JP3331343B2 - キシリトールの製造のための新規な酵母菌株 - Google Patents

キシリトールの製造のための新規な酵母菌株

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は代謝工学の分野に属する。特に本発明はキシ
リトール代謝が改変された新規な酵母株を使用するキシ
リトールを製造する方法に関する。本発明はさらにその
新規な酵母菌株およびそのような菌株を製造する方法に
関する。
発明の背景 キシリトールは通常、キシラン含有材料を先ず加水分
解して、キシロースを含む単糖混合物を製造する方法に
より製造される。このキシロースを次に通常ニッケル触
媒の存在下で還元してキシリトールにする。この型の方
法の多くがこの分野の文献に記載されている。米国特許
第3,784,408号、4,066,711号、4,075,406号、4,008,285
号および3,586,285号が例として言及できる。
しかしこれら従来の方法は比較的費用にかかるおよび
比較的有効性の低い多段階方法である。最大の問題は他
の加水分解副産物からのキシロースの効率的な完全な分
離を得ることに帰するものである。キシロースの還元反
応に使用した触媒が非常に高感度のため精製は非常に正
確である。最終生産物の純度は他方、いかに良くキシリ
トールが還元反応中に生成される他の生成物から分離で
きるかに依存する。
生物工学的方法によるキシリトールの製造は、それら
の方法が比較的に原価効率の良い方法により非常に高い
品質の生成物が提供できる場合、非常に魅力的である。
しかし上記の目的に対する酵母の醗酵によるキシリトー
ルの製造のため、酵母株は非病原性であることおよび食
品工業によって定められる要求に合うことが見出されな
ければならない。さらに酵母醗酵の助けによるキシリト
ールの高い収量を達成するためには、キシロースをキシ
リトールに還元できる酵母を使用することが必要であ
る。好ましくは、このような株はまた比較的キシリトー
ルの他の代謝的変換に非効率的であるべきである。
多くの酵母株は相当する糖アルコールへの糖の還元を
触媒する還元酵素を製造する。多くの酵母はまたそのキ
シロース代謝の初期の段階としてキシロースをキシリト
ールに還元することもでき、幾つかの酵母株は単独の炭
素およびエネルギーの源としてキシロースを使用でき
る。研究された酵母に対する反応経路またはキシロース
利用の経路は以下のものである・キシリトールはキシロ
ースがキシロースレダクターゼの助けによりキシリトー
ルに還元される最初の段階で合成される。キシリトール
は次に一連の連続的な段階により代謝（利用）される。
まず、キシリトールはキシリトールデヒドロゲナーゼに
よりキシルロースに酸化され、キシルロースはキシルロ
ースキナーゼ（キシラルロキナーゼとも呼ばれる）でリ
ン酸化されてキシルロース−５−リン酸になり、そして
キシルロース−５リン酸の一部はピルビン酸に変換され
そして幾つかの中間段階を経てエタノールに変換され
る。得られた主な生成物および副産物は酵母株および醗
酵条件にによって変化する。反応は厳密につながるもの
ではなく、従ってキシリトールの幾らかは常に培地中に
生産される。
一般にこの領域の研究はキシリトールよりもエタノー
ルを製造する能力を拡大する酵母株を同定する試みに焦
点が当てられている。それにもかかわらず、キシリトー
ル製造はキシロース利用酵母のうち比較的普通の特性で
ある。例えば、５つの遺伝子系統〔キャンディダ（Cand
ida）、ハンセヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス
（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）およびパチソレ
ン（Pachysolen）の44の酵母のうち42が培養培地中に幾
らかのキシリトールを生産できる〔バーボサ（Barbos
a）,M.F.S.ら,J.Indust.Micrbiol.3:241−251（1988）
およびEnzyme Microb.Technol.10:66−81（1988））。
キシリトールの工業的生産の為にこの様な菌株を使用
することが提案されている。例えば、キャンディダ・ト
ロピカリス（Candida tropicalis）・キャンディダ・ギ
ラモンディ（Candida guillermondii）・キャンディダ
・パパサイロシス（Candida parapsilosis）が提案され
ている〔国際出願PCT/FI90/00015,キャンディダ・トロ
ピカリス,PCT/FI91/00011,キャンディダ・トロピカリス
およびPCT/FI87/00162,キャンディダ・ギラモンディな
らびにフランス国特許2461545号公開公報，キャンディ
ダ・パパサイロシス〕。しかし上記の全てのキャンディ
ダ菌株は潜在病原菌でありならびに食品工業の要件に適
合しない。バーボサ（Barbosa）ら,J.Indust.Micrbiol.
3:241−251（1988）はキシリトールの生産のためにスク
リーニングされた酵母を記載している。しかしその許容
され収量を得る菌株もまた全て潜在病原性である。その
ためそれが食品工業および／または大規模でのキシリト
ール生産に対して利用できるキシリトールの生産に有益
な酵母の非病原性菌株の記載はなされていない。
さらに、キシロースの酵素的変換によりキシリトール
の有利な工業生産は収量が非常に高い場合にのみ可能で
ある。しかし、これは野性酵母菌株では達成できない。
種々の酵母菌株が最適な反応条件において、研究された
場合、あるキャンディダ・トロピカルス菌種はキシリト
ールの最大収量を得ることが見出された。しかし上に記
載されているように、この酵母種の菌株は潜在的に病原
性であり、そのため食品工業に利用できない。食品工業
に許容され得る種は、サッカロマイセス・セルビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）、キャンディダ・ユーテ
ィリス（Candida utilis）、クリイベロマイセス・マル
キシアナス（Kluyveromyces marxianus）である。サッ
カロマイセス・セルビシエは通常キシロース経路の酵素
を発現しないが、ハルボーン J.（Hallborn J.）ら、B
io/Technology 9:1090（1991）は、収量95％を主張し
て、キシロースからキシリトールへ変換しうるサッカロ
マイセス・セルビシエ菌株の構築のため、ピシア・ステ
ィプティス（Pichia stiptis）からクローン化されたキ
シロースレダクターゼ遺伝子の使用を記載している。
キシロース利用において欠陥のある突然変異株が記載
されている。ハーゲドーン,J（Hagedorn J.）ら,Curr.G
enet.16:27−33（1989）は酵母ピシア・スティプティス
の突然変異株が単一炭素源としてのキシロースの利用が
できず、キシロースレダクターゼまたはキシリトールデ
ヒドロゲナーゼのどちらかが欠けていることを特徴とす
ることを示している。ジェイムス,A.P.（James A.P.）
ら,Appl.Environ.Microbiol.55:2871−2876（1989）は
Ｄ−キシロースを代謝できない酵母パチソレン・タンノ
