JPH10512455A - 有機酸生成力が小さい新規の大腸菌変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 嫌気的培養条件下で成長しない大腸菌(E．coli)変異体であって、前記変異体が、炭素源としてグルコースを資化できるが、好気的培養条件下での有機酸生成力が抑制されている新規の大腸菌変異体が本願にて開示されている。 この変異体は、組み換えタンパク質の生成のための宿主系として有効に利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 有機酸生成力が小さい新規の大腸菌変異体発明の背景 １．発明の分野 本発明は、グルコース添加培地での好気的培養にて発酵生成する有機酸（特に 、酢酸塩）の生成力が小さい新規の大腸菌(E．coli)変異体に関する。有機酸生 成力が小さいことで、この変異体は、高細胞密度での好気的発酵による組み換え タンパク質の生成において有用な宿主株となる。 ２．従来の技術 有用な組み換えタンパク質を生成するために、大腸菌は、高細胞密度での好気 的発酵による宿主として広範に使用されている。 低廉で、かつ炭素源およびエ ネルギー源として容易に利用できることから、宿主細胞の高密度増殖ならびに組 み換え遺伝子の良好な発現のために、増殖培地に適量のグルコースが添加される 。高細胞密度好気的発酵での最大の問題点は、酢酸塩を主成分とする発酵による 酸副生物の生成である。 酸副生物、特に、酢酸塩の生成は、高細胞密度増殖を 制限する主要因子であり、これによって、組み換えタンパク質の生成も阻害され る（Han et al.,Biotechnol.Bioeng.,39,663 (1992)；Luli et al.,Appl.Environ.Microbiol.,56,1004(1990))。 これら問題点を解消するために、流加培養法(Fieschko et al.,Chem.Eng.Comm un.,45,2875(1986)；Ohta et al.,J.Ferment.Bioeng.,75,155(1993)；Yang,J.Bi otechnol.,23,271(1992))、培養基に生成した有機酸の除去方法(Landwall et al .,J.Gen.Microbiol.,103,345(1977)；Meyer et al.，Proceedings of the 3rd E uropean Congress on Biotechnology，(1984)；MacDonald，Appl．Environ．Mic robiol.，56，640(1990))、および培地組成を変更する方法(Holmes，Curr.Topic s Cell.Regul.28,69(1986)；Han et al.,Biotechnol.Bioeng.,41,316(1993)；Re iling,J.Biotechnol.2，191(1985)；Mori et al.,J.Fcrment.Technol.，50，519 (1972))などが使用されている。 しかしながら、これら方法によっても、増 殖率は小さく、かような培養条件下での貧弱な代謝活性では組み換えタンパク質 の収量も小さくなり、また微妙な栄養補給が難しくなって、その調整を誤りやす くなり(Chou et al.,Biotechnol.Bioeng.,44,952(1994))、さらに、培地のpH調 整のために添加した塩類が宿主の成長および／または産物生成の阻害を招く(Jan sen et al.,Biotechnol.Bioeng.,36,1(1990))などの不都合がある。 好気的条件下での大腸菌のグルコース代謝のために、TCAサイクルの処理能力 を超える量の炭素は、酢酸に転化され、細胞外に排出される(Majewski & Domach ,Biotechnol.Bioeng.,35,732(1990))。 これら排出された酢酸は、宿主の成長 と所望の組み換えタンパク質の生成を阻害する。 酢酸塩は、ホスホトランスアセチラーゼ(pta)および酢酸キナーゼ(ack)の連続作 用によって、アセチル補酵素Ａから形成される。 