DE69631117T2

DE69631117T2 - Neue e.coli mutante mit unterdrückter produktion organischer säuren

Info

Publication number: DE69631117T2
Application number: DE69631117T
Authority: DE
Inventors: Jong Ho Kangnam-ku LEE; Han Dongjak-ku CHOI; Il Lae Nowon-ku JUNG; Doe Sun Oriun-dong NA; Young Min Songpa-ku PARK
Original assignee: Korea Green Cross Corp
Current assignee: Korea Green Cross Corp
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1996-10-29
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2016-10-30
Also published as: DE69631117D1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Mutantenstamm von E. coli mit einer unterdrückten Produktion von fermentativen organischen Säuren (insbesondere Acetat) während des aeroben Wachstums in einem Medium, das mit Glucose ergänzt ist. Die Verringerung der Produktion organischer Säuren dieser Mutante macht es möglich, dass sie ein guter Wirtsstamm für eine Produktion rekombinanter Proteine unter Verwendung einer aeroben Fermentation mit hoher Zelldichte ist.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Das Dokument EP 0316229 offenbart E. coli, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Fähigkeit, Acetat zu bilden, höchstens ein Fünftel der Fähigkeit des E. coli-Wildtyps beträgt, und ein Verfahren zur Herstellung einer nützlichen Substanz durch Kultivierung von E. coli zu einer hohen Dichte und Gewinnen der Substanz.
Um nützliche rekombinante Proteine zu produzieren, wird E. coli weithin als ein Wirtsstamm für eine aerobe Fermentation mit hoher Zelldichte verwendet. Für ein Wachstum der Wirtszellen zu hoher Dichte und für eine gute Expression des rekombinanten Gens wird eine wesentliche Menge Glucose in das Wachstumsmedium zugegeben, da es eine kostengünstige und einfach verwendbare Kohlenstoff- und Energiequelle ist. Das Hauptproblem bei der aeroben Fermentation bei hoher Zelldichte ist die Produktion von fermentativen sauren Nebenprodukten, von denen Acetat das am meisten vorherrschende ist. Die Produktion von sauren Nebenprodukten, insbesondere Acetat ist ein Hauptfaktor bei der Beschränkung des Wachstums mit hoher Zelldichte und damit der Produktion einer rekombinanten Proteinproduktion (Han et al., Biotechnol. Bioeng., 39, 663 (1992); Luli et al., Appl. Environ. Microbiol., 56, 1004 (1990)).
Um diese Probleme zu lösen, sind Fed-Batch-Kulturtechniken (Fieschko et al., Chem. Eng. Commun., 45, 2875 (1986); Ohta et al., J. Ferment. Bioeng., 75, 155 (1993); Yang, J. Biotechnol., 23, 271 (1992)), Verfahren zur Entfernung organischer Säuren, welche von der Kultur produziert werden (Landwall et al., J. Gen. Microbiol., 102, 345 (1977); Meyer et al., Proceedings of the 3rd European Congress on Biotechnology, (1984); MacDonald, Appl. Environ. Microbiol., 56, 640 (1990)) oder wechselnde Medienzusammensetzungen (Holmes, Curr. Topics Cell. Regul. 28, 69 (1986); Han et al., Biotechnol. Bioeng., 41, 316 (1993); Reiling, J. Biotechnol. 2, 191 (1985); Mori et al., J. Ferment. Technol., 50, 519 (1972) verwendet worden. Aber diese Verfahren besitzen auch solche Beschränkungen, dass die langsamen Wachstumsraten und metabolisch weniger aktiven Kulturen, welche durch diese Kulturbedingungen resultieren, oft geringere Ausbeuten an rekombinantem Protein produzieren, dass die Kontrolle der komplizierten Nährstoffzufuhr umständlich und anfällig für Fehler ist (Chou et al:; Biotechnol. Bioeng., 44, 952 (1994)), und dass die für eine pH-Kontrolle zu dem Kulturmedium zugegeben Salze oft eine Hemmung des Wirtswachstums und/oder der Produktproduktion verursachen (Jensen et al., Biotechnol. Bioeng., 36, 1 (1990)).