フィラス（Pachysolen tannophilus）の突然変異株を開
示している。スティーヴィス,P.E.（Stevis.P.E）ら,Ap
pl.Biochem.Biotechnol.20:327−334（1989）では組換
えDNA工学による酵母キシルロキナーゼ突然変異株の構
築を開示している。
酵母キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）
およびクルイベロマイセス・マルキシアナス（Kluyvero
myces marxianus）はキシロースの分解に必要である本
質的に誘導可能な酵素、キシロースレダクターゼ、キシ
リトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロースキナーゼ
を有する。しかしながら、キャンディダ・ユーティリス
およびクルイベロマイセス・マルキシアナス酵母の化学
的および物理的環境に適合してキシリトール収量を増加
させる試みは未だ成功していない。
本発明の概要 酵母のキシリトール代謝が改変でき、そのためキシリ
トールを高い収量で製造する新規な酵母菌株を開発する
ことが今や見出された。
そのため、本発明は第一に、キシロースからキシリト
ールを合成できるがキシリトール代謝の酵素の１または
それ以上に欠陥があり、そのためキシリトールが培養培
地に集まり、そしてそこから回収できるような酵母菌種
である新規な酵母菌株に向けられるものである。
本発明はさらにこのような酵母菌株を使用してキシリ
トールを製造する方法に向けられる。
本発明はさらにキシロースを還元でき、およびキリト
ロールデヒドロゲナーゼおよび／またはキシルロースキ
ナーゼ活性のそれらの発現ができないまたは欠如してい
る改変酵母菌株を構築する方法に向けられる。
詳細な説明 本発明の改変酵母菌株はキシロースからキシリトール
を合成できるが、キシリトール利用の酵素の１またはそ
れ以上を欠如しており、そのため改変酵母宿主をキシロ
ースの上で生長させる場合、キシリトールは培地に集め
られる。このように、新規な菌株では、キシロースレダ
クターゼ活性は存在するが、キシリトール代謝が著しく
低下されている。結果として、キシロースがキシロース
レダクターゼの活性を誘導し、そのためキシロースから
キシリトールへの変換されても新規な菌株はその単独炭
素源としてキシロースが使用できない。
キシロース還元の反応経路は以下に示される。
キシロースレダクターゼは次の反応を触媒する。
キシリトール利用の最初の酵素、キシリトールデヒド
ロゲナーゼは次の反応を触媒する： 本発明の方法に従って製造される新規な酵母菌株は酵
母菌株の生長および維持のための他の炭素源およびエネ
ルギー源が生長培地に加えられた場合、キシロースから
キシリトールを生産する。キシロースからキシリトール
を生産するために望ましい培地条件の下では、本発明の
宿主は遺伝的に完全にキシリトールを代謝することがで
きないので、それらは遺伝的に単独の炭素源としてキシ
ロースを使用することができない。菌株がキシリトール
を代謝できないため、キシリトールは生長培地中に集め
られる。「遺伝的に不可能な」ということは、結果とし
て改変酵母宿主が望ましい突然変異、または他の安定的
に遺伝した他の遺伝的変化を所有するように天然酵母DN
Aが変わることを意味する。
このように、本発明の改変酵母菌株はグルコース代謝
およびキシロースの還元の高い割合を有するが、同時に
キシリトールのキシルロースへの酸化の顕著に減少した
割合を有する。新規な菌種はこのようにキシリトールの
非常に有効な生産材である。多くの酵母菌株がキシロー
スを利用することが知られており、例えばC.フラレリ
（C.frareli）（FTI−20038等）;C.グルリエモンドリ
（C.guilliermondii）（FTI:20037,IZ−803,IZ−1739,I
Z−1231,IZ−1322,IZ−1239,IZ−1422,c−138,17−07お
よびIZ−1735等）;C.インタメディア（C.intermedia）
（RJ−245等）;C.シュウドトロピカリス（C.pseudotrop
icalis）（IZ−431および1006等）;C.トロピカリス（C.
tropicalis）（1004,IZ−1824,IZ−1958および53−51
等）;C.ユーティリス（C.utirlis）（FTI−20039,74−6
4,1009,EQ2,IZ−1166,IZ−1840およびIZ−1841等）;H.
アノマラ（H.anomala）（IZ−1420,IZ−229,IZ781,IZ−
1033,RJ−510,IZ−271,IZ−1224,IZ−1260およびFTPTAT
−106等）;K.フラグリス（K.fragilis）（FTI−20066
等）;K.マルキシアナス（K.marxianus）（IZ−1821,14
5,IZ−1339,276,およびIZ−619等）;Pach.タンノフィリ
ス（Pach.tannophilus）（NRRL Y2460等）;P.ブトニイ
（P.butonii）（68−111等）および;P.スティピティス
（P.stipitis）（79−261等）である。
このような酵母は種々の提供源から得られ、例えばAT
TC,NRRL,アグロノミック インスティテュート〔Agrono
mic Institute;UNICAMP,ブラジル，キャンピナス（Camp
inas,Brazil）〕；ファウンデンション フォー イン
ダストリアル テクノロジー〔Foundation for Industr
ial Technology;FTI,ブラジル，サンパウロ（Sao Paul
o,Brazil）〕；マイクロバイオロジー インスティテュ
ート〔Microbiology Institute）;UFRJ,リオ デ ジャ
ネイロ（Rio de Janeiro）〕およびジモテクニック イ
ンスティテュート〔Zymotechnic Institute;ESALQ,ピラ
シカバ（Piracicaba）〕。当技術範囲で記載された全て
は例えば酵母抽出物10g/、ペプトン20g/およびＤ−
グルコース20g/を含む培地〔バーボサ,M.F.S（Barbos
a,M.F.S.）ら,J.Indust.Microbiol.3:241−251（198
8）〕の寒天スラントまたはプレート上で保持されてい
るであろう。
非病原性原菌体は新規な菌株の製造に使用される場
合、得られた変異株はまた品質および収量の両方に関し
て食品工業で設定される特定の要求をも満たす。好まし
くはキャンディダ（Candida）種、ハンセヌラ（Hansenu
la）種、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）種、ピ
チア（Pichia）種またはパチソレン（Pachysolen）種の
酵母が使用され、特にキャンディダ・ユーティリス（Ca
ndida utilis）またはクルイベロマイセス・マルキシア
ナス（Kluyveromyces marxianus）である。非常に好ま
しい具体例では、クルイベロマイセス・マルキシアナス
変異種マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus var.