酢酸塩を形成する酵素の（pt sおよびack遺伝子双方を削除した）不活性化変異体は、生成量は減ったものの、 依然として著量の酢酸塩を生成する。 また、この変異体は、親株での生成レベ ルを上回る量の乳酸塩とピルビン酸塩を蓄積する(Diaz-Ricci et al.,Biotcchno l.Bioeng.,38,1318(1991))。 これら結果は、酢酸塩生成のための他の経路が存 在すること、ならびに公知の酢酸塩の生合成経路の不活性化によって炭素が他の 有機酸の合成に振り向けられることを示唆している。 このように、有機酸を全く生成せず、かつこれによって所望の組み換えタンパ ク質の収量を向上する新規の宿主を開発するための研究が引き続き必要とされて いたのである。 発明の要旨 よって、本発明の目的とするところは、菌体の増殖と組み換えタンパク質生成 の阻害を受けない、有機酸生成力が小さい新規の大腸菌を提供することにある。 この目的は、好気的条件下、グルコース培地での増殖において有機酸の生成力 が小さい新規の大腸菌(E．coli）JL1506によって達成される。 本発明の他の目的は、発現宿主系として大腸菌(E．coli)JL1506を用いた組み 換えタンパク質の生成方法を提供することにある。 本発明の上記ならびに他の目的、特徴および適用は、以下の詳細な説明を参照 すれば、当業者からして自明である。 発明の詳細な説明 新規の大腸菌である大腸菌(E．coli)JL1506を、以下の手順に従って得た。 大腸菌(E．coli)MG1655(Guyer et al.,Cold Spring Harbor Sym.Quant.Biol., 45,135(1981))を米国のエール大学の大腸菌保存施設から提供を受け、常法(Mill er,細菌遺伝学の集中講義,Cold Spring Harbor Laboratory(1992))に従ってエチ ルメタンスルホン酸（EMS）で突然変異を誘発し、そして、好気的条件下にて有 機酸の生成経路を欠損している変異体をスクリーニングした。 ところが、スク リーニングしたすべての変異体は、依然として高いレベルで有機酸を生成してい た。 これは、好気的条件下で成長可能な変異体が有機酸を生成したものと考え られる。 そこで、本発明者らは、嫌気的条件下で成長しない変異体のスクリーニングを 行った。 スクリーニング された変異体の一つで、親株の増殖率を引き継いでいるものの、好気的条件下で のグルコースからの有機酸生成力が十分に抑制されている変異体を、JL1031と命 名した。 上記した表現型をもたらす変異を、未変異の親株MG1655に対してP1フ ァージで媒介して形質導入を行ったところ、得られたJL1506株がJL1031と同じ表 現型を有していることが確認された。 本発明の変異体が有するかように有用な特性は、本発明の変異体を、組み換え タンパク質生成のための発現宿主系として使用することを許容する。 発現宿主 系とした大腸菌JL1506から得られる組み換えタンパク質の種類は特に限定されな い。特に、lac，tacなどのカタボライト・リプレッション−感受性プロモーター の制御下での発現によって得られるタンパク質が有用である。 また、従来の大 腸菌を用いた宿主系と比較して、本発明による発現系は、カタボライト・リプレ ッションに対して非感受性プロモーターの制御下での発現によって得られるタン パク質の生成のために有利に使用することができる。 組み換えタンパク質をコードする外来遺伝子による大腸菌JL1506の形質転換は 、当該技術分野で周知の方法に従って実施できる。 本発明の限定を意味するも のでないが、形質転換の方法と実施条件は、組み換えタンパク質の種類、それを コードする遺伝子の大きさ、 選択マーカーなどに応じて、当業者であれば適宜選択調整することが可能である 。 形質転換体である大腸菌JL1506の培養は、当業者であれば適宜調整できる、適 正な条件下で、適切な培地にて実施することができる。 本発明の新規変異体である大腸菌JL1506は、親株MG1655を適当な突然変異誘発 剤で処理し、所望の特性を有する変異体をスクリーニングすることで取得するこ とができる。 突然変異誘発剤としては、化学薬品や紫外線などが使用できる。 