KR0151534B1 - 유기산 생성이 억제된 대장균 변이주 - Google Patents

유기산 생성이 억제된 대장균 변이주

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Abstract

본 발명은 유전자 조작에 의한 재조합 단백질의 생산에 유리하게 사용될 수 있는 대장균 변이주에 관한 것으로서, 이 변이주는 혐기성 조건하에서 생장할 수 없으며, 호기성 조건하에서 포도당 이용능을 갖지만 유기산 생산능이 저하된 것을 특징으로 한다. 이 대장균 변이주는 발효 도중에 유기산에 의한 대사저해를 받지 않으므로, 목적 재조합 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 도입하여 배양할 때에도 고농도의 탄소원의 존재하에서도 생장 억제 없이 잘 생육할 수 있으며, 목적하는 재조합 단백질을 효율좋게 생산할 수 있게 한다.

Description

유기산 생성이 억제된 대장균 변이주
본 발명은 일반적으로는 대장균 변이주에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 호기상태에서는 포도당을 이용하면서도 유기산을 생산하지 않기 때문에 고농도 배양이 가능한 재조합 단백질 발현의 숙주로 사용될 수 있는 대장균 변이주에 관한 것이다.
재조합 단백질을 코딩하는 외래 유전자가 삽입된 형질전환체 대장균으로부터 재조합 단백질을 생산하는 고농도 배양시스템에서는, 대장균의 생장을 위하여 포도당을 연속적으로 첨가하였다. 그러나, 포도당 배지에서 호기적으로 생장하는 대장균이라 할 지라도 초산, 젖산, 숙신산, 개미산 등의 유기산 (주로 초산이다. 이하유기산으로 약함)을 생성하고, 배양중에 생성된 이들 유기산은 숙주 세포인 대장균의 생장을 억제하는 작용을 하며(Brown et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, 5, 1985; Meyer et al., Proc. 3rd European Congress on Biotechnology, Munich, 1984), 또한 포도당에 의해 대사억제(catabolite repression)이 일어나 재차 유전자의 발현을 억제하여 재조합 단백질의 수율이 낮다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 포도당 농도를 조절하는 유가식 배양방법, 또는 생성된 유기산을 배양액으로부터 제거하는 공정 (Diaz-Rizi et al., Biotechnol. Prog., 6, 326, 1990; Ingram Conway, Appl. Environ. Microbiol., 54, 397, 1988)이 제안되었으나, 배양조건을 조절하기가 용이하지 않으며, 배양조건을 조절하는 과정에서 생성되는 염들이 또다른 생장억제효과를 초래하는 문제점이 있었다.
대장균의 포도당 대사에 있어서, 산소가 존재할 때 TCA 회로로 투입되는 포도당의 대사과정을 살펴보면 (Majewski Domach, Biotechnol. Bioeng., 35, 732, 1990), 해당과정에서 형성된 아세틸-CoA가 완전히 산화할 수 있는 양을 초과한 과량의 포도당이 투입되면 대장균은 아세틸 인산염(acetyl-phosphate)을 경유하여 초산을 생성하여 세포 밖으로 분비하고, 이렇게 분비된 초산을 비롯한 여러 유기산들이 대장균의 생장 또는 목적하는 재조합 산물의 생산을 억제하므로, 이러한 문제점을 개선하기 위해서는 유전학적으로 새로운 형질의 미생물이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 포도당 대사과정 중에 생성되는 유기산에 의한 성장억제 또는 재조합 단백질 생산억제를 받지 않는 대장균 변이주를 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적은 포도당 대사능을 가지면서 유기산 생산능이 억제된 대장균(E. coli)변이주 JL1506에 의해 달성된다.
본 발명은 또한 상기 변이주 JL1506을 재조합 단백질 발현 숙주로 사용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 적용 및 장점은 하기 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 대장균 변이주 JL1506은 다음과 같이 하여 얻었다.