marxianus）（CBSC12菌株等）またはクルイベロマイセ
ス・マルキシアヌス変異種ブルガリカス（Kluyveromyce
s marxianus var.bulgaricus）（ATCC16045菌株等）ま
たはクルイベロマイセス変異種ラクティス（Kluyveromy
ces marxianus var.lactics）が使用される。本発明の
方法は、いかなる酵母の改変にも応用可能であり、その
なかでキシリトール製造が可能であるがキシリトール利
用の酵素の１またはそれ以上が欠如している酵母を構築
または同定することが望ましい。以下に例証としての方
法は、モデルおよび出発物質として酵母クルイベロマイ
セス・マルキシアナスが使用され、本発明の改変した酵
母宿主に達するために他の酵母種の改良に対して拡張可
能および適用可能である。
クルイベロマイセス・マルキシアナスは食品工業で多
大に使用されているよく知られた非病原性酵母である。
酵母は例えば、この酵母のシノニムが234頁に言及され
ている、The Yeasts,A Taxonomic Study,N.J.W.Kreg
er−van Rij編,Elsever Science Publishers B.V.,
アムステルダム（1984）、に記載されている。ここで言
及するこの出版物および全ての他の文献は、このため参
照により本明細書に組み込まれる。野生菌株は通常、そ
のエネルギー源としてグルコースを使用するが、キシロ
ースを代謝することも可能である。あるキャンディダ菌
株のような食品工業の特定の要求を十分に満たす他の酵
母は、また本発明の目的に対して使用できる。
好ましくは、その発現が不活性であること所望される
遺伝子は天然酵母宿主においてキシリトールデヒドロゲ
ナーゼおよびキシロースキナーゼをコード化している遺
伝子である。これらの遺伝子は、それらが遺伝的に宿主
におけるキシリトール代謝の単一経路であるため、好ま
しい。そのため宿主がキシロースの存在下で生長する場
合に、いずれか（または両方）の酵素の発現の遮断は最
後にキシリトール利用を遮りおよび培地中にキシリトー
ルの集積を可能にする。
本発明の宿主は上述したものと同様の手段でキシリト
ール代謝を遮るであろういずれかの方法により製造でき
る。一つの具体例では、新規な酵母菌株を製造するため
の本発明の方法は出発菌株が同化できる炭素源およびエ
ネルギー源を含む生長培地で培養され、変異原性因子お
よび所望により染色体分裂または微細管形成が培地上で
行われるのを妨げる作用因子による処理がなされるこ
と、前記突然変異株は抗生物質に富み、およびキシリト
ール代謝が不完全な上記酵母菌株がスクリーニングさ
れ、収穫されることを特徴とする。
例えば、この具体例では、突然変異誘発には化学的ま
たは物理的処理が使用される。適当な化学的突然変異作
用物質は5'−ブロモウラシル、2'−アミノプリンおよび
5'−デオキシウリジンのような塩基類似体；硝酸および
ヒドロキシルアミンのような脱アミン剤；エチルメタン
スルホネートおよびニトロソグアニジンのようなアルキ
ル化薬、並びにアクリフラビンおよび臭化エチジウムの
ようなアクリジン誘導体である。これらの物質に使用の
方法は当業者に公知である。
有用な物理的作用方法は例えば、紫外線およびＸ線照
射である。これらの作用因子の使用の方法も当業者に公
知である。
所望により、酵母は有糸分裂の染色体分裂および微細
管形成に関する作用因子で処理できる。ベノミルの使用
は好ましい具体例である。この処理により相同染色体の
存在から所望の突然変異を有する染色体が単離される。
一倍性酵母菌株についてはこの処理は必要でない。
最終的に、上述されたような化学的または物理的方法
により改変された酵母は、そのなかに所望の本発明の改
変された宿主の性質が存在するものに対するスクリーニ
ングがなされる。例えば活性的代謝を有する細胞のみを
殺すニスタチンのような抗生物質とともに栄養要求変異
細胞の豊富なものが使用できる。処理はキシロースの存
在下で行われる。培養培地は最良の酵母生産材を決定す
るため技術的上周知の方法に従ったキシロースの量に対
して直接的に分析できる。
このように、新規な菌株は慣用の方法の適当な生長培
地で出発菌株を培養することにより製造できる。変異原
性因子処理は、化学的または物理的方法により、例えば
アクリフラビンまたはプロフラビンのような挿入または
削除を生ずる変異原性因子、点突然変異を生ずる変異原
性因子，エチルメタンスルホネート、紫外線照射または
同等のものを使用する方法により、得られた培養物にお
いて行うことができる。任意のベノミル処理の後、突然
変異株は例えばニスタチン処理により強化され、そして
最後に酵母菌株はキシロースに富みおよびグルコースに
乏しい寒天上でそれらを培養することによりスクリーニ
ングされる。キシロース代謝に欠陥のある小さなコロニ
ーが取り出され、それから慣用の技術による純粋培養体
が形成される。本発明の宿主の構築のために、化学的ま
たは物理的方法を使用することの有利な点はこのような
方法がいずれかの出発酵母菌株により容易に作業でき、
（培地中のキシリトールの製造を測定する）選択した方
法はまたいずれかの酵母菌株にもまた容易に適用できる
ことである。例えば、実施例に記載した方法は本発明の
宿主を、例証された種のみでなく本質的にキシロースを
代謝する能力を有する酵母宿主のいずれかによっても提
供することが期待されるべきものである。
本発明の宿主の構築に対する別の手順は組換えDNA工
学の使用を含む。最初の具体例では、キシリトール代謝
の酵素をコード化するDNA配列が、このような遺伝子中
のコード化情報を破壊するように改変され、および相同
性の組換えまたは遺伝子崩壊技術を使用して改変遺伝子
が天然酵母遺伝子の置き換えにより酵母の染色体中に挿
入される。この方法で標的とされ得る遺伝子の例はキシ
リトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロースキナーゼ
を含む。好ましくは、これがキシリトール利用の最初の
酵素であるものとしてキシリトールデヒドロゲナーゼが
不活性化の標的である。キシリトールデヒドロゲナーゼ
により触媒される可逆反応の平衡が、酵母細胞の内側に
存在する条件下でキシリトールの側に非常に強くシフト
されるため、キシルロースキナーゼの不活性化は高いキ
シリトール収量を確実にするのに十分である。両方の酵
素をコード化している遺伝子が不活性化の標的であるな
らば、キシリトールデヒドロゲナーゼの活性型（または
フラグメント）のいずれかの残っている低いレベルの発
現もキシルロースキナーゼ活性の欠損により宿主中で補
填されるであろう。
酵母からのこれらの遺伝子のクローニングの方法は技
術上周知である（実施例参照）。デヒドロゲナーゼまた
はキシルロースキナーゼに対してコード化された遺伝子
は例えば相当する突然変異株の相補によりエシャリキア
・コリ（Escherichia coli）または酵母中でクローン化
できる。クリーン化した遺伝子は酵母中から選択可能な
DNA配列をクローン化遺伝子のコード化領域、好ましく
はクローン化された遺伝子のそれぞれの末端からの数百
塩基対よりも小さくない距離において、挿入することに
より改良される。選択可能なマーカー（好ましくは抗生
物質耐性表現型を与える優性マーカー）は適当な制限部
位または置き換える操作をした崩壊した遺伝子のフラグ
メントのいずれかに挿入できる。得られたプラスミド構
造物は細菌中で増殖する。次に、適当な制限酵素がその
両方の末端にキシリトールデヒドロゲナーゼ（またはキ
シルロースキナーゼ）遺伝子配列を持ちそして中央の領
域に酵母選択性マーカー持つDNAフラグメントを切除す
るのに使用される。このDNAフラグメントは続いて酵母
菌株を形質転換して抗生物質耐性にするのに使用され
る。個々の形質転換体クローンを単一炭素源としてのキ
シロースを含む平板培地上での生長能力に対して検査す
る。好結果の遺伝子崩壊物は、最終的に、形質転換され
た菌株の相当する酵素活性を測定することによりおよび
／またはサザーンハイブリダイゼイション（Southern h