本発明の変異体を取得するために、遺伝子操作を行うこともできる。 上記した大腸菌JL1506の表現型をもたらす変異について、大腸菌染色体の51− 52min.の遺伝子をマッピングした。 グルコース最少培地にて好気的条件下では正常に増殖するが、嫌気的条件下で は正常に増殖しない表現型をもたらす単一変異は未だかつて報告されておらず、 本発明者らによって初めて知見されたのである。 本発明者らは、この変異遺伝子型を「glf-1031」（グルコース発酵欠損型）と 命名し、変異体JL1031がglf-1031を有することを明らかにした。 glf以外の遺伝子に関する変異の発生を避けるために、本発明者らは、glf-103 1の遺伝子型を、P1ファージを用いてMG1655に形質導入して、大腸菌JL1506を得 た。 本発明者らは、実施例にて本発明をより詳細に説明する。 すなわち、実施例 １−３では大腸菌JL1031の単離を、また実施例４−６では大腸菌JL1506と大腸菌 MG1655でのグルコースによるカタボライト・リプレッションが述べられている。 さらに、遺伝子操作した組み換え遺伝子を発現する上で変異大腸菌JL1506を宿 主系として用いることの有用性を確認するために、真正なβ−ガラクトシダーゼ 遺伝子(lacZ)を有するプラスミドpMKT2-1（Min et al.,Korean Biochem.J.,Nucl eic Acid Res.,16,5075(1988))で、大腸菌JL1506と大腸菌MG1655を形質転換して 、大腸菌JL1506/pMKT2-1と大腸菌MG1655/pMKT2-1それぞれを取得した(実施例７ および８)。 実施例９および10では、tryプロモーター(Amarm et al.,Gene，40，183(1985) )の制御下にあるヒトのリポコルチンcDNAを含むプラスミドpHT1(Huh et al.,Kor ean Biochem.J.,23,459(1990))を有する大腸菌JL1506、MG1655あるいはC600の形 質転換体を培養することで、大腸菌JL1506を宿主系とした場合のタンパク質発現 について評価した。 形質転換体によってβ−ガラクトシダーゼあるいはリポコルチンが生成される 場合、大腸菌JL1506でのタンパク質収量は、野性型株MG1655あるいはC600の約２ 倍であった。 本発明に関して、以下の様々な実験を行った。 1)形質導入、接合および遺伝子地図の作成などの遺伝学的実験は、Millerの方法 (Miller，細菌遺伝学の集中講義，Cold Spring Harbor Laboratory(1992))に従 って実施した。 2)β−ガラクトシダーゼの活性は、Minの方法(Min et al.,Nucleic Acid Res.,1 6,5075(1988))によって測定した。 すなわち、β−ガラクトシダーゼをコード する遺伝子を有する菌株は、37℃で、40μg/mlのアンピシリンを含むLB培地で培 養し、そして、200rpmで12−16時間遠心分離した。 培養中に、lacZの発現を誘 発するために、1mMのIPTG（イソプロピル-１-チオ-β-Ｄ-ガラクトピラノシド） を添加した。 一定の間隔で増殖培地の一部を採取し、そして、細胞を分解する ために、Ｚ-緩衝液、クロロホルムおよび0.1％SDSを培地に添加した。 分解し た細胞を28℃の水浴に５分間置き、そして、反応を停止するために、４mg/mlのO NPGを添加した。 反応混合物を遠心分離した後、分光光度計(Pharmacia LKB-Ul traspec III)を用いて上清の吸光度(420nm)を測定した。 3)β−ラクタマーゼの活性は、ヨード法(Han et al.,Biotechnol.,Bioeng.,39,6 53(1992))によって測定した。 まず、増殖培地(5ml)から得た細胞を洗浄用緩衝 液(0.05M Na₂HPO₄、0.05M KH₂PO₄、0.014M NaCl、0.01M H₂SO₄を含む0.1Mのリン 酸緩衝化生理食塩水(PBS);５ml)に懸濁し、そして遠心分離した。 沈殿した細 胞を0.1M PBS(５ml)で懸濁し、そして、超音波破砕器US-150Tで５分間にわたっ て分解した。 