CN110382684A - 产生木糖醇的梅奇酵母种 - Google Patents

产生木糖醇的梅奇酵母种 Download PDF

Info

Publication number
CN110382684A
CN110382684A CN201780087068.XA CN201780087068A CN110382684A CN 110382684 A CN110382684 A CN 110382684A CN 201780087068 A CN201780087068 A CN 201780087068A CN 110382684 A CN110382684 A CN 110382684A
Authority
CN
China
Prior art keywords
metschnikowia
xylose
plum surprise
surprise yeast
xylitol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780087068.XA
Other languages
English (en)
Inventor
罗宗丽
亨德里克·尤尔根斯·詹森范弗伦
艾伦·乔治·德波诺
安德鲁·塔普林·弗格森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Creatus Biosciences Inc
Original Assignee
Creatus Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Creatus Biosciences Inc filed Critical Creatus Biosciences Inc
Publication of CN110382684A publication Critical patent/CN110382684A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01009—D-Xylulose reductase (1.1.1.9), i.e. xylitol dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01113—L-Xylose 1-dehydrogenase (1.1.1.113)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01307—D-Xylose reductase (1.1.1.307)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了以加拿大国际保藏中心(IDAC)登记号No.081116‑01指定的梅奇酵母(Metschnikowia)株和从中来源的、表达至少一种木糖还原酶、至少一种木糖转运蛋白并且包含使木糖醇脱氢酶活性减弱的遗传修饰的株用于在从木糖生产木糖醇中的用途，以及用于从中生产木糖醇的组合物和方法。

Description

产生木糖醇的梅奇酵母种
相关申请的交叉引用
本发明申请主张2016年12月21日提交的美国临时专利申请No.62/437,606的优先权益，该专利申请的内容以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本发明涉及分子生物学和微生物学领域。本文提供了当培养时，从木糖产生木糖醇的梅奇酵母(Metschnikowia)种，以及制备和使用这些梅奇酵母(Metschnikowia)种的方法。
参考序列表
本发明申请包含以ASCII格式，通过EFS-Web提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。2017年12月19日所创建的所述ASCII拷贝的名称为14305-001-228_Sequence_Listing.txt并且大小为170,340字节。
发明背景
木糖是作为生产生物衍生化学品的可再生原料存在于的木质纤维生物质中的丰富的糖。然而，木质纤维生物质的使用和生物衍生化学品的生产受微生物中天然的低木糖吸收的限制。因此，可以使用木糖来生产生物衍生化合物，如木糖醇的微生物是尚未满足的需要。
木糖醇是广泛用作糖的低热值、低-碳水化合物的替代的五-碳糖醇(Drucker等人,Arch of Oral Biol.24:965-970(1979))。木糖醇的甜度与蔗糖大致相同，但是卡路里低33％。已报道木糖醇不影响糖尿病患者和高血糖个体的胰岛素水平。据报道木糖醇的消耗还有益于口腔卫生，其降低了龋齿的发病率。例如，据报道口香糖中的木糖醇抑制变形链球菌(Streptoccocus mutans)的生长(Haresaku等人,Caries Res.41:198-203(2007))，并且降低了急性中耳感染的发病率(Azarpazhooh等人,Cochrane Database of SystematicReviews 11:CD007095(2011))。此外，已报道木糖醇抑制健康牙齿釉质的脱矿并且使受损牙釉质再矿化(Steinberg等人,Clinical Preventive Dentistry 14:31-34(1992)；Maguire等人,British Dental J.194:429-436(2003)；Grillaud等人,Arch ofPediatrics and Adolescent Medicine 12:1180-1186(2005))。
商业上，可以通过木糖的化学还原来生产木糖醇，尽管这可以存在与从水解产物中分离和纯化木糖或木糖醇有关的困难。已描述了用于生产木糖醇的微生物系统(Sirisansaneeyakul等人,J.Ferment.Bioeng.80:565-570(1995)；Onishi等人,Agric.Biol.Chem.30:1139-1144(1966)；Barbosa等人,J.Ind.Microbiol.3:241-251(1988)；Gong等人,Biotechnol.Lett.3:125-130(1981)；Vandeska等人,WorldJ.Microbiol.Biotechnol.11:213-218(1995)；Dahiya等人,Cabdirect.org 292-303(1990)；Gong等人,Biotechnol.Bioeng.25:85-102(1983))。例如，已将来自假丝酵母属(Candida)的酵母描述为对于木糖醇生产是有用的。然而，假丝酵母种(Candida spp.)可以是条件致病菌，因此这些生物在与食品有关的过程中的使用是不期望的。
本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种、方法和组合物满足这些需要并且提供了其它相关优势。
发明概述
本文提供了具有木糖醇途径的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。当在具有木糖的培养基中培养时，这些梅奇酵母(Metschnikowia)种可以从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所述的木糖醇途径包括木糖还原酶，其将木糖转化为木糖醇。另外，在一些实施方式中，所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括对木糖醇脱氢酶的遗传修饰，其通常将木糖醇转化为木酮糖。因此，在一些实施方式中，本文提供了分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其具有至少一个编码木糖还原酶的外源核酸，或者作为另外一种选择或另外的，具有至少一个导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶过表达的外源核酸。在一些实施方式中，本文还提供了分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其具有使所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶活性减弱或失活的遗传修饰。在一些实施方式中，本文提供了分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其具有：(a)至少一个编码木糖还原酶或者导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶过表达的外源核酸；和(b)使所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶活性减弱或失活的遗传修饰。
本文还提供了可以以特定速率从木糖产生木糖醇的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。例如，在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少0.50g/L/h，至少0.60g/L/h，至少0.70g/L/h，至少0.80g/L/h，至少0.90g/L/h，至少1.00g/L/h，至少1.50g/L/h，至少2.00g/L/h，至少2.50g/L/h，至少3.00g/L/h，至少3.50g/L/h，至少4.00g/L/h，至少5.00g/L/h，至少6.00g/L/h，至少7.00g/L/h，至少8.00g/L/h，至少9.00g/L/h或至少10.00g/L/h的木糖醇。
本文还提供了可以以特定浓度从木糖产生木糖醇的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。例如，在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少75g/L，至少80g/L，至少85g/L，至少90g/L，至少95g/L，至少100g/L，至少110g/L，至少120g/L，至少130g/L，至少140g/L，至少150g/L，至少160g/L，至少170g/L，至少180g/L，至少190g/L，至少200g/L，至少250g/L或至少300g/L的木糖醇。
本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是选自下列的梅奇酵母(Metschnikowia)种：美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、核果梅奇酵母(Metschnikowia fructicola)、金佩梅奇酵母(Metschnikowia chrysoperlae)、瑞氏梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)、Metschnikowia andauensis、山西梅奇酵母(Metschnikowia shanxiensis)、中国梅奇酵母(Metschnikowia sinensis)、Metschnikowia zizyphicola、二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)、Metschnikowia lunata、佐贝尔梅奇酵母(Metschnikowia zobellii)、澳洲梅奇酵母(Metschnikowia australis)、Metschnikowia agaveae、Metschnikowia gruessii、夏威夷梅奇酵母(Metschnikowia hawaiiensis)、克里斯梅奇酵母(Metschnikowia krissii)、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-85株和梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-89株。在具体的实施方式中，所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种是于2016年11月8日，根据布达佩斯条约的条款，在作为国际保藏中心的加拿大国际保藏中心以指定登记号No.081116-01保藏的梅奇酵母(Metschnikowia)种。
在一些实施方式中，被引入所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种中的所述至少一个编码木糖还原酶的外源核酸是异源核酸。
在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有选自SEQ ID NO：11-18的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或者与SEQ IDNO：11具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括遗传修饰，其中所述遗传修饰包括编码所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶或其部分的至少一个等位基因的缺失。在具体的实施方式中，所述遗传修饰包括编码所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶或其部分的两个等位基因的缺失。
在一些方面，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种还包括编码木糖转运蛋白或导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白过表达的至少一种外源核酸。在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有选自SEQ ID NO：27-40的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：27-36中任一项所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：27-36中任一项具有至少30％的序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，本文提供了用于产生木糖醇的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种在一定条件下培养足够的一段时间以从木糖产生木糖醇。所述方法可以包括在具有木糖和C3碳源、C4碳源、C5碳源、C6碳源或它们的组合的培养基中培养所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，所述条件包括在包含木糖和选自纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、乙醇、乙酸酯、阿糖醇、山梨糖醇和甘油或它们的组合的共基质的培养基中培养所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。在具体的实施方式中，所述共基质为葡萄糖。在另一个具体实施方式中，所述培养基包含木糖和纤维二糖的组合，或者木糖和半乳糖的组合，或者木糖和甘油的组合。所述培养条件还可以包括好氧培养条件。所述培养可以包括分批培养、补料-分批培养或者连续培养。在一些实施方式中，所述方法包括使用(例如)提取、连续液-液萃取、渗透气化、膜滤法、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、提取过滤、离子交换色谱、吸附色谱或超滤将木糖醇与培养中的其它组分分离。
在一些方面，本文提供了通过本文所提供的方法所产生的生物衍生木糖醇。
在一些方面，本文提供了具有本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的组合物。另外或者作为另外一种选择，本文还提供了具有本文所提供的生物衍生木糖醇的组合物。在一些实施方式中，所述组合物是包含木糖的培养基。在具体的实施方式中，所述组合物是从中已除去了本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的培养基。
在一些实施方式中，所述组合物包括作为来自本文所述的方法的杂质的甘油、阿糖醇、C7糖醇或它们的组合。在具体的实施方式中，所述C7糖醇是庚七醇或其异构体。在一些实施方式中，所述甘油或阿糖醇，或者两者的量比通过除本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种以外的微生物所产生的相应的甘油或阿糖醇，或者两者的量大至少10％、20％、30％或40％。
附图说明
图1显示了野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)M2株从木糖生产木糖醇的产量。YP+4％木糖表示具有4％木糖的酵母提取物蛋白胨培养基。YP+10％木糖表示具有10％木糖的酵母提取物蛋白胨培养基。
图2显示了用于从木糖进行生产的示例性木糖醇途径。通过木糖还原酶(XR)发生了木糖还原为木糖醇，并且通过使编码木糖醇脱氢酶(XDH)的XYL2基因的缺失来防止木糖醇向木酮糖的转化。木糖转运蛋白(XT)和木糖还原酶(XR)的过表达提高了木糖醇的产量。共基质的使用支持了细胞代谢并且提供了用于木糖还原酶的氧化还原平衡。
图3显示了用于H0梅奇酵母(Metschnikowia)种基因组整合的耐受性标志物基因表达盒的图。
图4显示了用于XYL2基因缺失的示例性策略。
图5显示了在H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的XYL2缺失菌株中XYL1过表达的示例性构建策略。
图6A-6C显示了木糖的消耗(图6A)，从木糖产生木糖醇的产量(图6B)，以及当在不同浓度的木糖(X，≤10％)和纤维二糖(C)中培养时，野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种(H0)、xyl2缺失的H0梅奇酵母(Metschnikowia)株(xyl2Δ/xyl2Δ)和XYL1过表达且xyl2缺失的H0梅奇酵母(Metschnikowia)株(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)中的纤维二糖的利用(图6C)。
图7显示了木糖的消耗，从木糖产生木糖醇的产量，以及当在8％(w/v)的木糖和2.5％(w/v)的纤维二糖中培养时，野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种(H0)、xyl2缺失的H0梅奇酵母(Metschnikowia)株(xyl2Δ/xyl2Δ)和XYL1过表达且xyl2缺失的H0梅奇酵母(Metschnikowia)株(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)中的纤维二糖的利用。
图8显示了当在不同浓度的木糖(10％≤X≤20％)和半乳糖中培养时，对于野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种(H0)、缺失的H0梅奇酵母(Metschnikowia)株(H091:xyl2Δ/xyl2Δ)和XYL1过表达且xyl2缺失的H0梅奇酵母(Metschnikowia)株(H4316:xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)，从木糖产生木糖醇的产量。
图9显示了使用半乳糖作为共基质，重组H0梅奇酵母(Metschnikowia)种从12％(w/v)的木糖中生产木糖醇的产量。H091＝xyl2缺失菌株；H4316＝xyl2缺失加XYL1过表达菌株。
图10A-10C显示了木糖的消耗(图10A)，木糖醇的产量(图10B)和重组H0梅奇酵母(Metschnikowia)种对半乳糖的利用(图10C)。H0＝野生型；H091＝xyl2缺失菌株；H4316＝xyl2缺失加XYL1过表达菌株。
图11显示了用固体木糖5×再次补料中的木糖消耗和木糖醇产量。
图12A-12C显示了在使用半乳糖作为共基质(图12A)、使用纤维二糖作为共基质(图12B)或者使用甘油作为共基质(图12C)的方法中，通过具有木糖醇途径和木糖转运蛋白过表达的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖消耗和木糖醇产量。H0＝野生型；H091＝xyl2缺失菌株；H016＝具有一个被GXF1替代的XYL2拷贝和XYL1过表达盒的菌株；H016-21＝xyl2缺失加GXF1和XYL1过表达菌株。
图13显示了在使用半乳糖作为共基质的方法中具有木糖醇途径和木糖转运蛋白过表达的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种对木糖消耗和木糖醇产量。H0＝野生型；H091＝xyl2缺失菌株；H2-2＝具有一个被GXF2替代的XYL2拷贝和XYL1过表达盒的菌株；2c1d3＝xyl2缺失加GXF2和XYL1过表达菌株。
图14A和14B显示了使用不同的补料培养基和通气速率，使用补料-分批发酵，通过xyl2缺失加GXF1和XYL1过表达菌株的木糖和半乳糖的消耗以及木糖醇的产量。图14A使用了具有36％木糖，12％半乳糖，1.5％葡萄糖，1.5％蛋白胨，0.075％酵母提取物，0.075％KH2PO4，0.075％MgSO4和0.075％(NH4)2SO4的补料培养基。自动调节通气速率以将溶氧(DO)保持在50％饱和。图14B使用了具有36％木糖，12％半乳糖，3％葡萄糖，3％蛋白胨，1.5％酵母提取物，0.075％KH2PO4，0.075％MgSO4，和0.075％(NH4)2SO4的补料培养基。在第10天，添加更多的固体培养基化合物以将木糖浓度提高至7％。自动调节通气速率以将溶氧(DO)保持在50％饱和。
图15A-15D显示了在不同培养基中培养的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和FL株的细胞生长曲线。图15A为具有4％葡萄糖的YNB培养基(YNBG)。图15B为具有4％木糖的YNB培养基(YNBX)。图15C为具有2％葡萄糖和2％木糖的YNB培养基(YNBGX)。图15D为具有4％木糖的YPD培养基(YPDX)。
图16A和16B显示了H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和FL株在YNBG、YNBGX和YPDX培养基中所产生的甘油和乙醇。
图17A-17D显示了在H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima flavia)(FL)株在YNBG(图17A)、YNBX(图17B)、YNBGX(图17C)和YPDX(图17D)培养基中生长期间所产生的阿糖醇水平。
图18A-18C显示了在H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和FL株在YNBX(图18A)、YNBGX(图18B)和YPDX(图18C)培养基中生长期间所产生的木糖醇水平。
图19A-19D显示了H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和FL株在YNBG(图19A)、YNBX(图19B)、YNBGX(图19C)和YPDX(图19D)培养基中所产生的多种挥发性化合物的产量峰比。
图20显示了与美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)进化枝的成员相比，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的示例性生长曲线。
发明详述
本文所提供的组合物和方法部分基于梅奇酵母(Metschnikowia)属内新型酵母种的分离和鉴定的发现。这种新型梅奇酵母(Metschnikowia)种(在本文中称为“H0”或者“H0梅奇酵母(Metschnikowia)种”)的分离和鉴定已显示出新型的基因和蛋白，具体为新型木糖还原酶和新型木糖转运蛋白，其为梅奇酵母(Metschnikowia)种提供了利用木糖生产木糖醇的能力。对于这些新型基因和蛋白的使用包括(例如)将导致木糖醇途径的酶和蛋白，如木糖还原酶或木糖转运蛋白过表达的外源核酸引入梅奇酵母(Metschnikowia)种，和引入使梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶活性减弱或失活的遗传修饰。向梅奇酵母(Metschnikowia)种，包括本文所述的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种引入这些修饰可以导致木糖醇产量的显著升高。因此，可以通过将所述梅奇酵母(Metschnikowia)种在具有木糖作为碳源的培养基中培养，将本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种在用于产生木糖醇的方法中使用以用于生产木糖醇。本文还提供了具有通过使用本文所述的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种来生产木糖醇的方法所产生的木糖醇的组合物。本文还提供了涉及H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的新型蛋白的分离的多肽和涉及H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的新型基因的分离的核酸，和包括这些核酸的宿主细胞。
如本文所使用的，当用于表示培养或生长条件时，术语“好氧的”旨在表示在培养或生长条件中可用的游离氧(O2)。这包括当液体培养基中的溶氧超过50％饱和时。
如本文所使用的，当用于表示培养或生长条件时，术语“厌氧的”旨在表示培养或生长条件缺少游离氧(O2)。
如本文所使用的，术语“减弱”或其语法等价形式旨在表示削弱、降低或减弱酶或蛋白的活性或量。如果所述减弱导致活性或量低于给定途径起作用所需的临界水平，则酶或蛋白的活性或量的减弱可以模拟完全破环。然而，模拟一条途径完全破环的酶或蛋白的活性或量的减弱仍可以满足另外的途径继续起作用。例如，内源酶或蛋白的减弱可以足以模拟用于产生特定化合物(例如，木糖醇)的相同的酶或蛋白的完全破环，但是酶或蛋白剩余的活性或量仍可以足以维持其它途径或反应，如对于宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种幸存、复制或生长来说关键的途径。酶或蛋白的减弱还可以是以足以提高木糖醇得率的量削弱、降低或减弱所述酶或蛋白的活性或量，但不必需模拟所述酶或蛋白的完全破环。
如本文所使用的，术语“生物基的”是指完全或部分由生物衍生化合物组成的产物。生物基或生物衍生产物是相对于石油衍生产物来说的，其中这种产物来源于或合成自石油或石油化工原料。
如本文所使用的，术语“生物衍生的”表示来源于生物或者通过生物合成并且可以认为是可再生资源，因为它可以通过生物产生。这种生物，具体地本文所公开的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以使用原料或生物质，如糖(例如，木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖(例如，来自海洋植物生物质的半乳糖)、蔗糖和阿拉伯糖)、得自农业、植物、细菌或动物来源的碳水化合物，和甘油(例如，来自生物柴油生产的粗甘油副产物)。
如本文所使用的，术语“碳源”是指通过生物用于合成其有机分子的任何含碳分子，其包括(但不限于)本文所述的生物衍生化合物。这包括具有不同的碳原子量的分子。具体实例包括C3碳源、C4碳源、C5碳源和C6碳源。“C3碳源”是指含有三个碳原子的碳源，如甘油。“C4碳源”是指含有四个碳原子的碳源，如赤藓糖或者苏糖。“C5碳源”是指含有五个碳原子的碳源，如木糖、阿拉伯糖、阿糖醇、核糖或来苏糖。“C6碳源”是指含有六个碳原子的碳源，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖或艾杜糖。
如本文所使用的术语“外源的”旨在表示将参考分子或参考活性引入本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种。可以(例如)通过将编码核酸引入到宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种的遗传物质中，如通过整合到宿主染色体上或者作为非染色体遗传物质，如质粒来引入所述分子。作为另外一种选择或另外，所引入的分子可以是或者包括(例如)调控(例如，提高、降低或使其成为组成型)编码核酸的表达的非编码核酸，如启动子或增强子。因此，如参考编码核酸的表达所使用的，所述术语是指编码核酸以可表达形式引入宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种和/或提高宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种的编码核酸的表达(例如，过表达)的核酸的引入。当用于表示生物合成活性时，所述术语是指引入宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种中的活性。所述源可以是(例如)在引入梅奇酵母(Metschnikowia)种后，表达参考活性的同源或异源编码核酸。因此，术语“内源的”是指存在于宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种中的参考分子或活性。类似地，当用于表示编码核酸的表达时，所述术语是指微生物内所含的编码核酸的表达。术语“异源的”是指来源于参考梅奇酵母(Metschnikowia)种以外的来源的分子或活性，然而“同源的”是指来源于宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种的分子或活性。因此，本文所公开的编码核酸的外源表达可以使用异源或同源编码核酸之一或两者。
应理解当梅奇酵母(Metschnikowia)种中包含不止一种外源核酸时，所述不止一种外源核酸是指参考编码核酸或生物合成活性，如以上所讨论的。还应理解微生物可以具有相同外源核酸的一个或多个拷贝。如本文所公开的，还应理解可以将该不止一个外源核酸引入宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种的单独的核酸分子上，多顺反子核酸分子上或它们的组合，并且仍认为是不止一个外源核酸。例如，如本文所公开的，可以工程设计微生物以表达编码所期望的途径的酶或蛋白的两种或更多种外源核酸。在其中将编码所期望的活性的两种外源核酸引入宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种的情况下，应理解可以将所述两种外源核酸作为单一核酸引入到(例如)单个质粒上，不同的质粒上，可以在单一位点或多个位点整合到宿主染色体上，并且仍认为是两个外源核酸。类似地，应理解可以将大于两种外源核酸以任何所期望的组合，例如，在单一质粒上，在不同的质粒上引入到宿主生物中，可以在单一位点或多个位点整合到宿主染色体上，并且仍认为是两种或更多种外源核酸，例如，三种外源核酸。因此，参考外源核酸或生物合成活性的数目是指编码核酸的数目或者生物合成活性的数目，而不是引入到宿主生物中的单独的核酸的数目。
如本文所使用的，术语“遗传修饰”、“基因破坏”或其语法等价形式旨在表示使所编码的基因产物在功能上失活，或者具有活性但活性减弱的遗传改变。所述遗传改变可以是(例如)整个基因的缺失、转录或翻译所需的调控序列的缺失、导致产生截短基因产物的基因部分的缺失或者在本领域中熟知的使所编码的基因产物失活或活性减弱的任何多种突变策略。基因破环的一种特别有用的方法是全基因缺失，因为它降低或消除了本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种中遗传回复的发生。基因破环还包括无效突变，它是指基因或含有基因的区域内导致基因不被转录成RNA和/或翻译成功能基因产物的突变。这种无效突变可以由多种类型的突变产生，其包括(例如)点突变失活、基因部分缺失、整个基因缺失或染色体节段缺失。
如本文所使用的，术语“失活”或其语法等价形式旨在表示终止所述酶或蛋白的活性。可以通过编码所述酶或蛋白的整个核酸序列的缺失来完成这种失活。失活还可以伴随着编码所述酶或蛋白的核酸序列部分的缺失，从而通过所述核酸序列所编码的所得的酶或蛋白不具有全长酶或蛋白的活性。另外，可以通过编码酶或蛋白的核酸序列中的替代或插入，包括与缺失结合来完成所述酶或蛋白的失活。插入可以包括异源核酸，如本文所述的那些。
如本文所使用的，当用于表示本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种时，术语“分离的”旨在表示基本不含如参考微生物在自然界中所存在的至少一种组分的生物。所述术语包括除去如其在自然环境中所存在的一些或所有组分的梅奇酵母(Metschnikowia)种。所述术语还包括除去如所述微生物在非天然存在的环境中所存在的一些或所有组分的微生物。因此，分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种与如其在自然界中所存在的或者如其在非天然存在的环境中生长、储存或生存的其它物质部分或完全分离。分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的具体实例包括部分纯的微生物、基本纯的微生物和在非天然存在的培养基中培养的微生物。
如本文所使用的，术语“培养基”、“生长培养基”或其语法等价形式是指含有支持细胞，包括任何微生物，如本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种的生长的营养物的液体或固体(例如，凝胶状)物质。支持生长的营养物包括：提供碳的底物，如(但不限于)木糖、纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、乙醇、乙酸酯、阿拉伯糖、阿糖醇、山梨糖醇和甘油；提供基本元素的盐，包括镁、氮、磷和硫；氨基酸源，如蛋白胨或胰蛋白胨；和维生素含量源，如酵母提取物。在所述方法和鉴别本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种中有用的培养基的具体实例包括具有碳源的酵母提取物蛋白胨(YEP)培养基和酵母氮源(YNB)培养基，如(但不限于)木糖、葡萄糖、纤维二糖、半乳糖或甘油或它们的组合。YEP和YNB培养基的配方在本领域中是熟知的。例如，具有4％的木糖的YEP培养基包括(但不限于)酵母提取物1.0g，蛋白胨2.0g，木糖4.0g和100mL水。作为另一实例，具有2％的葡萄糖和2％的木糖的YNB培养基包括(但不限于)生物素2μg、泛酸钙400μg、叶酸2μg、肌醇2000μg、烟酸400μg、p-氨基苯甲酸200μg、盐酸吡哆醇400μg、核黄素200μg、盐酸硫胺400μg、硼酸500μg、硫酸铜40μg、碘化钾100μg、氯化铁200μg、硫酸锰400μg、钼酸钠200μg、硫酸锌400μg、磷酸二氢钾1g、硫酸镁500mg、氯化钠100mg、氯化钙100mg、20g葡萄糖、20g木糖和1L水。本领域技术人员可以容易地确定培养基中碳源的量。当培养基中存在不止一种提供碳的底物时，这些被称为“共-基质”。培养基还可以包括除生长所需的营养物以外的物质，如仅允许所选细胞生长的物质(例如，抗生素或抗真菌剂)，其通常存在于选择培养基中，或者当在相同培养基上生长时，允许相对于另一种微生物来区分一种微生物的物质，其通常存在于鉴别或指示培养基中。这些物质是本领域技术人员所熟知的。
如本文所使用的，术语“梅奇酵母(Metschnikowia)种”是指属于梅奇酵母(Metschnikowia)属的任何酵母种。示例性的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括(但不限于)美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、核果梅奇酵母(Metschnikowiafructicola)、金佩梅奇酵母(Metschnikowia chrysoperlae)、瑞氏梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)、Metschnikowia andauensis、山西梅奇酵母(Metschnikowiashanxiensis)、中国梅奇酵母(Metschnikowia sinensis)、Metschnikowia zizyphicola、二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)、Metschnikowia lunata、佐贝尔梅奇酵母(Metschnikowia zobellii)、澳洲梅奇酵母(Metschnikowia australis)、Metschnikowiaagaveae、Metschnikowia gruessii、夏威夷梅奇酵母(Metschnikowia hawaiiensis)、克里斯梅奇酵母(Metschnikowia krissii)、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-85株、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-89株和本文所述的独特的梅奇酵母(Metschnikowia)种，梅奇酵母(Metschnikowia)种H0，作为另外一种选择，称为“H0梅奇酵母(Metschnikowia)种”。本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种，即“H0梅奇酵母(Metschnikowia)种”是新发现的种，其于2016年11月8日，根据布达佩斯条约的条款，在作为国际保藏中心的加拿大国际保藏中心(“IDAC”)(地址：1015Arlington Street,Winnipeg,Manitoba,Canada R3E3R2)以指定登记号No.081116-01保藏。H0梅奇酵母(Metschnikowia)种所提议的学名为Metschnikowiavinificola(vinifi：来自酿酒用葡萄(酿酒葡萄藤的种)；cola：来自拉丁语单词“incola”，表示栖居者)。因此，vinificola(酿酒用葡萄的栖居者)的种名是指来自酿酒用葡萄的标准分离株。
另外，本文所提及的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以包括“非天然存在的”或“重组的”梅奇酵母(Metschnikowia)种。该生物旨在表示具有通常不存在于天然存在的梅奇酵母(Metschnikowia)种，包括参考种的野生型菌株中的至少一个遗传变化的梅奇酵母(Metschnikowia)种。遗传变化包括(例如)引入编码代谢多肽的可表达核酸的修饰、其它核酸的添加、核酸缺失和/或微生物遗传物质的其它基因破环。这些修饰包括(例如)其用于参考种的异源、同源或者异源和同源多肽两者的编码区和功能性片段。其它修饰包括(例如)非编码调控区，其中所述修饰改变了基因或操纵子的表达。示例性的代谢多肽包括本文所述的代谢途径(例如，木糖醇途径)内的酶或蛋白。
代谢修饰是指从其天然存在的状态改变的生化反应。因此，本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以具有对编码代谢多肽或其功能性片段的一个或多个核酸序列的遗传修饰，其改变了所述代谢多肽催化的生化反应，包括异化或同化反应和基础代谢。本文公开了示例性的代谢修饰。
如本文所使用的，术语“过表达”或其语法等价形式旨在表示以大于宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种的正常情况的量或者在宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种内不同于野生型表达的时间或位置的基因产物(例如，核糖核酸(RNA)、蛋白或酶)的表达。
如本文所使用的，当用于表示核酸序列或氨基酸序列时，术语“序列同一性”或者“序列同源性”是指两个或更多个核酸分子之间或者两个或更多个多肽之间的相似性。可以通过比较每条序列中的位置来确定同一性，其可以出于比较的目的进行比对。当所比较的序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则所述分子在该位置是同一的。序列之间的同一性程度是所述序列所共有的匹配或同源位置数目的函数。可以使用本领域中已知的软件程序进行两条序列的比对以确定它们的序列同一性百分比，所述软件程序如(例如)Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。优选地，使用缺省参数进行比对。可以使用的在本领域中熟知的一种比对程序是设置为缺省参数的BLAST。具体地，程序为BLASTN和BLASTP，使用以下缺省参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截止值＝60；预期值＝10；Matrix＝BLOSUM62；描述＝50条序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDStranslations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详细信息可见于国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)。
如本文所使用的，当用于表示培养或生长条件时，术语“基本厌氧的”旨在表示液体培养基中溶氧的量小于约10％饱和。所述术语还旨在包括包含液体或固体培养基且维持在小于约1％的氧的气氛中的密封盒。
如本文所使用的，术语“糖醇”是指通过糖的醛或酮的还原所产生的醇。因此，“C7糖醇”是指通过具有7个碳原子的糖的醛或酮的还原所产生的醇，如庚七醇或其异构体。
如本文所使用的，术语“木糖醇”是指具有化学式C5H12O5的戊糖醇，其摩尔质量为152.15g/mol，并且一种IUPAC名为(2R,3r,4S)-戊烷-1,2,3,4,5-五醇[(2S,4R)-戊烷-1,2,3,4,5-五醇]。木糖醇通常用作糖的低热值、低-碳水化合物替代物，其不影响患有糖尿病的人和具有高血糖的个体的胰岛素水平。
如本文所使用的，术语“木糖醇脱氢酶”是指催化木糖醇氧化以产生木酮糖的酶。木糖醇的这种氧化包括使用辅因子NAD的酶。示例性的木糖醇脱氢酶包括分类在E.C.1.1.1.9或者E.C.1.1.1.B19之下的酶。术语“梅奇酵母(Metschnikowia)木糖醇脱氢酶”或其语法等价形式是指来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶。表1提供了示例性的木糖醇脱氢酶的氨基酸和核酸序列两者。
表1
如本文所使用的，术语“木糖”是指具有化学式C5H10O5的具有甲酰基官能团的5碳单糖，其摩尔质量为150.13g/mol，并且一种IUPAC名为(3R,4S,5R)-环噁烷-2,3,4,5-四醇。木糖在本领域中还已知作为D-木糖、D-吡喃木糖、木糖苷、d-(+)-木糖、吡喃木糖、木糖(wood sugar)、xylomed和D-木戊糖(xylopentose)。
如本文所使用的，术语“木糖还原酶”是指催化木糖还原以产生木糖醇的酶。木糖的这种还原包括使用NADH或NADPH作为辅因子的酶。示例性的木糖还原酶包括分类在E.C.1.1.1.307之下的酶。术语“梅奇酵母(Metschnikowia)木糖还原酶”或其语法等价形式是指来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶。表2提供了示例性的木糖还原酶的氨基酸和核酸序列两者。
表2
如本文所使用的，术语“木糖转运蛋白”是指有利于木糖跨过细胞膜的移动的膜蛋白。术语“梅奇酵母(Metschnikowia)木糖转运蛋白”或其语法等价形式是指来自梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白。表3提供了示例性的木糖转运蛋白的氨基酸和核酸序列两者。
表3
本文提供了具有木糖醇途径的新型分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。当在具有木糖的培养基中培养时，这些梅奇酵母(Metschnikowia)种可以从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所述的木糖醇途径包括木糖还原酶，其将木糖转化为木糖醇。另外，在一些实施方式中，所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括对木糖醇脱氢酶的遗传修饰，其通常将木糖醇转化为木酮糖。因此，在一些实施方式中，本文提供了具有至少一个编码木糖还原酶的外源核酸，或者作为另外一种选择或另外，具有至少一个导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶过表达的外源核酸的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文还提供了具有使所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶活性减弱或失活的遗传修饰的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。在一些实施方式中，本文提供了分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其具有：(a)至少一个编码木糖还原酶或者导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶过表达的外源核酸；和(b)使所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶活性减弱或失活的遗传修饰。