Für den Glucosemetabolismus in E, coli-Stämmen unter aeroben Bedingungen wird der Kohlenstofffluss, der die Kapazität des TCA-Zyklus übersteigt, zu Essigsäure umgewandelt, die an die Außenseite der Zelle ausgeschieden wird (Majewski & Domach, Biotechnol. Bioeng., 35, 732 (1990)). Die ausgeschiedene Essigsäure hemmt das Wachstum des Wirtsstammes und die Produktion des gewünschten rekombinanten Proteins. Acetat wird aus Acetyl-CoenzymA durch die aufeinanderfolgende Wirkung von Phosphotransacetylase (pta) und Acetatkinase (ack) gebildet. Es wurde gezeigt, dass eine mutationsbedingte Inaktivierung (durch Deletion sowohl des pts- als auch des ack-Gens) der Acetat-bildenden Enzyme eine verringerte, aber noch immer wesentliche Menge Acetat produziert. Die Mutation verursachte auch, dass Lactat und Pyruvat auf einen höheren Spiegel als in dem Elternstamm akkumulierten (Diaz-Ricci et al., Biotechnol. Bioeng., 38, 1318 (1991). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es für die Acetatproduktion einen alternativen Stoffwechselweg gibt, und dass eine Inaktivierung von bekannten Acetatbiosynthesewegen den Kohlenstofffluss in Richtung anderer organischer Säuren umleitet.
Deshalb bestand ein Bedarf an einer fortwährenden Forschung zur Entwicklung eines neuen Wirtsstamms, dessen Produktion von organischen Säuren allgemein defizient ist, und wobei die Ausbeute von gewünschten rekombinanten Proteinen erhöht wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Somit ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen E. coli-Stamm bereitzustellen, dessen Produktion organischer Säuren unterdrückt ist, wobei sein Wachstum oder die Produktion von rekombinantem Protein nicht gehemmt ist.
Die Aufgabe kann durch einen neuen E. coli-Stamm JL 1506 gelöst werden, welcher die Produktion von organischen Säuren während des Wachstums auf einem Glucosemedium unter aeroben Bedingungen unterdrückt.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion eines rekombinanten Proteins, welche den E. coli-Stamm JL 1506 als ein Wirtsexpressionssystem verwendet.
Die obigen und andere Aufgaben, Merkmale und Anwendungen der vorliegenden Erfindung werden Fachleuten anhand der folgenden ausführlichen Erklärung offensichtlich werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der neue E. coli-Stamm JL 1506 kann durch das folgende Verfahren erhalten werden.
Der E. coli-Stamm MG 1655 (Guyer et al., Cold Spring Harbor Sym. Quant. Biol., 45, 135 (1981)) wurde mit freundlicher Genehmigung von der E. coli-Stammsammlung der Yale-Universtät, U.S.A. bereitgestellt, und wurde einer Mutagenese mittels Ethylmethansulfonat (EMS) durch ein Standardverfahren unterzogen (Miller, Short course in bacterial genetics. Cold Spring Harbor Laboratory (1992)), und es wurden Mutanten gesucht, die in Stoffwechselwegen der Produktion organischer Säuren unter anaeroben Bedingungen fehlerhaft waren. Aber alle der durchsuchten Mutanten produzierten noch immer organische Säuren mit den signifikanten Niveaus. Es wurde vermutet, dass die Mutanten, welche ein Wachstum unter anaeroben Bedingungen ermöglichen, organische Säuren produzieren können.
Deshalb führten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Arbeiten zum Screening von Mutanten fort, welche unter anaeroben Bedingungen nicht wachsen können. Eine der gescreenten Mutanten wird JL 1031 genannt, welche die Wachstumsgeschwindigkeit des Elternstamms beibehält, während die Produktion organischer Säuren aus Glucose unter aeroben Wachstumsbedingungen wirksam unterdrückt ist. Die den obigen Phänotyp verursachende Mutation wurde durch eine P1-Phagen-vermittelte Transduktion in den nicht mutagenisierten Elternstamm MG 1655 übertragen, und es wurde bestätigt, dass der resultierende Stamm JL 1506 den gleichen Phänotyp besitzt wie JL 1031.
Solche nützlichen Eigenschaften des Mutantenstamms der vorliegenden Erfindung machen es möglich, dass der Stamm als ein Wirtsexpressionssystem verwendet werden kann. Die Art der rekombinanten Proteine, welche durch die Verwendung des E. coli-Stamms JL 1506 als ein Wirtsexpressionssystem produziert werden kann, unterliegt keiner besonderen Beschränkung. Nichtsdestotrotz ist es nützlicher für die Proteine, deren Expression unter der Kontrolle eines gegenüber einer katabolischen Repression sensitiven Promotors wie etwa lac, tac und dergleichen liegt. Aber das Wirtssystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann nach wie vor auf vorteilhafte Art und Weise bei der Produktion anderer Proteine angewandt werden, deren Expression unter der Kontrolle von Promotoren liegt, welche gegenüber der katabolischen Repression nicht sensitiv sind, im Vergleich mit den anderen Wirtssystemen von anderen konventionellen E. coli-Stämmen.
Die Transformation von E. coli-Stamm JL 1506 mit einem fremden Gen, das für das rekombinante Protein codiert, kann durch die folgenden Verfahren durchgeführt werden, die Fachleuten gut bekannt sind. Die Verfahren und Bedingungen der Transformation, welche die vorliegende Erfindung nicht beschränken, können von Fachleuten ohne Schwierigkeiten bestimmt werden, in Abhängigkeit von der Art des rekombinanten Proteins, der Größe der dafür codierenden Gene, dem Selektionsmarker und dergleichen.