일차로 화학적 돌연변이원을 이용하여 대장균 MG1655를 돌연변이시킨 후, 혐기적인 상태에서 유기산을 생성하는 과정 각각을 차단한 돌연변이주를 선별하였으나, 이들은 여전히 유기산을 생산하였다 (한승희, 성균관대학교 석사논문, 발효 유기산 생성이 제한된 대장균 돌연변이 균주 개발 및 고농도 숙주세포로서 적합성 여부에 관한 연구, 1994년 5월).
이는 산소가 부족한 혐기적인 상태에서도 대장균은 생장하며, 생성된 NADH2와 해당과정의 중간산물들이 유기산으로 전환되는 것으로 분석되었다.
따라서 본 발명자들은 혐기상태에서는 생장하지 못하는 돌연변이 균주를 스크리닝하였다. 스크리닝된 균주중 하나가 JL1506로써, 호기적 상태에서 포도당으로부터 유기산 생성이 억제되었고, 동시에 야생종에 비하여 생장량의 차이는 없었다. 또한 포도당의 농도가 증가되어도 생장량의 억제가 나타나지 않았다.
본 발명에 다른 변이주는 위와 같은 성질 때문에, 외래 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 발현 숙주로서 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 변이주를 숙주로 사용하여 발현시킬 수 있는 외래 재조합 단백질의 종류에는 특별한 제한이 없다. 그러나, 대사억제(catabolite repression)에 민감한 프로모터 (예, lac, fac등)에 의해 전사발현되는 재조합 유전자에 의해 생성되는 재조합 단백질의 발현에 특히 유리하다. 그렇지만, 대사억제에 민감하지 않은 다른 종류의 프로모터에 의한 발현도 상기 민감성 프로모터보다는 낮지만 다른 종래의 대장균 균주에 비해서는 우수한 발현 효과를 나타낸다.
그리고, 재조합 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 본 발명에 따른 변이주에 도입시켜 형질전환체 변이주를 얻는 것은 당업계에 주지된 방법에 따라 실시할 수 있으며, 본 발명은 이들 형질전환 방법에 의해 전혀 제한을 받지 않는다. 발현시키고자 하는 재조합 단백질의 종류 및 그를 코딩하는 외래 유전자의 크기, 선별마커 등에 따라 적의의 방법을 선정하여 실시할 수 있으며, 이러한 선정은 당업자가 용이하게 할 수 있는 것이다.
또한 형질전환체 변이주를 배지에서 배양하여 재조합 단백질을 생산하는 조건이나 방법 역시 재조합 단백질의 종류 등에 따라 적의 선정될 수 있으며, 이러한 선정 역시 당업자에 의해 용이하게 행해질 수 있다.
모 균주로부터 본 발명의 변이주를 얻는 방법은, 통상의 돌연변이방법, 예를 들면 화학물질 처리, 자외선 처리, 물리적 처리, 유전자 조작 등의 방법을 포함하며, 이들을 병행하여 제한없이 사용하여 목적하는 성질을 갖는 돌연변이주를 선발할 수 있다.
본 발명에서는 먼저 야생종 MG1655를 EMS(에틸메탄설포네이트)로 처리하여 혐기적인 상태에서 생장하지 못하는 돌연변이균주 JL1031을 얻었다. JL1031은 혐기적인 상태에서 포도당을 발효하는 능력이 차단되어 생장하지 못하는 것으로 해석되었으며, 이와 관련된 유전형질은 대장균 염색체상의 51-52분 위치에 존재함을 확인하였다. 그 기작으로는 포도당을 세포내로 흡수하는 PTS 시스템에 돌연변이가 가해진 것으로 추정되었다.
단일 돌연변이로 혐기적인 상태에서 생장하지 못하는 유전형질은 보고된 바 없으므로, 본 발명자들은 이러한 형질을 glf-(glucose fermentation defective)라고 명명하였으며, JL1031의 형질은 glf- (마이너스)로 표시하였다.