ybridization）として知られる方法による酵母染色体の
関係する領域の構造を分析することにより確認できる。
例えば、適当な改変は、酵母に対する優性選択マーカ
ー（dominant selective marker）を有するクローン化
した遺伝子の内部フラグメントの置換である。細菌性カ
ナマイシン耐性遺伝子またはプレオマイシン耐性遺伝子
をコード化するDNAは、酵母に対する有益な優性選択マ
ーカーの例である。このような構造物は酵母プロモータ
ー配列に作動可能に結合できるか、相同組換えの部位に
ある酵母プロモーターを利用できる。そのコード配列が
崩壊した遺伝子のプロモーターが使用される場合、所望
の翻訳読込フレームをもつ相においてコード化配列を挿
入するこれらの形質転換体のみが選択されるであろう。
それゆえ、既に構造物に作動可能な結合したプロモータ
ー配列を提供することはしばしばより都合がよい。形質
転換したDNAを含む細胞のスクリーニングが可能ないず
れかの他の遺伝子は、抗生物質耐性に対する遺伝子の代
わりに使用でき、それらは例えば必須蛋白をコード化す
る遺伝子である。
両方のDNA末端上に（キシリトールデヒドロゲナーゼ
またはキシルロースキナーゼ遺伝子の部分配列のよう
な）所望の標的の部分配列を有しおよびフラグメント内
側の選択的マーカーを有する直鎖DNAフラグメントを有
する酵母細胞の形質転換を行うことができる。このよう
な形質転換は相当する遺伝子中に欠失突然変異を有する
形質転換体の高い比率を生ずることが知られている。
他方、キシリトールデヒドロゲナーゼおよび／または
キシルロースキナーゼを発現できる天然酵母を保持する
ことが所望ならば、標的酵素の発現の選択的な抑制のた
めに提供する他の組換え法が使用できる。このような方
法は、例えばキシリトールデヒドロゲナーゼまたはキシ
ルロースキナーゼをコード化するmRNAのような適当な所
望の標的に対して作用するアンチセンスRNAまたはリボ
ザイムの構築を含む。アンチセンスRNAをコード化するD
NA構造物は標的のmRNAの配列と相補のDNA配列を有する
であろうし、およびこのような標的mRNAと認識しおよび
それとハイブリダイズ可能な十分な長さのものであり、
そのため宿主細胞中の標的mRNAの翻訳が妨げられる。適
当なリボザイムをコード化するDNA構造物もまた標的mRN
Aとハイブリダイズするに十分なDNA配列を持つであろう
が、しかし一度このようなmRNAとハイブリダイズされる
とこのリボザイム活性は、その中にコード化されている
活性蛋白質の翻訳を支持する、このようなmRNAの能力を
破壊する部位においてmRNAの開裂を触媒する（例えば、
ヨーロッパ特許321,201号参照）。アンチセンスRNA構造
物またはリボザイム配列は、技術上周知の方法を使用す
るいずれかの適当な酵母プロモーター配列と作動可能に
結合されてよく、および当業者にまた公知の慣用の形質
転換技術を使用する遺伝的に安定な手段で酵母宿主の中
に形質転換されてよい。このような構造物の発現は作動
可能な結合酵母プロモーターの特性により決定されるで
あろうし、および所望である種々の生長培地において構
成的または誘導的または抑制的であってよい。このよう
な構造物の利点は標的酵素を発現する天然宿主の能力を
破壊しないことである。このようなオフ／オン（off/o
n）手段で調節可能な構造物の発現を形成する利点は標
的を発現する宿主の能力が、キシリトール合成に対して
提供されることが望ましい場合にのみ妨げられるべき標
的の発現を大いに調節できることである。
本発明に従って構築された新規な酵母菌株の有効性は
さらに同じ酵母菌株または異なる酵母菌株からクローン
化された過度に発現したキシロースレダクターゼにより
さらに改良できる。酵母からキシロースレダクターゼ遺
伝子のクローニングの方法は何人かの著者によって記載
されている〔ハルボーン J.（Hallborn J.）ら,Bio/Te
chnology 9:1090−1094（1991）；タクマ（Takuma）
ら,Appl.Biochem.Biotechnol 28/29:327−340（199
1）；およびストレーサー（Strasser）ら，独国特許400
9676号（1991）〕。酵母のキシロース−キシリトール変
換に対するこのクローン化遺伝子を使用する方法もまた
記載されている〔ハルボーン J.（Hallborn J.）ら,Bi
o/Technology 9:1090−1094（1991）〕。クローン化さ
れたキシロースレダクターゼ遺伝子は選択した酵素種中
で繁殖できる適当なベクターに転移できる。例えばベク
ターに基づくpKD1は、K.マルキアナス（K.Marxianus）
〔ビアンチ.M.M（Bianchi,M.M）Curr.Genet.12:185−19
2（1987）〕の高いレベルの発現に対する好ましいベク
ター型である。キシロースレダクターゼ遺伝子は、選択
された酵母に有効な機能で公知である他のプロモーター
に対して交換されうる。本発明の変異酵母菌株はキシロ
ースレダクターゼ遺伝子の過度な発現に対して提供され
るベクター（類）による形質転換のための宿主として使
用できる。
全ての具体例では、どんなやり方でもそれらは製造さ
れ、得られた本発明の新規な酵母菌株は、天然の酵母菌
株と比較した場合に著しく低下したキシリトール代謝の
能力により特徴づけられる。このことは、キシリトール
デヒドロゲナーゼ活性および／またはキシルロースキナ
ーゼ活性のようなキシリトールの代謝の酵素の１または
それ以上が改変されたために、このような酵素の発現が
酵母の改変の結果として（永続的にまたは調節的手段
で）消失または低下する事実によるものである。エネル
ギー生産のために宿主により利用可能ないずれかの炭素
源は本発明の酵母の生長を維持するのに使用でき、およ
びキシロースの減少に対して、減少した相当量を供給す
るのに使用できる。この機能（減少したポテンシャルを
供給すること）は、多分本発明の方法に対して、宿主細
胞の生長を維持するよりも重要である。例えば、グルコ
ースは好ましくは宿主の生長を維持するのに必要である
と当業者に知られている量でエネルギー源として生長培
地に加えられる。通気および攪拌の生長条件は宿主に最
適となるべきである。
キシロースが本発明の宿主に供給される場合、キシロ
ース炭素は本質的にキシリトールとして「閉じ込めら
れ」、そして宿主のエネルギー要求に対して利用できな
い。この特徴のため、本発明の新規な菌株はキシリトー
ルの生産に非常に有益である。本発明の突然変異菌株は
キシロースに富む栄養溶液中で培養され、それらは高い
効率でキシロースをキシリトールに転換する。それらの
変換の効率および所望の方法に対する有益性は、いずれ
かのキシロース含有溶液および加水分解物、例えば純粋
キシロース溶液または使用したパルプ液のような木材加
工工業からの廃液または調理液体またはそれらのキシロ
ースに富む部分、を使用することにより評価され得る。
もっとも有効なキシリトール製造物質は収穫されおよび
工業規模のキシリトール製造に使用される。
このように高い収量でキシロースをキシリトールに代
謝する新規な菌株は上述した処理の結果として得られ
る。菌株のキシリトール代謝が不完全であるため、菌株
はキシトールを分解（質の低下または代謝または利用）
しないが、キシリトールは生長培地に集積し、例えば酵
母細胞の除去に続いてクロマトグラフィー的に、回収す
る。生長培地から純粋なキシリトールにする技術上周知
のいずれかの方法が使用できる（例えば、ここで参照に
より本明細書に含まれる米国特許5,081,026号）。
本発明は本発明を制限することを意図しない以下の実
施例により詳細に説明されるであろう。これに関係し
て、方法はキシリトール製造に関して最適でないが、顕
著な酵母菌株の違いに関して言及されるべきである。
実施例１ 新規な酵母菌株の作成 クルイベロマイセス・マルキシアナス（Kluyveromyce
s marxianus）ATCC8608をYDP培地、DYM培地またはDYM−
酒石酸培地でpH6.0および30℃で培養する。YDP培地（10