次いで、この分解物を、４℃で、細胞均質化物が得られるまで遠 心分離した。 試験管(Ａ)に、20mMのベンジルペニシリン(0.25ml)、0.1M PBS(1.25ml)および 細胞均質化物(0.5ml)を添加し、この混合物を30℃で20分間反応せしめた。 対 照の試験管(Ｂ)には、0.1M PBS(2ml)を入れた。 各試験管にヨー素(2.5ml)を添 加し、10分間静置した後、490nmにてその吸光度を測定した。 4)リポコルチンは、SDS-ポリアミドゲル電気泳動によって、37kDのバンドとして 現れる(Davis,Ann.Rev.NY Acad.Sci.,121,404(1964))。 定量のためにイメージ ・デンシトメーター(Bio-RadGS-670)を用いた。 4-1)細胞から生成したリポコルチンの定量： 12時間の好気的培養を終えた培地用ブロスを、600nmでの吸光度が0.1になるよ うに２％の濃度にまで調整した、１％グルコースを含むLB培地(20ml)に接種して 、10時間培養を行った。 培地用ブロス(1ml)を、5mlのSDS 溶液(蒸留水4.0ml;0.5M Tris-Cl 1.0ml;グリセロール0.8ml;SDS10％;β−メルカ プトエタノール0.4ml;0.1％ブロモフェノールブルー、pH6.8)と混合し、95℃で 、５分間加熱処理した。 反応混合物の20mlを採取し、10％SDS-ポリアクリルア ミドゲル(SDS-PAGE)を用いた電気泳動に適用した。 4-2）可溶性タンパク質中のリポコルチンの定量： 上記4-1)と同じ手順に従って培養を行い、培養の６時間目と10時間目に培地用 ブロス(3ml)を採取して、細胞を回収するためにこれらを遠心分離した。 回収 した細胞を、５mMのEDTAを含むTris緩衝液(1ml)で懸濁し、超音波破砕器で分解 した。上清を、可溶性タンパク質画分として用いた。 20mlの上清に、等量のSD Sを添加し、得られた混合物を上記4-1)と同じ手順に従って処理した。 リポコ ルチンを、12％のSDS-PAGEで定量した。 本発明において、嫌気的条件下にてグルコースが資化できず、また好気的条件 下にて高細胞濃度で培養した際に有機酸生成力が抑制される性質を備えた新規の 大腸菌JL1506変異体が提供される。 この変異体は、組み換えタンパク質を生成 するための有用な宿主系として有効に利用することができる。 さらに、有機酸 生成に関与する遺伝子をブロックするなどして、新規の変異体を開発する際に使 用することができる。 発明の好適な実施態様 本発明を、以下の実施例によって具体的に説明する。これら実施例は、説明目 的のために例示的に示したものであって、請求の範囲に適切に記載された発明の 範囲がこれら実施例の開示によって限定的に解釈されるべきでない。 特に断り の無い限り、実施例に記載の部あるいは％は重量に基づく。実施例１ 大腸菌(E．coli)MG1655をEMSで処理した。 この突然変異した細胞を、ルリア −ベルタニ（LB:トリプトン10ｇ、酵母抽出物５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、蒸留 水１Ｌ)寒天培地に接種し、各単−コロニーを37℃でインキュベートした。 こ れらコロニーを、二組のグルコース（最終濃度１％）を補充したM56最小培地(KH₂ PO₄10.6g、Na₂HPO₄17.4g、10％MgSO₄・7H₂O4ml、1％(NH₄)₂SO₄2ml、0.05％FeSO₄ ・7H₂O 2ml、蒸留水１Ｌ)寒天培地にレプリカ接種した。一方の接種組を好気的 条件下でインキュベートし、他方の接種組を、37℃の嫌気ジャー(BBL)にて嫌気 的にインキュベートした。変異大腸菌JL1031を、好気的には通常に成長するが、 48時間培養しても嫌気的条件下では成長しないコロニーとして同定した。実施例２ JL1031に嫌気的条件下での成長力の欠失（Glf、変異体の特徴）をもたらす変 異部分の近くに正のマーカー（仮 にglf-1031と命名するが、詳細は実施例４を参照のこと）を置くべく、glf-1031 の近傍にトランスポゾンTn10を挿入した。 