Die Kultur von transformierten E. coli JL 1506 kann in einem geeigneten Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, wobei alle davon von einem Fachmann bestimmt werden können.
Die neue erfindungsgemäße E. coli-Mutante JL 1506 kann erhalten werden durch Behandlung des Elternstamms MG 1655 mit einem geeigneten Mutagen und Screening auf Mutanten mit den gewünschten Eigenschaften. Als Mutagene können Chemikalien oder UV-Licht verwendet werden. Es kann auch eine Genmanipulation verwendet werden, um die Mutante der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Die Mutation, welche den oben beschriebenen Phänotyp des Stamms JL 1506 verursacht, wurde bei 51–52 min. des E. coli-Chromosoms genetisch kartiert.
Zuvor ist nicht darüber berichtet worden, dass eine einzelne Mutation den Phänotyp eines normalen aeroben Wachstums, aber die Abwesenheit von anaerobem Wachstum in Glukoseminimalmedien verursacht, sondern dies ist zum ersten Mal von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden worden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung nannten den Genotyp der Mutante „glf-1031" (Glucose-Fermantationsdefekt, „glucose fermentation defective") und zeigten, dass die Mutante JL 1506 den Genotyp glf-1031 besitzt.
Um die Anwesenheit von jeglicher/jeglichen möglichen Mutation/en auf anderen Genen als glf zu vermeiden, transduzierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung unter Verwendung eine P1-Phagen den Genotyp glf-1031 in MG 1655, was E. coli JL 1506 ergab.
Die vorliegenden Erfindung wird ausführlicher durch die Beispiele beschrieben werden, wobei Beispiel 1 bis 3 die Isolierung von E. coli JL 1031 und die Konstruktion von JL 1506 beschreiben, und die Beispiele 4 bis 6 die katabolische Repression durch Glucose in den Stämmen JL 1506 und MG 1655 zeigen.
Um die Möglichkeit der Verwendung der Mutante E. coli JL 1506 als ein Wirtssytem für die Expression von genetisch manipulierten, rekombinanten Genen zu untersuchen, wurden durch Transformation des Plasmids pMKT2-1 (Min et al. Korean Biochem. J., Nucleic Acid Res., 16, 5075 (1988)), welches das native β-Galactosidasegen (lacZ) enthält, in JL 1506 beziehungsweise in MG 1655 (Beispiele 7 und 8) weiterhin die Stämme JL 1506/pMKT2-1 und MG 1655/pMKT2-1 erhalten.
In den Beispielen 9 und 10 wird eine Proteinexpression durch Verwendung von E. coli JL 1506 als ein Wirtssystem beurteilt, durch Kultivierung der Transformanten von E. coli JL 1506, MG 1555 oder C 600, welche das Plasmid pHT1 (Huh et al., Korean Biochem. J., 23, 459 (1990)) tragen, welches die humane Lipocortin-cDNA unter der Kontrolle des try-Promotors (Amann et al., Gene, 40, 183 (1985)) enthält.
Wenn β-Galactosidase oder Lipocortin durch die Transformanten produziert wurde, betrug die Proteinausbeute in dem Stamm JL 1506 etwa zweimal mehr als bei den Wildtypkontrollen von MG 1655 oder C 600.
Die verschiedenen, für die vorliegende Erfindung durchgeführten Experimente sind wie folgt:

1) Genetische Experimente wie etwa eine Transduktion, Konjugation und Genkartierung wurden gemäß den Verfahren nach Miller (Miller, A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor (1992)) durchgeführt.
2) Die Aktivität der β-Galactosidase wurde gemessen durch das Verfahren nach Min (Min et al., Nucleic Acid Res., 16, 5075 (1988). Folglich wurde ein Stamm, welcher das Gen für β-Galactosidase trägt, in LB-Medium mit 40 Mikrogramm/ml Ampicillin bei 37°C und 200 rpm für 12–16 Stunden kultiviert. Während der Kultivierung wurde 1 mM IPTG (Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid) zugegeben, um die Expression von lacZ zu induzieren. Es wurde nach einem bestimmten Zeitraum Kulturnährmedium entnommen, und es wurden Z-Puffer, Chloroform und 0,1% SDS dazugegeben, um die Zellen aufzuschließen. Die aufgeschlossenen Zellen wurden für 5 Minuten in einem Wasserbad mit 28°C stehen gelassen, es wurden 4 mg/ml ONPG zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Nach der Zentrifugation des Reaktionsgemischs wurde die Absorption (420 nm) des Überstands unter Verwendung eines Spektrophotometers (Pharmacia LKB-Ultraspec III) gemessen.