本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以以特定速率从木糖产生木糖醇。例如，在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少0.50g/L/h、至少0.60g/L/h、至少0.70g/L/h、至少0.80g/L/h、至少0.90g/L/h、至少1.00g/L/h、至少1.50g/L/h、至少2.00g/L/h、至少2.50g/L/h、至少3.00g/L/h、至少3.50g/L/h、至少4.00g/L/h、至少5.00g/L/h、至少6.00g/L/h、至少7.00g/L/h、至少8.00g/L/h、至少9.00g/L/h或至少10.00g/L/h的木糖醇。因此，在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少0.50g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少0.60g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少0.70g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少0.80g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少0.90g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少1.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少1.50g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少2.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少2.50g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少3.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少3.50g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少4.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少5.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少6.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少7.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少8.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少9.00g/L/h的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少10.00g/L/h的木糖醇。
本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以以特定浓度从木糖产生木糖醇。例如，在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少75g/L、至少80g/L、至少85g/L、至少90g/L、至少95g/L、至少100g/L、至少110g/L、至少120g/L、至少130g/L、至少140g/L、至少150g/L、至少160g/L、至少170g/L、至少180g/L、至少190g/L、至少200g/L、至少250g/L或至少300g/L的木糖醇。因此，在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少75g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少80g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少90g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少95g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少100g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少110g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少120g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少130g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少140g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少150g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少160g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少170g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少180g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少190g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少200g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少250g/L的木糖醇。在一些实施方式中，当培养时，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生了至少300g/L的木糖醇。
可以将本文所述的木糖醇途径引入本领域中已知的任何梅奇酵母(Metschnikowia)种。可以具有本文所述的木糖醇途径的示例性、非限制性的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、核果梅奇酵母(Metschnikowia fructicola)、金佩梅奇酵母(Metschnikowia chrysoperlae)、瑞氏梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)、Metschnikowia andauensis、山西梅奇酵母(Metschnikowia shanxiensis)、中国梅奇酵母(Metschnikowia sinensis)、Metschnikowia zizyphicola、二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)、Metschnikowia lunata、佐贝尔梅奇酵母(Metschnikowia zobellii)、澳洲梅奇酵母(Metschnikowia australis)、Metschnikowia agaveae、Metschnikowia gruessii、夏威夷梅奇酵母(Metschnikowia hawaiiensis)、克里斯梅奇酵母(Metschnikowia krissii)、梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-85株和梅奇酵母(Metschnikowia)种NS-O-89株。在具体的实施方式中，本文所述的木糖醇途径可以引入到于2016年11月8日，根据布达佩斯条约的条款，在作为国际保藏中心的加拿大国际保藏中心以指定登记号No.081116-01保藏的梅奇酵母(Metschnikowia)种中。
如本领域技术人员可以理解的，由于本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以是本领域中已知的任何梅奇酵母(Metschnikowia)种，因此在一些实施方式中，本文所述的编码木糖还原酶的外源核酸是与其中引入了外源核酸的宿主梅奇酵母(Metschnikowia)种相比的异源核酸。换言之，在一些实施方式中，至少一个编码木糖还原酶的外源核酸是异源核酸。
在一些实施方式中，编码木糖还原酶的外源核酸或者通过所述外源核酸的引入而过表达的木糖还原酶是本文所述的示例性木糖还原酶之一。例如，在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有选自SEQ ID NO：11-18中任一项的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，引入本文所述的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种中的木糖还原酶是本文所述的木糖还原酶的变体。这种变体仍保留了所述木糖还原酶的功能活性。例如，在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：11-18中任一项所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸替代、缺失或插入。本文所提供的木糖还原酶的变体还包括(例如)当与参考多肽序列相比时的缺失、融合或截短。因此，在一些实施方式中，本文所提供的木糖还原酶具有与SEQ ID NO：11-18中的任一项具有至少95.0％、至少95.1％、至少95.2％、至少95.3％、至少95.4％、至少95.5％、至少95.6％、至少95.7％、至少95.8％、至少95.9％、至少96.0％、至少96.1％、至少96.2％、至少96.3％、至少96.4％、至少96.5％、至少96.6％、至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％、至少97.0％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％、至少98.0％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99.0％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％或至少99.8％的同一性的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：11具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
本文还提供了本文所述的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其中使所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶的活性减弱或失活的遗传修饰包括编码所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶或其部分的等位基因之一或两者的缺失。因此，在一些实施方式中，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括编码所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶或其部分的至少一个等位基因的缺失。在一些实施方式中，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种包括编码所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶或其部分的两个等位基因的缺失。
本文还提供了具有包括木糖转运蛋白过表达的木糖醇途径的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种。当在具有木糖的培养基中培养时，与不具有所述木糖转运蛋白的梅奇酵母(Metschnikowia)种相比，这种梅奇酵母(Metschnikowia)种可以具有从木糖产生木糖醇的提高的产量。因此，在一些实施方式中，本文提供了分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其具有至少一个编码木糖转运蛋白的外源核酸，或者作为另外一种选择或另外，具有至少一个导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白过表达的外源核酸。在一些实施方式中，本文提供了分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其具有：(a)至少一个编码木糖还原酶或者导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶过表达的外源核酸；(b)使所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶的活性减弱或失活的遗传修饰；和(c)至少一个编码木糖转运蛋白或者导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖转运蛋白过表达的外源核酸。
在一些实施方式中，编码木糖转运蛋白的外源核酸或者通过所述外源核酸的引入而过表达的木糖转运蛋白是本文所述的示例性木糖转运蛋白之一。例如，在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有选自SEQ ID NO：27-40中任一项的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ IDNO：36所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述木糖还原酶具有SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，引入本文所述的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种中的木糖转运蛋白是本文所述的木糖转运蛋白的变体。这种变体仍保留了所述木糖转运蛋白的功能活性。例如，在一些实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：27-40中任一项所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸替代、缺失或插入。本文所提供的木糖转运蛋白的变体还包括(例如)当与参考多肽序列相比时的缺失、融合或截短。因此，在一些实施方式中，本文所提供的木糖转运蛋白具有与SEQ ID NO：27-40中任一项具有至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或者100％的同一性的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述木糖转运蛋白具有SEQ ID NO：27-36中任一项所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：27-36中的任一项具有至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或者100％的同一性的氨基酸序列。
本文所提供的木糖还原酶和木糖转运蛋白可以分别是梅奇酵母(Metschnikowia)木糖还原酶或者梅奇酵母(Metschnikowia)转运蛋白，其包括具有如本文所示的氨基酸序列的来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的那些，以及保留了它们各自功能(例如，木糖向木糖醇的转化或者木糖转运)的它们的变体。例如，本文提供了具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyl1以及保留了Xyl1的酶促功能的它的变体。Xyl1的酶促功能包括(但不限于)催化木糖向木糖醇的转化，其可以(例如)通过对所述变体进行如本文所述或另外如本领域中已知的测定来确定。作为另一实例，本文提供了具有SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyt1以及保留了Xyt1的转运蛋白功能的它的变体。Xyt1的转运蛋白功能包括(但不限于)将木糖转运穿过细胞壁和/或细胞膜，其可以(例如)通过对所述变体进行如本文所述或另外如本领域中已知的转运蛋白测定来确定。
可以(例如)通过在梅奇酵母(Metschnikowia)种中表达所述木糖还原酶并且测量通过所述梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇产量的提高来确定木糖还原酶的功能。同样地，可以(例如)通过在梅奇酵母(Metschnikowia)种中表达转运蛋白并测量所述梅奇酵母(Metschnikowia)种对木糖吸收的提高来确定木糖转运蛋白的功能。在示例性测定中，可以将过表达编码木糖还原酶和/或木糖转运蛋白的内源核酸的梅奇酵母(Metschnikowia)种在含有木糖的培养基中培养，并且可以通过高效液相色谱法(HPLC)测量培养基中木糖的减少和/或培养基中木糖醇的升高。在另一个示例性测定中，对于表达木糖还原酶和/或木糖转运蛋白的野生型和重组梅奇酵母(Metschnikowia)种，起始培养物可以在具有控制的量的葡萄糖和木糖(％；w/v)的YEP基础培养基中生长。将未接种的培养基用作给定取样时间的参比；所述培养基指示了100％的起始木糖或时间0h时的木糖。以24h的间隔，可以从培养物中无菌移除300-1000μL体积的样品并通过0.2μm注射器过滤器过滤，从而将培养基与酵母物理分离。可以将培养基转移到玻璃小瓶中，并且可以通过HPLC检验木糖和木糖醇的含量。表达木糖还原酶和/或木糖转运蛋白的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种可以消耗木糖并以高于其野生型对应菌株的速率产生木糖醇，并且野生型和重组梅奇酵母(Metschnikowia)种之间的差异可以表示所述变体的木糖还原酶和/或木糖转运蛋白功能。
如本文所述，可以将所提供的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种修饰以包含能够从木糖产生木糖醇的木糖醇途径。当所述修饰包括编码所述木糖醇途径的至少一种酶的异源外源核酸序列的引入时，可以根据宿主的密码子使用来修饰所述酶的编码序列。标准遗传密码在本领域中是熟知的，如(例如)Osawa等人,Microbiol Rev.56(1):229-64(1992)中所综述的。酵母种，包括(但不限于)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、阿斯米假丝酵母(Candida azyma)、叉开假丝酵母(Candida diversa)、木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)、皱膜假丝酵母(Candida rugopelliculosa)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)和Zygoascus hellenicus使用标准编码。某些酵母种使用替代编码。例如，“Leu”的“CUG”标准密码子在“CUG”进化枝种，如白假丝酵母(Candida albicans)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、口津假丝酵母(Candida melibiosica)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、褶皱假丝酵母(Candida rugose)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)和梅奇酵母(Metschnikowia)种中编码“Ser”。本文提供了H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的DNA密码子表。来自非“CUG”进化枝种的外源基因中的DNA密码子CTG需要转变为TTG、CTT、CTC、TTA或CTA以用于蛋白在梅奇酵母(Metschnikowia)种中的功能性表达。其它密码子优化可以导致梅奇酵母(Metschnikowia)种中外源基因的蛋白表达的提高。密码子优化的方法在本领域中是熟知的(例如，Chung等人,BMC Syst Biol.6:134(2012)；Chin等人,Bioinformatics 30(15):2210-12(2014))，并且多种工具是可用的(例如，https://www.dna20.com/services/genegps的DNA2.0；和http://genomes.urv.es/OPTIMIZER的OPTIMIZER)。
在一些实施方式中，所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以具有本文所述的外源核酸的一个或多个拷贝。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有所述外源核酸的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个拷贝。本文所述的不止一个外源核酸的表达可以进一步改善梅奇酵母(Metschnikowia)种对木糖的吸收和/或木糖向木糖醇的转化。照此，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少2个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少3个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少4个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少5个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少6个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少7个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少8个分别编码木糖转运蛋白的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少9个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种具有至少10个分别编码木糖转运蛋白和/或木糖还原酶的外源核酸。
在一些实施方式中，本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以具有一种或多种木糖醇途径以从木糖产生木糖醇。所述木糖醇途径可以是内源途径或外源途径。本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种还可以具有编码参与用于生产木糖醇的一种或多种木糖醇途径的一种或多种酶或蛋白的可表达的核酸。基于对所述梅奇酵母(Metschnikowia)种是内源的酶或蛋白，可以表达特定木糖醇途径的一些或全部的核酸。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以具有从木糖产生木糖醇和天然产生木糖醇的木糖醇途径的所有酶的内源表达，其可以通过进一步修饰或者提高所述木糖醇途径的酶或蛋白(例如，木糖转运蛋白或木糖还原酶)的表达得到改善。在一些实施方式中，所述梅奇酵母(Metschnikowia)种可以缺乏用于所期望的木糖醇途径的一种或多种酶或蛋白，然后将所缺乏的酶或蛋白的可表达核酸引入所述梅奇酵母(Metschnikowia)种以用于后续外源表达。作为另外一种选择，如果所述梅奇酵母(Metschnikowia)种显示出一些途径基因的内源表达，但是缺乏其它基因，则需要所缺乏的酶或蛋白的编码核酸以实现木糖醇的生物合成。因此，重组梅奇酵母(Metschnikowia)种还可以包括外源酶或蛋白活性以获得所期望的木糖醇途径，或者可以通过引入与一种或多种内源酶或蛋白一起产生木糖醇的一种或多种外源酶或蛋白活性来获得所期望的木糖醇途径。
本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以含有稳定的遗传变化，它是指可以培养超过5代而无所述变化损失的微生物。通常，稳定的遗传变化包括持续超过10代的修饰，具体地，稳定修饰将持续超过约25代，并且更具体地，稳定遗传修饰将超过50代，包括无穷代。
就降低酶或蛋白或使其失活的遗传修饰来说，特别有用的稳定遗传变化是基因缺失。对于降低回复至所述遗传变化之前的表型的可能性来说，使用基因缺失来引入稳定遗传变化是特别有用的。例如，可以(例如)通过使编码木糖醇脱氢酶的基因缺失来实现稳定生长-偶联的木糖醇生产。还可以通过多个缺失(例如，给定基因的两个等位基因的缺失)来提高木糖醇生长-偶联的生产的稳定性，从而显著降低对于每种破坏的活性所发生的多种补偿回复的可能性。
本领域技术人员将理解参考适合的宿主生物(如本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种和它们相应的代谢反应)或者适合于所期望的遗传材料(如所期望的代谢途径的基因)的来源生物，描述了遗传变化，包括本文中举例说明的代谢修饰。然而，考虑到多种生物的全基因组测序和基因组领域中的高技术水平，本领域技术人员将容易地能够将本文所提供的教导内容和指导应用于基本上所有其它生物。例如，可以通过引入来自参考种以外的种的相同或类似的编码核酸将本文中举例说明的代谢变化容易地应用于其它种。这些遗传变化包括(例如)种同源物的遗传变化，一般地并且具体地，直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置换。
直系同源物是通过垂直传递相关并且在不同生物中负责基本相同或等同的功能的基因。例如，对于环氧化物水解的生物学功能，小鼠环氧化物酶和人环氧化物酶可以考虑是直系同源物。当(例如)它们共有足够量的序列相似性以表示它们是同源的时，基因是通过垂直传递相关的，或者是通过来自共同祖先的进化相关的。如果它们共有立体结构但不必需共有足够量的序列相似性以表示它们是从共同祖先进化而来，以至于一级序列相似性不是可鉴别的，则还可以认为基因是直系同源的。直系同源的基因可以编码具有约25％至100％的氨基酸序列同一性的序列相似性的蛋白。如果它们的立体结构也显示出相似性，则编码共有小于25％的氨基酸相似性的蛋白的基因也可以认为是通过垂直传递产生的。认为酶的丝氨酸蛋白酶家族的成员，包括组织纤维蛋白溶酶原活化因子和弹性酶是通过来自共同祖先的垂直传递所产生的。
直系同源物包括通过(例如)进化在结构或整体活性方面出现变化的基因或者它们的编码基因产物。例如，当一个物种编码显示出两种功能的基因产物并且其中这些功能在第二个物种中已分成不同的基因时，三种基因和它们相应的产物被认为是直系同源物。对于生物化学化合物的生产，本领域技术人员将理解选择具有要引入或要破坏的代谢活性的直系同源基因来用于本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种的构建。显示出可分离的活性的直系同源物的实例为其中在两个或更多个物种之间或者在单一物种内已分成不同基因产物的不同活性。具体实例是两种类型的丝氨酸蛋白酶活性：弹性酶蛋白水解作用和纤溶酶原蛋白水解作用作为纤维蛋白溶酶原活化因子和弹性酶分离成不同的分子。第二实例是支原体5'-3'核酸外切酶和果蝇DNA聚合酶III活性的分离。可以将来自第一物种的DNA聚合酶认为是来自第二物种的核酸外切酶或聚合酶之一或两者的直系同源物，反之亦然。
相反，旁系同源物是通过(例如)复制，然后进化趋异相关的同源物，并且其具有类似或常规的功能，但是不具有相同的功能。旁系同源物可以起源或衍生自(例如)相同物种或者不同物种。例如，微粒体环氧化物酶(环氧化物水解酶I)和可溶性环氧化物酶(环氧化物水解酶II)可以认为是旁系同源物，因为它们代表了从共同祖先共同进化而来的两种不同的酶，其催化不同的反应并且在相同物种中具有不同的功能。旁系同源物是来自相同物种，彼此之间具有表明它们是同源的或者通过来自共同祖先的共同进化相关的显著的序列相似性的蛋白。旁系同源的蛋白家族组包括HipA同源物、荧光素酶基因、肽酶等。
非直系同源基因置换是来自一个物种的可以替代不同物种中参考基因功能的非直系同源基因。替代包括(例如)与不同物种中的参考功能相比，能够在来源物种中实施基本相同或类似的功能。尽管通常非直系同源基因置换将可鉴别为与编码参考功能的已知基因在结构上相关，但是尽管如此在结构上不太相关但是在功能上类似的基因以及它们相应的基因产物仍将属于如本文所使用的术语的含义中。与设法替代的编码所述功能的基因相比，功能相似性需要(例如)在非直系同源基因产物的活性位点或结合区中的至少一些结构相似性。因此，非直系同源基因包括(例如)旁系同源物或非相关基因。
因此，在鉴别和构建本文所提供的具有生物合成能力的梅奇酵母(Metschnikowia)种中，通过将本文所提供的教导内容或指导应用于特定物种，本领域技术人员将理解代谢修饰的鉴别可以包括直系同源物的鉴别和包含或失活。在旁系同源物和/或非直系同源基因置换存在于编码催化类似或基本类似的代谢反应的酶的参考微生物中的程度上，本领域技术人员还可以使用这些进化相关的基因。类似地对于基因破环，也可以在宿主微生物中使进化相关的基因被破坏或缺失以降低或消除靶向破坏的酶促活性的功能冗余。
可以通过本领域技术人员熟知的方法确定直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换。例如，对于两种多肽的核酸或氨基酸序列的检查将显示出所比较的序列之间的序列同一性和相似性。基于这些相似性，本领域技术人员可以确定所述相似性是否足够高以表明所述蛋白通过来自共同祖先的进化相关。本领域技术人员熟知的算法，如Align、BLAST、Clustal W等比较和确定了原始序列的相似性或同一性，并且还确定了可以分配权重和得分的序列中的空位的存在或意义。这些算法在本领域中也是已知的并且类似地适合于确定核苷酸序列的相似性或同一性。基于计算统计学相似性，或者在随机多肽中找到类似匹配的机会和所确定的匹配的显著性的熟知方法来计算确定关联性的足够的相似性的参数。如果需要，本领域技术人员还可以目视优化两条或更多条序列的计算机比较。可以预期相关基因产物或蛋白具有高相似性，例如，25％至100％的序列同一性。如果扫描大小足够的数据库，则不相关的蛋白可以具有与预期偶然发生的基本相同的同一性(约5％)。5％至24％之间的序列可以或可以不代表足够的同源性以得出所比较的序列相关的结论。考虑数据组的大小，可以实施确定这些匹配的显著性的其它统计分析以确定这些序列的相关性。
例如，使用BLAST算法，用于确定两条或更多条序列的相关性的示例性参数可以如下所示。简要地，可以使用BLASTP 2.0.8版(1999-01-05)和下列参数：Matrix：0BLOSUM62；空位开放：11；空位扩展：1；x_dropoff：50；期待值：10.0；字长：3；过滤器：开进行氨基酸序列比对。可以使用BLASTN 2.0.6版(1998-09-16)和下列参数：匹配：1；错配：-2；空位开放：5；空位扩展：2；x_dropoff：50；期待值：10.0；字长：11；过滤器：关进行核酸序列比对。本领域技术人员将已知，例如，可以对以上参数进行哪些改变以提高或降低比较的严格性和确定两条或更多条序列的相关性。
本文提供了使用本文所述的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种生产木糖醇的方法。这些方法可以包括将具有用于产生木糖醇的木糖醇途径的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种在一定条件下培养足够的一段时间以从木糖产生木糖醇。因此，在一些实施方式中，本文提供了用于产生木糖醇的方法，其包括将具有下列的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种：(a)至少一个编码木糖还原酶或者导致所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶过表达的外源核酸；和(b)使所述分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇脱氢酶活性减弱或失活的遗传修饰，在一定条件下培养足够的一段时间以从木糖产生木糖醇。
本文所提供的方法包括以指定速率和/或浓度产生木糖醇。因此，在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少0.50g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少0.60g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少0.70g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少0.80g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少0.90g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少1.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少1.50g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少2.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少2.50g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少3.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少3.50g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少4.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少5.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少6.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少7.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少8.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少9.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少10.00g/L/h的速率从木糖产生木糖醇。
在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少75g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少80g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少85g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少90g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少95g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少100g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少110g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少120g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少130g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少140g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少150g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少160g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少170g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少180g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少190g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少200g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少250g/L的浓度从木糖产生木糖醇。在一些实施方式中，本文所提供的方法以至少300g/L的浓度从木糖产生木糖醇。
可以培养本文所述的任何梅奇酵母(Metschnikowia)种以产生和/或分泌木糖醇。例如，可以培养本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种用于生物合成生产木糖醇。因此，在一些实施方式中，本文提供了含有木糖醇的培养基。在一些方面，还可以将培养基与产生木糖醇的梅奇酵母(Metschnikowia)种分离。将微生物与培养基分离的方法在本领域中是熟知的。示例性方法包括过滤、絮凝、沉淀、离心、沉降等。
对于木糖醇的生产，将本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种在具有碳源及其它必需营养素的培养基中培养。在一些实施方式中，在好氧培养基中培养本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种。所述好氧培养可以是分批、补料-分批或连续培养，其中培养基中的溶氧高于50％饱和。在一些实施方式中，在基本厌氧培养基中培养本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种。如本文所述，实现木糖醇的生物合成的一种示例性生长条件包括厌氧培养或发酵条件。在某些实施方式中，本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以在厌氧或基本厌氧条件下维持、培养或发酵。简要地，厌氧条件是指缺少氧的环境。基本厌氧条件包括(例如)培养、分批发酵或连续发酵，从而培养基中的溶氧浓度保持在0至10％饱和之间。基本厌氧条件还包括将细胞在维持在小于1％的氧的气氛的密封盒内的液体培养基或固体琼脂上生长或休眠。可以通过(例如)用N2/CO2的混合物或者其它适合的非氧气或气体向培养中鼓泡来维持氧的百分比。
有时希望在发酵罐中维持厌氧条件以降低整个过程的成本。可以(例如)通过首先用氮气向培养基鼓泡，然后用隔膜和钳口盖密封烧瓶来获得这些条件。对于未观察到厌氧生长的菌株，可以通过用小孔使隔膜穿孔以用于有限通气来施加微氧或基本厌氧条件。先前已描述了示例性厌氧条件并且所述示例性厌氧条件在本领域中是熟知的。在(例如)2007年8月10日提交的美国专利公开2009/0047719中描述了示例性的好氧和厌氧条件。如本文所公开的，可以以分批、补料-分批或连续方式进行发酵。如果需要，还可以在两相中进行发酵。第一相可以是好氧的以允许高生长，并因此允许高产量，然后是高得率的厌氧相。
如果需要，可以根据需要，通过添加碱，如NaOH或其它碱，或者酸将培养基的pH维持在所期望的pH，如约5.5-6.5的pH，以将培养基维持在所期望的pH。可以使用分光光度计通过测量光密度(600nm)来确定生长速率，并且可以通过监测碳源随时间的减少来确定木糖的吸收速率。
用于本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种的培养基可以包括木糖，其作为唯一碳源或者与本文所述的或本领域中已知的一种或多种共基质结合。所述培养基还可以包含其它补充剂，如酵母提取物和/或蛋白胨。所述培养基还可以包含(例如)任何其它碳水化合物源，其可以向梅奇酵母(Metschnikowia)种提供碳源。这些碳源包括，例如：其它糖，如纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、乙醇、乙酸酯、阿糖醇、山梨糖醇和甘油。因此，所述培养基可以包含木糖和共基质葡萄糖。所述培养基可以包含木糖和共基质纤维二糖。所述培养基可以包含木糖和共基质半乳糖。所述培养基可以包含木糖和共基质甘油。所述培养基可以包含葡萄糖、木糖和纤维二糖的组合。所述培养基可以包含葡萄糖、木糖和半乳糖的组合。所述培养基可以包含葡萄糖、木糖和甘油的组合。所述培养基可以包含木糖、纤维二糖、半乳糖和甘油的组合。
所述培养基可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更大量的碳源(w/v)。在一些实施方式中，所述培养基可以具有2％的碳源。在一些实施方式中，所述培养基可以具有4％的碳源。在一些实施方式中，所述培养基可以具有10％的碳源。在一些实施方式中，所述培养基可以具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更大量的木糖(w/v)。所述培养基可以具有1％的木糖。所述培养基可以具有2％的木糖。所述培养基可以具有3％的木糖。所述培养基可以具有4％的木糖。所述培养基可以具有5％的木糖。所述培养基可以具有6％的木糖。所述培养基可以具有7％的木糖。所述培养基可以具有8％的木糖。所述培养基可以具有9％的木糖。所述培养基可以具有10％的木糖。所述培养基可以具有11％的木糖。所述培养基可以具有12％的木糖。所述培养基可以具有13％的木糖。所述培养基可以具有14％的木糖。所述培养基可以具有15％的木糖。所述培养基可以具有16％的木糖。所述培养基可以具有17％的木糖。所述培养基可以具有18％的木糖。所述培养基可以具有19％的木糖。所述培养基可以具有20％的木糖。
在一些实施方式中，木糖不是唯一碳源。例如，在一些实施方式中，所述培养基包括木糖和C3碳源、C4碳源、C5碳源、C6碳源或它们的组合。因此，在一些实施方式中，所述培养基包括木糖和C3碳源(例如，甘油)。在一些实施方式中，所述培养基包括木糖和C4碳源(例如，赤藓糖或苏糖)。在一些实施方式中，所述培养基包括木糖和C5碳源(例如，阿糖醇、核糖或来苏糖)。在一些实施方式中，所述培养基包括木糖和C6碳源(例如，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖和艾杜糖)。作为另外一种选择或者另外，在一些实施方式中，所述培养基包括木糖和纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、阿糖醇、山梨糖醇和甘油或它们的组合。在具体的实施方式中，所述培养基包括木糖和葡萄糖。培养基中两种或更多种碳源的量可以独立地在1％至20％(例如，1％至20％的木糖和1％至20％的葡萄糖)，或者2％至14％(例如，2％至14％的木糖和2％至14％的葡萄糖)，或者4％至10％(例如，4％至10％的木糖和4％至10％)的范围内。在具体的实施方式中，每种碳源的量为2％(例如，2％的木糖和2％的葡萄糖)。
所述培养基可以是富含C5的培养基，其以五碳糖(如木糖)作为主要碳源。所述培养基还可以具有C6糖(六碳糖)。在一些实施方式中，所述培养基可以具有C6糖作为主要碳源。在一些实施方式中，所述C6糖是葡萄糖。所述培养可以具有C6糖和C5糖两者作为碳源，并且可以具有以不同比例存在的C6糖和C5糖。在一些实施方式中，培养基中C6糖的量与C5糖的量的比(C6：C5比)在约10：1至约1：20之间。例如，培养基中C6：C5比可以为约10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19或者1：20。在一些实施方式中，培养基中C6：C5比为约3：1。在一些实施方式中，培养基中C6：C5比为约1：1。在一些实施方式中，培养基中C6：C5比为约1：5。在一些实施方式中，培养基中C6：C5比为约1：10。所述C5糖可以是木糖，并且所述C6糖可以是葡萄糖。在一些实施方式中，培养基中葡萄糖的量与木糖的量的比(葡萄糖：木糖比)在约20：1至约1：10之间。例如，培养基中葡萄糖：木糖比可以为约20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9或1：10。在一些实施方式中，培养基中葡萄糖：木糖比为约3：1。在一些实施方式中，培养基中葡萄糖：木糖比为约1：1。在一些实施方式中，培养基中葡萄糖：木糖比为约1：5。在一些实施方式中，培养基中葡萄糖：木糖比为约1：10。
其它碳水化合物源包括(例如)可再生原料和生物质。在本文所提供的方法中可以用作原料的示例性生物质类型包括纤维素生物质和半纤维素生物质原料或原料部分。这些生物质原料含有(例如)作为碳源有用的碳水化合物基质，如木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和淀粉。考虑到本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解除以上举例说明的那些以外的可再生原料和生物质也可以用于培养本文所提供的微生物以用于木糖醇的生产。
因此，考虑到本文所提供的教导和指导，本领域技术人员将理解当在作为碳源的木糖上生长时，可以产生分泌木糖醇的梅奇酵母(Metschnikowia)种。所有需要的是在一种或多种所需要的酶或蛋白活性中进行工程设计以实现木糖醇的生物合成，包括(例如)包含用于产生木糖醇的一些或全部生物合成途径。另外，可以在梅奇酵母(Metschnikowia)种中工程设计遗传修饰，所述遗传修饰将降低进一步催化木糖醇转化为另一种化合物的酶，如木糖醇脱氢酶的活性或使其失活。因此，本文提供了当在碳水化合物，如木糖或其它碳源上生长时，产生和/或分泌木糖醇的梅奇酵母(Metschnikowia)种。
可以使用如本文举例说明的本领域中熟知的方法构建本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种，从而以足够的量外源表达编码本文所述的木糖醇途径的酶或蛋白的至少一种核酸以从木糖产生木糖醇。应理解在足以产生木糖醇的条件下培养本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种。按照本文所提供的教导和指导，本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以实现所期望的化合物的生物合成，从而导致产生约0.1-200mM或以上的胞内浓度。通常，所期望的化合物的胞内浓度在约3-150mM之间，具体地约5-125mM之间，并且更具体地约8-100mM之间，包括约10mM、20mM、50mM、80mM或以上。还可以从本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种实现每个这些示例性范围之间或以上的胞内浓度。