돌연변이 조작시 JL1031에 glf 이외의 다른 유전적 변형이 일어났을지도 모르므로, glf- 형질을 Tn10을 함유한 P1 파지를 이용하여 야생종 MG1655에 형질도입(transduction)하여 본 발명의 JL1506을 얻었다.
본 발명은 다음과 같이 구성된다.
실시예 1-3에서는 JL1031, JL1506을 분리하는 과정을 소개하며, 실시예 4-6을 통해 JL1506과 그의 친주인 MG1566의 생장에 있어서 포도당 투여 효과를 비교하였다.
또한 유전자 재조합용 숙주로서의 기능을 검토하기 위하여, 실시예 7-8에서는 HL1506과 MG1566에 베타-갈락토시다제를 함유하고 있는 플라스미드 pMKT2-1를 도입시켜 pro-lac 결실 돌연변이주인 JL1506-1과 MG1566-1을 각각 제작하였다.
또, 실시예 9-10에서는 리포코틴 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pHT1을 JL1506, MG1566, C600에 형질전환하여 그의 발현율을 평가하였다.
베타-갈락토시다제 또는 리포코틴 유전자를 본 발명의 JL1506와 대조군인 MG1566, C600에 형질전환하였을 때, 클로닝된 유전자들의 유전산물의 생산량은 본 발명의 균주인 JL1506이 MG1655 또는 C600에 비해 약 2배 증가를 나타내었다.
본 발명에서 사용하는 각종 실험방법을 소개한다.
1) 형질도입(transduction), 접합(conjugation), 염색체 지도작성 등의 유전학적인 실험은 밀러의 방법 (Miller, A short course in bacterial genetics, CSH, 1992)을 따랐다.
2) 베타-갈락토시다제 활성은 민등의 방법 (Min et al., Nucleic acid Res., 16, 5075, 1988)을 따랐다. 즉, 앰피실린이 40 ug/ml 함유한 LB 배지에서 37℃에서 12-16시간 200rpm으로 진탕배양하고, 1mM IPTG(이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드)를 첨가하여 lacZ 유전자의 발현을 유도하였다. 일정 시간마다 채취한 세포에 Z-완충용액, 클로로포름, 0.1% SDS를 첨가하여 세포를 분쇄한 뒤, 28℃수조에서 5분간 방치하고, 4mg/ml 농도의 ONPG 액을 첨가하고, 1M 탄산나트륨액 0.5ml을 가하여 반응을 종결시켰다. 원심분리하여 얻은 상등액을 흡광기(Pharmacia LKB-Ultrospec )를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정하였다.
3) 베타-락타마제 활성은 요오드법 (Han et al., Biotechnol. Bioeng., 39, 653, 1992)을 사용하였다. 즉 배양액 5ml을 원심분리하여 회수한 세포를 세척액 (0.05M Na2HPO4, 0.05M KH2PO4, 0.014M NaCl, 0.01M MgSO4 in 0.1M 인산완충액) 5ml에 현탁하고, 원심분리하였다. 회수한 세포를 0.1M 인산완충액 5ml에 현탁시키고, 초음파분쇄기 (Ultrasonic Homogenizer, US-150T)를 이용하여 5분간 분쇄하였다. 4℃에서 15000rpm으로 원심분리하여 세포분쇄물을 취하였다.
시험관 A에 20mM 벤질 페니실린(benzyl penicillin) 0.25ml과 0.1M 인산완충액 1.25ml, 세포분쇄물 0.5ml을 첨가하고, 30℃에서 20분간 반응시켰다. 대조군인 시험관 B에는 0.1M 인산완충액 2ml만을 첨가하였다. 요오드액 2.5ml을 첨가하고, 10분간 방치한 뒤 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
4) 리포코틴은 SDS-PAGE로 전기영동하고, 분자량 37kd의 밴드 (Davis, Ann. Rev. NY Acad. Sci., 121, 404, 1964)를 확인하여 밴드 밀도를 image densitometer (Bio-Rad GS-670)으로 스캐닝하여 정량하였다.