3) Die Aktivität der β-Lactamase wurde durch das Iod-Verfahren (Han et al., Biotechnol., Bioeng., 39, 653 (1992)) gemessen. Folglich wurden die Zellen aus der Kulturbrühe (5 ml) in einem Waschpuffer (0,05 M Na₂HPO₄, 0,05 M KH₂PO₄, 0,014 M NaCl, 0,01 M H₂SO₄ in 0,1 M phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), 5 ml) suspendiert und zentrifugiert. Die präzipitierten Zellen wurden in 0,1 M PBS (5 ml) suspendiert und mit einem Ultraschall-Homogenisator US-150T für 5 Minuten aufgeschlossen. Dann wurde das Resultat bei 4°C und 15000 rpm zentrifugiert und ergab ein Zellhomogenat.
Zu einem Teströhrchen (A) wurden 20 mM Benzylpenicillin (0,25 ml), 0,1 M PBS (1,25 ml) und Zellhomogenat (0,5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde bei 30°C für 20 Minuten umgesetzt. In ein Kontroll-Teströhrchen (B) wurde 0,1 M PBS (2 ml) platziert. Es wurde Iod (2,5 ml) zu den Teströhrchen zugegeben und sie wurden für 10 Minuten stehen gelassen und die Absorption bei 490 nm wurde gemessen.
4) Lipocortin wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als eine Bande bei 37 kD (Davis, Ann. Rev. NY Acad. Sci., 121, 404 (1964)) identifiziert. Zur Quantifizierung wurde ein Image Densitometer (Bio-Rad GS-670) verwendet.
4-1) Quantifizierung von durch die Zelle produziertem Lipocortin: Das Kulturnährmedium nach der aeroben Kultivierung für 12 Stunden wurde in LB-Medium (20 ml) angeimpft, welches 1% Glucose enthielt, auf eine Konzentration von 2%, so dass die Absorption bei 600 nm 0,1 sein kann, und für 10 Stunden kultiviert. Das Kulturnährmedium (1 ml) wurde mit 0,5 ml SDS-Lösung (destilliertes Wasser, 4,0 ml, 0,5 M Tris-Cl, 1,0 ml; Glycerol, 0,8 ml; SDS, 10%; β-Mercaptoethanol, 0,4 ml; 0,1% Bromphenolblau, pH 6,8) und für 5 Minuten bei 95°C hitzebehandelt. Zwanzig Mikroliter des Reaktionsgemischs wurden entnommen und einer Elektrophorese auf einem 10%-igen SDS-Polyacylamidgel (SDS-PAGE) unterzogen.
4-2) Quantifizierung von Lipocortin unter löslichen Proteinen: Die Kultivierung wurde durchgeführt durch Befolgen des gleichen Verfahrens wie im obigen Punkt 4-1 ), und das Kulturnährmedium (3 ml) wurde nach 6 Stunden und 10 Stunden entnommen und zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden in Tris-Puffer (1 ml), der 5 mM EDTA enthielt, suspendiert und mit einem Ultraschall-Homogenisator aufgeschlossen. Der Überstand wurde als lösliche Proteinfraktionen eingesetzt. Zu 20 Mikroliter des Überstands wurde die gleiche Menge an SDS zugegeben und das resultierende Gemisch wurde durch das gleiche Verfahren wie im obigen Punkt 4-1) behandelt. Lipocortin wurde durch 12% SDS-PAGE quantifiziert.

Für die vorliegende Erfindung wird die neue Mutante E. coli JL 1506 bereitgestellt, welche Glucose unter anaeroben Bedingungen nicht nutzen kann und deren Produktion organischer Säure unterdrückt ist, wenn sie mit einer hohen Zellkonzentrationen unter aeroben Bedingungen kultiviert wird. Die Mutante kann effektiv genutzt werden als ein nützliches Wirtssystem zur Produktion von rekombinantem Protein. Weiterhin kann sie verwendet werden, um neue Mutanten zu entwickeln, durch Blockieren von Genen, die in die Produktion organischer Säuren involviert sind.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele dargestellt werden. Aber diese Beispiele sind nur zu Zwecken der Veranschaulichung bereitgestellt und sollten nicht als Begrenzung des Umfangs der Erfindung gedeutet werden, welcher genau durch die beiliegenden Ansprüche begrenzt ist. Die Teile oder Prozentangaben in den Beispielen sind auf das Gewicht bezogen, solange nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
Der E. coli-Wildtypstamm MG 1655 wurde mit EMS behandelt. Die mutagenisierten Zellen wurden auf eine Luria-Bertani-Agarplatte (LB: Trypton, 10 g, Hefeextrakt, 5 g; NaCl, 5 g, destilliertes Wasser 1 Liter) ausplattiert und bei 37°C für Einzelkolonien inkubiert. Die Kolonien wurden in Kopie auf zwei Sätzen Agarplatten aus mit Glucose (Endkonzentration 1%) ergänztem M56-Minimalmedium (KH₂PO₄, 10,6 g; NaHPO₄, 17,4 g; 10% MgSO₄ 7H₂O, 4 ml; 1% (NH₄)₂SO₄, 2 ml; 0,05% FeSO₄ 7H₂O, 2 ml; destilliertes Wasser 1 Liter, pH 7,0) ausplattiert. Ein Satz wurde aerob inkubiert und der andere Satz wurde anaerob in einem anaeroben Gefäß (BBL) bei 37°C inkubiert. Ein Mutantenstamm, E. coli JL1031 wurde als eine Kolonie identifiziert, welche anaerob normal wuchs, aber anaerob nicht einmal nach 48 h gewachsen ist.