在一些实施方式中，培养条件包括厌氧或基本厌氧生长或者维持条件。先前已描述了示例性厌氧条件并且所述示例性厌氧条件在本领域中是熟知的。本文描述了并且在(例如)美国专利公开2009/0047719中描述了用于发酵过程的示例性厌氧条件。任何这些条件以及在本领域中熟知的其它厌氧条件可以用于所述梅奇酵母(Metschnikowia)种。在这些厌氧或基本厌氧条件下，生产菌株可以以5-10mM或以上以及在本文中举例说明的所有其它浓度的胞内浓度合成所期望的化合物。应理解，尽管上述说明是指胞内浓度，但是生产性微生物可以胞内产生所期望的化合物和/或将所述化合物分泌到培养基中。
本文所提供的方法可以包括在本领域中熟知的任何培养方法，如分批培养、补料-分批培养或者连续培养。该过程可以包括发酵。示例性发酵过程包括(但不限于)补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离；以及连续发酵和连续分离。在示例性分批发酵流程中，使生产生物在用适当气体鼓泡的适合尺寸的生物反应器中生长。在厌氧条件下，用惰性气体或气体，例如，氮气、N2/CO2混合物、氩气、氦等的组合对培养鼓泡。随着细胞生长和使用碳源，以大致平衡碳源和/或营养物的消耗的速度将其它碳源和/或其它营养物补料至生物反应器。将生物反应器的温度维持在所期望的温度，通常在22-37℃的范围内，但是基于生产生物的生长特征和/或发酵过程所需的条件，所述温度可以维持在更高或更低的温度。生长持续所期望的一段时间，从而在发酵罐中实现所期望的培养特征，例如，细胞密度、化合物浓度等。在分批发酵过程中，基于所期望的培养条件，发酵的时间长度通常在几小时至几天的范围内，例如，8至24小时，或者1、2、3、4或5天，或者长达一周。根据需要，pH可以是控制或不控制的，在此情况下在运行结束时，其中pH不控制的培养通常将降低或者增至pH 5-6。在培养期完成时，可以将发酵罐的内容物通过细胞分离单元，例如，离心机、过滤单元等以除去细胞和细胞碎片。在其中胞内表达所期望的化合物的情况下，可以根据需要，在将细胞与发酵肉汤分离之前或之后，使细胞酶促或化学裂解或破裂，以释放其它化合物。可以将发酵肉汤转移至化合物分离单元。通过在本领域中使用的标准分离程序进行化合物分离以将所期望的化合物与稀释的水溶液分离。基于所述发酵过程的化合物的化学特性，这些方法包括(但不限于)使用与水不混溶的有机溶剂(例如，甲苯或其它适合的溶剂，包括(但不限于)二乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二恶烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等)的液-液提取法以提供所述化合物的有机溶液，如果适当，标准蒸镏法等。
在示例性完全连续发酵流程中，生产生物通常首先以分批模式长成以实现所期望的细胞密度。当碳源和/或其它营养物耗尽时，以所期望的速率连续提供具有相同组成的补料培养基，并且以相同速率排出发酵液。在这些条件下，生物反应器中的化合物浓度以及细胞密度通常保持恒定。如以上所讨论的，发酵罐的温度保持在所期望的温度。在连续发酵阶段，通常对于优化生产，期望维持适合的pH范围。可以使用常规方法监测和维持pH，其包括添加适合的酸或碱以维持所期望的pH范围。根据情况和需要，连续操作所述生物反应器延长的一段时间，通常至少一周至几周并且长达一个月或更长的时间。根据需要，定期监测发酵溶液和/或培养，包括多达每天取样，以确保化合物浓度和/或细胞密度的一致性。以连续方式，随着新的补料培养基的提供，恒定除去发酵罐的内容物。根据需要，在除去或不除去细胞和细胞碎片的情况下，通常使含有细胞、培养基和产物的排除液流经受连续化合物分离程序。在本领域中使用的连续分离方法可以用于将所述化合物与稀释的水溶液分离，其包括(但不限于)使用与水不混溶的有机溶剂(例如，甲苯或其它适合的溶剂，包括(但不限于)二乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、氯仿、苯、戊烷、己烷、庚烷、石油醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、二恶烷、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)等)的连续液-液提取法、标准连续蒸镏法等，或者本领域中熟知的其它方法。
除本文所公开的培养和发酵条件之外，实现所期望的化合物的生物合成的生长条件可以包括向所述培养条件中添加渗透保护剂。在某些实施方式中，本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种可以如本文所述，在存在渗透保护剂的情况下维持、培养或发酵。简要地，渗透保护剂是指用作渗透剂并且帮助如本文所述的微生物在渗透应力下存活的化合物。渗透保护剂包括(但不限于)甜菜碱、氨基酸和糖海藻糖。这些的非限制性实例为甘氨酸甜菜碱、果仁糖甜菜碱、二甲基噻亭、二甲基锍基丙酸酯、3-二甲基锍基-2-甲基丙酸酯、哌啶酸、二甲基锍基乙酸酯、胆碱、L-卡尼汀和四氢嘧啶(ectoine)。在一个方面，所述渗透保护剂为甘氨酸甜菜碱。本领域的技术人员应理解适合于保护本文所述的微生物抵抗渗透应力的渗透保护剂的量和类型将取决于所使用的微生物。所述培养条件中渗透保护剂的量可以是(例如)不超过约0.1mM、不超过约0.5mM、不超过约1.0mM、不超过约1.5mM、不超过约2.0mM、不超过约2.5mM、不超过约3.0mM、不超过约5.0mM、不超过约7.0mM、不超过约10mM、不超过约50mM、不超过约100mM或不超过约500mM。
所述培养条件可以包括(例如)液体培养程序以及发酵及其它大规模培养程序。如本文所述，可以在好氧、厌氧或基本厌氧的培养条件下获得特别有用的生物合成产物得率。
本文所述的培养条件可以放大并连续生长以用于所期望的化合物的生产。示例性的生长程序包括(例如)补料-分批发酵和分批分离；补料-分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些方法在本领域中是熟知的。发酵程序对于商品化的量的所期望的产物的生物合成生产是特别有用的。通常并且如非连续培养程序一样，连续和/或近-连续生产包括将本文所提供的微生物在充足的营养物和培养基中培养以保持和/或几乎保持指数期的生长。处于这些条件下的连续培养可以包括(例如)生长或培养1、2、3、4、5、6或7天或以上。另外，连续培养可以包括1周、2、3、4或5或更多周并且长达数月的更长的时间段。作为另外一种选择，如果适合于具体应用，可以将本文所提供的生物培养数小时。应理解连续和/或近-连续培养条件还可以包括这些示例性时间段之间的所有时间间隔。还应理解培养本文所提供的微生物的时间是出于所期望的目的，生产足够量的化合物的足够的一段时间。
除使用大量木糖醇的连续生产，使用本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种的上述发酵程序之外，所述生物衍生化合物还可以(例如)同时经受化学合成和/或酶促过程以将木糖醇转化为其它化合物，或者所述生物衍生木糖醇可以与发酵培养分离并且如果需要，顺序经受化学和/或酶转化以将木糖醇转化为其它化合物。
为了产生更好的生产菌，可以使用代谢模型来优化生长条件。建模还可以用于设计另外优化所述途径的利用的基因敲除(参见，例如，美国专利公开US 2002/0012939、US2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654和US 2004/0009466，和美国专利No.7,127,379)。建模分析使得能够可靠地预测对于将代谢向所期望产物更有效的生产的方向转变的细胞生长的影响。
在一些实施方式中，本文所提供的生产生物衍生木糖醇的方法还包括使用本领域中熟知的多种方法将所述生物衍生木糖醇与培养中的其它组分分离。这些分离方法包括(例如)提取程序以及包括连续液-液萃取、渗透气化、膜滤法、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、提取过滤、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、吸附色谱、超滤、活性炭吸附、pH调节和沉淀或者以上列举的一种或多种方法的组合的方法。上述所有方法在本领域中是熟知的。
本文提供了如本文所述的生物衍生木糖醇。在一些实施方式中，这种生物衍生木糖醇是通过本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种产生的。本文还提供了具有通过本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种所产生的生物衍生木糖醇和其它组分的组合物。除所述生物衍生木糖醇以外的组分可以是细胞部分，例如，微量的培养基细胞部分，或者可以是在存在本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种的情况下所产生的发酵肉汤或培养基或其纯化或部分纯化的部分。因此，在一些实施方式中，所述组合物为培养基。在一些实施方式中，所述培养基可以是已除去本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种的培养基。当通过本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种生产时，所述组合物可以具有(例如)降低的副产物水平。所述组合物可以具有(例如)生物衍生木糖醇，和本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种的细胞裂解液或培养上清液。所述其它组分可以是副产物或杂质，如甘油、阿糖醇、C7糖醇或它们的组合。所述副产物可以是甘油。所述副产物可以是阿糖醇。所述副产物可以是C7糖醇(例如，庚七醇或其异构体)。在一些实施方式中，所述副产物或杂质(例如，甘油或阿糖醇或两者)比通过除本文所提供的分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种以外的微生物所产生的相应的副产物或杂质的量大至少10％、20％、30％或40％。
在一些实施方式中，本文提供的组合物可以具有生物衍生木糖醇和其它组分。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的上清液。所述其它组分可以是发酵肉汤或培养基的细胞部分。所述其它组分可以是本文所提供的梅奇酵母(Metschnikowia)种。所述其它组分可以是本文所提供的微生物的细胞裂解液。所述其它组分可以是副产物，如甘油、阿糖醇、C7糖醇或它们的组合。
在一些实施方式中，可以选择碳原料及其它细胞吸收源，如磷酸盐、氨、硫酸盐、氯化物及其它卤素以改变存在于通过本文所提供的微生物所产生的生物衍生木糖醇中的原子的同位素分布。以上列举的多种碳原料及其它吸收源将在本文中统称为“吸收源”。吸收源可以提供存在于通过本文所提供的微生物所产生的生物衍生木糖醇中或者副产物或杂质中的任何原子的同位素富集。可以对于任何靶原子，包括(例如)碳、氢、氧、氮、硫、磷、氯化物或其它卤素实现同位素富集。
在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变碳-12、碳-13和碳-14的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氧-16、氧-17和氧-18的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氢、氘和氚的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氮-14和氮-15的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变硫-32、硫-33、硫-34和硫-35的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变磷-31、磷-32和磷-33的比。在一些实施方式中，可以选择所述吸收源以改变氯-35、氯-36和氯-37的比。
在一些实施方式中，可以通过选择一种或多种吸收源将靶原子的同位素比改变至所期望的比。吸收源可以来源于天然来源，如自然界所存在的，或者来源于人为来源，并且本领域技术人员可以选择天然来源、人为来源或它们的组合以实现所期望的靶原子的同位素比。人为吸收源的实例包括(例如)至少部分来源于化学合成反应的吸收源。这些同位素富集的吸收源可以是商购的或者在实验室中制备的和/或任选地与所述吸收源的天然源混合以实现所期望的同位素比。在一些实施方式中，可以通过选择如自然界中所存在的所期望的吸收源来源来实现吸收源的靶原子同位素比。例如，如本文所讨论的，天然源可以是生物基的，其来源于生物或者通过生物合成，或者是如石油基产品或大气的来源。在一些这些实施方式中，碳源(例如)可以选自化石燃料-衍生的碳源，其可以相对不含碳-14，或者环境或大气碳源，如CO2，其可以比其石油-衍生的对应物具有更大量的碳-14。
在地球大气中，不稳定的碳同位素碳-14或放射性碳大致占1012个碳原子中的1个，并且其半衰期为约5700年。通过包括宇宙射线和常规氮(14N)的核反应，在上层大气中补充碳储量。由于其很早之前衰变，因此化石燃料不包含碳-14。化石燃料的燃烧降低了大气碳-14的份数，即所谓的“苏斯效应”。
确定化合物中原子的同位素比的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。使用本领域中已知的技术，如加速质谱(AMS)、稳定同位素比质谱(SIRMS)和点特异性天然同位素分馏核磁共振技术(SNIF-NMR)，通过质谱容易地评价了同位素富集。这些质谱技术可以与分离技术，如液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)和/或气相色谱等集成。
就碳而言，在美国作为通过美国材料试验协会(ASTM)国际组织，使用放射性碳年代测定，用于确定固体、液体和气体样品的生物基含量的标准化分析方法开发了ASTMD6866。该标准基于用于确定产品的生物基含量的放射性碳年代测定的使用。ASTM D6866于2004年首次颁布，并且该标准当前有效的版本为ASTM D6866-11(2011年4月1日生效)。放射性碳年代测定技术对于本领域技术人员来说是熟知的，其包括本文所述的那些。
通过碳-14(14C)与碳-12(12C)的比值来估计化合物的生物基含量。具体地，根据下式计算现代分率(Fraction Modern，Fm)：Fm＝(S-B)/(M-B)，其中B、S和M分别代表空白、样品和现代参比的14C/12C比。现代分率是来自“现代”的样品的14C/12C比的偏差的测量。现代的定义是归一化至δ13CVPDB＝-19/1000的国家标准局(NBS)草酸I(即标准参考物质(SRM)4990b)的放射性碳浓度(公元1950年)的95％(Olsson,The use of Oxalic acid as aStandard.in,Radiocarbon Variationsand Absolute Chronology,Nobel Symposium,12th Proc.,John Wiley&Sons,New York(1970))。使用国际上约定的定义：0.95乘以归一化至δ13CVPDB＝-19/1000的NBS草酸I(SRM4990b)的比活性，计算(例如)通过ASM所测量的质谱结果。这相当于1.176±0.010×10-12的绝对(公元1950年)14C/12C比(Karlen等人,ArkivGeofysik,4:465-471(1968))。标准计算考虑了一种同位素相对于另一种的差异吸收，例如，生物系统对12C的吸收优先于13C，然后优先于14C，并且这些修正反映为对于δ13所修正的Fm。
草酸标准品(SRM 4990b或HOx 1)是从一批1955年的甜菜所制备的。尽管制备了1000磅，但是这种草酸标准品不再是可商购的。草酸II标准品(HOx 2；N.I.S.T名称为SRM4990 C)是由一批1977年的法国甜菜糖蜜所制成的。在1980年代早期，12个实验室的小组测量了两种标准品的比值。草酸II与1的活性的比值为1.2933±0.001(加权平均数)。HOx II的同位素比为-17.8/1000。ASTM D6866-11建议使用可用的草酸II标准品SRM 4990 C(Hox2)作为现代标准品(参见Mann,Radiocarbon,25(2):519-527(1983)中有关原始vs.现用的草酸标准品的讨论)。Fm＝0％代表材料中完全缺少碳-14原子，因此表示是化石(例如，石油基)碳源。在对于1950年后来自核弹试验的向大气注入的碳-14进行修正之后，Fm＝100％表示完全现代的碳源。如本文所述，这种“现代”源包括生物基源。
如ASTM D6866中所述，由于1950年代的核试验项目的持续但逐渐减弱的影响，其导致了如ASTM D6866-11中所述的碳-14在大气中的大量富集，因此现代碳的百分比(pMC)可以大于100％。由于所有样品的碳-14活性是以“核弹前”的标准品为参考的，并且因为几乎所有的新的生物基产品是在核弹后的环境中产生的，因此所有pMC值(对于同位素份数修正后)必须乘以0.95(截止2010年)以更好地反映样品真正的生物基含量。大于103％的生物基含量表明要么是发生了分析误差，要么是生物基碳源具有超过数年的历史。
ASTM D6866相对于材料的总有机物含量来定量生物基含量，但是不考虑所存在的无机碳及其它含有非碳的物质。例如，基于ASTM D6866，50％淀粉-基材料和50％水的产品将认为具有生物基含量＝100％(作为100％生物基的50％的有机物含量)。在另一个实例中，50％淀粉-基材料、25％石油基材料和25％的水的产品将具有生物基含量＝66.7％(75％有机物含量，但仅有50％的产品是生物基的)。在另一个实例中，作为50％有机碳并且是石油基产品的产品将认为具有生物基含量＝0％(50％有机碳，但是来自化石来源)。因此，基于用于确定化合物或材料的生物基含量的熟知方法和已知标准品，本领域技术人员可以容易地确定生物基含量和/或本文所提供的具有所期望的生物基含量的所使用的所制备的下游产品。
应用碳-14年代测定技术来定量材料的生物基含量在本领域中是已知的(Currie等人,Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B,172:281-287(2000))。例如，碳-14年代测定已用于定量含有对苯二甲酸酯-的材料中的生物基含量(Colonna等人,Green Chemistry,13:2543-2548(2011))。值得注意地，来源于可再生的1,3-丙二醇和石油-衍生的对苯二甲酸的聚丙烯对苯二甲酸酯(PPT)聚合物导致Fm值接近30％(即，因为3/11的所述聚合物碳衍生自可再生的1,3-丙二醇，8/11来自化石端成员对苯二甲酸)(Currie等人，如上，2000)。相反，衍生自可再生的1,4-丁二醇和可再生的对苯二甲酸两者的聚对苯二甲酸丁二醇酯聚合物导致生物基含量大于90％(Colonna等人，如上，2011)。
因此，在一些实施方式中，本文提供了具有反映大气碳，也称为环境碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14比的生物衍生木糖醇。例如，在一些方面，所述生物衍生木糖醇可以具有至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或者多至100％的Fm值。在一些这些实施方式中，所述吸收源是CO2。在一些实施方式中，本文提供了具有反映石油基碳吸收源的碳-12、碳-13和碳-14比的生物衍生木糖醇。在该方面，本文所提供的生物衍生木糖醇可以具有小于95％，小于90％，小于85％，小于80％，小于75％，小于70％，小于65％，小于60％，小于55％，小于50％，小于45％，小于40％，小于35％，小于30％，小于25％，小于20％，小于15％，小于10％，小于5％，小于2％或小于1％的Fm值。在一些实施方式中，本文所提供的生物衍生木糖醇可以具有通过大气碳吸收源与石油基吸收源的组合所获得的碳-12、碳-13和碳-14比。使用这种吸收源的组合是可以改变碳-12、碳-13和碳-14比的一种方式，并且各个比将反映吸收源的比。
此外，本文还提供了产物衍生的生物衍生木糖醇，其中所述生物衍生木糖醇的碳-12、碳-13和碳-14同位素比与环境中所存在的CO2的值大致相同。例如，在一些方面，本文提供了具有本文所述的生物衍生木糖醇的生物基产品，所述生物衍生木糖醇具有与环境中所存在的CO2的值大致相同的碳-12相对于碳-13相对于碳-14的同位素比，或者本文所公开的任何其它的比。如本文所公开的，应理解产物可以具有与环境中所存在的CO2的值大致相同的碳-12相对于碳-13相对于碳-14的同位素比，或者任何本文所公开的比，其中所述产物是从如本文所公开的生物衍生木糖醇所产生的，其中对所述生物衍生木糖醇化学修饰以产生最终产物。如本文所述，化学修饰生物衍生木糖醇以产生所期望的产物的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。
本文还提供了具有通过本文所述的梅奇酵母(Metschnikowia)种或者使用本文所述的方法所产生的生物衍生木糖醇的生物基产品。在一些实施方式中，本文提供了使用生物衍生木糖醇所产生的生物基产品。这种生产可以包括将所述生物衍生化合物化学反应(例如，化学转化、化学官能化、化学偶联、氧化、还原、聚合、共聚合等)成最终产品。在一些实施方式中，本文提供了具有本文所述的生物衍生木糖醇的生物基产品。在一些实施方式中，本文提供了具有至少2％，至少3％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或者100％的如本文所公开的生物衍生木糖醇的生物基产品。
本文提供了涉及H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶(Xyl1蛋白)的分离的多肽和涉及H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的XYL1基因的分离的核酸，和包含这些核酸的宿主细胞。这种核酸在梅奇酵母(Metschnikowia)种中的存在可以导致所述梅奇酵母(Metschnikowia)种能够如本文所述从木糖产生木糖醇。因此，本文提供了具有Xyl1蛋白或其变体的氨基酸序列的分离的多肽；具有编码Xyl1蛋白或其变体的核酸序列的分离的核酸；具有XYL1的基因的核酸序列的分离的核酸；以及具有这些核酸序列和/或表达这些蛋白的宿主细胞。
在一些实施方式中，本文提供了具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的分离的多肽。本文还提供了具有作为本文所述的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的Xyl1蛋白的变体，但仍保留了所述多肽的功能活性的氨基酸序列的分离的多肽。例如，在一些实施方式中，所述分离的多肽具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸替代、缺失或插入。本文所提供的蛋白的变体还包括(例如)当与参考多肽序列相比时的缺失、融合或截短。因此，在一些实施方式中，本文所提供的分离的多肽具有与SEQ ID NO：11具有至少95.0％、至少95.1％、至少95.2％、至少95.3％、至少95.4％、至少95.5％、至少95.6％、至少95.7％、至少95.8％、至少95.9％、至少96.0％、至少96.1％、至少96.2％、至少96.3％、至少96.4％、至少96.5％、至少96.6％、至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％、至少97.0％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％、至少98.0％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99.0％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％或至少99.8％的同一性的氨基酸序列。
本文所述的Xyl1蛋白的变体还可以含有保守性氨基酸替代，这表示可以通过不改变所述蛋白的二级和/或三级结构的氨基酸来替代一个或多个氨基酸。这些替代可以包括通过具有类似物理化学性质的残基对氨基酸的替代，如用一个脂肪族残基(Ile、Val、Leu或Ala)替代另一个，或者碱性残基Lys和Arg，酸性残基Glu和Asp、酰胺残基Gln和Asn、羟基残基Ser和Tyr或者芳香族残基Phe和Tyr之间的替代。在Bowie等人,Science247:1306-10(1990)中更全面地描述了表型沉默的氨基酸交换。另外，本文所述的蛋白的变体包括对所述蛋白的功能区以外的氨基酸序列具有氨基酸替代、缺失或添加的那些，只要所述替代、缺失或添加不影响所产生的多肽的功能。做出这些替代或缺失的技术在本领域中是熟知的并且包括(例如)定点突变。
本文所提供的分离的多肽还包括保留其功能的本文所述的Xyl1蛋白的功能性片段。在一些实施方式中，本文提供了作为本文所述的Xyl1蛋白的功能性片段的分离的多肽。在一些实施方式中，本文提供了编码作为本文所述的Xyl1蛋白的功能性片段的多肽的分离的核酸。在一些实施方式中，所述分离的多肽可以是Xyl1的片段(SEQ ID NO：11)，其保留了所述蛋白的功能。
在一些实施方式中，本文所述的Xyl1蛋白的变体包括通过其它化学部分，如葡糖基基团、聚乙二醇(PEG)基团、脂类、磷酸盐、乙酰基等的共价修饰或集聚缀合(aggregativeconjugation)。在一些实施方式中，本文所述的Xyl1蛋白的变体还包括(例如)由本文所述的蛋白和另一种多肽所形成的融合蛋白。用于构建所述融合蛋白的所添加的多肽包括有利于本文所述的蛋白的纯化或寡聚的那些，或者提高本文所述的Xyl1蛋白的稳定性和/或功能的那些。
本文所述的Xyl1蛋白可以融合至异源多肽以有利于纯化。多个可用的异源肽(肽标签)允许所述融合蛋白与结合伴侣的选择性结合。肽标签的非限制性实例包括6-His、硫氧还蛋白、血球凝集素、GST和OmpA信号序列标签。识别并结合至异源肽标签的结合伴侣可以是任何分子或化合物，其包括金属离子(例如，金属亲和柱)、抗体、抗体片段或者选择性或特异性结合所述异源肽以允许所述融合蛋白的纯化的任何蛋白或肽。
还可以修饰本文所述的Xyl1蛋白以有利于寡聚物的形成。例如，本文所述的蛋白可以融合至促进寡聚的肽部分，如亮氨酸拉链，和某些抗体片段多肽，如Fc多肽。用于制备这些融合蛋白的技术是已知的，并且在(例如)WO 99/31241和Cosman等人,Immunity 14:123-133(2001)中得到描述。融合至Fc多肽提供了有利于在蛋白A或蛋白G柱上通过亲和色谱法纯化的额外优势。在Landschulz等人,Science 240:1759-64(1988)中描述了融合至亮氨酸-拉链(LZ)，例如，七肽重复序列，它是中间散布着其它氨基酸的四或五个亮氨酸残基。
可以以分离形式或者以基本纯化的形式提供本文所述的Xyl1蛋白。可以通过已知方法从重组细胞培养物中回收和纯化多肽，所述方法包括(例如)硫酸铵或乙醇沉淀、阴离子或阳离子交换色层法、磷酸纤维素色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。在一些实施方式中，蛋白色谱法用于纯化。
在一些实施方式中，本文提供了具有编码本文所述的Xyl1蛋白的外源核酸的重组微生物。在一些实施方式中，所述重组微生物具有编码本文所述的Xyl1蛋白的外源核酸，其中所述蛋白具有1至25、1至20、1至15、1至10或者1至5个氨基酸替代、缺失或插入。在一些实施方式中，所述Xyl1蛋白具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述Xyl1蛋白具有1至10个SEQ ID NO：11的氨基酸替代、缺失或插入并且保留了所述蛋白的功能。在一些实施方式中，所述Xyl1蛋白具有1至5个SEQ ID NO：11的氨基酸替代、缺失或插入并且保留了所述蛋白的功能。所述重组微生物可以是梅奇酵母(Metschnikowia)种，其包括(但不限于)本文所述的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种。
可以通过适合的宿主重组表达本文所述的Xyl1蛋白。当所述蛋白的异源表达是所期望的时，可以根据所述宿主的密码子使用修饰特定基因的编码序列。标准遗传密码在本领域中是熟知的，如(例如)Osawa等人,Microbiol Rev.56(1):229-64(1992)中所综述的。酵母种，包括(但不限于)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、阿斯米假丝酵母(Candida azyma)、叉开假丝酵母(Candida diversa)、木兰假丝酵母(Candidamagnoliae)、皱膜假丝酵母(Candida rugopelliculosa)、解脂耶罗威亚酵母(Yarrowialipolytica)和Zygoascus hellenicus使用标准编码。某些酵母种使用替代编码。例如，“Leu”的“CUG”标准密码子在菌种，如白假丝酵母(Candida albicans)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、口津假丝酵母(Candida melibiosica)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、褶皱假丝酵母(Candida rugose)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)和梅奇酵母(Metschnikowia)种中编码“Ser”。本文提供了H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的密码子表。
此外，宿主可以同时产生同类蛋白的其它形式，从而在相同细胞中表达了相同类型蛋白的多种形式。例如，所述宿主可以同时产生不同的木糖还原酶。
可以通过本领域中已知的常规方法产生本文所述的Xyl1蛋白的变体，如通过寡核苷酸-定位的定点突变，在特定位置引入突变。定点突变被认为是蛋白质工程的信息方法并且可以依赖于靶标蛋白的高分辨率晶体结构来进行特定氨基酸改变(Van Den Burg等人,PNAS 95:2056-60(1998))。用于鉴别多种蛋白质工程目标的位点特异性改变的计算方法也是本领域中已知的(Hellinga,Nature Structural Biology 5:525-27(1998))。
本领域中已知的其它技术包括(但不限于)非信息性突变技术(一般地称为“定向进化”)。定向进化结合高通量筛选使得能够测试蛋白构象中统计学有意义的变化(Arnold,1998)。定向进化技术可以包括类似于Crameri等人,Nature 391:288-91(1998)中所述的多样化方法、定点饱和突变、交错延伸法(StEP)(Zhao等人,Nature Biotechnology 16:258-61(1998))和DNA合成/重组装(美国专利No.5,965,408)。
如本文所公开的，可以将本文所述的编码Xyl1蛋白的核酸引入宿主生物。在一些情况下，还可以期望修饰所述蛋白的活性以提高所期望的产物的产量。例如，可以将已知提高蛋白活性的突变引入编码核酸分子。另外，可以应用优化方法以提高蛋白的活性和/或降低抑制活性，例如，降低负调节蛋白的活性。
一种这种优化方法是定向进化。定向进化是包括引入靶向特定基因的突变以改善和/或改变酶的性质的强有力的方法。可以通过开发和实施允许自动筛选多种酶变体(例如，>104种)的灵敏的高通量筛选测定来鉴别改善和/或改变的酶。通常进行突变和筛选的迭代循环以提供具有优化性质的酶。还已开发了可以帮助鉴别用于突变的基因区域的计算算法，并且所述计算算法可以显著减少需要产生和筛选的酶变体的数目。已发展了多种定向进化技术(有关综述，参见Hibbert等人,Biomol.Eng 22:11-19(2005)；Huisman andLalonde,In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries第717-742页(2007),Patel(主编),CRC Press；Otten and Quax.Biomol.Eng 22:1-9(2005)；和Sen等人,Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223(2007))以有效产生多种变体库，并且这些方法已成功应用于多种酶种类中广泛的性质的改善。已通过定向进化技术改善和/或改变的酶的特性包括，例如：对于非天然底物的转化，选择性/特异性；对于稳健的高温处理，温度稳定性；对于在较低或较高的pH条件下的生物加工，pH稳定性；底物或产物耐受性，从而可以实现高产物滴度；结合(Km)，包括拓宽底物结合以包括非天然底物；抑制(Ki)，以除去抑制副产物、底物或关键中间体；活性(kcat)，以提高酶促反应速率以实现所期望的流量；表达水平，以提高蛋白得率和整体途径流量；氧气稳定性，用于空气敏感性酶在好氧条件下的操作；和厌氧活性，用于好氧酶在不存在氧气的情况下的操作。
已发展了针对特定酶的所期望的性质，使其基因突变和多样化的一些示例性方法。这些方法对于本领域技术人员来说是熟知的。任何这些方法可以用于改变和/或优化本文所述的蛋白的活性。这些方法包括(但不限于)EpPCR，其通过降低PCR反应中DNA聚合酶的保真度来引入随机点突变(Pritchard等人,J Theor.Biol.234:497-509(2005))；易错滚环扩增(epRCA)，其类似于epPCR，除了将整个环形质粒用作模板并且将在最后2个核苷酸上具有核酸外切酶耐受性硫代磷酸键的随机6-聚体用于扩增所述质粒，然后将其转化至细胞，并且在所述细胞中，所述质粒在串联重复序列再环化(Fujii等人,Nucleic Acids Res.32:e145(2004)；和Fujii等人,Nat.Protoc.1:2493-2497(2006))；DNA或家族重排，其通常包括用核酸酶，如DNA酶I或者EndoV消化两种或更多种变体基因以产生随机片段池，所述随机片段池在存在DNA聚合酶的情况下通过退火和延伸循环重新组装以产生嵌合基因库(Stemmer,Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751(1994)；和Stemmer,Nature 370:389-391(1994))；交错延伸(StEP)，其需要模板引导(template priming)，然后是具有变性和非常短的持续时间的退火/延伸(短至5秒)的2步PCR的重复循环(Zhao等人,Nat.Biotechnol.16:258-261(1998))；随机引导重组(RPR)，其中使用随机序列引物来产生与模板的不同片段互补的多个短DNA片段(Shao等人,Nucleic Acids Res 26:681-683(1998))。
其它方法包括异源双链重组，其中将线性化质粒DNA用于形成通过错配修复所修复的异源双链(Volkov等人,Nucleic Acids Res.27:e18(1999)；和Volkov等人,MethodsEnzymol.328:456-463(2000))；临时模板随机嵌合(RACHITT)，其使用了DNA酶I断裂和单链DNA(ssDNA)的大小分级(Coco等人,Nat.Biotechnol.19:354-359(2001))；截短模板上的重组延伸(RETT)，其需要在存在用作模板池的单向ssDNA片段的情况下链从引物单向生长的模板转换(Lee等人,J.Molec.Catalysis 26:119-129(2003))；简并寡核苷酸基因重排(DOGS)，其中将简并引物用于控制分子之间的重组；(Bergquist and Gibbs,MethodsMol.Biol 352:191-204(2007)；Bergquist等人,Biomol.Eng 22:63-72(2005)；Gibbs等人,Gene 271:13-20(2001))；用于产生杂合酶的增长截短法(ITCHY)，其产生了具有所关心的基因或基因片段的1个碱基对缺失的组合库(Ostermeier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:3562-3567(1999)；和Ostermeier等人,Nat.Biotechnol.17:1205-1209(1999))；用于产生杂合酶的硫代增长截短法(THIO-ITCHY)，其类似于ITCHY，除了将硫代磷酸酯dNTP用于产生截短(Lutz等人,Nucleic Acids Res 29:E16(2001))；SCRATCHY，其组合了用于重组基因的两种方法，ITCHY和DNA重排(Lutz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:11248-11253(2001))；随机漂变突变(RNDM)，其中通过epPCR进行突变，然后筛选/选择保留了可用活性的那些(Bergquist等人,Biomol.Eng.22:63-72(2005))；序列饱和突变(SeSaM)，随机突变方法，其使用硫代磷酸酯核苷酸的随机掺入和切割，产生随机长度片段池，所述随机长度片段池用作在存在“通用”碱基，如肌苷的情况下延伸的模板，并且含有肌苷的互补序列的复制提供了随机碱基掺入，并因此导致突变(Wong等人,Biotechnol.J.3:74-82(2008)；Wong等人,Nucleic Acids Res.32:e26(2004)；和Wong等人,Anal.Biochem.341:187-189(2005))；合成重排，其使用设计以编码“靶标中所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸并且允许重排子代具有很高的多样性(Ness等人,Nat.Biotechnol.20:1251-1255(2002))；核苷酸交换和切割技术NexT，其利用了dUTP掺入与随后使用尿嘧啶DNA糖基化酶，然后用哌啶处理以进行终点DNA断裂的组合(Muller等人,Nucleic Acids Res.33:e117(2005))。
其它方法包括不依赖于序列同源性的蛋白质重组(SHIPREC)，其中将接头用于辅助两种远缘相关或不相关基因的融合，并且在所述两种基因之间产生一定范围的嵌合体，从而导致产生了单一混合杂交库(Sieber等人,Nat.Biotechnol.19:456-460(2001))；基因位点饱和突变TM(GSSMTM)，其中起始材料包括在所期望的突变位点含有简并的插入和两个引物的超螺旋双链DNA(dsDNA)质粒(Kretz等人,Methods Enzymol.388:3-11(2004))；组合盒式突变(CCM)，其包括使用短寡核苷酸盒以替代具有大量可能的氨基酸序列变化的限制区(Reidhaar-Olson等人,Methods Enzymol.208:564-586(1991)；和Reidhaar-Olson等人Science 241:53-57(1988))；组合多级盒式突变(CMCM)，其本质上类似于CCM并且使用高突变率的epPCR来鉴别热点(hot spots)和热区(hot regions)，然后通过CMCM延伸以覆盖限定的蛋白序列空间区域(Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.40:3589-3591(2001))；致突变菌株技术，其中条件性ts致突变质粒使用了mutD5基因，其编码了DNA聚合酶III的突变体亚基，从而在选择期间和当不需要选择时，在阻断有害突变的积累期间，允许随机和自然突变频率提高20至4000-X(Selifonova等人,Appl.Environ.Microbiol.67:3645-3649(2001))；Low等人,J.Mol.Biol.260:359-3680(1996))。
其它示例性方法包括浏览突变(Look-Through Mutagenesis,LTM)，它是评价和优化所选氨基酸的组合突变的多维突变方法(Rajpal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:8466-8471(2005))；基因重组装，它是可以一次应用于多个基因并且产生单个基因的大型嵌合体库(多个突变)的DNA重排法(Verenium Corporation所提供的TunableGeneReassemblyTM(TGRTM)技术)、计算机蛋白设计自动化(PDA)，它是锚定具有特定折叠的在结构上限定的蛋白主链，并且搜索可以稳定所述折叠和整体蛋白能学的用于氨基酸替代的序列空间的优化算法，并且它通常对具有已知三维结构的蛋白最有效(Hayes等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:15926-15931(2002))；和迭代饱和突变(ISM)，其包括使用结构/功能的知识来选择用于酶改善的可能位点，使用突变法，如Stratagene QuikChange(Stratagene；San Diego CA)在所选位点进行饱和突变，对于所期望的性质进行筛选/选择，并且使用改善的克隆，在另一位点重复一次并继续重复直至实现所期望的活性(Reetz等人,Nat.Protoc.2:891-903(2007)；和Reetz等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.45:7745-7751(2006))。
可以单独或以任意组合使用任何上述突变方法。另外，所述定向进化方法中的任一种或组合可以结合如本文所述的或者另外如本领域中已知的适应进化技术使用。
本文提供了具有编码本文所述的Xyl1蛋白的核酸序列以及本文所述的XYL1基因的特异性编码核酸序列的分离的核酸。本文所提供的核酸包括具有序列表中所提供的核酸序列的那些；在高严格性杂交条件下(例如，42°，2.5hr.，6×SCC，0.1％SDS)，杂交至序列表中所提供的核酸序列的那些；和与序列表中所提供的核酸序列具有显著核酸序列同一性的那些。本文所提供的核酸还涵盖了可以翻译以产生相同氨基酸序列的等价密码子替代。本文还提供了包含本文所述的核酸的载体。所述载体可以是适合于在宿主微生物中表达的表达载体。所述载体可以是病毒载体。
本文所提供的核酸包括编码具有如本文所述的氨基酸序列的蛋白的那些以及保留了它们的功能的它们的变体。本文所提供的核酸可以是cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA、RNA或其组合。由于遗传密码的简并度，两条DNA序列可以不同，但仍编码相同的氨基酸序列。
本文还提供了编码本文所述的蛋白的有用的核酸片段，包括探针和引物。可以(例如)在PCR方法中使用这些探针和引物以体外扩增或检测编码本文所述的蛋白的核酸的存在，并且可以在DNA和RNA印迹中用于分析。还可以通过使用这些探针来鉴别表达本文所述的蛋白的细胞。用于产生和使用这些引物和探针的方法是熟知的。
本文还提供了编码本文所述的蛋白的核酸片段，所述核酸片段是具有能够结合至本文所述的蛋白或核酸序列的靶标mRNA或DNA序列的单链核酸的反义或正义寡核苷酸。
编码本文所述的蛋白的核酸可以包括杂交至本文通过SEQ ID NO所公开的核酸的核酸或者杂交至编码本文通过SEQ ID NO所公开的氨基酸序列的核酸分子的核酸分子。杂交条件可以包括如本文所述的那些的本领域技术人员熟知的高度严格性、中等严格性或低严格性杂交条件。
严格杂交是指杂交的多核苷酸稳定的条件。如本领域技术人员已知的，杂交的多核苷酸的稳定性反映在杂交物的解链温度(Tm)。一般地，杂交的多核苷酸的稳定性是盐浓度，例如，钠离子浓度和温度的函数。杂交反应可以在较低的严格性条件下进行，然后通过不同，但更高的严格性清洗。对杂交严格性的提及涉及这些清洗条件。高度严格杂交包括仅允许在0.018M NaCl，65℃形成稳定的杂化多核苷酸的那些核酸序列杂交的条件，例如，如果杂交物在0.018M NaCl，65℃不稳定，则它在高严格性条件下将不会稳定，如本文所考虑的。可以(例如)通过在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS中，在42℃杂交，然后在0.1×SSPE和0.1％SDS中，在65℃清洗来提供高严格性条件。除高严格性杂交条件以外的杂交条件也可以用于描述本文所公开的核酸序列。例如，短语中等严格性杂交是指相当于在50％甲酰胺、5×Denhart溶液、5×SSPE、0.2％SDS中，在42℃杂交，然后在0.2×SSPE和0.2％SDS中，在42℃清洗的条件。短语低严格性杂交是指相当于在10％甲酰胺、5×Denhart溶液、6×SSPE、0.2％SDS中，在22℃杂交，然后在1×SSPE、0.2％SDS中，在37℃清洗的条件。Denhart溶液含有1％聚蔗糖、1％聚乙烯吡咯烷酮和1％牛血清白蛋白(BSA)。20×SSPE(氯化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA))含有3M氯化钠、0.2M磷酸钠和0.025M(EDTA)。其它适合的低、中等和高严格性杂交缓冲液和条件对于本领域技术人员是熟知的并且在(例如)Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001)；和Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999)。
编码本文所提供的蛋白的核酸包括与本文通过SEQ ID NO所公开的核酸序列具有特定序列同一性百分比的那些。例如，核酸分子可以与选自SEQ ID NO：11的序列具有至少95.0％，至少95.1％，至少95.2％，至少95.3％，至少95.4％，至少95.5％，至少95.6％，至少95.7％，至少95.8％，至少95.9％，至少96.0％，至少96.1％，至少96.2％，至少96.3％，至少96.4％，至少96.5％，至少96.6％，至少96.7％，至少96.8％，至少96.9％，至少97.0％，至少97.1％，至少97.2％，至少97.3％，至少97.4％，至少97.5％，至少97.6％，至少97.7％，至少97.8％，至少97.9％，至少98.0％，至少98.1％，至少98.2％，至少98.3％，至少98.4％，至少98.5％，至少98.6％，至少98.7％，至少98.8％，至少98.9％，至少99.0％，至少99.1％，至少99.2％，至少99.3％，至少99.4％，至少99.5％，至少99.6％，至少99.7％或者至少99.8％的序列同一性或者是相同的。
因此，在一些实施方式中，本文所提供的分离的核酸具有本文所公开的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的XYL1基因的核酸序列。因此，在一些实施方式中，本文提供了具有XYL1的核酸序列(SEQ ID NO：11)的分离的核酸。
本文还提供了在梅奇酵母(Metschnikowia)种(例如，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种)中表达多肽的方法，其中所述多肽包括亮氨酸(Leu；L)。该方法包括将编码所述多肽的外源核酸序列在允许所述多肽表达的条件下引入到梅奇酵母(Metschnikowia)种中，其中如本文所举例说明的，对于亮氨酸，所述外源核酸序列具有CTT、CTG、CTA、TTA或TTG密码子来替代CTG密码子。在具体的实施方式中，替代CTG密码子的密码子是TTG。对编码核酸序列做出这些修饰的方法在本领域中是熟知的。