4-1) 세포가 생산한 리포코틴을 정량하는 방법 : 1% 포도당이 함유된 LB 배지 20ml에 12시간 호기적으로 배양한 배양물 2%를 취하여 600nm에서의 흡광도가 0.1 되도록 2%를 접종하고, 10시간 배양하였다. 배양액 1ml을 취하고, SDS액 (증류수 4.0ml, 0.5M Tris-Cl 1.0ml, 글리세롤 0.8ml, SDS 10%, B-머캅토에탄올 0.4ml, 0.1% 브로모페놀 블루, pH 6.8) 0.5ml을 혼합하고, 95℃에서 5분간 열처리한 뒤, 20ul를 취하여 10% SDS-PAGE로 단백질을 전개하였다.
4-2) 수용성 단백질내 리포코틴을 정량하는 방법 : 4-1의 방법으로 배양하면서 6시간과 10시간의 배양액 3ml을 취하여 원심분리하여 세포를 회수하였다. 5mM EDTA이 첨가된 트리스 완충액 1ml에 현탁시키고, 초음파 분쇄기로 분쇄하였다. 원심분리후 상등액을 취하여 수용성 단백질 분획으로 사용하였다. 20ul를 취하고, 동량의 SDS액을 첨가한 뒤, 4-1의 방법으로 처리한 뒤, 12% SDS-PAGE로 단백질을 전개하였다.
이상에서 혐기상태에서 포도당을 발효하지 못하여 생장하지 못하는 JL1506을 포함하는 돌연변이균주는 호기적 상태에서 고농도 배양할 때 유기산의 생산을 억제하므로써, 유전자 재조합 단백질 등의 생산에 유용한 숙주세포임을 확인하였으며, 동시에 유기산 생산에 관련된 다른 유전자를 차단하므로써 얻어지는 새로운 돌연변이균주를 개발하는 원천세포로 사용될 수 있다.
본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 그러나 본 발명의 개념이 실시예에만 국한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
대장균 K-12 (F- lambda-)인 MG1655 (Bachmann, Linkage map ofE. coliK-12, ed. 7,E. coliandSalmonella typhimurium, pp.807,1987)를 EMS 처리하고, 혐기 배양 장치 (BBL Microbiology Systems)를 이용하여 혐기적으로 배양하여 혐기적 생장억제 돌연변이주 glff-인 JL1031를 얻었다.
[실시예 2]
실시예 1에서 얻은 JL1031를 LB배지에서 5 x 10 8 cell/ml가 되도록 배양하고, 원심분리하여 세포를 회수하였다.
Tn10을 가지고 있는 λNK561 (Foster et al., Cell, 23, 215, 1981)을 이용하여 MG1655로부터 1만개의 Tn10 풀을 제조하고, LB배지에 현탁하였다. 이를 Pl 파지라 명하였다.
회수된 JL1031를 Pl 흡착배지(10mM MgCl210mM CaCl2) 2ml에 현탁하여, MOI (multiplicity of infection)가 0.5로 되도록 Pl 파지를 혼합하고, 실온에서 30분 방치하였다. LB 배지 1ml을 첨가하고 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 LB 배지 1ml에 현탁시키고, 테트라사이클린이 함유된 LB 배지에 도말하였다. 37℃에서 16시간 배양하여 Pl 파지에 의해 Tn10이 형질전환된 집락을 4만개 얻었다.
혐기성 배양과 호기성 배양한 플레이트를 비교하는 레플리카 플레이팅(replica plating)방법으로 glf- 형질을 나타내는 1차 집락을 61개 얻었다. 1차 집락을 다시 Pl 파지로 감염시켜 레플리카 플레이팅하였으며, glf- 형질을 나타내는 2차 집락을 45개 얻었다. 이중 하나를 선택하여 JL1501이라 명명하였다.