Beispiel 2
Um einen positiven Marker in der Nähe der Mutation (vorläufig als glf-1031 genannt, siehe Beispiel 4 für eine weitere Erklärung) zu platzieren, welche den Mangel an anaerobem Wachstum in JL 1031 (Glf^–, für eine weitere Charakterisierung der Mutante) verursacht, wurde das Transposon Tn10 nahe der glf-1031 insertiert. Zu diesem Zweck wurde MG 1655 (Glf⁺) mit Lambda NK 561 (Foster, Cell, 23, 215 (1981)) infiziert und auf LB/Tet (15 μg/ml) ausplattiert. Die resultierenden, gegenüber Tetrazyklin resistenten (Tc-r) Koloniepools wurden zur Vermehrung des Phagen P1 vir verwendet. Der Stamm JL 1031 wurde mit dem P1-Lysat infiziert und auf einer LB/Tet-Platte für Tc-r-Transduktanten ausplattiert. Die Transduktanten wurden in Kopie ausplattiert auf Glucoseminimalmedium und es wurde eine Kolonie erhalten, welche anaerob (Glf+) auf dem Medium wachsen konnte. Ein P1-Lysat, hergestellt auf der Glf-Transduktante, wurde verwendet, um JL 1031 (Glf+) in Tc-r zu transduzieren. Unter den untersuchten 61 Tc-r-Transduktanten waren 16 nicht in der Lage, anaerob auf dem Glucoseminimalmedium zu wachsen. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Transposon Tn10 (zzz-1051::Tn10) nahe der glf-1031 platziert war, und dass diese 26,2% (16/61) co-transduzierbar waren. Eine der resultierenden 45 Glf^– zzz-1031::Tn10-Transduktanten wurde ausgesucht und als JL 1501 (glf-1031, zzz-1051::Tn10) bezeichnet.
Beispiel 3
Die glf-1031-Mutation wurde in MG 1655 rücktransduziert unter Verwendung von JL 1501 als Donor, und eine der resultierenden Glf^– zzz-1051::Tn 10-Transduktanten wurde zufällig gepickt, als JL 1506 bezeichnet (glf-1031, zzz-1051::Tn10) und wie unten beschrieben für eine weitere Charakterisierung verwendet. Der E. coli-Stamm JL 1506 wurde gemäß des Budapester Vertrags am 19. Oktober 1995 bei der „Korean Collection for Type Cultures" in GERI, KIST, PO box 115, Yusong, Taejon hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer KCTC 0204BP.
Eine Hfr-Konjugation und P1-Transduktionsanalyse ergaben, dass die zzz-1051::Tn 10 mit nupC-3146::Tn10, welche auf dem Chromosom von E. coli bei 51,75 min. lokalisiert ist, co-transduzierbar ist. Die Reversionsfrequenz der glf-1031, bestimmt durch die Frequenz der Reversion auf dem Glucoseminimalmedium unter anaeroben Bedingungen betrug 8 × 10³.
Beispiel 4
Stamm JL 1506 und sein Elternstamm MG 1655 wurden im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, auf M56-Medium, das mit verschiedenen Kohlenstoffquellen mit einer Endkonzentration von 1% ergänzt war, sowohl unter aeroben als auch anaeroben Wachstumsbedingungen zu wachsen. Für diesen Test wurden diese Stämme auf einer LB-Platte stellenweise aufgetragen und aerob über Nacht bei 37°C inkubiert. Die über Nacht angezogenen Kulturen wurden in Kopie auf geeigneten Zuckerminimalmedium-Platten ausplattiert. Eine Kopie der kopierten Platten wurde aerob inkubiert und die zweite Kopie wurde in einem anaeroben Gefäß (BBL) inkubiert. Das Wachstum wurde bei aeroben Kulturen nach 18 h und bei anaeroben Kulturen nach 48 Stunden bewertet. Die Fähigkeit dieser Stämme, verschiedene Kohlenstoffquellen unter aeroben und anaeroben Wachstumsbedingungen zu nutzen, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Der Mutantenstamm JL 1506 konnte anaerob nicht auf Glucose wachsen, während sein Elternstamm MG 1655 unter der gleichen Bedingung normal wuchs. Aber die Mutante wuchs anaerob in einem Glycerol/NO₃ ^– (20 mM) Minimalmedium normal. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die JL 1506-Mutante in dem anaeroben Atmungsweg nicht defekt ist, sondern im Glucosefermentationsweg defekt sein kann. Aus diesen Gründen wurde der Mutationslocus in JL 1506 vorrübergehend als glf (Glucosefermentationsdefekt, „glucose fermentation defective") bezeichnet.