本文还提供了将外源核酸引入到梅奇酵母(Metschnikowia)种(例如，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种)中的方法。这种方法是如实施例I中所举例说明的改良的醋酸锂流程或者电穿孔流程。
应理解在本文所提供的本发明的定义内，还提供了不显著影响本发明的多个实施方式的活性的改变。因此，以下实施例旨在说明，但不限制本发明。在整个本发明申请中，已参考了多个出版物。在本发明中，这些出版物的公开内容，包括GenBank和GI编号出版物以其全部内容作为参考并入本文以更全面地描述本发明所属领域的技术现状。
实施例I
H0梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖生产木糖醇
本实施例表明当在含有木糖的YEP培养基中培养时，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖产生木糖醇。
在补充有4％w/v或10％w/v木糖的酵母提取物蛋白胨(YEP)培养基中对H0梅奇酵母(Metschnikowia)种测定了从木糖生产木糖醇的产量。作为对照，还测定了酿酒酵母(S.cerevisiae)葡萄酒酵母M2。
将H0梅奇酵母(Metschnikowia)种细胞接种至125ml烧瓶中的50ml YEP+4％w/v或10％w/v木糖培养基中，并在30℃的培养箱中，以120rpm振荡培养。从培养中采集1ml样品，并通过离心除去细胞。将所述上清液通过0.22μm尼龙注射器过滤器过滤至HPLC样品小瓶中。通过HPLC，在Rezex RPM-monosaccharide Pb+2柱(Phenomenex)上，在80℃，使用水作为流动相，以0.6ml/min的流速分析所述上清液中木糖醇的含量。通过Agilent G1362A差示折光检测器(Agilent)检测峰。
H0梅奇酵母(Metschnikowia)种通过木糖依赖性途径产生木糖醇。例如，在4％木糖培养基中，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在5天中从40g/L的木糖中产生约13.8g/L的木糖醇，而在10％的木糖中，它在10天中从100g/L的木糖产生约23g/L的木糖醇(图1)。当木糖用尽时，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种开始消耗培养基中的木糖醇(图1)。在两种培养基中，酿酒酵母(S.cerevisiae)M2种未产生木糖醇(图1)。
实施例II
具有木糖醇途径的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种的构建
为了提高如实施例I中举例说明的通过H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖醇得率和产率，修饰了H0梅奇酵母(Metschnikowia)种基因组中的木糖醇生产途径。所述修饰包括使xyl2基因(SEQ ID NO：6)缺失，所述XYL2基因编码了木糖醇脱氢酶(XDH；SEQ ID NO：1)，并且使XYL1基因(SEQ ID NO：19)过表达，所述XYL1基因编码了木糖还原酶(XR；SEQ IDNO：11)并且在一些实验中，使木糖转运蛋白(GXF1；SEQ ID NO：42，或者GXF2；SEQ ID NO：44)过表达(图2)。提供共基质以支持细胞代谢并为木糖还原酶提供氧化还原平衡(图2)。
为了在H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中工程化木糖醇途径，需要鉴别作为基因调控的选择标志物的可用的抗真菌剂抗性基因。首先，测试了H0梅奇酵母(Metschnikowia)种对多种已知的抗真菌剂的敏感性。将单个酵母菌落接种到含有不同浓度抗生素(50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL、300ug/mL、350ug/mL、400ug/mL、450ug/mL)的5ml YPD肉汤中。将培养物在30℃好氧生长2天，并通过在600nm测定培养物的光密度来监测生长。确定H0梅奇酵母(Metschnikowia)种分别对100ug/mL诺尔丝菌素(cloNAT)，300ug/mL潮霉素，200ug/mL腐草霉素和400ug/ml遗传霉素敏感。
基于该敏感性谱，将已知在酿酒酵母(S.cerevisiae)中提供耐受性的基因引入H0梅奇酵母(Metschnikowia)种——natMX和hphMX基因，其通常分别提供对诺尔丝菌素和潮霉素的耐受性。然而，natMX和hphMX基因的引入导致无存活的菌落。假设H0梅奇酵母(Metschnikowia)种可能属于真菌CTG进化枝种，其中通用的亮氨酸CUG密码子主要翻译为丝氨酸，并且很少翻译为亮氨酸(Santos等人,2011,C.R.Bio.,334:607-611)，正如密切相关的种葡萄牙假丝酵母(C.lusitaniae)一样(Young等人,2000,Genetics,155:17-29)。对于亮氨酸编码，将CTG密码子转变为TTG(参见表4)，并且由于对于H0梅奇酵母(Metschnikowia)种，整个基因组注释不可用，因此基于对多个H0梅奇酵母(Metschnikowia)种开放阅读框架所计算的密码子偏好，优化了其它密码子。
表4：H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的密码子
密码子优化的抗生素基因序列如下所示：
MeNAT:
ATGGGTACCACCTTGGACGACACCGCCTACAGATACAGAACCTCCGTCCCAGGTGACGCCGAGGCCATCGAGGCCTTGGACGGTTCCTTCACCACCGACACCGTCTTCAGAGTCACCGCCACCGGTGACGGTTTCACCTTGAGAGAGGTCCCAGTGGACCCACCATTGACCAAGGTCTTCCCAGACGACGAGTCCGACGACGAGTCCGACGACGGTGAGGACGGTGACCCAGACTCCAGAACCTTCGTCGCCTACGGTGACGACGGTGACTTGGCCGGTTTCGTGGTCGTCTCCTACTCCGGTTGGAACAGAAGATTGACCGTCGAGGACATCGAGGTCGCCCCAGAGCACAGAGGTCACGGTGTCGGTAGAGCCTTGATGGGTTTGGCCACCGAGTTCGCCAGAGAGAGAGGTGCCGGTCACTTGTGGTTGGAGGTCACCAACGTCAACGCCCCAGCCATCCACGCCTACAGAAGAATGGGTTTCACCTTGTGCGGTTTGGACACTGCCTTGTACGACGGCACCGCCTCTGACGGTGAGCAGGCTTTGTACATGTCCATGCCATGTCCATAA(SEQ ID NO：55)
MeHPH:
ATGGGTACCAAGAAGCCTGAGTTGACCACTACTTCTGTTGAGAAGTTCTTGATCGAAAAGTTCGACTCTGTTTCTGACTTGATGCAGTTGTCCGAGGGTGAGGAGTCCAGAGCTTTCTCCTTCGACGTTGGTGGTAGAGGTTACGTCTTGAGAGTCAACTCCTGTGCCGACGGTTTCTACAAGGACAGATACGTCTACAGACACTTCGCCTCCGCTGCTTTGCCAATCCCAGAGGTCTTGGACATCGGTGAGTTCTCTGAGTCTTTGACCTACTGTATCTCCAGAAGAGCCCAGGGTGTCACCTTGCAGGACTTGCCAGAGACCGAGTTGCCAGCCGTCTTGCAGCCAGTCGCTGAGGCTATGGACGCTATCGCTGCTGCCGACTTGTCTCAGACTTCTGGTTTCGGTCAATTCGGTCCACAGGGTATCGGTCAGTACACCACTTGGAGAGACTTCATCTGTGCCATCGCCGACCCACACGTCTACCACTGGCAGACCGTTATGGACGACACCGTTTCTGCCTCTGTTGCCCAGGCTTTGGACGAGTTGATGTTGTGGGCTGAGGACTGTCCAGAGGTTAGACACTTGGTTCACGCTGACTTCGGTTCCAACAACGTCTTGACCGACAACGGTAGAATCACCGCTGTCATCGACTGGTCTGAGGCTATGTTCGGTGACTCCCAGTACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGACCTTGGTTGGCCTGTATGGAGCAGCAGACCAGATACTTCGAGAGAAGACACCCAGAGTTGGCTGGTTCTCCAAGATTGAGAGCTTACATGTTGAGAATCGGTTTGGACCAGTTGTACCAGTCCTTGGTTGACGGTAACTTCGACGACGCTGCCTGGGCTCAGGGTAGATGTGACGCTATCGTCAGATCTGGTGCTGGCACCGTTGGTAGAACCCAGATCGCTAGAAGATCCGCTGCTGTCTGGACCGACGGTTGTGTCGAGGTTTTGGCTGACTCTGGTAACAGAAGACCATCCACCAGACCAAGAGCCAAGGAGTAA(SEQ ID NO：56)
MeKAN:
ATGGGTACCAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGACCAAGATTGAACTCCAACATGGATGCTGATTTGTACGGTTACAAATGGGCTAGAGATAACGTCGGTCAATCTGGTGCGACTATCTACAGACTTTACGGCAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTCTTGAAGCATGGCAAAGGTTCCGTTGCCAACGACGTTACCGATGAGATGGTCAGACTTAACTGGTTGACGGAATTTATGCCTCTTCCTACCATCAAGCACTTCATCCGTACTCCTGATGACGCCTGGTTGCTCACCACTGCGATCCCAGGCAAAACCGCTTTCCAGGTCTTGGAGGAATACCCTGATTCTGGTGAGAACATTGTTGACGCGTTGGCCGTGTTCTTGCGTAGATTGCACTCGATTCCTGTTTGTAACTGTCCTTTCAACTCCGACCGTGTGTTCAGACTCGCTCAGGCCCAATCCAGAATGAACAACGGTTTGGTTGACGCGTCTGACTTTGATGACGAGCGTAACGGCTGGCCTGTTGAGCAGGTCTGGAAAGAGATGCACAAGCTCTTGCCATTCTCTCCAGATTCCGTCGTTACTCACGGTGATTTCTCTCTTGACAACCTTATTTTCGACGAGGGTAAGTTGATCGGTTGTATTGATGTTGGTAGAGTCGGTATCGCTGACAGATACCAGGATCTTGCCATCCTCTGGAACTGCCTCGGTGAGTTCTCTCCTTCCTTGCAGAAGAGACTTTTCCAGAAGTACGGTATTGATAACCCTGATATGAACAAGTTGCAGTTCCACTTGATGCTCGACGAGTTCTTTTGA(SEQ ID NO：57)
MeBLE:
ATGGGTACCGCCGACCAAGCGACGCCCAACTTGCCATCCAGAGATTTCGATTCCACGGCTGCCTTCTACGAAAGATTGGGCTTCGGTATCGTTTTCAGAGACGCCGGTTGGATGATCCTCCAGAGAGGTGATCTCAAGTTGGAGTTCTTCGCCCACCCAGGTCTCGATCCACTCGCTTCCTGGTTCAGCTGCTGTTTGAGATTGGACGACCTCGCGGAGTTCTACAGACAGTGCAAATCCGTCGGCATCCAGGAAACCAGCAGCGGTTACCCAAGAATCCACGCTCCAGAGTTGCAGGAGTGGGGTGGCACGATGGCCGCTTTGGTTGACCCAGACGGTACGCTCTTGCGTTTGATCCAGAACGAGTTGCTTGCTGGCATCTCCTGA(SEQ ID NO：58)
使用修改的醋酸锂流程(如以下所讨论的)，将受PGK1、ADH1和TEF启动子以及PGK1终止子(图3)控制的新的抗诺尔丝菌素基因(名称MeNAT，表示梅奇酵母(Metschnikowia)natMX4)成功高效转化至H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中并导致产生了诺尔丝菌素抗性菌落。使用相同流程，还成功产生了受不同启动子和终止子控制的密码子优化的抗潮霉素基因(MeHPH)、抗遗传霉素基因(MeKAN)和抗腐草霉素基因(MeBLE)，将其转化至H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中并导致产生了相应的抗性菌落(图3)。通过同源重组，对于特定基因组整合，将标志物基因表达盒侧接H0梅奇酵母(Metschnikowia)种基因序列(图3)。侧接序列的长度影响整合效率。对于H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中的同源重组，需要至少200个碱基核苷酸。
为了转化H0梅奇酵母(Metschnikowia)种，发展了修改的醋酸锂流程和电穿孔流程。所述修改的醋酸锂流程包括以下步骤：
1.将单菌落接种至YPD肉汤，在30℃生长过夜。
2.在YPD中将酵母细胞稀释至OD600＝0.4，并且生长另外两代直至OD600＝1.5-1.8(5至6小时)。
3.对于每次转化，收集5至10OD的细胞并将它们在200μl预处理溶液(0.1M醋酸锂，1×TE pH 7.5和10mM DTT)中再悬浮。将细胞在30℃，在振荡下培育1h。
4.通过@13000rpm离心1.5min收集细胞。在500μl冷无菌水中清洗细胞，并通过@13000rpm离心1.5min收集细胞。现在，细胞准备好进行转化并且可以在4℃储存几小时。
5.对于每次转化，制备以下混合物并加入细胞：
6.通过涡旋1min剧烈混合细胞。
7.将细胞在30℃，在不振荡的情况下培育30min。
8.在42℃，对细胞热冲击20-25min。
9.收集细胞并将它们在1ml YPD肉汤中再悬浮。
10.将细胞在30℃振荡培育1h(然后是步骤11至14)或者将细胞在30℃振荡培育6h，收集细胞，将它们在200μl dH2O中再悬浮，并将100μl细胞直接在选择性平板上涂板，并在30℃培育2-3天。
11.收集细胞并在200μl dH2O中再悬浮。
12.将100μl细胞在YPD平板中涂板，并在30℃培育过夜。(如有必要，将剩余100μl细胞在4℃保存以用于第二次涂板)
13.将细胞在选择性平板上重复涂板。
14.在30℃培育2至3天。
15.所述选择性平板可以是YPD+100ug/mL诺尔丝菌素(cloNAT)，或者300ug/mL潮霉素，或者200ug/mL腐草霉素，或者400ug/ml遗传霉素，或者如果转化了多个抗生素基因盒，则这些抗生素的组合。
所述电穿孔流程包括以下步骤：
1.将单菌落接种至YPD肉汤，在30℃生长过夜。
2.在YPD中将酵母细胞稀释至OD600＝0.4，并且生长另外两代直至OD600＝1.5-1.8(5至6小时)。
3.收集5至10OD的细胞，用水清洗并用200μl LiAC-TE-DTT溶液(0.1M醋酸锂，1×TE pH 7.5和10mM DTT)处理细胞。将细胞在30℃，在振荡下培育1h。
4.用200μl 1M的冷山梨糖醇清洗细胞并将它们在50μl 1M的冷山梨糖醇中再悬浮。
5.将细胞与5μl DNA(1-3μg)混合
6.将所述混合物加入到0.2cm的冷冻电穿孔杯的底部。将细胞在1.8kV，25μF，200Ω电穿孔。
7.立即加入1ml含有1M山梨糖醇的冷YPD肉汤。在30℃回收1h。
8.收集细胞并将它们在200μl 1M山梨糖醇中再悬浮。
9.将100μl细胞在YPD琼脂平板中涂板，并将所述平板在30℃培育过夜。(如有必要，将剩余100μl细胞在4℃保存以用于第二次涂板)
10.将细胞在选择性平板上重复涂板，并在30℃培育2-3天。
然后，进行XYL2基因的缺失。示例性缺失策略如图4所示。简要地，通过侧接与XYL2上游和下游序列同源的序列的抗真菌剂抗性基因盒替代第一309nt的XYL2开放阅读框架(ORF)。
然后，将XYL1基因的过表达引入xyl2缺失菌株。将来自H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖还原酶基因(XYL1)ORF(SEQ ID NO：19)连接至PGK1启动子和终止子。将该XYL1表达盒插入以上所讨论的XYL2缺失盒(图5)。
使用来自New England Biolabs的Q5高保真DNA聚合酶，通过PCR从H0梅奇酵母(Metschnikowia)种酵母基因组DNA扩增所有H0梅奇酵母(Metschnikowia)种基因序列。通过用核果梅奇酵母(M.fructicola)277(ANFW01000000)的全基因组鸟枪重叠群和H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的全基因组鸟枪重叠群的序列同源性搜索来设计引物。从H0梅奇酵母(Metschnikowia)种基因组扩增的，用于以上所讨论的缺失和过表达盒构建的并且如图3-5所示的序列如下所示：
XYL2up:
ACCGGATGCACACGAAAGGAGTATGTGCCAGCGAAGCAACAACGCCAAGTGTCACGGATGACGAGTATGACGATGAAACAGACGTGGAGAACTGTAATGGAGGGGAACCTGAATCAAGAGTGAGACAATACAGAACATGTGCAGATGATATTTTAAGTGTTCAGAGCCTTGACTAAAGCAGTTGATTCAAGACGTATAGTACCTTTGAAGTACCTATATAAAAGTAATAAGAGGTACTCGGCACACGTTGACCAATCTTATGTTTTGGCATGACTACGATGTACCGTAGAGTGTTCAATTTGATGTTTAGATCAATCTATTAGCGACTGCGGAAAGTAAGGGAGAGCCCTAAGAACTGAATCCCCGCATTGCCGGCGTCGACCGCAGTGAAACCAACGTAAGTCTATTATGTCGAATGTGAACAACGAGCCAAGTGCATAGATTGGGTCTCCCCGCGACGCACAAGCGGAGACTCCGGAGAGTCACACATGTGGCTGAGACGGCAAAAAGTGGGCTGATTCAAGAGCAACGCATTCCAAAACATCAGATTTTCACAAGCTTTGAATAAATTTTTATTCGCCTGACAATTACGAGCGTACTGCGGCGATGTAAGTGAATCGGATGCCCCCCATTTGTTTCATGCGCAGCCGCAATATAATAAAAAAAAAGGGGCCGATCTATGACGTAATGGCTATTTCAGCGCTTTTATTCGAGATCTGAAGCTCGTCACTTGCTGAAGTTCGTAATATATTCTAACACAAATAAATTCCGACGTGGCGCATGAAACTGAGTTTATGAGGGTCAAGCAGGATAAGAATTTACGAAAGGCTTAACGCGTGCGTTATGAACTGAATAACCTTCGTGTCAACAACAAACTGGGGTTTCCCCGCGCTGAGTTTTCCCGAGAATCATTGCTGCGCGAAGACTCCGACACTCTGCAGTATGCGTGGGATGCTATAAATTATGGACGACGACGTATTCCACTTTTTTTCCTTTTCTTTAATCAGCCGACACCATATCCGAAA(SEQ ID NO：59)
XYL2N:
ATGCCTGCTAACCCATCCTTGGTTTTGAACAAAGTGAACGACATCACGTTCGAGAACTACGAGGTTCCGTTACTCACAGACCCCAACGATGTATTGGTTCAGGTGAAAAAGACTGGAATCTGTGGATCTGACATCCACTACTACACCCACGGCAGAATTGGCGACTTCGTGTTGACAAAGCCAATGGTTTTGGGCCACGA(SEQ ID NO：60)
XYL2 C:
AGTGGCCACTACAACTTGTGCCCACACATGTGTTTTGCCGCCACGCCCAACTCTAACCCCGACGAGCCAAACCCGCCAGGGACTTTGTGCAAATATTACAAGTCCCCAGCGGACTTCTTGGTGAAATTGCCTGAGCACGTCTCCCTTGAGTTGGGCGCTATGGTCGAGCCTTTGACTGTCGGTGTGCACGCCTCGCGTTTGGGCCGTGTCACTTTTGGTGACCACGTTGTGGTTTTCGGTGCTGGCCCAGTCGGTATCCTTGCGGCTGCCGTGGCCAGAAAGTTTGGCGCTGCCAGCGTGACTATCGTCGACATCTTCGACAGCAAATTGGAATTGGCCAAGTCCATTGGCGCGGCCACTCACACATTCAACTCAATGACTGAGGGTGTTCTTTCGGAGGCTTTGCCCGCGGGCGTGAGACCTGACGTTGTATTGGAGTGCACTGGAGCAGAGATCTGTGTGCAGCAAGGTGTACTTGCGTTGAAGGCTGGTGGCCGCCACGTGCAAGTTGGAAATGCCGGCTCCTATCTCAAATTCCCCATCACCGAATTTGTTACCAAGGAGTTGACTCTCTTTGGATCCTTCCGTTACGGTTACAACGACTACAAGACGTCGGTCGCCATCTTGGACGAGAATTACAAGAACGGGAAGGAGAATGCGTTGGTGGACTTTGAAGCCTTGATTACTCACCGTTTCCCCTTCAAGAATGCCATTGAGGCTTACGACGCGGTGCGCGCTGGCGACGGAGCTGTCAAGTGTATCATTGACGGCCCAGAGTAA(SEQ ID NO：61)
XYL2C’:
CCTTCCGTTACGGTTACAACGACTACAAGACGTCGGTCGCCATCTTGGACGAGAATTACAAGAACGGGAAGGAGAATGCGTTGGTGGACTTTGAAGCCTTGATTACTCACCGTTTCCCCTTCAAGAATGCCATTGAGGCTTACGACGCGGTGCGCGCTGGCGACGGAGCTGTCAAGTGTATCATTGACGGCCCAGAGTAA(SEQ ID NO：62)
XYL2 d:
CGATGAAATAAAAAGATAATACTTGCTCTTACTCCATTTATAGACTAATGTACGCTGCTTCACGATAGTTTTCCTCACGATAGTTTATTTAGGCTCGTCGAGTCTCGCCGTCTCGCATGCTCATGAGATCGTTGGCGAGCTCTCTTTCTTGTCTGCTCCGGCCATTCATGGTGGAGGCTATTGAATTTTCAAACTTTGACAGTGATGAGTGCCTACCGAAGGTTGCATATTGGTAAGGCACATCGTGCGTGTATGAGCTTGCCGGATACTGCATGAGAAATGATGCTGGGACCGCAGAATTCAGCAAGTTTGCCAGCGATGTGCTTGTCAGTTTCGCCTCCATCACGTCATTCGTAGTGGACGCAATAGCGCTTGAAGACTGCGTTGGCCGAACCAGTCTGCTTCCATCAGCGTGAATCTTGTTCAGCATACCCGACAACATCTTCGTCTTGTATTTGATGTACTTCAAAATTCTGAGATACTTCAAGTCCTCGTCTAGATTCTCGTCATCCCAATCGATATCGGTACTCTCTGCATCTTCGACATCGGACTC(SEQ ID NO：63)
XYL1:
ATGCCCCAAGTGGGGTTTGGGTGCTGGAAAGTAACTAACAGTACATGTGCTGATACGATCTACAACGCGATCAAAGTTGGCTACAGATTATTTGATGGCGCTGAAGATTACGGGAACGAGAAAGAGGTGGGCGAAGGAATCAACAGGGCCATTGACGAAGGCTTGGTGGCACGTGACGAGTTGTTCGTGGTGTCCAAGCTCTGGAACAACTTCCATCATCCAGACAACGTCGAGAAGGCGTTGGACAAGACTTTGGGCGACTTGAATGTCGAGTACTTGGACTTGTTCTTGATCCATTTCCCAATTGCGTTCAAATTCGTGCCCTTTGAGGAGAAATACCCGCCCGGCTTCTACTGTGGAGAAGGCGATAAGTTTATCTACGAGGATGTGCCTTTGCTTGACACGTGGCGGGCATTGGAGAAGTTTGTGAAGAAGGGTAAGATCAGATCCATCGGAATCTCGAACTTTTCCGGCGCGTTGATCCAGGACTTGCTCAGGGGCGCCGAGATCCCCCCTGCCGTGTTGCAGATTGAGCACCACCCATACTTGCAGCAGCCCAGATTGATTGAGTATGTGCAGTCCAAGGGTATTGCCATCACAGCCTACTCCTCTTTTGGCCCACAGTCGTTTGTGGAGTTGGACCACCCCAAGGTCAAGGAGTGTGTCACGCTTTTCGAGCACGAAGACATTGTTTCCATCGCTAAAGCTCACGACAAGTCCGCGGGCCAGGTATTATTGAGGTGGGCCACGCAAAGGGGTCTTGCCGTGATTCCAAAGTCAAACAAAACCGAGCGTTTGTTGCTGAATTTGAATGTGAACGATTTTGATCTCTCTGAAGCAGAATTGGAGCAAATCGCAAAGTTGGACGTGGGCTTGCGCTTCAACAACCCTTGGGACTGGGACAAGATTCCAATCTTCCACTAA(SEQ ID NO：64)
ADH1启动子:
TTGTCTTGTAAAGAGTCTTCGGTCATTTTTACGCCGAATCGGCCTCTGGTGTACAGGTGTAATGTAAGCAGAAAGATGTAGATAATACATAGCGTCAACGGTTCTATCGAGTCAGGATTGACTGCGGGGCCAAATGTGGGGTATCACGTGTCGATGGAAACTGTCAACAAAAGATGAATTTTTTTTTGATCGTCAACGCTGCTCTAAGCGTGAATCAAGGATATGCGCTTATGGGGACGTGCGATCCGCGCCGCATTCACCCGAAGAACGTGCTCTCGATCGATCACCCGGCGCCGCGCACGGCCCAATCGAGAAAGAGGGACCTCGGAGATAAGCACCCCCTTTCTCGAAGTATGTACATATTATTTACAGCGAAATCACAAAGGCCAAGTCTACTCTCTATCACAATGATTATTTGCACGCTAGAAGTTTGCCGCCCCTCTTTCCTCATTCAAAGCTGTTTCAGAAATGCACTCGTAAGCGCATGTTCGTATCGGCATCGCAGGCTCAAATGCCCAGGAGCCGCCCGCGCAGCCCCATAAACCCATTTCAGGCATATGCGCCTAGTGGCCCGCAGCGTGCGCGAGCACCGAACATCACCCCACAGCAATGTATAAAACCCGAACAATATAAAAGCGATCCACATCGCTCGGTAATGCGTCCGTTCTTTCGTTCATCAGTATCACTTGCATTCACTTCACGAATCCGAGCTACAAACATCATCGCAATCAGAAA(SEQ ID NO：65)
PGK1启动子:
ATGTTCTGGGTGTTTCTGGTTTGGAGACTGGCTCAGAGATAAAGCAACCGGGTGAATAGAGATACAGTTTATTTGAGGCGGAAAGAGATCATCAGGCATACAAAATGCGTTTCGAGAATAAAGTTTTGTTGGAATGCCTTTATGCGTGATGTTGATGTGGGGATCTGTAAAGCAACTTGACCTGCAATTGCATTGCATGGGCCCGGTCGTGCTCATTTGTTGGTATGCGCTTATCCGGGCAACCACGTTGTTGAAAAGCGCGGATGGGCCGGAGTACTCACAGCAAGGGCAATCGACCACATTTATTCTTAGCGCCCATAGTTCAGGCGTCCGGAGTCATCAGCGGATGGTATCTGTTGAAAATAAAGTCTCCTAGAGTTTTTAATGTAATTACTTGCGTTTTCGATTTTTGTAGAAAGTTTTGGAGTTTGTGGGACTGAACTCAGGCCCAATGCGATTTCCGAATCTGGAGAAACGTAGTCGATATGCGATTAGGGGTAACAAAAAGATTTCATAGTCACACAAAGATCAATTCGACAGTATTTTGCAGTGATTGCATTGAAGGCCATAATATCATTGCAAATAGTGTCTATTTGGGCCCATTGGTGAATTCTGTCTGTGTTGAGTCATTCAAGACACAGCAATCAATTCGATTGCAGTCTCGCAGGTGGTGTGGTTGTGGTGCGACTTGAAAAACCCGGAGGATGGTAATCCGCCGAGAATGAACTCCGAGCGAAAACCCGTCAGACATATATAAACCCTCACAGTGCGCACTACTCGCCTGGAAAAATTAGAATTCGTTTCTATCAATTCATCTCCATTTGATATCAATTGATTCGCATACTAAAATCTATAACTA(SEQ ID NO：66)
PGK1终止子:
GTAGTTCGATAAGTTTGACACTTACCGATTGAATACACATTTTAATCTATGACTTTCATGTTTATTATGTATATTGAGGTCCAAAGCGTGTAAAAGGGCGGAGACATGTTCACAACTTAGCGGCTCCACTCATGATTTTGGTCCACGACTCTTCAGTCAATTCTTCATACCTGTTCTTGTTCAACCAGTAGATCAACTCTTTGCCGTCATCGCCCTTTGGTAACTTTTGATTCTTGAACTGATTTTTTGGCACCTTGTGATTGTGAGATGCTTGTATGTATTG(SEQ ID NO：67)
从质粒pUG6扩增了TEF启动子和终止剂序列(Güldener等人,1996,Nucleic Acidsres.,24:2519-2524)。
实施例III
使用纤维二糖作为共基质通过重组梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖生产木糖 醇
本实施例表明当用木糖和纤维二糖培养时，具有木糖醇途径的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种提高了从木糖生产木糖醇的产量。
木糖醇脱氢酶失活菌株不可以在以木糖作为唯一碳源的培养基中生长(数据未显示)。因此，筛选了几种不同的共基质，并且发现纤维二糖作为共基质表现良好(数据未显示)。
将野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种、xyl2缺失菌株和xyl2缺失加XYL1过表达菌株在YPD，在30℃预生长，直至OD600＝～10。收集细胞(120OD)并在15ml试管中在6ml木糖加纤维二糖培养基溶液中再接种，并在30℃，以150rpm/min的速度在振荡器上培育。所述培养基分别含有4％、6％、8％和10％(w/v)的木糖加一半量的纤维二糖。每次采集600μL样品用于分析，并通过离心除去酵母细胞。使用2μm注射器过滤器过滤上清液，并通过HPLC分析4μl以定量木糖、纤维二糖和木糖醇。
全部三种菌株消耗了一些木糖，但是xyl2缺失菌株(xyl2Δ/xyl2Δ)消耗的木糖的量最少，并且XYL1的过表达与xyl2缺失一起(xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)使得H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在8％木糖和4％纤维二糖中最有效地消耗木糖(图6A)。
对于野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种，随着时间的进行，木糖醇浓度增加，然后降低，这证实了它是通过木糖还原酶将木糖转化为木糖醇，并且同时通过木糖醇脱氢酶将木糖醇脱氢为木酮糖(图6B)。H0梅奇酵母(Metschnikowia)种野生型酵母所产生的木糖醇的最大量为4％木糖中、3天内的1.45％，6％木糖中、4天内的2.76％，8％木糖中、5天内的4.23％和10％木糖中、6天内的5.63％(图6A和6B)。在8天内，xyl2缺失菌株所产生的木糖醇的最大量为4％木糖中的4％，6％木糖中的4.4％，8％木糖中的2.35％和10％木糖中的1.25％，而在8天内，通过XYL1过表达且xyl2缺失的菌株所产生的木糖醇的最大量为4％木糖中的4％，6％木糖中的6％，8％木糖中的8％和10％木糖中的5.1％。
不受理论束缚，过高的木糖浓度似乎会抑制从木糖生产木糖醇的产量。例如，在4％木糖培养基中，xyl2缺失菌株将全部木糖转化为木糖醇，但是在6％木糖中仅将4.4％的木糖，在8％木糖中仅将2.35％的木糖，在10％木糖中仅将1.25％的木糖转化为木糖醇(图6A和6B)。另外，在6天内，XYL1的过表达与xyl2缺失一起从80g/L木糖产生了79.5g/L木糖醇，因此转化率为0.99g木糖醇/g木糖，并且体积产率为0.55g/L/h(图6B)。然而，在10％木糖培养基中，在6天内，相同菌株仅将一半的量的木糖转化为木糖醇(5.1％)。因此，XYL1的过表达与xyl2缺失一起使得H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在使用纤维二糖作为共基质的高达8％的木糖中，在木糖醇的生产中表现良好(图6B)。
在野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中，纤维二糖代谢受到抑制，但是通过其它重组H0梅奇酵母(Metschnikowia)菌株利用纤维二糖代谢以支持木糖还原酶的活性(图6C)。培养基中残留的纤维二糖表示所加入的纤维二糖过多。
纤维二糖与木糖的比从1:2降低至1:3和1:4，并且发现1:3(8％的木糖中有2.4％的纤维二糖)表现更好。在50ml培养中，在8％木糖加2.4％纤维二糖中重复这些实验。在5天内，具有XYL1过表达与xyl2缺失一起的H0梅奇酵母(Metschnikowia)菌株从80g/L的木糖产生了77.7g/L的木糖醇，其中木糖醇得率为0.97g/g木糖，并且产率为0.65g/L/h(图7)。
因此，使用纤维二糖作为共基质，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种中xyl2基因的缺失和XYL1基因的过表达将木糖醇的生产提高至0.97-0.99g/g木糖的得率和0.55-0.65g/L/h的产率。使用具有XYL2基因缺失和XYL1基因过表达的重组H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的一个其它优势是生产培养基仅由木糖、纤维二糖和水组成，其使得易于纯化并且生产经济合算。
实施例IV
使用半乳糖作为共基质通过重组梅奇酵母(Metschnikowia)种从木糖生产木糖醇
本实施例表明使用半乳糖作为共基质显著提高了具有木糖醇途径的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种中木糖醇的产量。
将野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种、xyl2缺失菌株和xyl2缺失加XYL1过表达菌株在YPD，在30℃预生长，直至OD600＝～10。收集细胞(120OD)并在15ml试管中在6ml培养基中再接种，并在30℃，以150rpm/min的速度在振荡器上生长。所述培养基分别含有10％、12％、14％、16％、18％和20％(w/v)的木糖加1/5的量的半乳糖。每天采集600μL样品，并通过离心除去细胞。通过2μm注射器过滤器过滤上清液，并将4μl上样至HPLC以定量木糖、纤维二糖和木糖醇。
通过使用半乳糖作为共基质，在10天内，所产生的木糖醇的最大量来自通过xyl2缺失加XYL1过表达菌株的12％木糖培养基(图8，H0＝野生型；H091＝xyl2Δ/xyl2Δ；H4316＝xyl2Δ::XYL1↑/xyl2Δ::XYL1↑)。所述xyl2缺失加XYL1过表达菌株(H4316)产生了超过200g/L的木糖醇，其得率为0.98g/g并且产率为0.53g/L/h。
使用12％木糖加4％半乳糖的其它实验显示xyl2缺失菌株(H091)在第6天产生了7.6％的木糖醇，而xyl2缺失加XYL1过表达菌株(H4316)在第6天从120g木糖产生了113g木糖醇(图9)，其超过了先前报道的使用纤维二糖作为共基质通过酿酒酵母(S.cerevisiae)工程菌株的93g/L的木糖醇产量(Oh等人,2013,Metab.Eng.,15:226-234)。
通过在补料-分批法中使用改良的培养基进一步提高了从木糖生产木糖醇的产量。将野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种、xyl2缺失菌株和xyl2缺失加XYL1过表达菌株在YPD中，在30℃预培养过夜，收集细胞(30OD)并在15ml试管中在4ml H2O中混悬。添加2ml培养基(24％木糖，8％半乳糖，0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，0.05％KH2PO4，0.05％MgSO4，0.05％(NH4)2SO4和1％葡萄糖)，并将试管在30℃，在速度为150rpm的转筒上培育。采集500μl样品用于HPLC分析。从第2天开始至第10天，每天在采样后添加500μl生产培养基。根据上述结果，将8％的木糖用作培养基中的初始浓度，并且从第2天至第10天每天添加0.5ml培养基(补料-批料)以保持木糖水平大于3％且小于8％。
以上实验显示通过添加少量葡萄糖及其它营养物，野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和两种重组H0梅奇酵母(Metschnikowia)菌株可以持续消耗木糖和产生木糖醇(图10A-10C)。野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在16天内产生了8.1％的木糖醇，而xyl2缺失突变体(H091)在16天内产生了20.3％的木糖醇，其得率为0.98g/g，产率为0.53g/L/h。XYL1的过表达加xyl2缺失(H4316)显示出与xyl2缺失突变体类似的木糖醇产量。在17天之后，通过xyl2缺失菌株在培养基中保留了约0.8％的木糖和1.3％的半乳糖，表明半乳糖可以进一步降低。
通过固体木糖的再补料，从木糖生产木糖醇的产量进一步提高。将野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和xyl2缺失菌株在YPD中，在30℃预培养过夜，收集细胞(30OD)并在125ml烧瓶中在20ml水中混悬。添加10ml培养基(24％木糖，8％半乳糖，0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，0.05％KH2PO4，0.05％MgSO4，0.05％(NH4)2SO4和1％葡萄糖)，并将烧瓶在以120rpm振荡的30℃培育箱中培育。采集600μl样品用于HPLC分析以监测培养基中的木糖含量。将与以上培养基具有相同比例的木糖粉末及其它营养物向烧瓶中添加5次以将木糖浓度维持在2％至10％之间。
以上实验显示通过向培养基中添加固体木糖，野生型H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和xyl2缺失菌株可以持续消耗木糖并且在20天内分别产生了超过17％(w/v)和27％(w/v)的木糖醇(图11)。
基于上述内容，使用半乳糖作为共基质并且添加包括额外的木糖在内的营养物，通过使用XYL2缺失的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种获得了超过27％的木糖醇，其产率为0.56g/L/h。
半乳糖是海洋生物质，特别是红藻中最丰富的糖之一。因此，海洋生物质是用于木糖醇生产的有吸引力的可再生资源。照此，使用本实施例中所述的方法，可以通过具有将木糖为木糖醇的木糖醇途径的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种使用海洋生物质来产生木糖醇。
实施例V
通过过表达木糖转运蛋白来提高从木糖生产木糖醇的产量
本实施例表明提高木糖向具有木糖醇途径的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种的转运可以加快木糖醇的生产。
通过在H0梅奇酵母(Metschnikowia)种野生型菌株中用GXF1-XYl1过表达盒(XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)或者GXF2-XYL1过表达盒(XYL2p-MeHPH-TEF1t-TPIp-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1-XYL2t)替代一个拷贝XYL2来构建菌株。XYL2的另一个拷贝保持为野生型或者用ADH1p-MeNAT-PGK1t盒替代。
将H0梅奇酵母(Metschnikowia)种野生型菌株、xyl2缺失菌株和转运蛋白-木糖还原酶过表达且xyl2缺失的菌株在YPD培养基中预生长。收集酵母细胞并在6ml添加4％半乳糖，或者4％纤维二糖，或者4％甘油作为共基质的YP木糖(8％)培养基中再悬浮。采集600μl样品用于HPLC分析以测量木糖的消耗和木糖醇的产生。
以上实验显示当在具有木糖和共基质半乳糖(图12A)或纤维二糖(图12B)或甘油(图12C)的培养基中培养时，与xyl2缺失菌株相比，通过xyl2缺失加XYL1过表达菌株中GXF1木糖转运蛋白的过表达导致木糖醇的生产加快了约5％至10％，尽管共基质纤维二糖的使用未改善工程化菌株中木糖醇的生产(图12A-12C，H0＝野生型；H091＝xyl2缺失菌株；H016＝XYL2的一个拷贝被GXF1替代且XYL1过表达的菌株；H016-21＝xyl2缺失加GXF1和XYL1过表达的菌株)。此外，当在具有木糖和作为共基质的半乳糖的培养基中培养时，xyl2缺失加XYL1过表达菌株中GXF2木糖转运蛋白的过表达也导致木糖醇的生产加快了约5％至10％(图13，H0＝野生型；H091＝xyl2缺失菌株；H2-2＝XYL2的一个拷贝被GXF2替代且XYL1过表达的菌株；2c1D3＝xyl2缺失加GXF2和XYL1过表达的菌株)。
基于上述内容，木糖转运蛋白的过表达可以改善通过具有木糖醇途径的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种产生木糖醇的速度。
实施例VI
3L生物反应器中的补料-分批发酵
本实施例表明使用补料-分批发酵法，从木糖生产木糖醇的产量可以提高至至少30％的木糖醇。
使用重组梅奇酵母(Metschnikowia)种H016-21株(xyl2缺失菌株中的1个TPI1p-GXF1-DIT1t-UBI4p-XYL1拷贝)，在3L生物反应器(Applikon Biotechnology)中进行2L补料-分批发酵。进行了两个独立实验。
第一补料-分批发酵程序为：将酵母细胞在50ml YPD中，在30℃生长过夜，并转移至500ml YPD中。然后，将167ml培养物与50ml 40％的木糖以及33ml 20％的半乳糖混合并转移至3L反应器中的750ml YPD中，其最终接种物的OD600＝2.0。用空气或氧气对反应器中的培养基鼓泡。最小搅拌速率为300rpm，并对其进行自动调节以将溶氧(DO)水平维持在50％饱和。将pH保持在5.5-6.0。补料含有36％木糖，12％半乳糖，1.5％葡萄糖，1.5％蛋白胨，0.75％酵母提取物，0.075％KH2PO4，0.075％MgSO4.7H2O，0.075％(NH4)2SO4。调节补料速度以将木糖水平维持在6％以下。在7天内，添加1L培养基储液，并且继续发酵另外3天以消耗掉培养基中剩余的木糖。发酵总计持续10天，并且在2L体积中产生了20％的木糖醇(图14A)，这比先前最好的结果短了3天。
在第二补料-分批发酵中，修改所述方法以改善产率：将细胞在10ml YPD中，在30℃生长20小时，并转移至400ml YPD加4％木糖和2％半乳糖。将培养物在30℃生长24小时，并以150rpm振荡。将预培养物泵入含有680ml培养基(YPD+4％木糖+2％半乳糖)的3L生物反应器中，其最终接种物的OD600＝3.0。补料含有36％木糖，12％半乳糖，3％葡萄糖，3％蛋白胨，1.5％酵母提取物，0.075％KH2PO4，0.075％MgSO4.7H2O，0.075％(NH4)2SO4。补料速度为6ml/hr。自动调节通气速率以将DO保持在70％饱和。在7天内，添加1L培养基储液，并且继续发酵直至木糖几乎用完。在第10天，添加更多的固体培养基化合物以将木糖浓度提高至7％。发酵总计持续18天。木糖醇得率在第8天达到20％，这比先前的补料-分批发酵快了2天。通过添加更多的木糖，在第18天产生了30.5％的木糖醇，这是我们所实现的最大量(图14B)。
基于上述内容，补料-分批发酵方法的使用可以改善通过具有木糖醇途径的重组梅奇酵母(Metschnikowia)种产生木糖醇的速率和总体浓度。
实施例VII
H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的特异性生长和代谢产物生产
本实施例表明当与亲缘关系较近的梅奇酵母(Metschnikowia)种(美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima flavia)相比时，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种差异生长并且产生了不同的代谢产物。