00ml）は酵母抽出物10g、グルコース20gおよびペプトン
20gを含む。DYM培地（1000ml）は（NH2）2SO4,5.0g、KH
2PO4,1.0g、MgSO4・7H2O,0.5g、NaC1,0.1gおよびCaCl2
・2H2O,0.1gを含む。DYM−酒石酸培地はNa2SO4,7.1g、
（NH4）２−酒石酸,27.6g、KH2PO4,6.8g、MgSO4・7H2O,
0.5g、NaCl,0.1gおよびCaCl2・2H2O,0.1gを含む。DYM培
地およびDYM−酒石酸培地は微量元素溶液（1:1000）、
ビタミン溶液（1:100）および炭素源を追加し；最後の
２要素はオートクレーブの後に加える。糖および糖アル
コールを別途20％の溶液（wt/vol）でオートクレーブ
し、およびビタミン混合物をろ過によって滅菌する。こ
のビタミン溶液（1000ml）はＬ−ヒスチジン・HCl・H
2O,100mg、ビオチン0.2mg、パントテン酸カルシウム40m
g、葉酸0.2mg、イノシトール200mg、ナイアシン40mg、
パラアミノ安息香酸20mg、塩酸ピリドキシン40mg、リボ
フラビン20mgおよび塩酸チアミン40mgを含む。微量元素
混合物（1000ml）はH3Bo3,500mg、CuSO4・5H2O,40mg、K
I,100mg、FeCl3・6H2O,200mg、MnSO4・H2O,400mg、Na2M
oO4・2H2O,200mgおよびZnSO4・7H2O,400mgを有する。
A.変異原性因子の処理 ａ）アクリフラビン0.001％（wt/vol）を有するDYM−グ
ルコース（１％wt/vol）培地100mlをクルイベロマイセ
ス・マルキシアナス ATCC8608で植菌し、震とう機で３
日間生長させる。細胞を遠心沈降させ、滅菌0.9％NaCl
100mlで洗浄し、新たなYDP培地500mlに再懸濁させ
る。一夜生長させた培養物をベノミル処理で使用するた
めにさらに２％グルコースの入ったDYM培地中に移す。
ｂ）エチルメタンスルホネート（EMS）変異原性因子に
対しては、YDP培地上で一夜生長させた培養物を遠心沈
降させそして細胞密度２×109/mlまで濃縮する。EMSを
加えて最終濃度30mg/mlにし、そして懸濁物を２時間15
分インキュベートする。この処理は約70％の酵母を死滅
させる。変異原性因子2mlで処理した細胞懸濁物をあら
たなYDP培地100mlで希釈し、２日間生長させた後、さら
にベノミル処理のためのグルコースを含むDYM培地中に
移す。
ｃ）同様に、いずれかの化学的または物理的変異原性因
子方法が使用できる。使用量は微生物の死滅率は10ない
し100％であるような方法で最適化する。処理の後微生
物は培養培地または生長に最適な場所に移す。その後そ
れを段階Ｂに進める。
B.ベノミル処理 アクリフラビンまたはEMSで突然変異誘発され、そし
て続いてグルコースを含むDYM培地中で生長させた細胞
を遠心分離によって収集し、新たなYDP培地に加えて細
胞密度108/mlの溶液を得る。ベノミル（10mg/ml）をジ
メチルスルホキシドに溶解し、ろ過によって滅菌しそし
て細胞懸濁物に導入して、100μg/mlの最終ベノミル濃
度を得る。培地を30℃で２日間震とうする。細胞を遠心
分離で収集し、滅菌0.9％NaClで二回洗浄し、そして５
倍体積の新たなYDP培地で再懸濁する。２日間の培養
後、ニスタチン強化に使用するために培養物をグルコー
スの入ったDYM培地に移す。ベノミル処理の有効性を続
いて二核を持つ細胞の頻度を顕微鏡的に判断することに
より行う。顕微鏡的な評価の前に酵母細胞を酢酸−ホル
ムアルデヒド−アルコールで固定し、およびストレイボ
ロヴァ（Streiblova）〔Yeast,A Practical Approac
h,I.キャンベル（I.Campbell）およびJ.A.ダッフス（J.
A.Duffus）編,IRLプレス，オックスフォード（1988）〕
に詳細に記載されている、HCl−ギームザ（HCl−Giems
a）で染色する。同様に、染色体分裂または微小管形成
を妨げる幾つかの他の化合物が使用できる。
C.抗生物質による強化 グルコース中で生長した突然変異誘導された、および
ベノミルで処理された細胞を遠心沈降させ、塩水溶液で
洗浄し、炭素源のないDYM培地に再懸濁して107/mlの細
胞密度の液を得る。８ないし15時間の飢餓状態の後、10
0ml当りキシロース1gを添加する。微生物を死滅させる
ためにニスタチンをエタノールに懸濁する（1mg/ml）
（その低い溶解度によりろ過できない。）。懸濁物を滅
菌水に1:10で希釈しキシロース添加の15時間後、培養物
（10％vol/vol）に加える。殺菌効果を刺激するため
に、他の炭素源のパルスをニスタチンとともに加える。
30℃の震とう機での培養を２時間以上続け、その後細胞
を収集し生理食塩水で洗浄する。洗浄したペレットをYD
P培地の最初の量で再懸濁させる。生存酵母細胞が回収
された場合（１ないし３日間）、培養物を単一炭素源と
してグルコースの入ったDYM培地に移す。ニスタチン処
理の死滅割合は処理の前および後の平板菌数（YDP培
地）により監視する;99.999％より大きい数の細胞が死
滅する。炭素源の不在下ではニスタチンは細胞の０ない
し40％をそれぞれ死滅させる。同様に、殺菌効果が生長
細胞のみに作用する他の抗生物質が使用できる。
D.突然変異原因子を指示する部位 酵母キシリトールデヒドロゲナーゼをクローンニング
する方法は〔コッター,P（Kotter）ら,Curr.Genet.18:4
93−500（1990）〕ならびに異なる酵母種からのキシル
ロースキナーゼ酵素をクローニングする方法〔ホ,N.W.Y
（Ho,N.W.Y）ら,Enzyme Microbiol.Technol.11:417−4
21（1989）〕；スティービス,E.P（Stevis E.P.）ら,Ap
plied and Envioronmental Microbiol 53:2975−29
77（1987）〕に記載されている。酵母の組込み的形質転
換に対して優勢な選択性マーカーの適当な材料は、例え
ばプラスミドpUT332〔ガティグノル,A.（gatignol A.）
ら,Gene 91:35−41（1990）〕である。キシリトールデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子中に挿入されたフレオマイシン耐
性マーカーを含むプラスミドの構築は慣用の組換えDNA
法により行うことができる。酵母染色体中のキシリトー
ル−異化遺伝子の突然変異性アレルを導入するために多
くの形質転換方法が使用でき、例えば塩化リチウム処理
した酵母細胞の形質転換または適当な酵素調剤〔例えば
リチカーゼ（lyticase）〕で酵母細胞壁を溶かすことに
よって製造する酵母スフェロプラストの形質転換であ
る。いくらかの酵母に対しては電気穿孔方が好ましい形
質転換方法である。形質転換物は1mlあたりフレオマイ
シン５−20μｇを含む強化培地プレートの上で選択さ
れ、さらにそれらのキシリトール合成能力に対してスク
リーニングされる。
E.突然変異体のスクリーニング ニスタチン処理からの潜在的な突然変異体を、１当
り、グルコース100mgおよびキシロース10gを含むDYM寒
天上に平板培養する。その結果それらの炭素源としてキ
シロースを使用できない突然変異体が単に小さいコロニ
ーとして増殖する。それらの部分に対して、キシロース
代謝性酵母は限定した炭素でなくそのため大きなコロニ
ーに生長する。小さいコロニーは取り出され、そしてYD
P培地寒天の上で再培養される。グルコース、キシロー
スおよびキシルロース上で生長する単離された変異体菌
株の能力は先ずYDP液体培地で植菌したものを一夜生長
させて決定する。次に培養物一杯を種々の炭素源（グル
コース、キシロースまたはキシルロース）の入ったDYM
−酒石酸培地25mlに移す。２または３日後、変異体の生
長および野生菌株の生長がA600において測定される。潜
在的な有用変異株はグルコース上で容易に生長するが、
キシロースを使用できない。この性質を持つ菌株はさら