Beispiel 5
Der Mutantenstamm JL 1506 und sein Kontrollstamm wurden verglichen im Hinblick auf ihre Fähigkeit, während des aeroben Wachstums in Glucosemedium organische Säuren zu produzieren. Eine aerob über Nacht angezogene LB-Kultur von jedem Stamm wurde in einem 250 ml Kolben angeimpft, der 50 ml M56/Glucose- (Endkonzentration von 0,5%) Medium enthielt, mit einer anfänglichen O. D. bei 600 nm von 0,01. Die Kulturen wurden in einem Rotationsschüttler bei 37°C, 200 rpm inkubiert. Jeweils nach 3 Stunden wurden Aliquots der Kulturen gesammelt. Es wurde die Absorption bei 600 nm für das Wachstum und die Konzentrationen an organischen Säuren für die Säureproduktion unter Verwendung von HPLC bestimmt. Für eine Analyse der organischen Säuren wurde 1 ml der Kulturprobe bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut nach Mischen mit einem gleichen Volumen 5 mM H₂SO₄ zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde durch einen Membranfilter (Gelman, 0,2 μm) filtriert und bei –20°C bis zur Analyse gelagert. 10 μl des Filtrats wurden einer HPLC-(Spectra Physics Co.) Analyse unter Verwendung einer Aminex HPX-87H-Säule (300 × 7,8 mm; Bio-Rad) für eine Quantifizierung der organischen Säuren unterzogen. Als ein Elutionsmittel wurde 0,01 M H₂SO₄ mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,4 ml/min verwendet. Es wurde ein UV-Detektor bei 210 nm verwendet.
Verglichen mit den maximalen Konzentrationen jeder organischen Säure, die von jeder Kultur produziert wurde, produzierte JL 1506 als Ergebnis 0,3 mM Essigsäure, 0,8 mM Ameisensäure und 0,3 mM Milchsäure, während MG 1655 20,6 mM Essigsäure, 14,9 mM Ameisensäure und 0,4 mM Milchsäure erzeugte. Somit ist bei der erfindungsgemäßen Mutante JL 1506 die Produktion organischer Säure wesentlich unterdrückt. Insbesondere produzierte sie Essigsäure nur im Ausmaß von 1% des Niveaus seiner Wildtypkontrolle.
Beispiel 6
Die Wirkung von Glucose auf das Wachstum von JL 1506 und MG 1655 wurde verglichen durch Beobachtung des Wachstums in LB mit verschiedenen Glucosekonzentrationen. Eine aerob über Nacht angezogene LB-Kultur von jedem Stamm wurde in einem 125 ml Kolben angezogen, der 10 ml LB enthielt, das mit Glucose mit einer Endkonzentration von 0,2%, 0,5% oder 1% ergänzt war. Die Kulturen wurden in einem Rotationsschüttler bei 37°C, 200 rpm inkubiert. Die Absorption bei 600 nm des Kulturnährmediums wurde jede Stunde gemessen, um das Wachstum der Stämme zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Wie aus Tabelle 2 entnommen werden kann, zeigte der Stamm JL 1506 eine Zunahme des Wachstums, wenn die Glucosekonzentration anstieg, während der Stamm MG 1655 eine Abnahme des Wachstums ab 8 Stunden der Kultivierung zeigte, wegen der Anreicherung der von ihm selbst produzierten organischen Säuren.
Weiterhin erreichte das Wachstum von JL 1506 eine Absorption von 7,18, was fast das Doppelte der Absorption (4,04) des Elternstamms ist.
Beispiel 7
Um die Brauchbarkeit des Stamms JL 1506 für eine Entwicklung als ein rekombinanter Proteinexpressionswirt zu testen, wurde die Produktivität der Plasmid-codierten Proteine in JL 1506 und MG 1655 getestet. Das Plasmid pMKT2-1 (Min et al., Nucleic Acid Res., 16, 5075 (1988)), welches für das β-Galactosidase-(lacZ) und das β-Lactamasegen (bla) codiert, wurde in JL 1506 und MG 1655 eingebracht. Die resultierende Transformante JL 1506/pMKT2-1 oder MG 1655/pMKT2-1 wurde bei 37°C, 200 rpm in einem 250 ml Kolben kultiviert, der 10 ml LB/Glucose (0,5%) enthielt. Es wurde die Absorption bei 600 nm für das Zellwachstum, Enzymaktivitäten von β-Galactosidase- und β-Lactamase und die Plasmidstabilität bestimmt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, dass JL 1506/pMKT2-1, welches von JL 1506 der vorliegenden Erfindung stammt, das Plasmid stabil genug behielt, dass 100% des Plasmids nach einer Subkultur von 18 Generationen beibehalten wurde.