分别将H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima flavia)(FL)的三个单菌落接种至5ml酵母浸出粉胨葡萄糖(YEPD)培养基，并在30℃生长过夜。将培养物转入100ml YEPD，并在30℃生长4小时。收集细胞并接种至500ml烧瓶中的200ml培养基中，其OD600＝1.0。使用了四种不同类型的培养基：1)YNBG：具有4％的葡萄糖的酵母氮源培养基，2)YNBX：具有4％的木糖的酵母氮源培养基，3)YNBGX：具有2％葡萄糖和2％木糖的酵母氮源培养基，和4)YPDX：具有2％葡萄糖和2％木糖的YEP。将培养物在30℃生长，并以180rpm振荡。每天采集样品来监测生长(通过OD600测量)和代谢产物含量(通过高效液相色谱法(HPLC)测量)。通过顶空GC-MS测量H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和FL所产生的挥发性化合物。OD600和HPLC数据是三次生物实验重复的平均值。还计算了标准偏差。通过峰高大致比较了GC-MS数据。
在所有测试的培养基中，在H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和FL株之间观察到生长速率的差异。具体地，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种的生长速度比FL快(图15A-15D)。例如，在第3天，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种相对于FL的OD600的比在YNBG中为1.17(图15A)，在YNBX中为1.30(图15B)，在YNBGX中为1.26(图15C)并且在YPDX中为1.19(图15D)。
在第1天，在YNBG、YNBGX和YPDX培养基中检测了甘油和乙醇。在YNBG和YNBGX培养基中两菌株之间的浓度相似(图16A和16B)。然而，在YPDX培养基中，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种产生了比FL多45％的甘油(905mg/L相对于624mg/L；图16A)。
在所有生长培养基中，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和FL两者均产生阿糖醇(图17A-17D)。然而，在YNBG培养基中，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在第1天产生了不同的量的阿糖醇——H0梅奇酵母(Metschnikowia)种产生了比FL多60mg/L的阿糖醇(图17A)。最显著地，在YNBGX培养基中，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在第1天、第2天和第3天产生了显著更高的量的阿糖醇——H0梅奇酵母(Metschnikowia)种产生了比FL多约40mg/L的阿糖醇(图17C)。在YNBX和YPDX培养基中，在两个种之间阿糖醇的水平类似(图17B和17D)。
H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在YNBX培养基中在第3天(1.61g/L)，在YNBGX培养基中在第2天(1.43g/L)并且在YPDX培养基中在第4天(21.5g/L)产生了最大量的木糖醇，而FL在YNBX培养基中在第6天(2.33g/L)，在YNBGX培养基中在第2天(0.73g/L)并且在YPDX培养基中在第4天(21.9g/L)产生了最大量的木糖醇(图18A-18C)。在第3天，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种与FL之间的木糖醇含量之比为YNBX中的4.39，YNBGX中的5.43和YPDX中的0.87。
通过顶空GC-MS测量了分别对于在YNBG中生长1天和在YNBX、YNBGX和YPDX中生长3天后培养基中的挥发性化合物。计算峰高比并在FL和H0梅奇酵母(Metschnikowia)种之间进行比较。该分析显示FL产生了比H0梅奇酵母(Metschnikowia)种更多的挥发性化合物(图19A-19D)。具体地，FL在YNBG培养基中产生了更多的乙醛、乙酸乙酯、乙缩醛、1-(1-乙氧基乙氧基)戊烷和苯乙醇(图19A)；在YNBX培养基中产生了更多的乙酸异戊酯、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇(图19B)；在YNBGX培养基中产生了更多的乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异戊酯、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和苯乙醇(图19C)，和在YPDX培养基中产生了更多的乙醛、异丁醇、乙酸异戊酯、3-甲基-1-丁醇、壬酸乙酯和苯乙醇(图19D)。
基于上述结果，H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima flavia)种之间的生长谱和分泌的代谢产物谱显示了在不同培养基中生长期间生长速率以及一些代谢产物的含量和动态中的差异。
实施例VIII
通过梅奇酵母(Metschnikowia)种的木糖代谢
本实施例表明梅奇酵母(Metschnikowia)种将木糖作为碳源消耗并代谢，并且H0梅奇酵母(Metschnikowia)种和Metschnikowia zizyphicola是使用木糖醇途径从木糖生产木糖醇的特别有用的宿主种。
将几种已知的美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)进化枝种(美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、Metschnikowia andauensis、金佩梅奇酵母(Metschnikowia chrysoperlae)、中国梅奇酵母(Metschnikowia sinensis)、山西梅奇酵母(Metschnikowia shanxiensis)和Metschnikowia zizyphicola)以及本文所述的新的H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在具有2％木糖的YP培养基上生长延长的一段时间，其中通过测定10、13、16、19、34和41小时的OD600来监测细胞培养物的生长。
这些实验显示所有测定的种消耗木糖用于生长(图20)。H0梅奇酵母(Metschnikowia)种在其生长方面不同于大部分美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)进化枝种，其在晚期阶段(41小时)，从初始0.03的OD600达到约25的OD600(图20)。Metschnikowia zizyphicola培养物和H0梅奇酵母(Metschnikowia)种培养物的OD600也是类似的，并且两者均比所测定的其它种要高得多(图20)。
序列表
<110> 创新生物科学公司
<120> 产生木糖醇的梅奇酵母种
<130> 14305-001-228
<140> TBA
<141> On even date herewith
<150> 62/437,606
<151> 2016-12-21
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 362
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Xyl2蛋白
<400> 1
Met Pro Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Val Asn Asp Ile Thr
1 5 10 15
Phe Glu Asn Tyr Glu Val Pro Leu Leu Thr Asp Pro Asn Asp Val Leu
20 25 30
Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Tyr Tyr
35 40 45
Thr His Gly Arg Ile Gly Asp Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu
50 55 60
Gly His Glu Ser Ala Gly Val Val Val Glu Val Gly Lys Gly Val Thr
65 70 75 80
Asp Leu Lys Val Gly Asp Lys Val Ala Ile Glu Pro Gly Val Pro Ser
85 90 95
Arg Thr Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110
Met Cys Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Asn Pro Asp Glu Pro Asn Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Tyr Lys Ser Pro Ala Asp Phe Leu Val
130 135 140
Lys Leu Pro Glu His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Met Val Glu Pro
145 150 155 160
Leu Thr Val Gly Val His Ala Ser Arg Leu Gly Arg Val Thr Phe Gly
165 170 175
Asp His Val Val Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Ile Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Val Ala Arg Lys Phe Gly Ala Ala Ser Val Thr Ile Val Asp Ile
195 200 205
Phe Asp Ser Lys Leu Glu Leu Ala Lys Ser Ile Gly Ala Ala Thr His
210 215 220
Thr Phe Asn Ser Met Thr Glu Gly Val Leu Ser Glu Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Gly Val Arg Pro Asp Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Ile Cys
245 250 255
Val Gln Gln Gly Val Leu Ala Leu Lys Ala Gly Gly Arg His Val Gln
260 265 270
Val Gly Asn Ala Gly Ser Tyr Leu Lys Phe Pro Ile Thr Glu Phe Val
275 280 285
Thr Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asp
290 295 300
Tyr Lys Thr Ser Val Ala Ile Leu Asp Glu Asn Tyr Lys Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Asn Ala Leu Val Asp Phe Glu Ala Leu Ile Thr His Arg Phe Pro
325 330 335
Phe Lys Asn Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Ala Val Arg Ala Gly Asp Gly
340 345 350
Ala Val Lys Cys Ile Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 2
<211> 362
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Xyl2蛋白
<400> 2
Met Pro Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Val Asn Asp Ile Ser
1 5 10 15
Phe Glu Asn Tyr Glu Val Pro Leu Leu Thr Asp Pro Asn Asp Val Leu
20 25 30
Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Tyr Tyr
35 40 45
Thr His Gly Arg Ile Gly Asp Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu
50 55 60
Gly His Glu Ser Ala Gly Val Val Val Glu Val Gly Lys Gly Val Thr
65 70 75 80
Asp Leu Lys Val Gly Asp Lys Val Ala Ile Glu Pro Gly Val Pro Ser
85 90 95
Arg Thr Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110
Met Cys Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Asn Pro Asp Glu Pro Asn Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Tyr Lys Ser Pro Ala Asp Phe Leu Val
130 135 140
Lys Leu Pro Glu His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Met Val Glu Pro
145 150 155 160
Leu Thr Val Gly Val His Ala Ser Arg Leu Gly Arg Val Thr Phe Gly
165 170 175
Asp His Val Val Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Ile Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Val Ala Arg Lys Phe Gly Ala Ala Ser Val Thr Ile Val Asp Ile
195 200 205
Phe Asp Ser Lys Leu Glu Leu Ala Lys Ser Ile Gly Ala Ala Thr His
210 215 220
Thr Phe Asn Ser Met Thr Glu Gly Val Leu Ser Glu Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Gly Val Arg Pro Asp Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Ile Cys
245 250 255
Val Gln Gln Gly Val Leu Ala Leu Lys Ala Gly Gly Arg His Val Gln
260 265 270
Val Gly Asn Ala Gly Ser Tyr Leu Lys Phe Pro Ile Thr Glu Phe Val
275 280 285
Thr Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asp
290 295 300
Tyr Lys Thr Ser Val Ala Ile Leu Asp Glu Asn Tyr Lys Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Asn Ala Leu Val Asp Phe Glu Ala Leu Ile Thr His Arg Phe Pro
325 330 335
Phe Lys Asn Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Ala Val Arg Ala Gly Asp Gly
340 345 350
Ala Val Lys Cys Ile Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 3
<211> 362
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima flavia）的示例性木糖醇脱氢酶（与H0 Xyl2p相同）
<400> 3
Met Pro Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Val Asn Asp Ile Thr
1 5 10 15
Phe Glu Asn Tyr Glu Val Pro Leu Leu Thr Asp Pro Asn Asp Val Leu
20 25 30
Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Tyr Tyr
35 40 45
Thr His Gly Arg Ile Gly Asp Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu
50 55 60
Gly His Glu Ser Ala Gly Val Val Val Glu Val Gly Lys Gly Val Thr
65 70 75 80
Asp Leu Lys Val Gly Asp Lys Val Ala Ile Glu Pro Gly Val Pro Ser
85 90 95
Arg Thr Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110
Met Cys Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Asn Pro Asp Glu Pro Asn Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Tyr Lys Ser Pro Ala Asp Phe Leu Val
130 135 140
Lys Leu Pro Glu His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Met Val Glu Pro
145 150 155 160
Leu Thr Val Gly Val His Ala Ser Arg Leu Gly Arg Val Thr Phe Gly
165 170 175
Asp His Val Val Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Ile Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Val Ala Arg Lys Phe Gly Ala Ala Ser Val Thr Ile Val Asp Ile
195 200 205
Phe Asp Ser Lys Leu Glu Leu Ala Lys Ser Ile Gly Ala Ala Thr His
210 215 220
Thr Phe Asn Ser Met Thr Glu Gly Val Leu Ser Glu Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Gly Val Arg Pro Asp Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Ile Cys
245 250 255
Val Gln Gln Gly Val Leu Ala Leu Lys Ala Gly Gly Arg His Val Gln
260 265 270
Val Gly Asn Ala Gly Ser Tyr Leu Lys Phe Pro Ile Thr Glu Phe Val
275 280 285
Thr Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asp
290 295 300
Tyr Lys Thr Ser Val Ala Ile Leu Asp Glu Asn Tyr Lys Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Asn Ala Leu Val Asp Phe Glu Ala Leu Ile Thr His Arg Phe Pro
325 330 335
Phe Lys Asn Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Ala Val Arg Ala Gly Asp Gly
340 345 350
Ala Val Lys Cys Ile Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 4
<211> 362
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）二尖变体（var.bicuspidata）NRRL YB-4993的示例性木糖醇脱氢酶
<400> 4
Met Thr Thr Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Val Asp Asp Ile Ser
1 5 10 15
Phe Glu Asn Tyr Gln Ile Pro Arg Ile Thr Glu Pro Asn Glu Val Leu
20 25 30
Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Tyr Tyr
35 40 45
Ala His Gly Lys Ile Gly Asp Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu
50 55 60
Gly His Glu Ser Ser Gly Ile Val Val Glu Val Gly Asp Ala Val Ser
65 70 75 80
His Leu Lys Ala Gly Asp Lys Val Ala Ile Glu Pro Gly Val Pro Ser
85 90 95
Arg Phe Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110
Met Lys Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Lys Glu Gly Glu Pro Asn Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Tyr Lys Ser Pro Ala Asp Phe Leu Val
130 135 140
Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Met Val Glu Pro
145 150 155 160
Leu Thr Val Gly Val His Ala Ser Arg Leu Gly Lys Ile Thr Phe Gly
165 170 175
Asp His Val Val Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Ile Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Val Ala Arg Lys Phe Gly Ala Ala Ser Val Thr Val Val Asp Ile
195 200 205
Phe Asp Asn Lys Leu Lys Leu Ala Lys Asp Met Gly Ala Ala Thr His
210 215 220
Val Phe Asn Ser Arg Thr Ser Asp Ser Leu Gly Asp Asn Leu Pro Ala
225 230 235 240
Gly Val Asn Pro Asp Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Val Cys
245 250 255
Ile Gln Gln Gly Val Leu Ala Leu Lys Ala Gly Gly Arg Phe Val Gln
260 265 270
Val Gly Asn Ala Gly Ser Tyr Val Lys Phe Pro Ile Thr Glu Leu Val
275 280 285
Thr Lys Glu Leu Ile Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Tyr Asn Asp
290 295 300
Tyr Lys Thr Ser Val Asp Ile Leu Asp Glu Asn Tyr Lys Asn Gly Lys
305 310 315 320
Asp Asn Ala Met Ile Asp Phe Glu Ala Leu Ile Thr His Arg Phe Ser
325 330 335
Phe Asp Asp Ala Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Val Arg Ser Gly Asp Gly
340 345 350
Ala Ala Lys Cys Ile Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 5
<211> 363
<212> PRT
<213> Pichia stipitis
<220>
<223> 来自树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的示例性木糖醇脱氢酶（在梅奇酵母（Metschnikowia）种中不存在可用的Xyl2p序列)
<400> 5
Met Thr Ala Asn Pro Ser Leu Val Leu Asn Lys Ile Asp Asp Ile Ser
1 5 10 15
Phe Glu Thr Tyr Asp Ala Pro Glu Ile Ser Glu Pro Thr Asp Val Leu
20 25 30
Val Gln Val Lys Lys Thr Gly Ile Cys Gly Ser Asp Ile His Phe Tyr
35 40 45
Ala His Gly Arg Ile Gly Asn Phe Val Leu Thr Lys Pro Met Val Leu
50 55 60
Gly His Glu Ser Ala Gly Thr Val Val Gln Val Gly Lys Gly Val Thr
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Gly Asp Asn Val Ala Ile Glu Pro Gly Ile Pro Ser
85 90 95
Arg Phe Ser Asp Glu Tyr Lys Ser Gly His Tyr Asn Leu Cys Pro His
100 105 110
Met Ala Phe Ala Ala Thr Pro Asn Ser Lys Glu Gly Glu Pro Asn Pro
115 120 125
Pro Gly Thr Leu Cys Lys Tyr Phe Lys Ser Pro Glu Asp Phe Leu Val
130 135 140
Lys Leu Pro Asp His Val Ser Leu Glu Leu Gly Ala Leu Val Glu Pro
145 150 155 160
Leu Ser Val Gly Val His Ala Ser Lys Leu Gly Ser Val Ala Phe Gly
165 170 175
Asp Tyr Val Ala Val Phe Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ala Ala
180 185 190
Ala Val Ala Lys Thr Phe Gly Ala Lys Gly Val Ile Val Val Asp Ile
195 200 205
Phe Asp Asn Lys Leu Lys Met Ala Lys Asp Ile Gly Ala Ala Thr His
210 215 220
Thr Phe Asn Ser Lys Thr Gly Gly Ser Glu Glu Leu Ile Lys Ala Phe
225 230 235 240
Gly Gly Asn Val Pro Asn Val Val Leu Glu Cys Thr Gly Ala Glu Pro
245 250 255
Cys Ile Lys Leu Gly Val Asp Ala Ile Ala Pro Gly Gly Arg Phe Val
260 265 270
Gln Val Gly Asn Ala Ala Gly Pro Val Ser Phe Pro Ile Thr Val Phe
275 280 285
Ala Met Lys Glu Leu Thr Leu Phe Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Phe Asn
290 295 300
Asp Tyr Lys Thr Ala Val Gly Ile Phe Asp Thr Asn Tyr Gln Asn Gly
305 310 315 320
Arg Glu Asn Ala Pro Ile Asp Phe Glu Gln Leu Ile Thr His Arg Tyr
325 330 335
Lys Phe Lys Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Asp Leu Val Arg Ala Gly Lys
340 345 350
Gly Ala Val Lys Cys Leu Ile Asp Gly Pro Glu
355 360
<210> 6
<211> 1089
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的XYL2
<400> 6
atgcctgcta acccatcctt ggttttgaac aaagtgaacg acatcacgtt cgagaactac 60
gaggttccgt tactcacaga ccccaacgat gtattggttc aggtgaaaaa gactggaatc 120
tgtggatctg acatccacta ctacacccac ggcagaattg gcgacttcgt gttgacaaag 180
ccaatggttt tgggccacga atccgccggt gtggtcgtgg aggtcggcaa aggtgtcact 240
gacttgaagg ttggtgataa ggttgccatt gagcccggag tgccttctcg caccagtgac 300
gagtacaaga gtggccacta caacttgtgc ccacacatgt gttttgccgc cacgcccaac 360
tctaaccccg acgagccaaa cccgccaggg actttgtgca aatattacaa gtccccagcg 420
gacttcttgg tgaaattgcc tgagcacgtc tcccttgagt tgggcgctat ggtcgagcct 480
ttgactgtcg gtgtgcacgc ctcgcgtttg ggccgtgtca cttttggtga ccacgttgtg 540
gttttcggtg ctggcccagt cggtatcctt gcggctgccg tggccagaaa gtttggcgct 600
gccagcgtga ctatcgtcga catcttcgac agcaaattgg aattggccaa gtccattggc 660
gcggccactc acacattcaa ctcaatgact gagggtgttc tttcggaggc tttgcccgcg 720
ggcgtgagac ctgacgttgt attggagtgc actggagcag agatctgtgt gcagcaaggt 780
gtacttgcgt tgaaggctgg tggccgccac gtgcaagttg gaaatgccgg ctcctatctc 840
aaattcccca tcaccgaatt tgttaccaag gagttgactc tctttggatc cttccgttac 900
ggttacaacg actacaagac gtcggtcgcc atcttggacg agaattacaa gaacgggaag 960
gagaatgcgt tggtggactt tgaagccttg attactcacc gtttcccctt caagaatgcc 1020
attgaggctt acgacgcggt gcgcgctggc gacggagctg tcaagtgtat cattgacggc 1080
ccagagtaa 1089
<210> 7
<211> 1089
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）277的示例性木糖醇脱氢酶
<400> 7
atgcctgcta acccatcctt ggttttgaac aaagtgaacg acatctcgtt cgagaactac 60
gaggttccgt tactcacaga ccccaacgat gtattggttc aggtgaaaaa gactggaatc 120
tgtggatctg acatccacta ctacacccac ggcagaattg gcgactttgt attgacaaag 180
ccaatggttt tgggccacga gtccgccggt gtggtcgtgg aggtcggcaa aggcgtcact 240
gacttgaagg ttggcgataa ggttgccatt gagcccggag tgccttctcg caccagtgac 300
gagtacaaga gtggtcacta caacttgtgc ccacacatgt gttttgccgc cacgcccaac 360
tctaaccccg acgagccaaa cccgccaggg actttgtgca aatactacaa gtcccccgcg 420
gacttcttgg tgaaattgcc tgagcacgtc tcccttgagt tgggcgctat ggtcgagcct 480
ttgactgtcg gtgtgcacgc ctcgcgtttg ggccgtgtca cttttggtga ccacgttgtg 540
gttttcggtg ctggcccagt cggtattctt gcggctgccg tggccagaaa gtttggcgct 600
gccagtgtga ctatcgtcga catcttcgac agcaaattgg aattggccaa gtccattggc 660
gcggccactc acacattcaa ctcaatgact gagggtgttc tttctgaggc tttgcccgcg 720
ggcgtgagac ctgacgttgt attggagtgc actggagcag agatctgtgt gcagcaaggt 780
gtacttgcgt tgaaggctgg tggccgccac gtgcaagttg gaaatgccgg ctcctatctc 840
aaattcccca tcaccgagtt cgtcaccaag gagttgactc tctttgggtc cttccgttac 900
ggctacaacg actacaagac gtcggtcgcc atcttggacg agaattacaa gaacgggaaa 960
gagaatgcgt tggtggactt tgaagccttg attactcacc gtttcccctt caagaatgcc 1020
attgaggctt acgacgcggt gcgcgctggc gacggagctg tcaagtgtat cattgacggc 1080
ccagagtaa 1089
<210> 8
<211> 1089
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima flavia）的示例性木糖醇脱氢酶
<400> 8
atgcctgcta acccatcctt ggttttgaac aaagtgaacg acatcacgtt cgagaactac 60
gaggttccgt tactcacaga ccccaacgat gtattggttc aggtgaaaaa gactggaatc 120
tgcggatctg acattcacta ctacacccac ggcagaattg gcgactttgt attgacaaag 180
ccgatggttt tgggccacga atccgccggt gtggtcgtgg aggtcggcaa aggcgtcact 240
gacttgaagg ttggtgataa ggttgccatt gagcctggag tgccttctcg caccagtgac 300
gagtacaaga gtggtcacta caacttgtgc ccacacatgt gttttgccgc cacgcccaac 360
tctaaccccg acgagccaaa cccgccaggg actttgtgca aatactacaa gtcccccgcg 420
gacttcttgg tgaaattgcc tgagcacgtc tcccttgagt tgggcgctat ggtcgagcct 480
ttgactgtcg gtgtgcacgc ctcgcgtttg ggccgtgtca cttttggtga ccacgttgtg 540
gttttcggtg ctggcccagt cggtatcctt gcggctgccg tggccagaaa gtttggcgct 600
gccagtgtga ctatcgtcga catcttcgac agcaaattgg aattggccaa gtccattggc 660
gcggccactc acacattcaa ctcaatgact gagggtgttc tttcggaggc tttgcccgcg 720
ggcgtgagac ctgacgttgt attggagtgc actggagcag agatctgtgt gcagcaaggt 780
gtacttgcgt tgaaggctgg tggccgccac gtgcaagttg gaaatgccgg ctcctatctc 840
aaattcccca tcaccgagtt cgtcaccaag gagttgactc tctttgggtc cttccgttac 900
ggctacaacg actacaagac gtcggtcgcc atcttggacg agaattacaa gaacgggaaa 960
gagaatgcgt tggtggattt tgaagccttg attactcacc gtttcccctt caagaatgcc 1020
attgaggctt acgacgcggt gcgcgctggc gacggagctg tcaagtgtat cattgacggc 1080
ccagagtaa 1089
<210> 9
<211> 1089
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata）二尖变体（var.bicuspidata）NRRL YB-4993的示例性木糖醇脱氢酶
<400> 9
atgactacaa acccatcgtt ggtattgaac aaagtggacg atatttcgtt cgaaaactac 60
cagatcccta gaatcactga gcctaatgaa gtattagtcc aggtaaagaa gacgggaatc 120
tgcggctctg atattcacta ctacgcacat ggaaaaatcg gagacttcgt tttgacaaag 180
ccaatggtct taggccatga atcctcggga attgttgttg aggtgggtga tgctgtatcc 240
catttgaaag ctggggacaa ggttgccatt gagcctggag tgccttctcg ttttagcgat 300
gagtacaaga gcggtcacta taacttatgc ccgcatatga aatttgctgc tacccccaac 360
tcgaaagagg gtgaaccaaa ccctccgggc actttgtgca agtattataa gtcgcccgca 420
gacttcttgg ttaaattgcc tgatcacgtg tcgctcgaat tgggagcaat ggtcgagcca 480
ttgaccgtgg gtgtgcatgc ttctcggttg ggtaagatca cttttggtga tcatgtggtt 540
gtatttggcg ctggtccagt tggaattctt gcagccgctg ttgcaagaaa atttggcgcc 600
gcctccgtca ccgttgttga tatcttcgac aacaaattaa agctagcgaa ggacatgggt 660
gctgccaccc atgtctttaa ctcgaggact tccgactctt tgggggataa tttgcccgca 720
ggtgtgaatc cagatgttgt tttggagtgt accggagctg aagtttgtat ccagcaaggt 780
gttttggctt taaaagcggg tggtcgcttt gtgcaagtgg gcaatgccgg ttcatatgtc 840
aagttcccaa ttactgagct tgtgaccaaa gagttgattc tttttgggtc cttccggtat 900
ggatacaatg actacaagac ctctgtggat atcttggatg aaaattacaa aaacggaaaa 960
gacaatgcaa tgatagactt cgaggctttg attactcacc ggttctcatt cgacgatgcc 1020
atcaaggcat acgacaaagt gcgttctggt gacggcgctg caaaatgtat cattgatggg 1080
ccagaataa 1089
<210> 10
<211> 1092
<212> DNA
<213> 树干毕赤酵母（Pichia stipitis）
<220>
<223> 来自树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的示例性木糖醇脱氢酶（在梅奇酵母（Metschnikowia）种中不存在可用的XYL2基因序列）
<400> 10
atgactgcta acccttcctt ggtgttgaac aagatcgacg acatttcgtt cgaaacttac 60
gatgccccag aaatctctga acctaccgat gtcctcgtcc aggtcaagaa aaccggtatc 120
tgtggttccg acatccactt ctacgcccat ggtagaatcg gtaacttcgt tttgaccaag 180
ccaatggtct tgggtcacga atccgccggt actgttgtcc aggttggtaa gggtgtcacc 240
tctcttaagg ttggtgacaa cgtcgctatc gaaccaggta ttccatccag attctccgac 300
gaatacaaga gcggtcacta caacttgtgt cctcacatgg ccttcgccgc tactcctaac 360
tccaaggaag gcgaaccaaa cccaccaggt accttatgta agtacttcaa gtcgccagaa 420
gacttcttgg tcaagttgcc agaccacgtc agcttggaac tcggtgctct tgttgagcca 480
ttgtctgttg gtgtccacgc ctccaagttg ggttccgttg ctttcggcga ctacgttgcc 540
gtctttggtg ctggtcctgt tggtcttttg gctgctgctg tcgccaagac cttcggtgct 600
aagggtgtca tcgtcgttga cattttcgac aacaagttga agatggccaa ggacattggt 660
gctgctactc acaccttcaa ctccaagacc ggtggttctg aagaattgat caaggctttc 720
ggtggtaacg tgccaaacgt cgttttggaa tgtactggtg ctgaaccttg tatcaagttg 780
ggtgttgacg ccattgcccc aggtggtcgt ttcgttcaag ttggtaacgc tgctggtcca 840
gtcagcttcc caatcaccgt tttcgccatg aaggaattga ctttgttcgg ttctttcaga 900
tacggattca acgactacaa gactgctgtt ggaatctttg acactaacta ccaaaacggt 960
agagaaaatg ctccaattga ctttgaacaa ttgatcaccc acagatacaa gttcaaggac 1020
gctattgaag cctacgactt ggtcagagcc ggtaagggtg ctgtcaagtg tctcattgac 1080
ggccctgagt aa 1092
<210> 11
<211> 318
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的XYL1蛋白
<400> 11
Met Ala Thr Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Gln Val Gly
1 5 10 15
Phe Gly Cys Trp Lys Val Thr Asn Ser Thr Cys Ala Asp Thr Ile Tyr
20 25 30