に特徴付けされる。
他の研究に対する変異体菌株はYDP培地で一夜培養さ
れそして次に生長基質としてグルコース0.5ないし1.0％
およびキシリトール製造に対する基質として供給される
キシロース1.0ないし5.0％を含む培地に移される。培養
物を植菌後３日および７日に糖及び糖アルコールの分析
用に採取する。試料は0.2pmフィルターを通して細胞お
よび沈澱物を除去しそして、ろ液を希釈してHPLCにより
分析する。使用したカラム（長さ25cm、直径8mm）バイ
オ ラド アミネックス マイクロガード（Bio Rad Am
inex MicroGuard）社（アメリカ合衆国，カリフォルニ
ア州，リッチモンド）で製造された脱灰した（deashin
g）カートリッジはCa2+型の強陽イオン交換樹脂であ
る。カラム温度は85℃であり、およびH2Oで0.6ml/分の
割合で溶離される。注入容積は10μｌでありおよび化合
物の溶離後RIディテクターで検出される。外部的な標準
的方法が使用される。
キシロースを利用するクルイベロマイセス・マルキシ
アナス，マルキシアナス変種例えばCBSC12菌株、ブルガ
リカス変種例えばATCC16045菌株およびラクティス変種
菌株は有用な出発菌株である。同様に、キシロースで生
長する他のK.マルキシアナス亜種または亜株は変異体の
製造に使用できる。最初に酵母菌株の突然変異誘発がい
ずれかの突然変異原因子により最大限に行われる。処理
時間または強度（例えば、化学的突然変異原性因子の濃
度、紫外線照射に対する強度もしくは距離）を変化させ
ることによって、10％を超えるが100％より少ない生物
を死滅させる使用量が決定される。突然変異誘発された
酵母はベノミルまたは微細管形成を妨げる幾らかの他の
化合物の存在下で生長させる（半致死濃度）。一倍体酵
母菌株はベノミル処理または同等の処理は必要でない。
培養物は、所望の変異体もまた生長が可能である生長基
質として炭素源を使用する新たな生長培地に移される。
生長が開始した後、飢餓状態にするため細胞を炭素源の
ない培地に移動する。キシロースまたはキシリトールな
らびに生長する細胞を死滅させる抗生物質（例えばニス
タチン）を添加する。キシロースの存在下での処理が非
突然変異誘発性細胞を約100％死滅させるが、炭素源な
しでは90％より少なく死滅させるような方法に先立ち、
抗生物質の濃度および処理時間は最適化される。キシロ
ースまたはキシリトール上で生長する細胞は殺されるが
所望の突然変異体は生きている。適当な種類の突然変異
体は、ここより前に示されたように生きている細胞から
スクリーニングされる。
酵素活性および酵母のキシリトール製造能力は実施例
２ないし４に記載した方法により測定する。
実施例２ 新規な酵母菌種の酵素活性 キシロース／キシリトール代謝に影響を及ぼすもっと
も顕著な酵素の活性は出発菌株および新規な酵母菌株に
対して以下の方法で測定される。
クルイベロマイセス・マルキシアナスはYDP培地50ml
中で一夜生長させ、炭素源および／または誘導物質とし
てキシロース10gおよびグルコース20gを有するDYM−酒
石酸培地１に対する植菌物として使用される。生長２
日後、培養物を遠心分離し、そしてペレットはセーレン
セン（Sorensen）リン酸緩衝液、pH7で洗浄し残りの糖
を除去する。細胞を同じ緩衝液で再度で懸濁し、−20℃
においてＸ−プレス（Ｘ−Press）を通して５回の通過
で破壊する。DNアーゼ（DNase）タイプＩ（50mg/ml）を
溶かした抽出物に添加しそして混合物を室温で１時間イ
ンキュベートする。得られた粗抽出物を185000×ｇで60
分間遠心分離する。測定される酵素は上澄み液に可溶で
残っている。タンパク質濃度はローリー（Lowry）法
〔J.Biol.Chem.193:265−275（1951〕で測定する。
キシロースレダクターゼ活性はNADPHの酸化によっ
て、分光光度計で340nmで測定される。反応混合物は50m
Mトリス−HCl緩衝液pH7.5,700μｌ、100mMキシロース,1
00μｌ、希釈した細胞抽出物,100μｌ、および１μＭ
NADPH,100μｌを含む。反応は還元型ヌクレオチドを加
えることにより開始しそして約２分間続ける。初期の反
応割合は特定のキシロースレダクターゼ活性を測定する
ことに使用される。
キシリトールデヒドロゲナーゼ活性は続くNADHのNAD
への酸化により測定され、該反応はキシルロースのキシ
リトールへの還元に連結する。キシロースおよびNADPH
の代わりにキシルロースおよびNADHをそれぞれ使用する
ことを除いて、測定はキシロースレダクターゼ測定と同
様に行われる。
得られた結果は表１に示される。
実施例３ 新規な酵母菌株によるキシリトールの生成 キシロースの供給源としてキシロースの水溶液を使用
して震とうフラスコ中で実施例１に記載された方法で醗
酵を行う。グルコースをエネルギーおよび炭素源として
醗酵ブロス（broth）に加える。フラスコを攪拌し効率
的に通気する。
出発菌株および新規な突然変異性酵母菌株についての得
られた結果を表１に示す。
変異体II−１ないしII−６について得られた結果は、
これらの宿主が未だキシリトールデヒドロゲナーゼ活性
を保持するため、キシルロースキナーゼ遺伝子における
突然変異からなる。
実施例４ より大きい規模におけるキシリトールの生成 より大きい規模におけるキシリトールの製造に対する
出発菌株および新規な酵母菌株の能力もまた研究され
る。醗酵中に使用される全ての化学物質は工業銘柄のも
のである。異なる２つの堅材種を使用する亜硫酸工程か
らのパルプ状廃液をキシロース源として使用する。菌を
植菌したものを酵母のコロニーをYMブロス（100ml）に
移すことによって培養し、培養は震とう機（200rpm）
中、30℃で１日間行われる。培養物は次にグルコース30
g/を含むNH4−酒石酸900ml緩衝培地pH6.0に移され
る。菌を植菌したものを震とう機（200rpm）中、30℃で
１日間再度生長させ、次に無菌的に培養機に移す。
キシロース、キシリトール、エタノールおよびグルコ
ースを実施例１で記載した方法でHPLCによって分析す
る。細胞量は乾物量測定によって決定される。醗酵ブロ
スを遠心分離し、細胞量を水で洗浄し、105℃で一夜乾
燥する。
容量分析的なキシリトール製造割合はキシロース消費
の初期に要求される時間を無視する方法で測定されるキ
シリトール収量は製造されたキシリトールに対する消費
されたキシロースの割合として計算される。
醗酵パラメータは以下に示される:pH6.0（25％NaO
H）、500rpmで激しく攪拌、通気4.0Nl/分（vvm）および
温度30℃ 生長培地の組成は以下の通りである。
グルコース 240g CSL〔コーンスティープリカー〕 250g （corn steep liquor 45.5％,d.s.〕 （NH4）2SO4 20g （NH4）2HPO4 20g KH2PO4 8g MgSO4・7H2O 8g H2O ５ キシロース約600g/5（12−13％） 結果を表２に示す。
特定のキシトール製造割合は括弧中（ｇキシリトール
/g酵母）に示される。
得られた結果は新しい酵母菌株が出発菌株に比べてキ
シリトールの優れた生産材であることを示す。
このように、本発明の方法を使用して、キシリトール
デヒドロゲナーゼ（XDH）、またはキシロースキナーゼ
あるいはそれら両方の特定の活性が前記酵母菌株の有す
るものより顕著に低く、そしてこれらのものよりキシロ
ースからより多くのキシリトールを製造できるクルイベ
ロマイセス・マルキシアナスの幾つかの突然変異菌株が
獲得される。
実施例５ 組換えDNA方法によるアンチセンスRNA酵母菌株の構築 所望の酵母宿主からの酵母のキシリトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子またはキシロースキナーゼ遺伝子は、これ
らの遺伝子のクローニングに対する技術上周知の方法に
従ってクローン化できる〔コッター,P（Kotter,P）ら,C
urr.Genet.18:493−500（1990）：ホー.N.W.Y（Ho.N.W.