Die Wachstumsprofile und Enzymaktivitäten sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Die letzte O. D. (12 h) der JL 1506/pMKT2-1-Kultur betrug 7,95, während die von MG 1655/pMKT2-1 4,69 betrug. JL 1506/pMKT2-1 produzierte etwa 70% mehr Zellausbeute beurteilt gemäß den O. D.-Werten als die Wildtypkontrolle MG 1655/pMKT2-1. Für die Produktion von β-Galactosidase produzierte die erfindungsgemäße Mutante eine 11,5-fach höhere Gesamt(volumetrische) Aktivität als die Wildtypkontrolle. Deshalb produzierte die Mutante eine etwa 6,8-fach höhere spezifische Aktivität (Aktivitätseinheiten/O. D.) als ihre Kontrolle. Wenn β-Lactamase in demselben Plasmid von pMKT2-1 codiert wurde, produzierte die Mutante 66% mehr Gesamtaktivität als ihre Kontrolle. Es wurde aber kein Unterschied in den spezifischen Aktivitäten zwischen der Mutante und der Wildtypkontrolle beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen, dass JL 1506 der vorliegenden Erfindung sehr nützlich ist zur Entwicklung als ein Wirtsstamm für Produktionen von rekombinantem Protein von Plasmid-codierten Genen.
Beispiel 8
Um das Ausmaß der katabolischen Repression auf die Expression eines Plasmid-codierten Gens (β-Galactosidase) in JL 1506 der vorliegenden Erfindung während des Wachstums in Glucosemedium zu bestimmen, wurden die β-Galactosidase-Aktivitäten und das Zellwachstum in LB/Glucosekulturen mit oder ohne Ergänzung von _CAMP bestimmt. Stamm MG 1655 wurde zum Vergleich unter den gleichen Bedingungen angezogen. Diese Stämme wurden in einem 250 ml Koben angeimpft, der 20 ml LB/Glucose (0,1%) enthielt, mit oder ohne Zugabe von cAMP (Endkonzentration von 5 mM). Die Kulturen wurden in einem Rotationsschüttler bei 37°C, 200 rpm inkubiert. Es wurden Wachstum und β-Galactosidaseaktivität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Der Wildtypstamm MG 1655 zeigte eine starke Repression auf die Beta-Galactosidase-Expression in Abwesenheit von cAMP, und die Repressions wirkung wurde deutlich, als die Zelle älter wurde. Eine Zugabe von cAMP schwächte die katabolischen Repressionswirkung durch Glucose ab. Aber der Mutantenstamm JL 1506 der vorliegenden Erfindung zeigte nicht die katabolische Repressionswirkung und die Enzymaktivitäten waren viel höher als diejenigen von MG 1655 mit cAMP. Diese Ergebnisse zeigen, dass der erfindungsgemäße Mutantenstamm JL 1506 eine sehr geringe katabolische Repression durch Glucose im Medium auf die Expression des Plasmid-codierten Gens besitzt.
Beispiel 9
Die Produktivitäten eines heterologen rekombinanten Proteins in Kolben-Batchkulturen von JL 1506 und zwei Kontrollstämmen, MG 1655 und C 600 wurden bestimmt und verglichen. Das Plasmid pHT1 (Huh et al., Korean Biochem. J., 23, 459 (19901), welches humane Lipocortin-cDNA enthält, wurde durch Transformation in den erfindungsgemäßen JL 1506, seinen Wildtyp-Elternstamm MG 1655 und den C 600-Wirtsstamm, von dem im obigen Bericht berichtet wurde, dass er das Lipocortinprotein überproduziert, eingebracht. Jede dieser Transformanten (JL 1506/pHT1, MG 1655/pHT1 und C 600/pHT1) wurde in einem 250 ml Kolben angeimpft, der 20 ml LB/Glucose(Endkonzentration 0,1%) Medium enthielt, und in einem Rotationsschüttler bei 37°C, 200 rpm inkubiert. Bei geeigneten Kulturzeiten wurden die Kulturmedien gesammelt und für das Wachstum die Absorption bei 600 nm bestimmt. Die Kulturproben wurden auch im Hinblick auf die Menge an gesamten Lipocortin untersucht, das in dem gesamten zellulären Protein produziert wurde. Für die Lipocortin-Analyse wurde 1 ml Kulturmedium mit 0,5 ml SDS-Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 1,0 ml; 10% (w/v) Glycerol, 0,8 ml; 10% (w/v) SDS; β-Mercaptoethanol, 0,4 ml; Bromphenolblau, 0,1% (w/v); destilliertes Wasser, 4,0 ml) gemischt und für 5 min bei 95°C wärmebehandelt. 20 μl der Proben wurden einer 10%-igen SDS-PAGE unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliant-Bau gefärbt und mit einem Image Densitometer (Bio-Rad Modell GS-670) gescannt. Die Lipocortin- Bande wurde durch das berichtete Molekulargewicht (37 kd) identifiziert, und ihr relatives Bandenvolumen (Dichte × Bandenfläche) wurde in Tabelle 5 verglichen.