Asn Ala Ile Lys Val Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr
35 40 45
Gly Asn Glu Lys Glu Val Gly Glu Gly Ile Asn Arg Ala Ile Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Val Ala Arg Asp Glu Leu Phe Val Val Ser Lys Leu Trp Asn
65 70 75 80
Asn Phe His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asp Lys Thr Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Asn Val Glu Tyr Leu Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro
100 105 110
Ile Ala Phe Lys Phe Val Pro Phe Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe
115 120 125
Tyr Cys Gly Glu Gly Asp Lys Phe Ile Tyr Glu Asp Val Pro Leu Leu
130 135 140
Asp Thr Trp Arg Ala Leu Glu Lys Phe Val Lys Lys Gly Lys Ile Arg
145 150 155 160
Ser Ile Gly Ile Ser Asn Phe Ser Gly Ala Leu Ile Gln Asp Leu Leu
165 170 175
Arg Gly Ala Glu Ile Pro Pro Ala Val Leu Gln Ile Glu His His Pro
180 185 190
Tyr Leu Gln Gln Pro Arg Leu Ile Glu Tyr Val Gln Ser Lys Gly Ile
195 200 205
Ala Ile Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu
210 215 220
Asp His Pro Lys Val Lys Glu Cys Val Thr Leu Phe Glu His Glu Asp
225 230 235 240
Ile Val Ser Ile Ala Lys Ala His Asp Lys Ser Ala Gly Gln Val Leu
245 250 255
Leu Arg Trp Ala Thr Gln Arg Gly Leu Ala Val Ile Pro Lys Ser Asn
260 265 270
Lys Thr Glu Arg Leu Leu Leu Asn Leu Asn Val Asn Asp Phe Asp Leu
275 280 285
Ser Glu Ala Glu Leu Glu Gln Ile Ala Lys Leu Asp Val Gly Leu Arg
290 295 300
Phe Asn Asn Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Ile Phe His
305 310 315
<210> 12
<211> 318
<212> PRT
<213> Spathaspora passalidarum
<220>
<223> 来自Spathaspora passalidarum CBS 10155的示例性木糖还原酶；Xyl1.1p
<400> 12
Met Ala Thr Ile Lys Leu Ser Ser Gly His Leu Met Pro Leu Val Gly
1 5 10 15
Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Asn Ala Thr Ala Ala Asp Gln Ile Tyr
20 25 30
Asn Ala Ile Lys Ala Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr
35 40 45
Gly Asn Glu Lys Glu Val Gly Asp Gly Leu Lys Arg Ala Ile Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp Asn
65 70 75 80
Asn Tyr His Asp Pro Lys Asn Val Glu Thr Ala Leu Asn Arg Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Leu Gln Leu Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro
100 105 110
Ile Ala Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe
115 120 125
Tyr Cys Gly Asp Gly Asn Asn Phe His Tyr Glu Asn Val Pro Leu Leu
130 135 140
Asp Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val Gln Ala Gly Lys Ile Lys
145 150 155 160
Ser Ile Gly Ile Ser Asn Phe Pro Gly Ala Leu Ile Tyr Asp Leu Val
165 170 175
Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ala Val Leu Gln Ile Glu His His Pro
180 185 190
Tyr Leu Gln Gln Pro Lys Leu Ile Glu Tyr Val Gln Lys Gln Gly Ile
195 200 205
Ala Ile Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Leu Glu Leu
210 215 220
Asn Gln Asn Arg Ala Leu Asn Thr Pro Thr Leu Phe Glu His Asp Thr
225 230 235 240
Ile Lys Ser Ile Ser Thr Arg Leu Asn Lys Thr Pro Ala Gln Val Leu
245 250 255
Leu Arg Trp Ala Thr Gln Arg Asn Ile Ala Val Ile Pro Lys Ser Asn
260 265 270
Asn Pro Ala Arg Leu Ala Gln Asn Leu Asp Val Thr Ser Phe Asp Leu
275 280 285
Thr Glu Glu Asp Phe Asn Ala Ile Ser Ala Leu Asp Ile Asn Leu Arg
290 295 300
Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Asn Ile Pro Ile Phe Val
305 310 315
<210> 13
<211> 317
<212> PRT
<213> Spathaspora passalidarum
<220>
<223> 来自Spathaspora passalidarum UFMGCMY469的示例性木糖还原酶；Xyl1.2p
<400> 13
Met Ser Phe Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Glu Met Pro Lys Ile Gly Phe
1 5 10 15
Gly Thr Trp Lys Met Asp Lys Ala Thr Ile Pro Gln Gln Ile Tyr Asp
20 25 30
Ala Ile Lys Gly Gly Ile Arg Ser Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr Gly
35 40 45
Asn Glu Lys Glu Val Gly Leu Gly Tyr Lys Lys Ala Ile Glu Asp Gly
50 55 60
Leu Val Lys Arg Gly Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp Asn Asn
65 70 75 80
Phe His Asp Pro Lys Asn Val Glu Lys Ala Leu Asp Arg Thr Leu Ala
85 90 95
Asp Leu Gln Leu Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro Ile
100 105 110
Ala Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Arg Tyr Pro Pro Cys Phe Tyr
115 120 125
Cys Gly Asp Gly Asp Asn Phe His Tyr Glu Asp Val Pro Leu Leu Glu
130 135 140
Thr Trp Lys Ala Leu Glu Ala Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Arg Ser
145 150 155 160
Leu Gly Val Ser Asn Phe Thr Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu Arg
165 170 175
Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ala Val Leu Gln Val Glu His His Pro Tyr
180 185 190
Leu Gln Gln Pro Arg Leu Ile Glu Phe Ala Gln Lys Gln Gly Ile Val
195 200 205
Val Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Thr Glu Leu Asn
210 215 220
Gln Asn Arg Ala Asn Asn Thr Pro Arg Leu Phe Asp His Glu Val Ile
225 230 235 240
Lys Lys Ile Ala Ala Arg Arg Gly Arg Thr Pro Ala Gln Val Ile Leu
245 250 255
Arg Trp Ala Thr Gln Arg Asn Val Val Ile Ile Pro Lys Ser Asp Thr
260 265 270
Pro Glu Arg Leu Val Glu Asn Leu Ala Val Phe Asp Phe Asp Leu Thr
275 280 285
Glu Glu Asp Phe Lys Glu Ile Ala Ala Leu Asp Ala Asn Leu Arg Phe
290 295 300
Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp His Ile Pro Ile Phe Val
305 310 315
<210> 14
<211> 318
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidate）二尖变体（var.bicuspidate）NRRL YB-4993的示例性木糖还原酶
<400> 14
Met Ser Thr Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Glu Met Pro Gln Val Gly
1 5 10 15
Phe Gly Cys Trp Lys Val Thr Asn Asp Thr Cys Ala Asp Thr Ile Tyr
20 25 30
Asn Ala Ile Lys Val Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Gln Asp Tyr
35 40 45
Gly Asn Glu Lys Glu Val Gly Gln Gly Leu Asn Arg Ala Ile Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Val Ala Arg Asp Glu Leu Phe Val Val Ser Lys Leu Trp Asn
65 70 75 80
Asn Phe His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asp Lys Thr Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Asn Val Glu Tyr Leu Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro
100 105 110
Ile Ala Phe Lys Phe Val Pro Phe Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe
115 120 125
Tyr Cys Gly Asp Gly Asp Lys Phe His Tyr Glu Asp Val Pro Leu Leu
130 135 140
Asp Thr Trp Arg Ala Leu Glu Lys Met Val Lys Lys Gly Lys Ile Arg
145 150 155 160
Ser Ile Gly Ile Ser Asn Phe Ser Gly Ala Leu Ile Gln Asp Leu Leu
165 170 175
Arg Gly Ala Glu Ile Ala Pro Ala Val Leu Gln Ile Glu His His Pro
180 185 190
Tyr Leu Gln Gln Pro Arg Leu Val Glu Tyr Val Lys Ser Lys Gly Ile
195 200 205
Ala Ile Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Ile Glu Leu
210 215 220
Asp His Pro Lys Val Lys Glu Cys Val Thr Leu Phe Asp His Asp Thr
225 230 235 240
Ile Leu Ser Val Ala Arg Ala His Asn Lys Ser Ala Gly Gln Val Leu
245 250 255
Leu Arg Trp Ala Thr Gln Arg Gly Leu Ala Val Ile Pro Lys Ser Asn
260 265 270
Lys Thr Glu Arg Leu Val Gln Asn Leu Glu Val Asn Asp Phe Asp Leu
275 280 285
Ser Asp Ala Glu Leu Lys Ser Ile Ser Lys Leu Asp Val Gly Leu Arg
290 295 300
Phe Asn Asn Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Ile Phe His
305 310 315
<210> 15
<211> 318
<212> PRT
<213> 葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）
<220>
<223> 来自葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）ATCC 42720的示例性木糖还原酶
<400> 15
Met Ala Thr Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Glu Met Pro Gln Val Gly
1 5 10 15
Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Asn Lys Thr Cys Ala Asp Gln Ile Tyr
20 25 30
Asn Ala Ile Lys Val Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr
35 40 45
Gly Asn Glu Lys Glu Val Gly Glu Gly Ile Asn Arg Ala Ile Ala Asp
50 55 60
Gly Leu Val Ala Arg Asp Glu Leu Phe Val Val Ser Lys Leu Trp Asn
65 70 75 80
Asn Phe His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asp Lys Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Leu Asn Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro
100 105 110
Ile Ala Phe Lys Phe Val Pro Phe Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe
115 120 125
Tyr Cys Gly Asp Thr Asn Lys Phe Ile Tyr Glu Asp Val Pro Ile Ile
130 135 140
Asp Thr Trp Arg Ala Leu Glu Lys Leu Val Glu Lys Gly Lys Ile Arg
145 150 155 160
Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Asn Gly Ser Leu Leu Leu Asp Leu Leu
165 170 175
Arg Ala Ala Lys Ile Lys Pro Ala Val Leu Gln Ile Glu His His Pro
180 185 190
Tyr Leu Gln Gln Pro Gln Leu Ile Lys Trp Val Lys Ser Lys Gly Ile
195 200 205
Ala Val Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu
210 215 220
Asn His Pro Lys Val Gly Ser Cys Thr Thr Leu Phe Glu His Glu Asp
225 230 235 240
Ile Val Ser Ile Ala Lys Lys His Gly Lys Ser Pro Gly Gln Val Leu
245 250 255
Leu Arg Trp Ala Thr Gln Asn Gly Leu Ala Val Ile Pro Lys Ser Asn
260 265 270
Lys Thr Glu Arg Leu Val Gln Asn Leu Asn Val Asn Asp Phe Asp Leu
275 280 285
Ser Ala Ser Asp Leu Ser Ala Ile Ala Lys Leu Asp Ile Gly Leu Arg
290 295 300
Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Glu Ile Pro Ile Phe His
305 310 315
<210> 16
<211> 317
<212> PRT
<213> 季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）
<220>
<223> 来自季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）的示例性木糖还原酶
<400> 16
Met Ser Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ser Val Gly Phe
1 5 10 15
Gly Cys Trp Lys Val Asp Asn Ala Thr Cys Ala Asp Thr Ile Tyr Asn
20 25 30
Ala Ile Lys Val Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr Gly
35 40 45
Asn Glu Lys Glu Val Gly Asp Gly Ile Asn Arg Ala Leu Asp Glu Gly
50 55 60
Leu Val Ala Arg Asp Glu Leu Phe Val Val Ser Lys Leu Trp Asn Ser
65 70 75 80
Phe His Asp Pro Lys Asn Val Glu Lys Ala Leu Asp Lys Thr Leu Ser
85 90 95
Asp Leu Lys Val Asp Tyr Leu Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro Ile
100 105 110
Ala Phe Lys Phe Val Pro Phe Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe Tyr
115 120 125
Cys Gly Asp Gly Asp Lys Phe His Tyr Glu Asp Val Pro Leu Ile Asp
130 135 140
Thr Trp Arg Ala Leu Glu Lys Leu Val Glu Lys Gly Lys Ile Arg Ser
145 150 155 160
Ile Gly Ile Ser Asn Phe Ser Gly Ala Leu Ile Gln Asp Leu Leu Arg
165 170 175
Ser Ala Lys Ile Lys Pro Ala Val Leu Gln Ile Glu His His Pro Tyr
180 185 190
Leu Gln Gln Pro Arg Leu Val Glu Tyr Val Gln Ser Gln Gly Ile Ala
195 200 205
Ile Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu Asp
210 215 220
His Pro Arg Val Lys Asp Val Lys Pro Leu Phe Glu His Asp Val Ile
225 230 235 240
Lys Ser Val Ala Gly Lys Val Lys Lys Thr Pro Ala Gln Val Leu Leu
245 250 255
Arg Trp Ala Thr Gln Arg Gly Leu Ala Val Ile Pro Lys Ser Asn Asn
260 265 270
Pro Asp Arg Leu Leu Ser Asn Leu Lys Val Asn Asp Phe Asp Leu Ser
275 280 285
Gln Glu Asp Phe Gln Glu Ile Ser Lys Leu Asp Ile Glu Leu Arg Phe
290 295 300
Asn Asn Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Thr Phe Ile
305 310 315
<210> 17
<211> 324
<212> PRT
<213> 热带假丝酵母（Candida tropicalis）
<220>
<223> 来自热带假丝酵母（Candida tropicalis）的示例性木糖还原酶
<400> 17
Met Ser Thr Thr Val Asn Thr Pro Thr Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Met Pro Leu Val Gly Phe Gly Cys Trp Lys Val Thr Asn Ala Thr
20 25 30
Ala Ala Asp Gln Ile Tyr Asn Ala Ile Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe
35 40 45
Asp Gly Ala Glu Asp Tyr Gly Asn Glu Lys Glu Val Gly Glu Gly Ile
50 55 60
Asn Arg Ala Ile Lys Asp Gly Leu Val Lys Arg Glu Glu Leu Phe Ile
65 70 75 80
Thr Ser Lys Leu Trp Asn Asn Phe His Asp Pro Lys Asn Val Glu Thr
85 90 95
Ala Leu Asn Lys Thr Leu Ser Asp Leu Asn Leu Asp Tyr Val Asp Leu
100 105 110
Phe Leu Ile His Phe Pro Ile Ala Phe Lys Phe Val Pro Ile Glu Glu
115 120 125
Lys Tyr Pro Pro Gly Phe Tyr Cys Gly Asp Gly Asp Asn Phe His Tyr
130 135 140
Glu Asp Val Pro Leu Leu Asp Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val
145 150 155 160
Glu Ala Gly Lys Ile Lys Ser Ile Gly Ile Ser Asn Phe Thr Gly Ala
165 170 175
Leu Ile Tyr Asp Leu Ile Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ile Glu His His Pro Tyr Leu Gln Gln Pro Lys Leu Ile Glu Tyr
195 200 205
Val Gln Lys Ala Gly Ile Ala Ile Thr Gly Tyr Ser Ser Phe Gly Pro
210 215 220
Gln Ser Phe Leu Glu Leu Glu Ser Lys Arg Ala Leu Asn Thr Pro Thr
225 230 235 240
Leu Phe Glu His Glu Thr Ile Lys Ser Ile Ala Asp Lys His Gly Lys
245 250 255
Ser Pro Ala Gln Val Leu Leu Arg Trp Ala Thr Gln Arg Asn Ile Ala
260 265 270
Val Ile Pro Lys Ser Asn Asn Pro Glu Arg Leu Ala Gln Asn Leu Ser
275 280 285
Val Val Asp Phe Asp Leu Thr Lys Asp Asp Leu Asp Asn Ile Ala Lys
290 295 300
Leu Asp Ile Gly Leu Arg Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Asn Ile
305 310 315 320
Pro Ile Phe Val
<210> 18
<211> 318
<212> PRT
<213> 木糖发酵酵母（Scheffersomyces stipitis）
<220>
<223> 来自木糖发酵酵母（Scheffersomyces stipitis）CBS 6054的示例性木糖还原酶
<400> 18
Met Pro Ser Ile Lys Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Met Pro Ala Val Gly
1 5 10 15
Phe Gly Cys Trp Lys Val Asp Val Asp Thr Cys Ser Glu Gln Ile Tyr
20 25 30
Arg Ala Ile Lys Thr Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Glu Asp Tyr
35 40 45
Ala Asn Glu Lys Leu Val Gly Ala Gly Val Lys Lys Ala Ile Asp Glu
50 55 60
Gly Ile Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Leu Thr Ser Lys Leu Trp Asn
65 70 75 80
Asn Tyr His His Pro Asp Asn Val Glu Lys Ala Leu Asn Arg Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Leu Gln Val Asp Tyr Val Asp Leu Phe Leu Ile His Phe Pro
100 105 110
Val Thr Phe Lys Phe Val Pro Leu Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly Phe
115 120 125
Tyr Cys Gly Lys Gly Asp Asn Phe Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ile Leu
130 135 140
Glu Thr Trp Lys Ala Leu Glu Lys Leu Val Lys Ala Gly Lys Ile Arg
145 150 155 160
Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Pro Gly Ala Leu Leu Leu Asp Leu Leu
165 170 175
Arg Gly Ala Thr Ile Lys Pro Ser Val Leu Gln Val Glu His His Pro
180 185 190
Tyr Leu Gln Gln Pro Arg Leu Ile Glu Phe Ala Gln Ser Arg Gly Ile
195 200 205
Ala Val Thr Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln Ser Phe Val Glu Leu
210 215 220
Asn Gln Gly Arg Ala Leu Asn Thr Ser Pro Leu Phe Glu Asn Glu Thr
225 230 235 240
Ile Lys Ala Ile Ala Ala Lys His Gly Lys Ser Pro Ala Gln Val Leu
245 250 255
Leu Arg Trp Ser Ser Gln Arg Gly Ile Ala Ile Ile Pro Lys Ser Asn
260 265 270
Thr Val Pro Arg Leu Leu Glu Asn Lys Asp Val Asn Ser Phe Asp Leu
275 280 285
Asp Glu Gln Asp Phe Ala Asp Ile Ala Lys Leu Asp Ile Asn Leu Arg
290 295 300
Phe Asn Asp Pro Trp Asp Trp Asp Lys Ile Pro Ile Phe Val
305 310 315
<210> 19
<211> 957
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的XYL1基因
<400> 19
atggctacta tcaaattgaa ctctggatac gacatgcccc aagtgggttt tgggtgctgg 60
aaagtaacta acagtacatg tgctgatacg atctacaacg cgatcaaagt tggctacaga 120
ttatttgatg gcgctgaaga ttacgggaac gagaaagagg tgggcgaagg aatcaacagg 180
gccattgacg aaggcttggt ggcacgtgac gagttgttcg tggtgtccaa gctctggaac 240
aacttccatc atccagacaa cgtcgagaag gcgttggaca agactttggg cgacttgaat 300
gtcgagtact tggacttgtt cttgatccat ttcccaattg cgttcaaatt cgtgcccttt 360
gaggagaaat acccgcccgg cttctactgt ggagaaggcg ataagtttat ctacgaggat 420
gtgcctttgc ttgacacgtg gcgggcattg gagaagtttg tgaagaaggg taagatcaga 480
tccatcggaa tctcgaactt ttccggcgcg ttgatccagg acttgctcag gggcgccgag 540
atcccccctg ccgtgttgca gattgagcac cacccatact tgcagcagcc cagattgatt 600
gagtatgtgc agtccaaggg tattgccatc acagcctact cctcttttgg cccacagtcg 660
tttgtggagt tggaccaccc caaggtcaag gagtgtgtca cgcttttcga gcacgaagac 720
attgtttcca tcgctaaagc tcacgacaag tccgcgggcc aggtattatt gaggtgggcc 780
acgcaaaggg gtcttgccgt gattccaaag tcaaacaaaa ccgagcgttt gttgctgaat 840
ttgaatgtga acgattttga tctctctgaa gcagaattgg agcaaatcgc aaagttggac 900
gtgggcttgc gcttcaacaa cccttgggac tgggacaaga ttccaatctt ccattaa 957
<210> 20
<211> 957
<212> DNA
<213> Spathaspora passalidarum
<220>
<223> 来自Spathaspora passalidarum CBS 10155的示例性木糖还原酶; XYL1.1
<400> 20
atggctacta ttaaattatc ctcaggtcac ttgatgcctt tagttggttt cggttgttgg 60
aaggtcgaca acgctaccgc tgctgaccaa atctacaacg ctatcaaggc tggttacaga 120
ttattcgacg gtgctgaaga ttacggtaac gaaaaggaag tcggtgacgg tttaaagaga 180
gccattgatg aaggtctcgt caagagagaa gaattattca tcacctctaa gttatggaac 240
aactaccacg acccaaagaa cgttgaaact gctttaaaca gaaccttatc cgatttacaa 300
ttggactacg ttgatttatt cttgatccac ttcccaattg ctttcaagtt cgttccatta 360
gaagaaaaat acccaccagg tttctactgt ggtgacggta acaacttcca ctatgaaaat 420
gttccattat tggacacttg gaaggccttg gaaaagttag ttcaagctgg taagatcaag 480
tctatcggta tctctaactt ccctggtgct ttaatctacg acttggtcag aggtgctacc 540
atcaagccag ctgttttaca aattgaacac cacccatact tacaacaacc aaagttgatt 600
gaatacgtcc aaaagcaagg tattgctatt accgcttact cttctttcgg tcctcaatct 660
ttcttggaat tgaaccaaaa cagagcttta aacaccccaa ccttgtttga acacgacacc 720
atcaagtcta tctctaccag attaaacaag accccagctc aagtcttatt aagatgggcc 780
acccaaagaa acattgctgt tattccaaag tctaacaacc cagctagatt agctcaaaac 840
ttggacgtca cctctttcga cttgaccgaa gaagacttca acgctatctc tgctttggac 900
atcaacttga gattcaacga cccatgggac tgggacaaca ttccaatctt cgtttaa 957
<210> 21
<211> 954
<212> DNA
<213> Spathaspora passalidarum
<220>
<223> 来自Spathaspora passalidarum UFMGCMY469的示例性木糖还原酶; XYL1.2
<400> 21
atgtctttta aattatcttc aggttatgaa atgccaaaaa tcggttttgg tacttggaag 60
atggacaagg ccaccattcc tcagcaaatt tacgatgcta tcaagggtgg tatcagatca 120
ttcgatggtg ctgaagatta tggtaacgaa aaggaagttg gtcttggtta caagaaggct 180
attgaagacg gtcttgttaa gagaggagat ctttttatta cctccaagtt atggaataac 240
ttccatgacc caaagaatgt ggaaaaggct ttagacagaa ctttagctga tttgcaattg 300
gattacgtcg acttattttt aattcatttc ccaattgctt tcaagtttgt tccattggaa 360
gaaagatacc caccttgctt ctactgtggt gatggtgaca acttccatta tgaagatgtc 420
ccattattgg aaacctggaa ggctttagaa gccttggtta agaagggtaa gattagatca 480
cttggtgttt ctaacttcac tggtgctttg ttgttagatt tacttagagg tgctaccatt 540
aagccagctg ttttgcaagt cgaacatcat ccatacttgc aacaaccaag attaattgaa 600
tttgctcaaa agcaaggtat tgttgtcact gcttactctt catttggtcc tcaatctttc 660
actgaattga accaaaacag agctaacaac actccaagat tgtttgacca cgaagtcata 720
aagaagattg ctgctagaag gggcagaact ccagctcaag ttatcttaag atgggccacc 780
caaagaaatg tcgtgattat tccaaaatcc gatactccag aaagattggt cgaaaacttg 840
gctgtctttg actttgactt aactgaagaa gatttcaaag aaattgctgc cttggatgct 900
aatttgagat ttaatgaccc atgggactgg gaccatattc caatctttgt ttaa 954
<210> 22
<211> 957
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidate）二尖变体（var.bicuspidate）NRRL YB-4993的示例性木糖还原酶
<400> 22
atgagcacta tcaaattgaa ctcgggctac gaaatgcccc aagtgggctt tggctgctgg 60
aaggtgacaa acgacacttg cgcggatact atctacaatg ccatcaaagt ggggtacaga 120
ttgttcgatg gtgcccaaga ctacggaaat gaaaaagaag ttggccaggg actcaacaga 180
gcgatcgatg aaggattggt ggcacgtgat gagttatttg tggtatccaa gctttggaac 240
aatttccatc acccagacaa tgttgaaaag gccctagaca agacattggg tgacttgaac 300
gtcgaatact tggacttatt tctcatccac tttcccattg ctttcaaatt tgttcccttt 360
gaggaaaagt acccacctgg gttctactgc ggtgacggcg acaaattcca ttacgaggac 420
gtgcctttgc tcgacacgtg gcgggctttg gagaaaatgg tcaagaaagg taaaatcaga 480
tccattggta tttcgaactt ttctggagct ttgatccaag acttgcttag gggcgctgaa 540
attgctcccg ctgttctaca aattgaacac cacccatact tgcaacagcc ccggttggtt 600
gagtatgtga aatcaaaggg cattgctatt actgcctact cgtcttttgg cccacagtct 660
tttatcgagt tagatcaccc taaagtaaag gaatgcgtca ctttgtttga ccatgacaca 720
attttgtccg ttgccagagc acacaataag tctgccggcc aagttttgtt gagatgggcc 780
actcaaagag gtcttgcagt tattcccaaa tctaacaaga cagaacgctt ggtgcaaaac 840
ttggaggtaa acgactttga cctttctgac gctgagttga agtccatctc caagctagat 900
gtggggttgc gtttcaacaa cccttgggac tgggacaaga ttcctatctt ccactga 957
<210> 23
<211> 957
<212> DNA
<213> 葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）
<220>
<223> 来自葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）ATCC 42720的示例性木糖还原酶
<400> 23
atggccacta ttaagttgaa ctcaggatac gagatgcctc aggttggttt cggctgctgg 60
aaagtcgaca acaaaacctg tgctgaccaa atctacaatg ccatcaaagt cggttacaga 120
ttgtttgacg gcgctgaaga ttatggtaac gaaaaagaag ttggcgaagg tatcaacaga 180
gccattgctg atggcttggt tgctcgtgac gagttattcg ttgtctcgaa gctctggaac 240
aacttccatc accctgacaa tgtggaaaaa gctttggaca agacattgag cgacttgaac 300
ctcgagtacc ttgacttgtt tttgatccat ttcccaattg ctttcaagtt tgttcctttc 360
gaagaaaagt accctccagg attctactgt ggagacacca acaagttcat ttacgaagac 420
gttccaatca ttgacacttg gagagctttg gaaaagttgg tggaaaaggg aaagattaga 480
tccattggtg tttccaactt caatggctcc ttgcttctcg acttgcttag agctgctaag 540
atcaagcctg ctgttttgca aatcgagcac cacccatact tgcaacaacc acagttgatc 600
aaatgggtca agagcaaagg aattgctgtg actgcgtact cttcgtttgg tcctcaatca 660
ttcgttgagt tgaaccaccc taaggtcggt agctgcacca cattgttcga acacgaagac 720
attgtctcca tcgccaaaaa gcatggaaag agccctggcc aagtcttgtt gagatgggct 780
actcagaacg gtcttgctgt tattccaaag tccaacaaaa ccgaacgttt ggttcagaac 840
ttgaatgtca acgattttga cctttctgct ctggacttga gtgccattgc taaattggac 900
attggcttgc gtttcaatga tccatgggac tgggatgaaa tcccaatctt ccactag 957
<210> 24
<211> 954
<212> DNA
<213> 季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）
<220>
<223> 来自季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）的示例性木糖还原酶
<400> 24