この目的のために、MG1655(Glf)を λ NK561(Foster,Cell,23,215(1981))で感染せしめ、LB/Tet(15μg/ml)に接種し た。 得られたテトラサイクリン耐性(Tc-r)コロニーのプールを、ファージP1vi rの増殖のために用いた。 大腸菌JL1031をP1溶解物で感染せしめ、Tc-rの形質 導入のためにLB/Tetプレートに接種した。 この形質導入体をグルコース最小培 地にレプリカ接種し、その培地で嫌気的に成長できるコロニー(Glr)を取得した 。 Glf形質導入にて調製したP1溶解物を、JL1031(Glf)にTc-rを形質導入するた めに用いた。 試験した61個の形質導入体の内、16個はグルコース最小培地で嫌 気的に成長しなかった。 これら結果は、トランスポゾンTn10(zzz-1051::Tn10) がglf-1031の近傍に位置し、これらの26.2％(16/61)が共形質導入できることを 示唆している。得られた45個のGlfzzz-1031::Tn10形質導入体の一つを選択し、 これをJL1051(glf-1031,zzz-1051::Tn10)と命名した。実施例３ JL1051をドナーとして、MG1655へglf-1031変異を再形質導入し、得られたGlfz zz-1051::Tn10形質導入体の一つを任意に選択し、これをJL1506(glf-1031,zzz-1 051::Tn10)と命名し、後述する特徴決定のために用いた。大腸菌JL1506は、ブダ ペスト条約の規定に従い、1995年10月19日に、テジョン市、ユソン、GERI、KIST 、私書箱115号に所在の 大韓典型培養物保存研究所(KOREAN COLLECTION FOR TYPE CULTURES)に寄託され 、受託番号KCTC 0204BPが付与されている。 Hfr-接合およびP1形質導入の分析は、zzz-1051::Tn10が、大腸菌染色体の51.7 5min.に位置するnupC-3146::Tn10で共形質導入できることを示した。 嫌気的条 件下にあるグルコース最小培地での復帰変異の頻度によって決定した glf-1031 の復帰変異の頻度は、８×10^-3であった。実施例４ 大腸菌JL1506とその親株である大腸菌MG1655を、好気的および嫌気的成長条件 下で、最終濃度が１％の様々な炭素源が補充された M56培地でその成長力を試験 した。 この試験のために、これら大腸菌をLBプレートに貼着し、好気的に、37 ℃で一晩インキュベートした。 一晩成長せしめた培養物を、一組の適切な糖類 最小平板培地にレプリカ培養した。 一方のレプリカプレートを好気的にインキ ュベートし、他方のレプリカプレートを嫌気ジャー(BBL)にてインキュベートし た。 好気的条件下で18時間あるいは嫌気的条件下で48時間培養した後、成長度 を評価した。 好気的および嫌気的成長条件下でのこれら大腸菌の様々な炭素源 の資化性を、表１にまとめた。 変異大腸菌JL1506は、嫌気的条件下にてグルコース培地で成長しなかったが、 その親株である大腸菌MG1655は同条件下で正常に成長した。 しかしながら、変 異体は、グリセロール/NO₃(20mM)最小培地で嫌気的条件下で正常に成長した。 これら結果は、変異大腸菌JL1506の嫌気呼吸経路は正常であるが、グルコース発 酵経路に欠陥があることを示唆している。 このような理由で、JL1506での変異 座を仮にglf（グルコース発酵不全）と命名した。実施例５ 変異大腸菌JL1506とその対照大腸菌MG1655について、好気的条件下、グルコー ス培地での成長過程における 有機酸の生成に関して比較を行った。 各大腸菌を好気的に一晩成長せしめたLB 培地を、600nmでの初期吸光度が0.01とした50mlのM56/グルコース（最終濃度0.5 ％）培地が入った250ml容のフラスコに接種した。 これら培養基を、37℃、200 rpmの条件でロータリー振とう機でインキュベートした。 ３時間ごとに培地の 一部を採取した。増殖度と有機酸濃度に関する600nmでの吸光度を、HPLCを用い た酸生成のために決定した。 有機酸分析のために、１mlの培地試料を室温で遠 心分離した。上清に等量の５mM硫酸を加えて混合した後に再度遠心分離した。 