Tabelle 5
Die Mutante JL 1506 der vorliegenden Erfindung zeigte die höchste Zellausbeute unter den getesteten Stämmen in diesen aeroben LB/Glucose-Batchkulturen. Sie produzierte von allen getesteten Stämmen auch die höchste Lipocortin-Produktivität. Die 10 h-Probe von JL 1506/pHT1 erzeugte 9,93-mal mehr Lipocortin als diejenige von MG 1655/pHT1 (10 h). Die von der erfindungsgemäßen Mutante produzierte Menge an Lipocortin betrug fast das Zweifache der Menge, welche in C 600/pHT1 produziert wurde.
Beispiel 10
Die Mengen an löslichem Lipocortin, welche in gleichen Mengen an löslichen Zellfraktionen von JL 1506 und zwei anderen Kontrollstämmen produziert wurden, wurden bestimmt und verglichen. Die verwendeten Kulturbedingungen und Stämme waren die gleichen, wie in Beispiel 9 beschrieben. 3 ml Kulturnährmedium wurden bei 6 h und bei 10 h Kulturdauer gesammelt und bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die Zellen zu ernten. Das resultierende Zellpellet wurde in 1 ml Tris-Hcl-Puffer mit EDTA (Endkonzentration 5 mM) resuspendiert. Lösliche zelluläre Proteinfraktionen wurden durch Aufschließen der Zellen mit einem Ultraschall-Homogenizer und Abnehmen der Überstände nach einer Zentrifugation bei 4°C hergestellt. Die Proteinkonzentrationen in den löslichen zellulären Proteinfraktionen wurden durch das Verfahren nach Bradford (Bradford, Anal. Biochem., 72, 248 (1976)) bestimmt. Der resultierende Überstand wurde mit Volumen des SDS-Probenpuffers gemischt und eine gleiche Menge an löslichem Protein wurde einer 10%-igen SDS-PAGE unterzogen und die relative Produktivität des Lipocortinproteins wurde bestimmt, wie es in Beispiel 9 beschrieben wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Relative Menge der Lipocortin-Produktion in einer gleichen Menge von löslichen zellulären Proteinfraktionen
Basierend auf der Produktivität von löslichem Lipocortin, produziert in einer Einheitsmenge von löslichen Zellproteinen (spezifische Produktivität), zeigte der Stamm JL 1506/pHT1 auch unter den getesteten Stämmen die höchste Produktivität an löslichem Lipocortin. Er produzierte Lipocortin in einer 4,64-fach höheren Menge als MG 1655/pHT1. C 600/pHT1 produzierte bei 6 h mehr lösliches Lipocortin als bei 10 h. JL 1506/pHT1 produzierte eine 2,83-fach höhere (4,64/1,64) Produktivität als eine Kultur von C 600/pHT1 bei 6 h. Diese Ergebnisse zeigen, dass der erfindungsgemäße Stamm JL 1506 sich ausgezeichnet als ein Wirtsstamm für die Lipocortin-Produktion eignet.

Claims

E. coli-Mutante JL 1504, hinterlegt gemäß dem Budapester Vertrag unter der Eingangsnummer KCTC 0204BP, welche Glucose als Kohlenstoffquelle nutzen kann, aber unter aeroben Wachstumsbedingungen eine unterdrückte Produktion von organischer Säure aufweist, wohingegen ihr Wachstum unter anaeroben Kulturbedingungen mit Glucose als Kohlenstoffquelle gehemmt ist.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins unter Verwendung eines E. coli-Stamms als Wirtsexpressionssytem, dadurch gekennzeichnet, dass ein fremdes Gen, welches für ein gewünschtes rekombinantes Protein codiert, in eine E.coli-JL 1506-Mutante nach Anspruch 1 eingebracht wird, die erhaltene transformierte E. coli-Mutante in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert wird, bis das gewünschte Protein produziert wird, und das gewünschte Protein aus dem Kulturnährmedium gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Protein Lipocortin ist.