[실시예 3]
실시예 2에서 얻은 JL1501에서 Pl 파지를 배양하여 얻은 파지들을 실시예 1의 MG1655에 형질전환시켜 glf- 형질을 나타내는 집락을 얻었으며, 이를 JL1506이라 명명하였다. 대장균 JL1506은 대덕 생명공학연구소내 유전자은행에 1995년 10월 19일에 기탁되어 KCTC 0204BP의 기탁번호를 부여받았다.
JL1506의 형질은 glf-1031 zeb-1510::Tn10으로써, Hfr 접합(Hfr conjug a tion)과 Pl 형질도입(transduction)방법으로 분석한 결과 대장균 염색체의 51. 75분에 위치하는 nupC-3146::Tn 10 kan과 70.4%로 공동형질도입되었다. 복귀돌연변이 빈도는 8 x 10-3으로, 일반적인 수준이었다.
한편, 모균주와 중간 변이주, 그리고 본 발명의 변이주의 유전학적 특성(genotype)을 비교하여 보면, 모균주인 MG1655는 대장균 야생형으로서, λ-, F-이다 (Cold Spring Harbor Sm. Quan. Biol. 45 : 135-140). 중간 변이주 JL1031은 MG1655, glf-1031로, 그리고 JL1506은 MG1655, glf-1031, zzz-1510::Tn10으로 표시될 수 있다.
[실시예 4]
M56 배지 (인산2수소 칼리 10.6g, 인산수소나트륨 17.4g, 황간마그네슘 10%액 4ml, 황산제1철 0.05%를 함유하는 용액 2ml를 증류수 1리터에 녹인다, pH 7.0)에 포도당, 과당, 글리세롤을 각각 1%(wt) 되도록 첨가한 배지에 탄소원으로서 글루코스(glu), 프럭토스(fru) 또는 글리세롤(gly), 또는 글리세롤 + 질소원으로서의 20mM 질산소다(gly + NO3)을 첨가하고, 대장균 변이주 JL1506과 그의 친주인 MG1655를 접종하고, 혐기상태와 호기상태로 배양하였다. 혐기상태의 배양은 고형배지에서 혐기성 배양조 (BBL Microbiology Systemsrpm)에 놓은 상태에서 37℃, 24시간동안 배양하여 실시하였고, 호기상태의 배양은 최소배지에서 15-20시간 배양하였다. 이때, 호기상태에서의 배양은 또한 액체배지에서는 37℃에서 200rpm으로, 영양배지에서는 10-15시간, 그리고 최소배지에서는 20-40시간동안 배양하여 실시할 수도 있다.
그리고 이들 혐기상태와 호기상태에서의 각종 탄소원의 대사능을 관찰하고 하기 표1에 결과를 나타내었다.
상기 표1의 결과로부터, 본 발명의 변이주인 JL1506은 질산이 첨가된 글리세롤 배지에서 혐기적으로 생장하였으므로 혐기적 호흡계에는 이상이 없으나, 포도당을 이용하여 생장하는 형질만 차단된 것임을 확인할 수 있었다. 이 점에서 혐기 상태에서도 포도당을 이용하여 생장할 수 있는 친주 MG1655과 다르다.
[실시예 5]
M56 배지에 포도당을 0.5% 첨가한 배지 50ml을 125ml 플라스크에 옮기고, JL1506과 MG1655를 접종한 다음 37℃에서 200rpm으로 진탕하여 배양하였다.시간별로 흡광도를 측정하고, 유기산을 HPLC로 정량하였다.
배양액을 원심분리하여 얻은 상등액을 0.005M 황산과 동량 혼합한 뒤, 다시 원심분리하여 얻은 상등액을 막사이즈 0.2nm의 막으로 여과하고, 이중 100ul를 취하여 HPLC (Spectra Physics사 제품)으로 분석하였다. 컬럼은 Aminex HPX-87H (300 x 7.8mm; Bio-Rad사 제품)이며, 0.0M HSO로 분당 0.4ml 흘려 주었다. 디텍터로는 파장 210nm UV 디텍터를 이용하였다.