得られた上清を膜フィルター(Gelman、0.2μm)で濾過し、分析時まで−20℃で保 存した。 10μlの濾過物を、有機酸の定量のために、Aminex HPX-87Hカラム(30 0×7.8mm:Bio-Rad)を用いたHPLC(Spectra Physics社)分析に適用した。 溶出液 として、流速0.4ml/分の0.01M硫酸を用いた。 210nmの紫外線検出器を使用した 。 その結果、各培養基で生成した各有機酸の最高濃度を比較したところ、JL1506 は、0.3mMの酢酸、0.8mMの蟻酸および0.3mMの乳酸を生成していたのに対し、MG1 655は、20.6mMの酢酸、14.9mMの蟻酸および0.4mMの乳酸を生成していた。 この ように、本発明の変異大腸菌JL1506の有機酸生成能力は、著しく抑制されていた 。特に、JL1506は、野性型の対照大腸菌のわずか１％のレベルの酢酸しか生成し なかったのである。実施例６ JL1506とMG1655の成長に対するグルコースの効果を、様々な濃度のグルコース を添加したLB培地での成長を観察して比較を行った。 各大腸菌を好気的に一晩 成長せしめたLB培地を、グルコースが0.2％、0.5％あるいは1％の最終濃度にな るよう添加された 10mlのLB培地が入れられた125ml容のフラスコに接種した。 これら培養基を、37℃、200rpmの条件でロータリー振とう機でインキュベートし た。 大腸菌の成長度を決定するために毎時間、培地用ブロスの600nmでの吸光 度を測定した。 その結果を、下記表２に示した。 表２の結果から明らかなように、大腸菌JL1506はグルコースの濃度が大きくな るに従って成長度も上昇しているが、大腸菌MG1655では、MG1655自体が生成した 有機酸が蓄積されるため、培養を始めて８時間を過ぎた頃から成長度の減少が認 められる。 さらに、大腸菌JL1506の最大の成長度は7.18の吸光度にまで達しており、これ は親株の吸光度(4.04)のほぼ２倍に相当する。実施例７ 組み換えタンパク質の発現用宿主となる大腸菌JL1506の実用性を評価するため に、プラスミドでコードされるタンパク質の生産性を大腸菌JL1506とMG1655にて 試験した。 β−ガラクトシダーゼ(1acZ)とβ−ラクタマーゼ遺伝子(bla)をコ ードするプラスミドpMKT2-1(Min et al.,Nucleic Acid Res.,16,5075(1988))を 、大腸菌JL1506とMG1655に導入した。 得られた形質転換体、JL1506/pMKT2-1あ るいはMG1655/pMKT2-1を、10mlのLB/グルコース(0.5％)を含む250ml容のフラス コにて、37℃、200rpmの条件で培養を行った。 細胞の成長度、β−ガラクトシ ダーゼとβ−ラクタマーゼの酵素活性、およびプラスミドの安定性を、600nmで の吸光度によって決定した。 その結果、本発明の大腸菌JL1506から得られたJL1506/pMKT2-1が、18代にわた る継代培養によっても、 プラスミドの100％がその安定性を維持していたことが、確認された。 細胞の成長度と酵素活性の測定結果を、表３に示した。 JL1506/pMKT2-1の培養物の最終吸光度（12時間後）は7.95であり、MG1655/pMK T2-1の最終吸光度は4.69であった。 JL1506/pMKT2-1は、吸光度値から判断して、野性型の対照大腸菌MG1655/pMKT2-1 よりも70％以上大きな収量を示している。 β−ガラクトシダーゼの生成につい て、 本発明の変異体は、野性型の対照大腸菌の11.5倍（体積）の生成量を示した。 よって、本発明の変異体は、対照よりも約6.8倍の比活性（活性単位／吸光度） を示したことになる。 同じくpMKT2-1プラスミドによってコードされるβ−ラ クタマーゼの生成について、本発明の変異体は、対照よりも66％以上大きな収量 を示している。 しかしながら、変異体と対照との間では比活性に相違は認めら れなかった。 これらの結果は、本発明の大腸菌JL1506が、プラスミドがコードした遺伝子か ら組み換えタンパク質を生成する際に用いる宿主として非常に有用であることを 示している。