Y）ら,Enzyme Microbiol.Technol.11:417−421（198
9）；スティビス,P.E（Stevis,P,E）ら,Applied and
Envioronmental Microbiol.53:2975−2977（198
7）〕。他方、最初の酵母種からのキシリトールデヒド
ロゲナーゼまたはキシルロースキナーゼのクローン化遺
伝子は、第二の酵母種からの遺伝子を、この遺伝子がそ
れらをクロスハイブリダイズするのを可能にする十分相
補性がある場合に、同定ならびにクローン化するのに使
用でき；例えば、最初の実験に示したように、サザンブ
ロット分析を使用して、第二の、所望の酵母宿主の制限
消化されたゲノムDNAに対するハイブリダイゼーション
のためのプローブとして最初の酵母宿主からクローン化
されたDNAを使用することである。クローン化DNAから、
相補的な配列は所望の酵素に対してコード化された配列
とハイブリダイズするであろうことが予測される。Olig
onucleotide synthesis,A Practical Approach,MJ.
ガイト（M.J.Gait）編,IRLプレス，オックスフォード,1
984年に記載されているように、この配列はイン・ビト
ロで化学的手段により合成できる。アンチセンス配列
は、正確なコード化配列を知らない場合でさえ、所望の
遺伝子配列を指示するいずれかのクローン化DNAから得
ることが可能である。好ましくはそのようなクローン化
されたDNAは一つの鎖が「有意な」（コード化）DNA一本
鎖〔‘sense'or（coding）strand〕であり、もう一つの
鎖がアンチセンス（非コード化）鎖〔antisence（non−
coding）strand〕である二本鎖形態である。アンチセン
ス構築物は上記に記載したおよび技術上周知の技術を使
用して、アンチセンス（非コード化）配列を有するRNA
の転写を生じる方法で、所望の酵母プロモーターにこの
ような二本鎖DNAを作動可能に結合することにより、設
計される。好ましくは、アンチセンスDNAは酵母キシリ
トールデヒドロゲナーゼプロモーターまたはキシルロー
スキナーゼプロモーターを供給する配列と作動可能に結
合し、このため標的とされる酵素に対するmRNAの発現が
生じるこれらの条件下でアンチセンスRNAの発現が生じ
る。
このようなアンチセンス構築物は、酵母宿主例えば、
キャンディダ（Candida）種、ハンセヌラ（Hansenula）
種、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）種、ピチア
（Pichia）種またはパチソレン（Pachysolen）種の酵
母、好ましくはクルイベロマイセス・マルキシアナス
（Kluyveromyces marxianus）およびキャンディダ・ユ
ーティリス（Candida utilis）種ならびに、最も好まし
くは、クルイベロマイセス・マルキシアナス，マルキシ
アナス変種（Kluyveromyces marxianus var.marxianu
s）、クルイベロマイセス・マルキシアナス，ブルガリ
カス変種（Kluyveromyces marxianus var.bulgaricus）
およびクルイベロマイセス・マルキシアナス，ラクティ
ス変種（Kluyveromyces marxianus var.lactics）に形
質転換された、ベクターを提供し、さらに抗生物質、例
えば既に記載したニスタチン、の上で生長できる。酵母
は前に記載したように生長させ、ならびに突然変異株は
生長にキシロースを使用できない、またはキシロース上
で非常に乏しく生長するがグルコース上で生長できると
するさらなる検討について選択される。
実施例６ 組換えDNA法による酵母菌株リボザイムの構築 所望の酵母宿主からの酵母のキシリトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子またはキシロースキナーゼ遺伝子は、技術
上周知の方法に従ってクローン化できる〔コッター,P
（Kotter,P）ら,Curr.Genet.18:493−500（1990）：ホ
ー.N.W.Y（Ho.N.W.Y）ら,Enzyme Microbiol.Technol.1
1:417−421（1989）；スティビス,P.E（Stevis,P,E）
ら,Applied and Envioronmental Microbiol.53:2975
−2977（1987）〕。他方、ある酵母種からのキシリトー
ルデヒドロゲナーゼまたはキシルロースキナーゼのクロ
ーン化遺伝子は、別の酵母種からの遺伝子を、この遺伝
子がそれらをクロスハイブリダイズするのを可能にする
十分相補性がある場合に、同定ならびにクローン化に使
用でき；例えば最初の実験に示したように、サザンブロ
ット分析を使用して、第二の、所望の酵母宿主の制限消
化されたゲノムDNAに対するハイブリダイゼーションの
ためのプローブとして最初の酵母宿主からクローン化さ
れたDNAを使用する。相補的な配列はクローン化DNAの配
列から、それがアンチセンスRNA構築物を伴うものとし
ての所望の酵素に対してコード化された配列とハイブリ
ダイズするであろうことが予測される。Oligonucleotid
e synthesis,A Practical Approach,MJ.ガイト（M.
