardrekombinationsverfahren in vivo erhalten. Die Phagen-Multiplizität war ungefähr 10 Phagen-Körper pro 1 Bakterienzelle. Die λ-behandelten Kulturen wurden 15 min bei 37°C inkubiert, um den cI-Repressor zu inaktivieren, und dann 19 h bei 28°C inkubiert. Die Kontrollkulturen wurden bei 37°C über den gesamten Zeitraum inkubiert. β-Lactamase-Aktivität wurde mit einem iodometrischen Test bestimmt, wie von Chaykovakaya, S.M. und Venkina, T.G. beschrieben, Antibiotics 7(5):453–456, 1962. Eine Aktivitätseinheit ist als die minimale Enzymmenge definiert, die für Inaktivierung von 1 × 10^–7 M Penicillin (60 in in 1 h bei 37°C, pH 6,8–7,0, erforderlich ist.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, ist die β-Lactamase-Synthese in den C-600 Su⁺/pBR322-bla Zellen, die mit λ-Phagen mit Mutationen in den späten Genen O und R infiziert sind, fast 10-mal höher als die Synthese in C-600 Su⁺/pBR322-bla Kontrollzellen.
Beispiel 2
Erhöhte Produktion von β-Lactamase die von bla-Gen codiert ist das sowohl im Plasmid als auch im Phagen enthalten ist
Kulturen von E. coli W 3101 recA 13 Su° mit und ohne Transformation mit pBR322 wurden in Aminopeptid Medium, das mit 0,15 M NaCl 1:1 bei 37°C verdünnt war, bis zu einer Dichte von 1 × 10⁸ Zellen/ml angezogen. Ein recA-Stamm wurde verwendet, da diese Zellen eine verminderte Fähigkeit zur Rekombination in Bereichen hoher Homologie sowohl im Plasmid als auch im Phagen (z.B. bla-Gen) besitzen. Folglich verhindern recA-Kulturen den Ausschluss des homologen bla-Gens. Die Kulturen wurden in zwei Portionen aufgeteilt. Die erste Portion, die nicht dem Phagen exponiert war, wurde bei 37°C 16 h inkubiert. Die zweite Portion wurde mit Phagen λ cI₈₅₇ bla Q_am117 R_am54 mit einer Multiplizität von etwa 10 Phagen-Körper pro 1 Bakterienzelle infiziert und 2,5 – 3 h bei 37°C und dann weitere 14 h bei 28°C kultiviert. β-Lactamase-Aktivität wurde mit dem iodometrischen Verfahren gemessen. Die in Tabelle 2 (unten) gezeigten Ergebnisse sind in Einheiten ausgedrückt, wie sie oben für Tabelle 1 definiert sind.
Phage λ cI₈₅₇ bla Q_am117 R_am54 wurde aus lysogenen Kulturen hergestellt, die bei 28°C in Aminopeptid Medium gehalten wurden. Wenn die Bakterienzelldichte etwa 1 × 10⁸ Zellen/ml erreichte, wurden die Zellen 20 Minuten auf 43°C erwärmt, um den cI-Repressor zu inaktivieren. Folglich wird der Phage aus dem bakteriellen Genom geschnitten und beginnt seine lytische Entwicklung. Nach 50 min durchlaufen die Zelle eine Lyse und setzen jeweils 100–200 Körper frei. Bei einer Dichte von 1 × 10⁸ Zellen/ml produzierten die Kulturen 1–2 × 10¹⁰ Phagen-Körper pro ml. Folglich bedeutet die Infektion von Bakterienzellen mit Phagen mit einer Multiplizität von etwa 10, dass 1 ml Phagen-Lysat (1 × 10¹⁰ Phagen-Körper) zu 10 ml Bakteriensuspension (1 × 10⁹ Zellen) gegeben wurde.
Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 gezeigt, produzierten Bakterienzellen, die sowohl mit Plasmid, das das Zielgen enthält, als auch mit Phagen, der dasselbe Gen trägt, transformiert waren, etwa 10-mal mehr rekombinantes Protein (β-Lactamase) als die Bakterienzellen, die nur mit Phagen transformiert waren, und über 100-mal mehr als die Bakterienzellen, die nur mit Plasmid transformiert waren.
Beispiel 3
Superproduktion von β-Galactosidase, die von lac-Gen codiert ist, das sowohl in Plasmid als auch in Phagen enthalten ist.
Kulturen von E. coli RLMI, die Prophage λ cI₈₅₇ bla Q_am117 R_am54 (trägt eine Kopie des β-Galactosidase-Gens lac5) enthielten, wurden in LB-Medium (Difco) bei 30°C mit intensiver Belüftung bis zu einer Dichte von ungefähr 1 × 10⁸ Zellen/ml angezogen. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und 20 min inkubiert, um den cI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C gesenkt und die Bakterienzellen durchliefen eine Lyse, wobei Phagen mit 1–2 × 10¹⁰ PFU/ml gebildet wurden. Anschließend wurden 10 Liter Phagenlysat, das etwa 1 × 10¹⁰ Phagen-Körper (λ cI₈₅₇ plac5 Q_am117 R_am54) pro ml enthielt, zu 401 E. coli Ca 77 Su° Suspension, die mit Plasmid pZ56 transformiert waren, mit einer Dichte von etwa 1 × 10⁸ Zellen/ml in LB-Medium gegeben. Folglich war die Infektionsmultiplizität 25, d.h. es waren 25 Phagen-Körper pro Bakterienzelle.
Nach 7 h bei 37°C waren 1,9 g rekombinante β-Galactosidase pro 1 Kulturmedium gebildet. Die Aktivität der β-Galactosidase wurde nach dem Verfahren von Miller (Miller, J.H., EXPERIMENTS IN MOLECULAR GENETICS, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory Press) berechnet. Eine Aktivitätseinheit war als die minimale Enzymmenge definiert, die zur Hydrolyse von 1 μM ortho-Nitrophenyl-β-D-galactosidase in ortho-Nitrophenol pro min bei 37°C, pH 7,0, erforderlich ist.
Beispiel 4
Superexpression von humanem Interferon α-2b
Su⁺ und Su° Stämme von E. coli K 802, die mit einem Plasmid transformiert waren, das eine einzige Kopie des alpha-2 humanes Interferon (pIF-2-trp) codierenden Gens trug, wurden in LB-Medium bis zu einer Dichte von 1,5–2 × 10⁸ Zellen/ml angezogen. Diese Zellen wurden dann mit einer Multiplizität von 15 mit verschiedenen λ Phagenlysaten infiziert, wie in Tabelle 3 (unten) angegeben. Kultivierung wurde unter intensivem Belüften bei 25°C 13 h weitergeführt. Kontrollkulturen, die nicht mit Phagen infiziert waren, wurden bei 37°C über denselben Zeitraum inkubiert.
Tabelle 3
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, erhöhte sich die Interferon-Expression um etwa das 10-fache im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollkulturen, wenn die Bakterienzellen, die mit das Zielgen enthaltendem Plasmid transformiert waren, mit Phagen λ, der nur die temperatursensitive Mutation in cI enthielt, infiziert waren. Zusätzliche amber-Mutationen in Q und R Genen erhöhte zudem die Expression um etwa das 40-fache im Vergleich zu bakteriellen Kontrollzellen. Eine zusätzliche Kopie des Interferon-Gens zu Phage λ mit cI, Q und R-Mutationen erhöhten die Interferon-Synthese um etwa das 175-fache gegenüber den Kontrollen. Wenn schließlich ein nicht-supprimierender Su° Stamm von E. coli, der mit einem Plasmid transformiert war, das eine Kopie des Interferon-Gens trug, mit Phagen λ infiziert wurde, der ebenfalls eine Kopie des Interferon-Gens wie auch cI, Q und R Mutationen besaß, produzierten die bakteriellen Wirtszellen etwa 375 mal mehr rekombinantes Protein als die Kontrollzellen, die nur mit Plasmid transformiert waren.