그 결과, JL1506은 초산을 0.3mM, 개미산을 0.8mM, 그리고 젖산을 0.3mM의 양으로 생산한 반면, 친주인 MG1655는 초산을 20.6mM, 개미산을 14.9mM, 그리고 젖산을 0.4mM의 양으로 생산하였다. 이로써 JL1506은 호기적인 상태에서 유기산의 생산능이 현저하게 저하되었음을 확인하였다.
[실시예 6]
LB 배지에 포도당을 0.2, 0.5, 1% 첨가한 배지 10ml을 250ml 플라스크에 옮기고, JL1506과 MG1655를 접종한 다음 37℃에서 200rpm으로 진탕하여 배양하였다. 시간별로 배양액 시료를 채취하여 흡광도를 측정함으로써, 포도당 농도에 따른 균주의 생육능을 측정하였다. 결과는 표2와 같다.
이상 표2의 결과로부터, 본 발명의 JL506은 포도당의 농도가 증가함에 따라 생장량이 증가되는 반면, 친주인 MG1655에 있어서는 포도당을 1% 첨가한 배지에서 MG1655의 흡광도가 배양시작 4시간 이후부터 증강세가 둔화되다가 배양시작 8시간이후부터는 감소하기 시작하는데, 이는 배양 도중에 형성된 유기산에 의해 생장이 억제받음을 입증하는 것이다.
또한 본 발명의 변이주인 JL1506는 최대 7.18까지 흡광도를 보여 MG1655의 최대 흡광도인 4.04에 비하여 약 2배 가까운 생장을 보였다.
[실시예 7]
본 발명의 변이주 JL1506이 재조합 유전자 산물의 생산에 적합한 숙주인지를 알아보기 위하여 형질전환 벡터로 많이 사용되고 있는 플라스미드pMKT2-1을 도입시켜 안정도를 평가하였다.
즉, pro-lac 부위가 제거된 Hfr 균주 EG333 (Golub등, 1983, P.N.A.S., 80:1401-1405)와 JL1506 또는 MG1655을 배양하여 pro-lac 결실 돌연변이균주 JL1506-1과 MG1655-1를 제조하였다.
베타-갈락토시다제(β-gal)와 베타-락타마제(β-lac) 유전자를 갖고 있는 플라스미드 pMKT2-1 (Min et al., Nucleic Acid Res., 16, 5075, 1988)으로 JL1506-1 또는 MG1655-1을 형질전환하여 각각 JL1506-2와 MG1655-2를 얻었다.
포도당이 0.5% 함유된 LB 배지 10ml를 250ml 플라스크에 옮기고, JL1506-2와 MG1655-2를 접종한 후 37℃에서 200rpm으로 진탕하여 배양하였다. 시간별로 채취하여 흡광도와 효소 활성, 플라스미드 안정성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 변이주JL1506로부터 유도된, 외래 플라스미드-함유 형질전환체 JL1506-2는 20세대를 경과하여도 플라스미드가 모두 100% 유지되어 재조합 유전자 산물의 생산을 위한 숙주로서 적합함을 나타내었다.
흡광도와 효소활성에 관한 결과는 표3과 같다.
상기 표3에 기초하여, 변이주 형질전환체 JL1506-2와 친주 형질전환체MG1655-2의 흡광도를 비교하면, 7.95/4.69로써, JL1506-2의 생장이 빠름을 알 수 있었다. 동시에 베타-갈락토시다제의 발현량도 242.86 X 10 유니트와 21.1 X 10 유니트로 11.5배 증가하였다.
그러나 플라스미드 pMKT2-1에 포함되어 있는 베타-락타마제의 발현량은 일정한 비율을 유지하였다. 이는 베타-락타마제에 관련된 bla 유전자는 대사억제(catabolic repression)에 의한 영향을 받지 않기 때문이다.