実施例８ グルコース培地で増殖している本発明の大腸菌JL1506における、プラスミドが コードした遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）の発現に関するカタボライト・リプ レッションの程度を決定するために、cAMPを補充もしくは除外したLB/グルコー ス培養基にて、そのβ−ガラクトシダーゼ活性と細胞の成長度を決定した。 比 較のために、大腸菌MG1655を同じ条件下で成長せしめた。これら大腸菌を、cAMP を補充（５ｍＭの最終濃度）もしくは除外した20mlのLB/グルコース(0.1％)が入 った250ml容のフラスコに接種した。 これら培養基を、37℃、200rpmの条件で ロータリー振とう機でインキュベ ートした。 細胞の成長度とβ−ガラクトシダーゼの活性を決定した。 それら の結果を、表４に示した。 野性型大腸菌MG1655は、cAMPが欠除している場合には明確なリプレッションが 認められ、このリプレッション効果は細胞が加齢するに従って増長されていた。 cAMPを添加することで、グルコースによるカタボライト・リプレッション効果は 緩和されていた。 一方で、本発明の変異大腸菌JL1506ではカタボライト・リプ レッションの効果は認められず、またその酵素活性は、cAMPを用いた大腸菌MG16 55での酵素活性よりはるかに大きかった。 これら結果は、本発明の変異大腸菌 JL1506が、遺伝子をコードしたプラスミドの発現に関すして、培地中のグルコー スによるカタボライト・リプレッションの作用をほとんど受けないことを実証す るものである。実施例９ 大腸菌JL1506と二つの対照大腸菌MG1655とC600のフラスコ回分培養での異種組 み換えタンパク質の生成力を決定し、そして比較した。 ヒトリポコルチンcDNA を含むプラスミドpHT1(Huh et al.,Korean Biochem.J.,23,459(1990))を、本発 明の大腸菌JL1506、その親株である野性型の大腸菌MG1655、および前出の文献に てリポコルチンを過剰生成すると報告された宿主大腸菌C600に導入した。 これ ら形質転換体(JL1506/pHT1、MG1655/pHT1およびC600/pHT1）のそれぞれを、20ml のLB/グルコース(0.1％の最終濃度)培地が入った250ml容のフラスコに接種し、 これらを、37℃、200rpmの条件でロータリー振とう機でインキュベートした。 培養開始後の適当な時間に、培地用ブロスを回収し、細胞の成長度を600nmの吸 光度によって決定した。 細胞タンパク質におけるリポコルチンの総量について も、培地試料の分析を行った。リポコルチンの分析を行うべく、１mlの培地用ブ ロスを0.5mlのSDS試料用緩衝液(0.5M Tri-HCl(pH6.8)1.0ml;10％(w/v)グリヤロ ール0.8ml;10％(w/v)SDS;β−メルカプトエタノール0.4ml;ブロモフェノールブ ルー0.1％(w/v);蒸留水4.0ml)と共に混合し、95℃で、５分間加熱処理した。 得られた試料20μｌを10％SDS-PAGEに適用した。 電気泳動した後、ゲルをクー マシーブリリアントブルーで染色し、イメージ・デンシトメーター(Bio-Rad GS- 670)で走査した。 リポコルチンのバンドは報告されていた分子量(37kd)で同定 され、バンドの相対体積（密度×バンドの面積）を表５にて比較した。 本発明の変異大腸菌JL1506は、好気的LB/グルコース回分培養法で試験した大 腸菌の中で最高の細胞の増殖度を示した。 また、大腸菌JL1506は、試験したす べての大腸菌の中で最高のリポコルチン生成力も示した。10時間培養したJL1506 /pHT1は、MG1655/pHT1(10時間培養)の9.93倍もの量のリポコルチンを生成してい た。 本発明の変異大腸菌によって生成されたリポコルチンの 量は、C600/pHT1によって生成されるリポコルチンの量のほぼ２倍であった。実施例１０ 大腸菌JL1506と二つの対照大腸菌から得た等量の可溶化細胞画分中に生成した 可溶性リポコルチンの量を決定し、そして比較した。 使用した培養条件と大腸 菌は、実施例９に記載のものと同様である。 