Beispiel 5
Erhöhte Wiedergewinnung von biologisch aktivem rekombinantem Interferon durch Phagevermittelte Wirtszelllyse
Stamm E. coli SG 20050 wurde mit einem zwei Kopien des humanen Interferon alpha-2b Gens (pIF-14) tragenden Plasmid mit Standardverfahren transformiert. Die transformierten Zellen wurden in 80 Liter LB-Medium bei 37°C unter intensiver Belüftung bis zu einer Dichte von 2 × 10⁸ Zellen/ml angezogen. Die Kultur wurde in zwei Portionen geteilt. Die erste wurde nicht mit Phagen infiziert. Die zweite wurde mit λ Phagenlysat infiziert, das von E. coli K 802/λcI₈₅₇ Q_am117 R_am54 mit einer Multiplizität von 10 Phagen- Körper pro Bakterienzelle geerntet war. Die Kontrollzellen wurden 19 h bei 37°C inkubiert und die Phage-infizierten Zellen wurden 19 h bei 21°C inkubiert.
Interferon-Produktion sowohl in Kontrollkulturen als auch in Phage-infizierten Kulturen war etwa 20% des zellulären Gesamtproteins. Allerdings war das Interferon in den Kontrollen wenigstens zum Teil mit unlöslichen Einschlusskörpern assoziiert. Folglich war es nicht möglich, seine biologische Aktivität ohne Solubilisierung, Denaturierung und Renaturierung zu bestimmen. Im Gegensatz hierzu wurde die spezifische Aktivität des löslichen Interferons, das nach einer Phage-vermittelten Zelllyse in das Medium abgegeben wurde, ohne weiteres mittels Standardenzymimmunoassay bestimmt. Die Interferon-Aktivität betrug 4 × 10¹⁰ IU/Liter (200 mg/l).
Vorklinische toxikologische Untersuchungen des rekombinanten humanen alpha-2b Interferons, das mit dem Phage-Superproduktionsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, zeigten, dass die Verbindung praktisch nicht-toxisch war. Intraabdominale und intramuskuläre Injektionen des rekombinanten Interferons in weiße Mäuse und Wistar Ratten mit 8,5 × 10⁹ ME/kg (2,5 × 10⁵ mal die humane therapeutische Dosis) und intravenöse Injektionen in Mäuse und Kaninchen mit 4,25 × 10⁹ ME/kg (1,25 × 10⁵ mal die humane therapeutische Dosis) hatten keine ausgesprochene Intoxikation oder Todesfälle bei den Tieren zur Folge. Injektionen über vier Monate in Wistar Ratten mit 6 × 10⁵, 6 × 10⁶ und 3 × 10⁷ ME/kg (18, 180 beziehungsweise 900 mal die humane therapeutische Dosis) zeigten keine Schädigungen der Hauptorgane und Körpersysteme der Versuchstiere. Ähnlich zeigten intravenöse Injektionen über drei Monate in Kaninchen von 6 × 10⁵ und 6 × 10⁶ ME/KG und intramuskuläre Injektionen über zwei Monate in Hunde mit 3 × 10⁸ ME/KG keine Anzeichen einer Schädigung der Organsysteme.
Während der immuntoxischen und allergenen Untersuchung des rekombinanten Interferons wurden die Induktion zellulärer und humoraler Reaktionen wie auch verzögerte und unmittelbare Hypersensitivitätsreaktionen untersucht. Die Ergebnisse deuteten an, dass kein immuntoxischer oder allergener Einfluss ausgebildet wurde. Das rekombinante Interferon besaß ebenfalls keine mutagenen oder DNA-schädigenden Wirkungen in Bakterien während einer metabolischen Aktivierung in vitro oder im Knochenmark von Mäuseembryonen in vivo.