atgtctatca agttaaactc tggatatgac atgccctcgg tgggttttgg ctgctggaag 60
gtcgacaatg ccacctgtgc cgacaccatc tacaatgcca tcaaggtggg atacagatta 120
tttgacggag ccgaggatta cggtaacgaa aaggaagtgg gagatggtat taatagagca 180
ctcgatgagg gcttggttgc cagagatgag cttttcgttg tttccaagct ctggaactcg 240
ttccatgacc ccaaaaacgt ggaaaaggcg ttggacaaaa cattgagcga cttgaaggtg 300
gactaccttg acttgttctt gatccacttt ccaattgctt tcaagtttgt tcccttcgag 360
gagaaatatc ctccaggatt ctactgtgga gatggggaca agttccacta cgaggacgtg 420
ccactcatcg acacctggag agcattggag aagttggtgg agaagggtaa aatcagatcc 480
attggtattt ccaactttag tggtgcgttg atccaggact tgttgagaag tgccaaaatc 540
aagccagcag tgttgcagat cgaacaccac ccttacttgc agcaaccaag attggttgag 600
tacgttcaat ctcaaggcat cgccatcacc gcatactcgt ctttcggacc ccaatctttc 660
gtggaattgg accaccctcg tgtcaaggat gtcaagccat tgttcgagca cgacgtcatc 720
aagtccgttg ctggcaaagt caagaagacc ccagcacagg tgttgttgag atgggccact 780
caaagaggac ttgccgtgat tcccaagtcg aacaatcccg ataggttgtt gagcaacttg 840
aaggtgaacg actttgattt gtcgcaagaa gacttccaag aaatctccaa gttggacatt 900
gaattgagat tcaacaatcc ttgggactgg gacaagattc caactttcat ctaa 954
<210> 25
<211> 975
<212> DNA
<213> 热带假丝酵母（Candida tropicalis）
<220>
<223> 来自热带假丝酵母（Candida tropicalis）的示例性木糖还原酶
<400> 25
atgtctacta ctgttaatac tcctactatt aaattaaact ccggttatga aatgccatta 60
gttggtttcg gatgttggaa agtcaccaat gccactgccg ctgaccaaat ctacaatgcc 120
attaaaactg gttacagatt atttgatggt gctgaagatt acggtaacga aaaagaagtt 180
ggtgaaggta tcaacagagc cattaaagat ggattagtta aaagagaaga attattcatc 240
acttctaaat tatggaacaa tttccatgat ccaaagaatg ttgaaactgc tttaaacaaa 300
actttaagtg acttgaactt ggactatgtt gatttattct tgattcattt cccaattgct 360
tttaaatttg ttccaattga agaaaaatac ccacctggtt tctactgtgg tgatggtgat 420
aacttccact atgaagatgt tccattatta gatacttgga aagctttgga aaaattggtt 480
gaagctggta agatcaaatc tattggtatt tccaatttca ctggtgcttt gatttacgat 540
ttgatcagag gtgctactat caaaccagct gttttacaaa ttgaacatca cccatacttg 600
caacaaccaa aattgattga atatgttcaa aaagctggta ttgccattac tggttactct 660
tcatttggtc cacaatcatt cttggaatta gaatccaaga gagctttgaa taccccaact 720
ttatttgaac atgaaactat taaatcaatt gctgataaac atggtaaatc tccagctcaa 780
gttttattaa gatgggctac tcaaagaaat attgctgtta ttccaaaatc aaacaatcca 840
gaaagattag ctcaaaactt gtctgttgtt gactttgact tgactaagga tgatttggac 900
aatattgcta aattggacat tggtttgaga ttcaatgatc catgggactg ggacaacatt 960
ccaatctttg tttaa 975
<210> 26
<211> 957
<212> DNA
<213> 木糖发酵酵母（Scheffersomyces stipitis）
<220>
<223> 来自木糖发酵酵母（Scheffersomyces stipitis）CBS 6054的示例性木糖还原酶
<400> 26
atgccttcta ttaagttgaa ctctggttac gacatgccag ccgtcggttt cggctgttgg 60
aaagtcgacg tcgacacctg ttctgaacag atctaccgtg ctatcaagac cggttacaga 120
ttgttcgacg gtgccgaaga ttacgccaac gaaaagttag ttggtgccgg tgtcaagaag 180
gccattgacg aaggtatcgt caagcgtgaa gacttgttcc ttacctccaa gttgtggaac 240
aactaccacc acccagacaa cgtcgaaaag gccttgaaca gaaccctttc tgacttgcaa 300
gttgactacg ttgacttgtt cttgatccac ttcccagtca ccttcaagtt cgttccatta 360
gaagaaaagt acccaccagg attctactgt ggtaagggtg acaacttcga ctacgaagat 420
gttccaattt tagagacctg gaaggctctt gaaaagttgg tcaaggccgg taagatcaga 480
tctatcggtg tttctaactt cccaggtgct ttgctcttgg acttgttgag aggtgctacc 540
atcaagccat ctgtcttgca agttgaacac cacccatact tgcaacaacc aagattgatc 600
gaattcgctc aatcccgtgg tattgctgtc accgcttact cttcgttcgg tcctcaatct 660
ttcgttgaat tgaaccaagg tagagctttg aacacttctc cattgttcga gaacgaaact 720
atcaaggcta tcgctgctaa gcacggtaag tctccagctc aagtcttgtt gagatggtct 780
tcccaaagag gcattgccat cattccaaag tccaacactg tcccaagatt gttggaaaac 840
aaggacgtca acagcttcga cttggacgaa caagatttcg ctgacattgc caagttggac 900
atcaacttga gattcaacga cccatgggac tgggacaaga ttcctatctt cgtctaa 957
<210> 27
<211> 543
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Xyt1p
<400> 27
Met Gly Tyr Glu Glu Lys Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Lys Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile His Asn Val Tyr Val Ile Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Cys Thr Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Val Phe Val Asp Gln Gln Pro Tyr Leu Lys Met Phe Asp Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ala Ser Met Ser Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Leu Thr Ser Thr Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Phe Ile Cys Gly Ile Leu Trp Val Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Cys Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ala Gly Trp Gly Ile Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Thr Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Val Thr Val Gly Ile Phe Ile Met Phe Leu Ile Gly
165 170 175
Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gln Gly Lys Ala Ser Phe Arg Ile Pro Trp
180 185 190
Gly Val Gln Met Val Pro Gly Leu Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly Tyr Trp Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Asn Val Gln Ala Lys Gly Asn Arg Asn Asp
225 230 235 240
Ala Asn Val Gln Ile Glu Met Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Leu
245 250 255
Asp Glu His Leu Lys Glu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Lys Lys
260 265 270
Tyr Arg Gln Arg Thr Ile Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Gln
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Leu Val Pro Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Ile Ile Asn Met Ala Val Thr Val Pro Ala Leu Phe Cys Leu Asp
325 330 335
Leu Leu Gly Arg Arg Thr Ile Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe Met Met
340 345 350
Ala Trp Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Pro
355 360 365
Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asp His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Cys Ser
385 390 395 400
Phe Ala Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ala Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Ile Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gln Leu Trp Asp Glu Gly Val Pro Ala
485 490 495
Trp Arg Ser Ala Lys Trp Gln Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Ala
500 505 510
Glu Leu Ala His Lys Met Asp Val Ala His Ala Glu His Ala Asp Leu
515 520 525
Leu Ala Thr His Ser Pro Ser Ser Asp Glu Lys Thr Gly Thr Val
530 535 540
<210> 28
<211> 524
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Gxf1p
<400> 28
Met Ser Gln Asp Glu Leu His Thr Lys Ser Gly Val Glu Thr Pro Ile
1 5 10 15
Asn Asp Ser Leu Leu Glu Glu Lys His Asp Val Thr Pro Leu Ala Ala
20 25 30
Leu Pro Glu Lys Ser Phe Lys Asp Tyr Ile Ser Ile Ser Ile Phe Cys
35 40 45
Leu Phe Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly Thr
50 55 60
Ile Ser Gly Phe Val Asn Met Ser Asp Phe Lys Thr Arg Phe Gly Glu
65 70 75 80
Met Asn Ala Gln Gly Glu Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu
85 90 95
Met Val Ser Ile Phe Asn Val Gly Cys Ala Val Gly Gly Ile Phe Leu
100 105 110
Cys Lys Ile Ala Asp Val Tyr Gly Arg Arg Ile Gly Leu Met Phe Ser
115 120 125
Met Val Val Tyr Val Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Thr Thr
130 135 140
Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Leu Ile Ala Gly Leu Ala Val
145 150 155 160
Gly Thr Val Ser Val Ile Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Val Ala Pro
165 170 175
Lys Gln Leu Arg Gly Thr Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Cys Ile Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Thr Tyr
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Gln Trp Arg Ile Pro Leu Gly Ile Cys Phe Ala Trp
210 215 220
Ala Leu Phe Leu Val Ala Gly Met Leu Asn Met Pro Glu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Leu Val Glu Lys Ser Arg Ile Asp Asp Ala Arg Lys Ser Ile Ala
245 250 255
Arg Ser Asn Lys Val Ser Glu Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu Val
260 265 270
Gln Leu Ile Gln Ala Gly Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser Ala
275 280 285
Thr Trp Met Glu Leu Val Thr Gly Lys Pro Lys Ile Phe Arg Arg Val
290 295 300
Ile Met Gly Val Met Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly Asp Asn
305 310 315 320
Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Leu Gln
325 330 335
Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Ile Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala Ser
340 345 350
Thr Phe Val Gly Ile Tyr Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Leu Cys
355 360 365
Leu Leu Thr Gly Ser Ala Cys Met Phe Val Cys Phe Ile Ile Tyr Ser
370 375 380
Leu Ile Gly Thr Gln His Leu Tyr Lys Asn Gly Phe Ser Asn Glu Pro
385 390 395 400
Ser Asn Thr Tyr Lys Pro Ser Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr Cys
405 410 415
Leu Tyr Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr Cys
420 425 430
Ile Val Ser Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Ala Met Ser
435 440 445
Val Ala Thr Ala Ala Asn Trp Met Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe
450 455 460
Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val Phe
465 470 475 480
Thr Gly Cys Leu Ala Phe Ser Phe Phe Tyr Val Tyr Phe Phe Val Val
485 490 495
Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Ile Leu Tyr Ala Ser
500 505 510
Gly Thr Leu Pro Trp Lys Ser Ser Gly Trp Val Pro
515 520
<210> 29
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Delta-Gxf1p (具有短N-末端的Gxf1p的变体)
<400> 29
Met Ser Asp Phe Lys Thr Arg Phe Gly Glu Met Asn Ala Gln Gly Glu
1 5 10 15
Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu Met Val Ser Ile Phe Asn
20 25 30
Val Gly Cys Ala Val Gly Gly Ile Phe Leu Cys Lys Ile Ala Asp Val
35 40 45
Tyr Gly Arg Arg Ile Gly Leu Met Phe Ser Met Val Val Tyr Val Val
50 55 60
Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Thr Thr Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe
65 70 75 80
Ile Gly Arg Leu Ile Ala Gly Leu Ala Val Gly Thr Val Ser Val Ile
85 90 95
Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Val Ala Pro Lys Gln Leu Arg Gly Thr
100 105 110
Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Cys Ile Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly
115 120 125
Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Asp Ser Arg Gln Trp
130 135 140
Arg Ile Pro Leu Gly Ile Cys Phe Ala Trp Ala Leu Phe Leu Val Ala
145 150 155 160
Gly Met Leu Asn Met Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Val Glu Lys Ser
165 170 175
Arg Ile Asp Asp Ala Arg Lys Ser Ile Ala Arg Ser Asn Lys Val Ser
180 185 190
Glu Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu Val Gln Leu Ile Gln Ala Gly
195 200 205
Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser Ala Thr Trp Met Glu Leu Val
210 215 220
Thr Gly Lys Pro Lys Ile Phe Arg Arg Val Ile Met Gly Val Met Leu
225 230 235 240
Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly Asp Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly
245 250 255
Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Leu Gln Asp Ser Phe Gln Thr Ser
260 265 270
Ile Ile Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Val Gly Ile Tyr
275 280 285
Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Leu Cys Leu Leu Thr Gly Ser Ala
290 295 300
Cys Met Phe Val Cys Phe Ile Ile Tyr Ser Leu Ile Gly Thr Gln His
305 310 315 320
Leu Tyr Lys Asn Gly Phe Ser Asn Glu Pro Ser Asn Thr Tyr Lys Pro
325 330 335
Ser Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr Cys Leu Tyr Ile Phe Phe Phe
340 345 350
Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr Cys Ile Val Ser Glu Ser Tyr
355 360 365
Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Ala Met Ser Val Ala Thr Ala Ala Asn
370 375 380
Trp Met Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser
385 390 395 400
Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val Phe Thr Gly Cys Leu Ala Phe
405 410 415
Ser Phe Phe Tyr Val Tyr Phe Phe Val Val Glu Thr Lys Gly Leu Ser
420 425 430
Leu Glu Glu Val Asp Ile Leu Tyr Ala Ser Gly Thr Leu Pro Trp Lys
435 440 445
Ser Ser Gly Trp Val Pro
450
<210> 30
<211> 548
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Gxf2p
<400> 30
Met Ser Ala Glu Gln Glu Gln Gln Val Ser Gly Thr Ser Ala Thr Ile
1 5 10 15
Asp Gly Leu Ala Ser Leu Lys Gln Glu Lys Thr Ala Glu Glu Glu Asp
20 25 30
Ala Phe Lys Pro Lys Pro Ala Thr Ala Tyr Phe Phe Ile Ser Phe Leu
35 40 45
Cys Gly Leu Val Ala Phe Gly Gly Tyr Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly
50 55 60
Thr Ile Ser Gly Phe Val Asn Met Asp Asp Tyr Leu Met Arg Phe Gly
65 70 75 80
Gln Gln His Ala Asp Gly Thr Tyr Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly
85 90 95
Leu Ile Val Ser Ile Phe Asn Ile Gly Cys Ala Val Gly Gly Leu Ala
100 105 110
Leu Ser Lys Val Gly Asp Ile Trp Gly Arg Arg Ile Gly Ile Met Val
115 120 125
Ala Met Ile Ile Tyr Met Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Gln
130 135 140
Asp Lys Trp Tyr Gln Tyr Phe Ile Gly Arg Leu Ile Thr Gly Leu Gly
145 150 155 160
Val Gly Thr Thr Ser Val Leu Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Ser Ala
165 170 175
Pro Lys His Leu Arg Gly Thr Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Met Val
180 185 190
Thr Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Asn
195 200 205
Tyr Thr Asp Ser Arg Gln Trp Arg Ile Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala
210 215 220
Trp Ala Leu Leu Leu Ile Ser Gly Met Val Phe Met Pro Glu Ser Pro
225 230 235 240
Arg Phe Leu Ile Glu Arg Gln Arg Phe Asp Glu Ala Lys Ala Ser Val
245 250 255
Ala Lys Ser Asn Gln Val Ser Thr Glu Asp Pro Ala Val Tyr Thr Glu
260 265 270
Val Glu Leu Ile Gln Ala Gly Ile Asp Arg Glu Ala Leu Ala Gly Ser
275 280 285
Ala Gly Trp Lys Glu Leu Ile Thr Gly Lys Pro Lys Met Leu Gln Arg
290 295 300
Val Ile Leu Gly Met Met Leu Gln Ser Ile Gln Gln Leu Thr Gly Asn
305 310 315 320
Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Lys Ala Val Gly Met
325 330 335
Ser Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Val Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala
340 345 350
Ser Thr Phe Val Gly Ile Trp Ala Ile Glu Arg Met Gly Arg Arg Ser
355 360 365
Cys Leu Leu Val Gly Ser Ala Cys Met Ser Val Cys Phe Leu Ile Tyr
370 375 380
Ser Ile Leu Gly Ser Val Asn Leu Tyr Ile Asp Gly Tyr Glu Asn Thr
385 390 395 400
Pro Ser Asn Thr Arg Lys Pro Thr Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr
405 410 415
Cys Leu Phe Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr
420 425 430
Ser Ile Val Ser Glu Thr Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Gly Met
435 440 445
Ala Val Ala Thr Ala Ala Asn Trp Met Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe
450 455 460
Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val
465 470 475 480
Phe Thr Gly Cys Leu Ile Phe Ser Phe Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val
485 490 495
Arg Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Glu Leu Tyr Ala
500 505 510
Thr Asp Leu Pro Pro Trp Lys Thr Ala Gly Trp Thr Pro Pro Ser Ala
515 520 525
Glu Asp Met Ala His Thr Thr Gly Phe Ala Glu Ala Ala Lys Pro Thr
530 535 540
Asn Lys His Val
545
<210> 31
<211> 526
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Gxs1p
<400> 31
Met Gly Leu Glu Ser Asn Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Arg Ala Gly Ser Ser Gly Met Gly Ile Phe Val Gly Val Phe
20 25 30
Ala Ala Leu Gly Gly Val Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly Thr Ile Ser
35 40 45
Gly Val Met Ala Met Pro Trp Val Lys Glu His Phe Pro Lys Asp Arg
50 55 60
Val Ala Phe Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Ser
65 70 75 80
Ala Gly Thr Phe Phe Gly Ala Ile Leu Ala Pro Leu Leu Thr Asp Thr
85 90 95
Leu Gly Arg Arg Trp Cys Ile Ile Ile Ser Ser Leu Val Val Phe Asn
100 105 110
Leu Gly Ala Ala Leu Gln Thr Ala Ala Thr Asp Ile Pro Leu Leu Ile
115 120 125
Val Gly Arg Val Ile Ala Gly Leu Gly Val Gly Leu Ile Ser Ser Thr
130 135 140
Ile Pro Leu Tyr Gln Ser Glu Ala Leu Pro Lys Trp Ile Arg Gly Ala
145 150 155 160
Val Val Ser Cys Tyr Gln Trp Ala Ile Thr Ile Gly Ile Phe Leu Ala
165 170 175
Ala Val Ile Asn Gln Gly Thr His Lys Ile Asn Ser Pro Ala Ser Tyr
180 185 190
Arg Ile Pro Leu Gly Ile Gln Met Ala Trp Gly Leu Ile Leu Gly Val
195 200 205
Gly Met Phe Phe Leu Pro Glu Thr Pro Arg Phe Tyr Ile Ser Lys Gly
210 215 220
Gln Asn Ala Lys Ala Ala Val Ser Leu Ala Arg Leu Arg Lys Leu Pro
225 230 235 240
Gln Asp His Pro Glu Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Ile Gln Ala Ala
245 250 255
Tyr Glu Phe Glu Thr Val His Gly Lys Ser Ser Trp Ser Gln Val Phe
260 265 270
Thr Asn Lys Asn Lys Gln Leu Lys Lys Leu Ala Thr Gly Val Cys Leu
275 280 285
Gln Ala Phe Gln Gln Leu Thr Gly Val Asn Phe Ile Phe Tyr Phe Gly
290 295 300
Thr Thr Phe Phe Asn Ser Val Gly Leu Asp Gly Phe Thr Thr Ser Leu
305 310 315 320
Ala Thr Asn Ile Val Asn Val Gly Ser Thr Ile Pro Gly Ile Leu Gly
325 330 335
Val Glu Ile Phe Gly Arg Arg Lys Val Leu Leu Thr Gly Ala Ala Gly
340 345 350
Met Cys Leu Ser Gln Phe Ile Val Ala Ile Val Gly Val Ala Thr Asp
355 360 365
Ser Lys Ala Ala Asn Gln Val Leu Ile Ala Phe Cys Cys Ile Phe Ile
370 375 380
Ala Phe Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Thr Ala Trp Val Val Cys Gly
385 390 395 400
Glu Ile Phe Pro Leu Arg Thr Arg Ala Lys Ser Ile Ala Met Cys Ala
405 410 415
Ala Ser Asn Trp Leu Leu Asn Trp Ala Ile Ala Tyr Ala Thr Pro Tyr
420 425 430
Leu Val Asp Ser Asp Lys Gly Asn Leu Gly Thr Asn Val Phe Phe Ile
435 440 445
Trp Gly Ser Cys Asn Phe Phe Cys Leu Val Phe Ala Tyr Phe Met Ile
450 455 460
Tyr Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val Asp Glu Leu Tyr Glu
465 470 475 480
Lys Val Ala Ser Ala Arg Lys Ser Pro Gly Phe Val Pro Ser Glu His
485 490 495
Ala Phe Arg Glu His Ala Asp Val Glu Thr Ala Met Pro Asp Asn Phe
500 505 510
Asn Leu Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Glu Asp Ala Ser Val
515 520 525
<210> 32
<211> 526
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Hgt12p
<400> 32
Met Gly Leu Glu Ser Asn Lys Leu Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Arg Ala Gly Ser Ser Gly Met Gly Ile Phe Val Gly Val Phe
20 25 30
Ala Ala Leu Gly Gly Val Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly Thr Ile Ser
35 40 45
Gly Val Met Ala Met Pro Trp Val Lys Glu His Phe Pro Lys Asp Arg
50 55 60
Val Ala Phe Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Ser
65 70 75 80
Ala Gly Thr Phe Phe Gly Ala Ile Leu Ala Pro Leu Leu Thr Asp Thr
85 90 95
Leu Gly Arg Arg Trp Cys Ile Ile Ile Ser Ser Leu Val Val Phe Asn
100 105 110
Leu Gly Ala Ala Leu Gln Thr Ala Ala Thr Asp Ile Pro Leu Leu Ile
115 120 125
Val Gly Arg Val Ile Ala Gly Leu Gly Val Gly Leu Ile Ser Ser Thr
130 135 140
Ile Pro Leu Tyr Gln Ser Glu Ala Leu Pro Lys Trp Ile Arg Gly Ala
145 150 155 160
Val Val Ser Cys Tyr Gln Trp Ala Ile Thr Ile Gly Ile Phe Leu Ala
165 170 175
Ala Val Ile Asn Gln Gly Thr His Lys Ile Asn Ser Pro Ala Ser Tyr
180 185 190
Arg Ile Pro Leu Gly Ile Gln Met Ala Trp Gly Leu Ile Leu Gly Val
195 200 205
Gly Met Phe Phe Leu Pro Glu Thr Pro Arg Phe Tyr Ile Ser Lys Gly
210 215 220
Gln Asn Ala Lys Ala Ala Val Ser Leu Ala Arg Leu Arg Lys Leu Pro
225 230 235 240
Gln Asp His Pro Glu Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Ile Gln Ala Ala
245 250 255
Tyr Glu Phe Glu Thr Val His Gly Lys Ser Ser Trp Ser Gln Val Phe
260 265 270
Thr Asn Lys Asn Lys Gln Leu Lys Lys Leu Ala Thr Gly Val Cys Leu
275 280 285
Gln Ala Phe Gln Gln Leu Thr Gly Val Asn Phe Ile Phe Tyr Phe Gly
290 295 300
Thr Thr Phe Phe Asn Ser Val Gly Leu Asp Gly Phe Thr Thr Ser Leu
305 310 315 320
Ala Thr Asn Ile Val Asn Val Gly Ser Thr Ile Pro Gly Ile Leu Gly
325 330 335
Val Glu Ile Phe Gly Arg Arg Lys Val Leu Leu Thr Gly Ala Ala Gly
340 345 350
Met Cys Leu Ser Gln Phe Ile Val Ala Ile Val Gly Val Ala Thr Asp
355 360 365
Ser Lys Ala Ala Asn Gln Val Leu Ile Ala Phe Cys Cys Ile Phe Ile
370 375 380
Ala Phe Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Thr Ala Trp Val Val Cys Gly
385 390 395 400
Glu Ile Phe Pro Leu Arg Thr Arg Ala Lys Ser Ile Ala Met Cys Ala
405 410 415
Ala Ser Asn Trp Leu Leu Asn Trp Ala Ile Ala Tyr Ala Thr Pro Tyr
420 425 430
Leu Val Asp Ser Asp Lys Gly Asn Leu Gly Thr Asn Val Phe Phe Ile
435 440 445
Trp Gly Ser Cys Asn Phe Phe Cys Leu Val Phe Ala Tyr Phe Met Ile
450 455 460
Tyr Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val Asp Glu Leu Tyr Glu
465 470 475 480
Lys Val Ala Ser Ala Arg Lys Ser Pro Gly Phe Val Pro Ser Glu His
485 490 495
Ala Phe Arg Glu His Ala Asp Val Glu Thr Ala Met Pro Asp Asn Phe
500 505 510
Asn Leu Lys Ala Glu Ala Ile Ser Val Glu Asp Ala Ser Val
515 520 525
<210> 33
<211> 548
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Hxt5p
<400> 33
Met Ser Ile Phe Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gly Val Ser Ser Thr Glu
1 5 10 15
Ser Leu Ser Asn Asp Val Arg Tyr Asp Asn Met Glu Lys Val Asp Gln
20 25 30
Asp Val Leu Arg His Asn Phe Asn Phe Asp Lys Glu Phe Glu Glu Leu
35 40 45
Glu Ile Glu Ala Ala Gln Val Asn Asp Lys Pro Ser Phe Val Asp Arg
50 55 60
Ile Leu Ser Leu Glu Tyr Lys Leu His Phe Glu Asn Lys Asn His Met
65 70 75 80
Val Trp Leu Leu Gly Ala Phe Ala Ala Ala Ala Gly Leu Leu Ser Gly
85 90 95