培養開始後の６時間目と10時間目 に３mlの培地用ブロスを回収し、細胞を得るために室温にて遠心分離した。 得 られた細胞ペレットを、EDTA（最終濃度は５ｍＭ）を含む１mlのTris-HCl緩衝液 で再懸濁した。 超音波ホモジェナイザーで細胞を分解し、次いで、４℃で遠心 分離した後に上清を回収することで可溶化細胞画分を調製した。 可溶化細胞画 分でのタンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)の方法(Bradford,Anal.B iochcm.,72,248(1976))によって決定した。 得られた上清をSDS試料用緩衝液と 混合し、等量の可溶性タンパク質を10％SDS-PAGEに適用し、そして、実施例９の 手順に従ってリポコルチン・タンパク質の相対生成力を決定した。その結果を、 表６に示した。 単位量の可溶性タンパク質中に生成された可溶性リポコルチンの量（比生成力 ）からみて、試験した大腸菌の中で、JL1506/pHT1が最高量の可溶性リポコルチ ンを生成していた。 また、大腸菌JL1506/pHT1は、MG1655/pHT1の4.64倍もの量 のリポコルチンを生成していた。C600/pHT1は、10時間の培養よりも６時間の培 養において、可溶性リポコルチンを多く生成していた。 JL1506/pHT1は、６時 間培養したC600/pHT1の2.83倍(4.64/1.64)もの量を生成していた。 これら結果 は、本発明の大腸菌JL1506が、リポコルチン生成のための宿主として適切である ことを実証するものに他ならない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー，ジョン，ホ 大韓民国 135−110 ソウル カンナム− ク アプグジュング−ドング ハンヤン アパートメント ナンバー 55−1202 (72)発明者 チョイ，ハン 大韓民国 156−090 ソウル ドンジャク −ク サダン−ドング 105 ウスング アパートメント ナンバー 302−308 (72)発明者 ジュン，イル，ラエ 大韓民国 139−205 ソウル ノウォン− ク サンガエ−５−ドング ビュクサン アパートメント 105−709 (72)発明者 ナ，ドエ，サン 大韓民国 138−151 ソウル ソンパ−ク オリウン−ドング オリンピック アス レチック ヴィレッジ アパートメント ナンバー 317−105 (72)発明者 パーク，ヤング，ミン 大韓民国 138−172 ソウル ソンパ−ク ソンパ−２−ドング 151 ハンヤン セカンド アパートメント ナンバー 22 −605

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グルコースを用いた嫌気的培養条件下で成長しない大腸菌(E．coli)変異体 であって、前記変異体が、炭素源としてグルコースを資化できるが、好気的培養 条件下での有機酸生成力が抑制されている大腸菌変異体。 ２．前記大腸菌(E．coli)変異体が、受託番号KCTC 0204BPとしてブダペスト条約 の規定に基づいて寄託された大腸菌(E．coli)JL1506である請求の範囲第１項に 記載の大腸菌変異体。 ３．発現宿主系として大腸菌(E．coli)を利用する組み換えタンパク質の製造方 法であって、以下の工程； (a) 所望の組み換えタンパク質をコードする外来遺伝子を請求の範囲第１項に記 載の大腸菌変異体に導入して、前記外来遺伝子を有する形質転換した大腸菌変異 体を取得し； (b) 工程(a)で取得した形質転換した大腸菌変異体を、所望のタンパク質を生成 するために適切な培地で培養し；および (c) 培地用ブロスから所望のタンパク質を回収する、工程を含む、組み換えタン パク質の製造方法。 ４．前記大腸菌(E．coli)変異体が、受託番号KCTC 0204BPとしてブダペスト条約 の規定に基づいて寄託された大腸菌(E．coli)JL1506である請求の範囲第３項に 記載の組み換えタンパク質の製造方法。 ５．前記タンパク質が、リポコルチンである請求の範囲第３項に記載の組み換え タンパク質の製造方法。