Embryotoxische Untersuchungen des rekombinanten Interferons wurden mit trächtigen weiblichen Mantelpavianen durchgeführt. Tägliche intramuskuläre Dosen während der Organogenese (20. bis 50. Trächtigkeitstag) verursachten Defekte bei der embryonalen Entwicklung, die zu Fehlgeburten oder Totgeburten führten. Ähnliche Ergebnisse wurden für rekombinante Interferon-Analoga erhalten, und könnten am wahrscheinlichsten mit einer starken antiproliferativen Wirkung der Interferone erklärt werden. Es ist möglich, dass die Fehlgeburten einer „Cancellation" der Immuntoleranz des mütterlichen Organismus gegen den Fötus zugeschrieben werden kann, die durch die immunmodulierende Wirkung des Proteins ausgelöst wird.
Rekombinantes Interferon wurde ebenfalls in ukrainischen Kliniken untersucht. Gestützt auf diese klinischen Daten wurde gezeigt, dass rekombinantes Interferon bei der Behandlung verschiedener menschlicher Erkrankungen und Zuständen zweckdienlich ist. Zum Beispiel war rekombinantes Interferon bei Behandlung von akuter und chronischer Hepatitis B, akuten viralen, bakteriellen und gemischten Infektionen, akuten und chronischen septischen Krankheiten, Herpesinfektionen, Herpes zoster, Papillomatose des Larynx, Multipler Sklerose und verschiedenen Krebsarten, einschließlich Melanom, Nierenzellkarzinom, Blasenkarzinom, Ovarialkarzinom, Brustkrebs, Kaposi Sarkom und Myelom wirksam.
Die Kontraindikationen bei klinischen Humananwendungen waren ausgedehnte (mehrere Monate) Anwendungen mit hoher Dosis, Allergie und Schwangerschaft. Die bemerkten möglichen Nebenwirkungen waren gering und vorübergehende „grippeähnliche" Symptome und bei ausgedehnten Dosierungsschemata waren Leuko- und Thrombocytopenie vermerkt.
Da wir eine Reihe von Anwendungsformen dieser Erfindung beschrieben haben, ist es offensichtlich, dass unsere Beschreibung der Erfindung verändert werden kann, um weitere Anwendungsformen bereitzustellen, die das zugrunde liegende Verfahren dieser Erfindung nutzen. Deshalb weiß der Fachmann, dass der Rahmen dieser Erfindung eher von den anhängigen Ansprüchen als von den spezifischen Anwendungsformen definiert werden soll, die oben detailliert und mit Hilfe von Beispielen beschrieben worden sind.

Claims

Eine E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das ein Protein codiert, wobei die E. coli-Wirtszelle mit einem Bakteriophagen λ lytisch infiziert ist, wobei der Bakteriophage λ bei einer permissiven Temperatur zum Wachstum ohne Lyse fähig ist und zur Vermittlung der Lyse bei einer restriktiven Temperatur fähig ist und mindestens eine Kopie des genannten exprimierbaren heterologen Gens umfasst, das das genannte Protein codiert.
Die Wirtszelle nach Anspruch 1, wobei der Wirtszelle ein Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Die Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Wirtszelle recA-defizient ist.
Die Wirtszelle nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle recA^-13 ist.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Bakteriophage außerdem eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Die Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei die temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Bakteriophage außerdem eine Mutation in mindestens einem Gen umfasst, dessen Expression bei der restriktiven Temperatur die Lyse der Wirtszelle vermittelt.
Die Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei das mindestens eine Gene aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R ausgewählt wird.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und R_am54 Mutationen umfasst.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Eine E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das ein Protein codiert, wobei die E. coli-Wirtszelle mit einem Bakteriophagen λ lytisch infiziert ist, der mindestens ein mutiertes Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R und mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das das Protein codiert, umfasst.
Die Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei der Bakteriophage außerdem eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Die Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und R_am54 Mutationen umfasst.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei der Wirtszelle ein Suppressor für die Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die Wirtszelle recA-defizient ist.