[실시예 8]
포도당이 1% 함유된 LB 배지 20ml에 cAMP를 5mM 첨가하고, 250ml 플라스크에옮기고, JL1506-2와 MG1655-2를 접종한 후 37℃에서 200rpm으로 진탕하여 배양하였다 시간별로 채취하여 흡광도와 베타-갈락토시다제의 효소 활성을 측정하였다. 비교를 위하여, 동일한 조건하에서 cAMP를 첨가하지 않은 배지에서도 배양하였다. 결과는 표4와 같다.
상기 표에 따르면, MG1655-2에서는 cAMP를 첨가하였을 때 베타-갈락토시다제의 발현량이 증가하므로써, 대사억제(catabolic repression) 현상이 심하게 일어나고 있는 것이 확인된다. 그러나 JL1506-2에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다.
[실시예 9]
인체 리포코틴 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pHTl(허등, 한국생화학회지, 23, 459, 1990)을 실시예 3의 JL1506과 MG1655 및 상기 문헌에서 사용한 바 있는 대장균 C600에 형질전환시켜, 각각 JL1506-3, MG1655-3, C600-3을 얻었다.
포도당이 1% 함유된 LB 배지 20ml를 250ml 플라스크에 옮기고, JL1506-3와 MG1655-3, C600-3를 접종한 후 37℃에서 200rpm으로 진탕하여 배양하였다. 10시간 배양후 배양액 1ml과 SDS액 0.5ml을 혼합하고, 95℃에서 5분간 열처리한 뒤 20ul를 취하여 10% SDS-PAGE로 단백질을 전재한 후, 분자량 37kd의 밴드 밀도를 스캐닝하여 리포코틴을 정량하였다. 6시간과 10시간 배양액으로부터 수용성 리포코틴도 정량하였다. 시간별 흡광도와 수용성 리포코틴에 대한 결과는 표5와 같다.
본 발명의 변이주 JL1506-3을 10시간 배양했을 때 생산된 리포코틴의 상대적인 값은 9.93이었으며, C600-3과 비교하여도 2배 이상의 리포코틴을 생산하였음을 확인할 수 있었다.
[실시예 10]
실시예 9의 배지에 IPTG를 첨가하였다. 10시간후 생산된 리포코틴 및 6시간과 10시간때 생산된 수용성 리포코틴의 양을 IPTG를 첨가하지 않은 경우와 비교하여 상대적인 값으로 환산하여 표6에 나타내었다.
MG1655-3와 C600-3은 IPTG를 첨가함으로써 리포코틴의 생산량을 전반적으로 증가시킬 수 있지만, JL1506-3의 경우에는 IPTG를 첨가하는 경우에도 리코코틴의 생산량에 큰 차이가 없음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이주 JL1506를 이용하여 리포코틴을 생산하는 경우에는 IPTG에 의한 유도가 필요없다.

Claims (5)

  1. 혐기성 조건하에서 생장할 수 없으며, 호기성 조건하에서 포도당 이용능을 갖지만 유기산 생산능이 억제된 대장균 변이주.
  2. 제1항에 있어서, 변이주는E. coliJL1506 (KCTC 0204BP)임을 특징으로 하는 대장균 변이주.
  3. 목적 재조합 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 제1항의 대장균 변이주에 도입시켜 상기 외래 유전자-보유 형질전환체 변이주를 얻는 단계; 상기 형질전환체 변이주를 배양배지에서 배양하여 상지 목적 재조합 단백질을 생산하는 단계; 및 배양액으로부터 상기 목적 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 대장균 변이주를 숙주로 이용하는 발효법에 의해 재조합 단백질을 생산하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 변이주는E. coliJL1506 (KCTC 0204BP)임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 재조합 단백질은 리포코틴임을 특징으로 하는 방법.
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