J.Gait）編,IRLプレス，オックスフォード,1984年に記
載されているように、この配列はイン・ビトロで化学的
手段により合成できる。好ましくはそのようなDNAは一
つの鎖が「有意な」（コード化）DNA一本鎖〔‘sense'o
r（coding）strand〕であり、もう一つの鎖がアンチセ
ンス（非コード化）鎖〔antisence（non−coding）stra
nd〕である二本鎖形態であるクローン化DNAから得られ
る。本発明のリボザイム構築物はヨーロッパ特許321,20
1号に示唆されるテトラヒメナ（Tetrahymena）リボザイ
ムのようなリボザイムの触媒活性、および所望の標的mR
NAのmRNAに対して作用するアンチセンスRNA配列の十分
な長さを有し、このため本発明アンチセンスRNA構築物
は標的とされるmRNAにハイブリダイズし、ならびにリボ
ザイムを配置して、mRNAを開裂して非常に小さいので活
性酵素を提供できない形態にするであろう。リボザイム
構築物は上記に記載したおよび技術上周知の技術を使用
して、リボザイム−アンチセンスRNAの転写を生じる方
法で、所望の酵母プロモーターにこのような二本鎖DNA
を作動可能に結合することにより、設計される。好まし
くは、リボザイム−アンチセンスDNAは酵母キシリトー
ルデヒドロゲナーゼプロモーターまたはキシルロースキ
ナーゼプロモーターを供給する配列と作動可能に結合
し、このため標的とされる酵素に対するmRNAの発現が生
じるこれらの条件下でアンチセンスRNAの発現が生じ
る。
このようなリボザイム構築物は、酵母宿主例えば、キ
ャンディダ種、ハンセヌラ種、クルイベロマイセス種、
ピチア種またはパチソレン種の酵母、好ましくはクルイ
ベロマイセス・マルキシアナスおよびキャンディダ・ユ
ーティリス種ならびに、最も好ましくは、クルイベロマ
イセス・マルキシアナス，マルキシアナス変種、クルイ
ベロマイセス・マルキシアナス，ブルガリカス変種およ
びクルイベロマイセス・マルキシアナス，ラクティス変
種に形質転換された、ベクターを提供し、さらに抗生物
質、例えば既に記載したニスタチン、の上で生長でき
る。酵母は前に記載したように生長させ、ならびに突然
変異株は生長にキシロースを使用できない、またはキシ
ロース上で非常に乏しく生長するがグルコース上で生長
できるとするさらなる検討について選択される。
今や十分記載された本発明をもって、当業者により、
広くそして同等の範囲で条件、パラメーター等を行うこ
とが可能な範囲で、本発明の精神もしくは範囲またはそ
のいかなる具体例を影響することなく、それらを理解す
べきである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:645 (Ｃ１２Ｐ 7/18 1:84 Ｃ１２Ｒ 1:78） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:84） (56)参考文献 特開 昭60−145095（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−196096（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−138192（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−52884（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−143387（ＪＰ，Ａ) 国際公開85／3949（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｂｒｅｗ．Ｃｈｅ ｍ．，1985年，Ｖｏｌ．43，Ｎｏ．２, ｐ．84−90 Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ．，1990年，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ. １，ｐ．56−59 Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，1988 年，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１，ｐ．83−86 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 7/18 C12N 1/19 C12N 9/00 - 9/94 C12N 15/52 - 15/61 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩ （ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】酵母宿主からのキシリトールの製造のため
    の方法であって、該方法が、 a.キシリトールを合成できおよび代謝できる酵母宿主を
    選択し、該酵母宿主はカンジダ（Candida）属、ハンセ
    ヌラ（Hansenula）属、クルイベロマイセス（Kluyverom
    yces）属およびピチア（Pichia）属からなる群から選択
    され； b.段階（ａ）の前記酵母における前記キシリトール代謝
    に関与する１またはそれ以上の酵素の発現を改変して、
    前記キシリトールの前記代謝を低下させまたは除去さ
    せ； c.前記キシリトールの前記合成および集積を与える有効
    な新しい条件において、段階（ｂ）の前記酵母を増殖さ
    せ；ならびに d.段階（ｃ）で製造されたキシリトールを回収すること
    からなる方法。
  2. 【請求項２】前記酵母株が非病原性である請求項１に記
    載の方法。
  3. 【請求項３】段階（ｂ）の前記改変がキシリトールデヒ
    ドロゲナーゼ、またはキシルロースキナーゼ、あるいは
    キシリトールデヒドロゲナーゼおよびキシルロースキナ
    ーゼの両方をコードしている遺伝子の発現を除去または
    低下させる請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】段階（ｂ）の前記改変が前記酵母を変異原
    性因子または染色体分裂または微小管形成を阻害する作
    用因子に曝すことを含む請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】染色体分裂または微小管形成を阻害する前
    記作用因子がベノミル（benomyl）である請求項４に記
    載の方法。
  6. 【請求項６】段階（ｂ）の前記改変が前記酵母の遺伝子
    において挿入、欠失または点変異を生ずる作用因子に曝
    すことを含む請求項３に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記作用因子がアクリフラビン、エチルメ
    タンスルホネート、紫外線照射およびＸ線照射からなる
    群から選択される請求項４ないし６のいずれか一つに記
    載の方法。
  8. 【請求項８】段階（ｂ）の前記改変が、遺伝子工学的方
    法により、前記キシリトール代謝に関与する１またはそ
    れ以上の酵素を発現する酵母宿主の能力を改変すること
    を含む請求項1,3,4または６に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記遺伝子工学的方法が遺伝子破壊である
    請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記遺伝子工学的方法が、前記キシリト
    ール代謝の酵素に対して作用するリボザイムまたはアン
    チセンスRNAをコードしている組換え型DNA構築物によ
    り、段階（ａ）の前記酵母を形質転換することを含む請
    求項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記酵母が、クルイベロマイセス マル
    キシアナス（Kluyveromyces marxianus）およびカンジ
    ダ ユーティリス（Candida utilis）からなる群から選
    択される請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記クルイベロマイセス マルキシアナ
    ス（Kluyveromyces marxianus）が、クルイベロマイセ
    ス マルキシアナス変種マルキシアナス（Kluyveromyce
    s marxianus var.marxianus）、クルイベロマイセス
    マルキシアナス変種ブルガリカス（Kluyveromyces marx
    ianus var.bulgaricus）およびクルイベロマイセス マ
    ルキシアナス変種ラクティス（Kluyveromyces marxianu
    s var.lactics）からなる群から選択される請求項11に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記酵母が、キシルロースキナーゼ遺伝
    子および／またはキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
    が変異された突然変異体から選択される請求項12に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】前記方法がさらに段階（ｂ）の前記酵母
    を抗生物質中で増殖させることからなる請求項1,3,4,6
    または８に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記抗生物質がニスタチン（nystatin）
    である請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記段階（ｂ）が、さらに高キシロース
    および低グルコースの増殖基質中における増殖および選
    択を含む請求項1,3,4,6または８に記載の方法。
  17. 【請求項１７】段階（ｃ）において、基質がキシロース
    を含む溶液である請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】相当する野生型酵母株と比較して低下し
    たキシリトールを代謝する能力を有する改変酵母株であ
    り、そして該酵母株を増殖させるために使用される媒体
    中にキシリトールを集積することができる改変酵母株で
    あって、および a.キシリトールを合成できおよび代謝できる酵母宿主を
    選択し、該酵母宿主はカンジダ（Candida）属、ハンセ
    ヌラ（Hansenula）属、クルイベロマイセス（Kluyverom
    yces）属およびピチア（Pichia）属からなる群から選択
    され； b.段階（ａ）の前記酵母における前記キシリトール代謝
    に関与する１またはそれ以上の酵素の発現を改変して、
    前記キシリトールの前記代謝を低下させまたは除去さ
    せ； c.前記酵母の選択を許容する条件において、段階（ｂ）
    の前記酵母を増殖させることを含む方法によって製造さ
    れる改変酵母株。
  19. 【請求項１９】前記酵母がクルイベロマイセス マルキ
    シアナス（Kluyveromyces marxianus）およびカンジダ
    ユーティリス（Candida utilis）からなる群から選択
    される請求項18に記載の改変酵母株。
  20. 【請求項２０】前記クルイベロマイセス マルキシアナ
    ス（Kluyveromyces marxianus）が、クルイベロマイセ
    ス マルキシアナス変種マルキシアナス（Kluyveromyce
    s marxianus var.marxianus）、クルイベロマイセス
    マルキシアナス変種ブルガリカス（Kluyveromyces marx
    ianus var.bulgaricus）およびクルイベロマイセス マ
    ルキシアナス変種ラクティス（Kluyveromyces marxianu
    s var.lactics）からなる群から選択される請求項19に
    記載の改良酵母株。
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