Die Wirtszelle nach Anspruch 16, wobei die Wirtszelle recA^–13 ist.
Die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei das Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen und biologisch aktiven heterologen Proteins umfassend: – Transformation einer E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das das Protein codiert; – Infektion der transformierten Wirtszelle mit einem Bakteriophagen λ, der bei einer permissiven Temperatur zum Wachstum ohne Lyse fähig ist und zur Vermittlung der Lyse bei einer restriktiven Temperatur fähig ist und mindestens eine Kopie des exprimierbaren heterologen Gens umfasst, das das Protein codiert; – Kultivierung der Wirtszelle bei der permissiven Temperatur und – Lyse der infizierten Wirtszellen zur Freisetzung des löslichen und biologisch aktiven Proteins durch Kultivierung der Wirtszelle bei der restriktiven Temperatur.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Wirtszelle einen Supressor zur Reparatur von amber-Mutationen produziert.
Das Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Wirtszelle ein Suppressor zur Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Wirtszelle recA-defizient ist.
Das Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Wirtszelle recA^–13 ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei der Bakteriophage λ mindestens ein mutiertes Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei der Bakteriophage eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 25, wobei die temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei das lytische Wachstum des Bakteriophagen bei einer Temperatur über 32°C induziert wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 27, wobei die permissive Temperatur weniger als etwa 32°C beträgt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 28, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Infektionsmultiplizität im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 bereitgestellt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 29, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Infektionsmultiplizität im Bereich von etwa 10 bis etwa 25 bereitgestellt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 30, wobei die Lyse der Wirtszelle bei der restriktiven Temperatur bei höheren Infektionsmuliplizitäten im Vergleich zu geringeren Infektionsmultiplizitäten verzögert ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 31, wobei das Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 32, wobei der Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und R_am54 Mutationen umfasst.
Ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen und biologisch aktiven heterologen Proteins umfassend: – Transformation einer E. coli-Wirtszelle mit einem Plasmid umfassend mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das das Protein codiert; – Infektion der transformierten Wirtszelle mit einem Bakteriophagen λ, der mindestens ein mutiertes Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, Q und R und mindestens eine Kopie eines exprimierbaren heterologen Gens, das das Protein codiert, umfasst; – Kultivierung der Wirtszelle bei einer permissiven Temperatur und – Lyse der infizierten Wirtszellen zur Freisetzung des löslichen und biologisch aktiven Proteins durch Kultivierung der Wirtszelle bei einer restriktiven Temperatur.
Das Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Wirtszelle einen Supressor zur Reparatur von amber-Mutationen produziert.
Das Verfahren nach Anspruch 34, wobei der Wirtszelle ein Suppressor für die Reparatur von amber-Mutationen fehlt.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei die Wirtszelle recA-defizient ist.
Das Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Wirtszelle recA^–13 ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 38, wobei der Bakteriophage eine temperatursensitive Mutation umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 39, wobei die temperatursensitive Mutation cI₈₅₇ ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 40, wobei der Bakteriophage λ cI₈₅₇, Q_am117 und R_am54 Mutationen umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 41, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Infektionsmultiplizität im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 bereitgestellt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 41, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Infektionsmultiplizität im Bereich von etwa 10 bis etwa 25 bereitgestellt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 43, wobei die Lyse der Wirtszelle bei der restriktiven Temperatur bei höheren Infektionsmuliplizitäten im Vergleich zu geringeren Infektionsmultiplizitäten verzögert ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 44, wobei das Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 45, wobei das Protein in einer Konzentration von mindestens 100 μg/ml hergestellt wird.
Verwendung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 18, um ein lösliches und biologisch aktives heterologes Protein herzustellen.
Verwendung einer Wirtszelle nach Anspruch 47, wobei das Protein in einer Konzentration von mindestens 100 μg/ml hergestellt wird.
Verwendung einer Wirtszelle nach Anspruch 47 oder 48, wobei das Protein menschliches alpha-2b-Interferon ist.