Leu Asp Gln Ser Ile Ile Ser Gly Ala Ser Ile Gly Met Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Asn Leu Thr Glu Arg Glu Ala Ser Leu Val Ser Ser Leu Met Pro
115 120 125
Leu Gly Ala Met Ala Gly Ser Met Ile Met Thr Pro Leu Asn Glu Trp
130 135 140
Phe Gly Arg Lys Ser Ser Leu Ile Ile Ser Cys Ile Trp Tyr Thr Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Leu Cys Ala Gly Ala Arg Asp His His Met Met Tyr Ala
165 170 175
Gly Arg Phe Ile Leu Gly Val Gly Val Gly Ile Glu Gly Gly Cys Val
180 185 190
Gly Ile Tyr Ile Ser Glu Ser Val Pro Ala Asn Val Arg Gly Ser Ile
195 200 205
Val Ser Met Tyr Gln Phe Asn Ile Ala Leu Gly Glu Val Leu Gly Tyr
210 215 220
Ala Val Ala Ala Ile Phe Tyr Thr Val His Gly Gly Trp Arg Phe Met
225 230 235 240
Val Gly Ser Ser Leu Val Phe Ser Thr Ile Leu Phe Ala Gly Leu Phe
245 250 255
Phe Leu Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val His Lys Gly Arg Asn Gly
260 265 270
Met Ala Tyr Asp Val Trp Lys Arg Leu Arg Asp Ile Asn Asp Glu Ser
275 280 285
Ala Lys Leu Glu Phe Leu Glu Met Arg Gln Ala Ala Tyr Gln Glu Arg
290 295 300
Glu Arg Arg Ser Gln Glu Ser Leu Phe Ser Ser Trp Gly Glu Leu Phe
305 310 315 320
Thr Ile Ala Arg Asn Arg Arg Ala Leu Thr Tyr Ser Val Ile Met Ile
325 330 335
Thr Leu Gly Gln Leu Thr Gly Val Asn Ala Val Met Tyr Tyr Met Ser
340 345 350
Thr Leu Met Gly Ala Ile Gly Phe Asn Glu Lys Asp Ser Val Phe Met
355 360 365
Ser Leu Val Gly Gly Gly Ser Leu Leu Ile Gly Thr Ile Pro Ala Ile
370 375 380
Leu Trp Met Asp Arg Phe Gly Arg Arg Val Trp Gly Tyr Asn Leu Val
385 390 395 400
Gly Phe Phe Val Gly Leu Val Leu Val Gly Val Gly Tyr Arg Phe Asn
405 410 415
Pro Val Thr Gln Lys Ala Ala Ser Glu Gly Val Tyr Leu Thr Gly Leu
420 425 430
Ile Val Tyr Phe Leu Phe Phe Gly Ser Tyr Ser Thr Leu Thr Trp Val
435 440 445
Ile Pro Ser Glu Ser Phe Asp Leu Arg Thr Arg Ser Leu Gly Met Thr
450 455 460
Ile Cys Ser Thr Phe Leu Tyr Leu Trp Ser Phe Thr Val Thr Tyr Asn
465 470 475 480
Phe Thr Lys Met Ser Ala Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Leu Thr Leu Gly
485 490 495
Phe Tyr Gly Gly Ile Ala Phe Leu Gly Leu Ile Tyr Gln Val Cys Phe
500 505 510
Met Pro Glu Thr Lys Asp Lys Thr Leu Glu Glu Ile Asp Asp Ile Phe
515 520 525
Asn Arg Ser Ala Phe Ser Ile Ala Arg Glu Asn Ile Ser Asn Leu Lys
530 535 540
Lys Gly Ile Trp
545
<210> 34
<211> 524
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Hxt2.6p
<400> 34
Met Ser Ser Thr Thr Asp Thr Leu Glu Lys Arg Asp Thr Glu Pro Phe
1 5 10 15
Thr Ser Asp Ala Pro Val Thr Val His Asp Tyr Ile Ala Glu Glu Arg
20 25 30
Pro Trp Trp Lys Val Pro His Leu Arg Val Leu Thr Trp Ser Val Phe
35 40 45
Val Ile Thr Leu Thr Ser Thr Asn Asn Gly Tyr Asp Gly Ser Met Leu
50 55 60
Asn Gly Leu Gln Ser Leu Asp Ile Trp Gln Glu Asp Leu Gly His Pro
65 70 75 80
Ala Gly Gln Lys Leu Gly Ala Leu Ala Asn Gly Val Leu Phe Gly Asn
85 90 95
Leu Ala Ala Val Pro Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Asp Arg Phe Gly Arg
100 105 110
Arg Pro Val Ile Cys Phe Gly Gln Ile Leu Thr Ile Val Gly Ala Val
115 120 125
Leu Gln Gly Leu Ser Asn Ser Tyr Gly Phe Phe Leu Gly Ser Arg Ile
130 135 140
Val Leu Gly Phe Gly Ala Met Ile Ala Thr Ile Pro Ser Pro Thr Leu
145 150 155 160
Ile Ser Glu Ile Ala Tyr Pro Thr His Arg Glu Thr Ser Thr Phe Ala
165 170 175
Tyr Asn Val Cys Trp Tyr Leu Gly Ala Ile Ile Ala Ser Trp Val Thr
180 185 190
Tyr Gly Thr Arg Asp Leu Gln Ser Lys Ala Cys Trp Ser Ile Pro Ser
195 200 205
Tyr Leu Gln Ala Ala Leu Pro Phe Phe Gln Val Cys Met Ile Trp Phe
210 215 220
Val Pro Glu Ser Pro Arg Phe Leu Val Ala Lys Gly Lys Ile Asp Gln
225 230 235 240
Ala Arg Ala Val Leu Ser Lys Tyr His Thr Gly Asp Ser Thr Asp Pro
245 250 255
Arg Asp Val Ala Leu Val Asp Phe Glu Leu His Glu Ile Glu Ser Ala
260 265 270
Leu Glu Gln Glu Lys Leu Asn Thr Arg Ser Ser Tyr Phe Asp Phe Phe
275 280 285
Lys Lys Arg Asn Phe Arg Lys Arg Gly Phe Leu Cys Val Met Val Gly
290 295 300
Val Ala Met Gln Leu Ser Gly Asn Gly Leu Val Ser Tyr Tyr Leu Ser
305 310 315 320
Lys Val Leu Asp Ser Ile Gly Ile Thr Glu Thr Lys Arg Gln Leu Glu
325 330 335
Ile Asn Gly Cys Leu Met Ile Tyr Asn Phe Val Ile Cys Val Ser Leu
340 345 350
Met Ser Val Cys Arg Met Phe Lys Arg Arg Val Leu Phe Leu Thr Cys
355 360 365
Phe Ser Gly Met Thr Val Cys Tyr Thr Ile Trp Thr Ile Leu Ser Ala
370 375 380
Leu Asn Glu Gln Arg His Phe Glu Asp Lys Gly Leu Ala Asn Gly Val
385 390 395 400
Leu Ala Met Ile Phe Phe Tyr Tyr Phe Phe Tyr Asn Val Gly Ile Asn
405 410 415
Gly Leu Pro Phe Leu Tyr Ile Thr Glu Ile Leu Pro Tyr Ser His Arg
420 425 430
Ala Lys Gly Leu Asn Leu Phe Gln Phe Ser Gln Phe Leu Thr Gln Ile
435 440 445
Tyr Asn Gly Tyr Val Asn Pro Ile Ala Met Asp Ala Ile Ser Trp Lys
450 455 460
Tyr Tyr Ile Val Tyr Cys Cys Ile Leu Phe Val Glu Leu Val Ile Val
465 470 475 480
Phe Phe Thr Phe Pro Glu Thr Ser Gly Tyr Thr Leu Glu Glu Val Ala
485 490 495
Gln Val Phe Gly Asp Glu Ala Pro Gly Leu His Asn Arg Gln Leu Asp
500 505 510
Val Ala Lys Glu Ser Leu Glu His Val Glu His Val
515 520
<210> 35
<211> 556
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Qup2p
<400> 35
Met Gly Phe Arg Asn Leu Lys Arg Arg Leu Ser Asn Val Gly Asp Ser
1 5 10 15
Met Ser Val His Ser Val Lys Glu Glu Glu Asp Phe Ser Arg Val Glu
20 25 30
Ile Pro Asp Glu Ile Tyr Asn Tyr Lys Ile Val Leu Val Ala Leu Thr
35 40 45
Ala Ala Ser Ala Ala Ile Ile Ile Gly Tyr Asp Ala Gly Phe Ile Gly
50 55 60
Gly Thr Val Ser Leu Thr Ala Phe Lys Ser Glu Phe Gly Leu Asp Lys
65 70 75 80
Met Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ala Ile Glu Ala Asn Val Val Ser Val
85 90 95
Phe Gln Ala Gly Ala Tyr Phe Gly Cys Leu Phe Phe Tyr Pro Ile Gly
100 105 110
Glu Ile Trp Gly Arg Lys Ile Gly Leu Leu Leu Ser Gly Phe Leu Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Ala Ala Ile Ser Leu Ile Ser Asn Ser Ser Arg Gly Leu
130 135 140
Gly Ala Ile Tyr Ala Gly Arg Val Leu Thr Gly Leu Gly Ile Gly Gly
145 150 155 160
Cys Ser Ser Leu Ala Pro Ile Tyr Val Ser Glu Ile Ala Pro Ala Ala
165 170 175
Ile Arg Gly Lys Leu Val Gly Cys Trp Glu Val Ser Trp Gln Val Gly
180 185 190
Gly Ile Val Gly Tyr Trp Ile Asn Tyr Gly Val Leu Gln Thr Leu Pro
195 200 205
Ile Ser Ser Gln Gln Trp Ile Ile Pro Phe Ala Val Gln Leu Ile Pro
210 215 220
Ser Gly Leu Phe Trp Gly Leu Cys Leu Leu Ile Pro Glu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Phe Leu Val Ser Lys Gly Lys Ile Asp Lys Ala Arg Lys Asn Leu Ala
245 250 255
Tyr Leu Arg Gly Leu Ser Glu Asp His Pro Tyr Ser Val Phe Glu Leu
260 265 270
Glu Asn Ile Ser Lys Ala Ile Glu Glu Asn Phe Glu Gln Thr Gly Arg
275 280 285
Gly Phe Phe Asp Pro Leu Lys Ala Leu Phe Phe Ser Lys Lys Met Leu
290 295 300
Tyr Arg Leu Leu Leu Ser Thr Ser Met Phe Met Met Gln Asn Gly Tyr
305 310 315 320
Gly Ile Asn Ala Val Thr Tyr Tyr Ser Pro Thr Ile Phe Lys Ser Leu
325 330 335
Gly Val Gln Gly Ser Asn Ala Gly Leu Leu Ser Thr Gly Ile Phe Gly
340 345 350
Leu Leu Lys Gly Ala Ala Ser Val Phe Trp Val Phe Phe Leu Val Asp
355 360 365
Thr Phe Gly Arg Arg Phe Cys Leu Cys Tyr Leu Ser Leu Pro Cys Ser
370 375 380
Ile Cys Met Trp Tyr Ile Gly Ala Tyr Ile Lys Ile Ala Asn Pro Ser
385 390 395 400
Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Thr Ala Thr Thr Pro Ala Gly Thr Ala
405 410 415
Ala Lys Ala Met Leu Tyr Ile Trp Thr Ile Phe Tyr Gly Ile Thr Trp
420 425 430
Asn Gly Thr Thr Trp Val Ile Cys Ala Glu Ile Phe Pro Gln Ser Val
435 440 445
Arg Thr Ala Ala Gln Ala Val Asn Ala Ser Ser Asn Trp Phe Trp Ala
450 455 460
Phe Met Ile Gly His Phe Thr Gly Gln Ala Leu Glu Asn Ile Gly Tyr
465 470 475 480
Gly Tyr Tyr Phe Leu Phe Ala Ala Cys Ser Ala Ile Phe Pro Val Val
485 490 495
Val Trp Phe Val Tyr Pro Glu Thr Lys Gly Val Pro Leu Glu Ala Val
500 505 510
Glu Tyr Leu Phe Glu Val Arg Pro Trp Lys Ala His Ser Tyr Ala Leu
515 520 525
Glu Lys Tyr Gln Ile Glu Tyr Asn Glu Gly Glu Phe His Gln His Lys
530 535 540
Pro Glu Val Leu Leu Gln Gly Ser Glu Asn Ser Asp
545 550 555
<210> 36
<211> 543
<212> PRT
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Aps1p/Hgt19p
<400> 36
Met Gly Tyr Glu Glu Lys Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Lys Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile His Asn Val Tyr Val Ile Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Cys Thr Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Val Phe Val Asp Gln Gln Pro Tyr Leu Lys Met Phe Asp Asn Pro
50 55 60
Ser Ser Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ala Ser Met Ser Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Leu Thr Ser Thr Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Phe Ile Cys Gly Ile Leu Trp Val Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Cys Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ala Gly Trp Gly Ile Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Thr Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Val Thr Val Gly Ile Phe Ile Met Phe Leu Ile Gly
165 170 175
Tyr Gly Cys Ser Phe Ile Gln Gly Lys Ala Ser Phe Arg Ile Pro Trp
180 185 190
Gly Val Gln Met Val Pro Gly Leu Ile Leu Leu Ile Gly Leu Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly Tyr Trp Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Asn Val Gln Ala Lys Gly Asn Arg Asn Asp
225 230 235 240
Ala Asn Val Gln Ile Glu Met Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Leu
245 250 255
Asp Glu His Leu Lys Glu Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Thr Lys Lys
260 265 270
Tyr Arg Gln Arg Thr Ile Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Gln
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Leu Val Pro Ser Leu Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Ile Ile Asn Met Ala Val Thr Val Pro Ala Leu Phe Cys Leu Asp
325 330 335
Leu Leu Gly Arg Arg Thr Ile Leu Leu Ala Gly Ala Ala Phe Met Met
340 345 350
Ala Trp Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Pro
355 360 365
Ala Tyr Ile Ser Asp Thr Val Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asp His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Cys Ser
385 390 395 400
Phe Ala Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Leu Ala Thr Ser
420 425 430
Ala Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Ile Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gln Leu Trp Asp Glu Gly Val Pro Ala
485 490 495
Trp Arg Ser Ala Lys Trp Gln Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Ala
500 505 510
Glu Leu Ala His Lys Met Asp Val Ala His Ala Glu His Ala Asp Leu
515 520 525
Leu Ala Thr His Ser Pro Ser Ser Asp Glu Lys Thr Gly Thr Val
530 535 540
<210> 37
<211> 539
<212> PRT
<213> 季也蒙毕赤酵母菌（Pichia gulliermondii）
<220>
<223> 来自季也蒙毕赤酵母菌（Pichia gulliermondii）的示例性木糖转运蛋白;Axt1p
<400> 37
Met Ala Tyr Glu Asp Lys Leu Val Ala Pro Ala Leu Lys Phe Arg Asn
1 5 10 15
Phe Leu Asp Lys Thr Pro Asn Ile Tyr Asn Pro Tyr Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Ile Ser Cys Ile Ala Gly Met Met Phe Gly Phe Asp Ile Ser Ser Met
35 40 45
Ser Ala Phe Val Ser Leu Pro Ala Tyr Val Asn Tyr Phe Asp Thr Pro
50 55 60
Ser Ala Val Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ser Ala Met Ala Leu Gly Ser
65 70 75 80
Phe Phe Gly Ser Ile Ala Ser Ala Phe Val Ser Glu Pro Phe Gly Arg
85 90 95
Arg Ala Ser Leu Leu Thr Cys Ser Trp Phe Trp Met Ile Gly Ala Ala
100 105 110
Ile Gln Ala Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Ile Ile Gly Arg Ile
115 120 125
Ile Ser Gly Phe Gly Val Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr
130 135 140
Gly Ser Glu Met Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Arg Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Phe Gln Leu Ser Val Thr Leu Gly Ile Met Ile Met Phe Phe Ile Ser
165 170 175
Tyr Gly Thr Ser His Ile Lys Thr Ala Ala Ala Phe Arg Leu Ala Trp
180 185 190
Ala Leu Gln Ile Ile Pro Gly Leu Leu Met Cys Ile Gly Val Phe Phe
195 200 205
Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys Gln Gly His Trp Asp Glu
210 215 220
Ala Glu Ile Ile Val Ala Lys Ile Gln Ala Lys Gly Asp Arg Glu Asn
225 230 235 240
Pro Asp Val Leu Ile Glu Ile Ser Glu Ile Lys Asp Gln Leu Met Val
245 250 255
Asp Glu Asn Ala Lys Ala Phe Thr Tyr Ala Asp Leu Phe Ser Lys Lys
260 265 270
Tyr Leu Pro Arg Thr Ile Thr Ala Met Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln
275 280 285
Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Glu
290 295 300
Met Ala Gly Tyr Gly Gly Asn Gly Val Leu Val Ser Ser Thr Ile Gln
305 310 315 320
Tyr Val Ile Phe Val Val Val Thr Phe Val Ser Leu Phe Phe Leu Asp
325 330 335
Lys Phe Gly Arg Arg Lys Ile Leu Leu Val Gly Ala Ala Ser Met Met
340 345 350
Thr Trp Gln Phe Ala Val Ala Gly Ile Leu Ala Arg Tyr Ser Val Pro
355 360 365
Tyr Asp Leu Ser Asp Thr Val Lys Ile Lys Ile Pro Asp Asn His Lys
370 375 380
Ser Ala Ala Lys Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr Leu Phe Val Ala Ser
385 390 395 400
Phe Gly Phe Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Leu Tyr Cys Ser Glu Val
405 410 415
Trp Gly Asp Ser Gln Ser Arg Gln Arg Gly Ala Ala Val Ser Thr Ala
420 425 430
Ser Asn Trp Ile Phe Asn Phe Ala Leu Ala Met Phe Thr Pro Ser Ser
435 440 445
Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Cys Ile Tyr Ala Thr Phe Cys
450 455 460
Ala Cys Met Phe Ile His Val Phe Phe Phe Phe Pro Glu Thr Lys Gly
465 470 475 480
Lys Arg Leu Glu Glu Ile Ala Gln Ile Trp Glu Glu Lys Ile Pro Ala
485 490 495
Trp Lys Thr Thr Asn Trp Gln Pro His Val Pro Leu Leu Ser Asp His
500 505 510
Glu Leu Ala Glu Lys Ile Asn Ala Glu His Val Glu Asn Val Asn Ser
515 520 525
Arg Glu Gln Ser Asp Asp Glu Lys Ser Gln Val
530 535
<210> 38
<211> 547
<212> PRT
<213> 中间假丝酵母（Candida intermedia）
<220>
<223> 来自中间假丝酵母（Candida intermedia）PYCC 4715的示例性木糖转运蛋白;Gxf1p
<400> 38
Met Ser Gln Asp Ser His Ser Ser Gly Ala Ala Thr Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Ser Ile Leu Glu Lys Glu Lys Glu Asp Ser Pro Val Leu Gln Val Asp
20 25 30
Ala Pro Gln Lys Gly Phe Lys Asp Tyr Ile Val Ile Ser Ile Phe Cys
35 40 45
Phe Met Val Ala Phe Gly Gly Phe Val Phe Gly Phe Asp Thr Gly Thr
50 55 60
Ile Ser Gly Phe Val Asn Met Ser Asp Phe Lys Asp Arg Phe Gly Gln
65 70 75 80
His His Ala Asp Gly Thr Pro Tyr Leu Ser Asp Val Arg Val Gly Leu
85 90 95
Met Ile Ser Ile Phe Asn Val Gly Cys Ala Val Gly Gly Ile Phe Leu
100 105 110
Cys Lys Val Ala Asp Val Trp Gly Arg Arg Ile Gly Leu Met Phe Ser
115 120 125
Met Ala Val Tyr Val Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ser Ser Ser Thr
130 135 140
Lys Trp Tyr Gln Phe Phe Ile Gly Arg Leu Ile Ala Gly Leu Ala Val
145 150 155 160
Gly Thr Val Ser Val Val Ser Pro Leu Phe Ile Ser Glu Val Ser Pro
165 170 175
Lys Gln Ile Arg Gly Thr Leu Val Cys Cys Phe Gln Leu Cys Ile Thr
180 185 190
Leu Gly Ile Phe Leu Gly Tyr Cys Thr Thr Tyr Gly Thr Lys Thr Tyr
195 200 205
Thr Asp Ser Arg Gln Trp Arg Ile Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala Trp
210 215 220
Ala Ile Leu Leu Val Val Gly Met Leu Asn Met Pro Glu Ser Pro Arg
225 230 235 240
Tyr Leu Val Glu Lys His Arg Ile Asp Glu Ala Lys Arg Ser Ile Ala
245 250 255
Arg Ser Asn Lys Ile Pro Glu Glu Asp Pro Phe Val Tyr Thr Glu Val
260 265 270
Gln Leu Ile Gln Ala Gly Ile Glu Arg Glu Ala Leu Ala Gly Gln Ala
275 280 285
Ser Trp Lys Glu Leu Ile Thr Gly Lys Pro Lys Ile Phe Arg Arg Val
290 295 300
Ile Met Gly Ile Met Leu Gln Ser Leu Gln Gln Leu Thr Gly Asp Asn
305 310 315 320
Tyr Phe Phe Tyr Tyr Gly Thr Thr Ile Phe Gln Ala Val Gly Leu Lys
325 330 335
Asp Ser Phe Gln Thr Ser Ile Ile Leu Gly Ile Val Asn Phe Ala Ser
340 345 350
Thr Phe Val Gly Ile Tyr Val Ile Glu Arg Leu Gly Arg Arg Leu Cys
355 360 365
Leu Leu Thr Gly Ser Ala Ala Met Phe Ile Cys Phe Ile Ile Tyr Ser
370 375 380
Leu Ile Gly Thr Gln His Leu Tyr Lys Gln Gly Tyr Ser Asn Glu Thr
385 390 395 400
Ser Asn Thr Tyr Lys Ala Ser Gly Asn Ala Met Ile Phe Ile Thr Cys
405 410 415
Leu Tyr Ile Phe Phe Phe Ala Ser Thr Trp Ala Gly Gly Val Tyr Cys
420 425 430
Ile Ile Ser Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Ile Arg Ser Lys Ala Met Ser
435 440 445
Ile Ala Thr Ala Ala Asn Trp Leu Trp Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe
450 455 460
Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile His Phe Tyr Tyr Gly Phe Val Phe
465 470 475 480
Thr Gly Cys Leu Ala Phe Ser Phe Phe Tyr Val Tyr Phe Phe Val Tyr
485 490 495
Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Glu Val Asp Glu Met Tyr Ala Ser
500 505 510
Gly Val Leu Pro Leu Lys Ser Ala Ser Trp Val Pro Pro Asn Leu Glu
515 520 525
His Met Ala His Ser Ala Gly Tyr Ala Gly Ala Asp Lys Ala Thr Asp
530 535 540
Glu Gln Val
545
<210> 39
<211> 522
<212> PRT
<213> 中间假丝酵母（Candida intermedia）
<220>
<223> 来自中间假丝酵母（Candida intermedia）的示例性葡萄糖/木糖同向转运蛋白Gxs1p
<400> 39
Met Gly Leu Glu Asp Asn Arg Met Val Lys Arg Phe Val Asn Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Lys Ala Gly Ser Thr Ala Met Ala Ile Ile Val Gly Leu Phe
20 25 30
Ala Ala Ser Gly Gly Val Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Gly Thr Ile Ser
35 40 45
Gly Val Met Thr Met Asp Tyr Val Leu Ala Arg Tyr Pro Ser Asn Lys
50 55 60
His Ser Phe Thr Ala Asp Glu Ser Ser Leu Ile Val Ser Ile Leu Ser
65 70 75 80
Val Gly Thr Phe Phe Gly Ala Leu Cys Ala Pro Phe Leu Asn Asp Thr
85 90 95
Leu Gly Arg Arg Trp Cys Leu Ile Leu Ser Ala Leu Ile Val Phe Asn
100 105 110
Ile Gly Ala Ile Leu Gln Val Ile Ser Thr Ala Ile Pro Leu Leu Cys
115 120 125
Ala Gly Arg Val Ile Ala Gly Phe Gly Val Gly Leu Ile Ser Ala Thr
130 135 140
Ile Pro Leu Tyr Gln Ser Glu Thr Ala Pro Lys Trp Ile Arg Gly Ala
145 150 155 160
Ile Val Ser Cys Tyr Gln Trp Ala Ile Thr Ile Gly Leu Phe Leu Ala
165 170 175
Ser Cys Val Asn Lys Gly Thr Glu His Met Thr Asn Ser Gly Ser Tyr
180 185 190
Arg Ile Pro Leu Ala Ile Gln Cys Leu Trp Gly Leu Ile Leu Gly Ile
195 200 205
Gly Met Ile Phe Leu Pro Glu Thr Pro Arg Phe Trp Ile Ser Lys Gly
210 215 220
Asn Gln Glu Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Arg Leu Arg Lys Leu Pro
225 230 235 240
Ile Asp His Pro Asp Ser Leu Glu Glu Leu Arg Asp Ile Thr Ala Ala
245 250 255
Tyr Glu Phe Glu Thr Val Tyr Gly Lys Ser Ser Trp Ser Gln Val Phe
260 265 270
Ser His Lys Asn His Gln Leu Lys Arg Leu Phe Thr Gly Val Ala Ile
275 280 285
Gln Ala Phe Gln Gln Leu Thr Gly Val Asn Phe Ile Phe Tyr Tyr Gly
290 295 300
Thr Thr Phe Phe Lys Arg Ala Gly Val Asn Gly Phe Thr Ile Ser Leu
305 310 315 320
Ala Thr Asn Ile Val Asn Val Gly Ser Thr Ile Pro Gly Ile Leu Leu
325 330 335
Met Glu Val Leu Gly Arg Arg Asn Met Leu Met Gly Gly Ala Thr Gly
340 345 350
Met Ser Leu Ser Gln Leu Ile Val Ala Ile Val Gly Val Ala Thr Ser
355 360 365
Glu Asn Asn Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Val Ala Phe Ser Cys Ile
370 375 380
Phe Ile Ala Phe Phe Ala Ala Thr Trp Gly Pro Cys Ala Trp Val Val
385 390 395 400
Val Gly Glu Leu Phe Pro Leu Arg Thr Arg Ala Lys Ser Val Ser Leu
405 410 415
Cys Thr Ala Ser Asn Trp Leu Trp Asn Trp Gly Ile Ala Tyr Ala Thr
420 425 430
Pro Tyr Met Val Asp Glu Asp Lys Gly Asn Leu Gly Ser Asn Val Phe
435 440 445
Phe Ile Trp Gly Gly Phe Asn Leu Ala Cys Val Phe Phe Ala Trp Tyr
450 455 460
Phe Ile Tyr Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu Gln Val Asp Glu Leu
465 470 475 480
Tyr Glu His Val Ser Lys Ala Trp Lys Ser Lys Gly Phe Val Pro Ser
485 490 495
Lys His Ser Phe Arg Glu Gln Val Asp Gln Gln Met Asp Ser Lys Thr
500 505 510
Glu Ala Ile Met Ser Glu Glu Ala Ser Val
515 520
<210> 40
<211> 574
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的示例性木糖转运蛋白; Gxf2p/Gal2p
<400> 40
Met Ala Val Glu Glu Asn Asn Met Pro Val Val Ser Gln Gln Pro Gln
1 5 10 15
Ala Gly Glu Asp Val Ile Ser Ser Leu Ser Lys Asp Ser His Leu Ser
20 25 30
Ala Gln Ser Gln Lys Tyr Ser Asn Asp Glu Leu Lys Ala Gly Glu Ser
35 40 45
Gly Ser Glu Gly Ser Gln Ser Val Pro Ile Glu Ile Pro Lys Lys Pro
50 55 60
Met Ser Glu Tyr Val Thr Val Ser Leu Leu Cys Leu Cys Val Ala Phe
65 70 75 80
Gly Gly Phe Met Phe Gly Trp Asp Thr Gly Thr Ile Ser Gly Phe Val
85 90 95
Val Gln Thr Asp Phe Leu Arg Arg Phe Gly Met Lys His Lys Asp Gly
100 105 110
Thr His Tyr Leu Ser Asn Val Arg Thr Gly Leu Ile Val Ala Ile Phe
115 120 125
Asn Ile Gly Cys Ala Phe Gly Gly Ile Ile Leu Ser Lys Gly Gly Asp
130 135 140
Met Tyr Gly Arg Lys Lys Gly Leu Ser Ile Val Val Ser Val Tyr Ile
145 150 155 160
Val Gly Ile Ile Ile Gln Ile Ala Ser Ile Asn Lys Trp Tyr Gln Tyr
165 170 175
Phe Ile Gly Arg Ile Ile Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ile Ala Val
180 185 190
Leu Cys Pro Met Leu Ile Ser Glu Ile Ala Pro Lys His Leu Arg Gly
195 200 205
Thr Leu Val Ser Cys Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ala Gly Ile Phe Leu
210 215 220
Gly Tyr Cys Thr Asn Tyr Gly Thr Lys Ser Tyr Ser Asn Ser Val Gln
225 230 235 240
Trp Arg Val Pro Leu Gly Leu Cys Phe Ala Trp Ser Leu Phe Met Ile
245 250 255
Gly Ala Leu Thr Leu Val Pro Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Cys Glu Val
260 265 270
Asn Lys Val Glu Asp Ala Lys Arg Ser Ile Ala Lys Ser Asn Lys Val
275 280 285
Ser Pro Glu Asp Pro Ala Val Gln Ala Glu Leu Asp Leu Ile Met Ala
290 295 300
Gly Ile Glu Ala Glu Lys Leu Ala Gly Asn Ala Ser Trp Gly Glu Leu
305 310 315 320
Phe Ser Thr Lys Thr Lys Val Phe Gln Arg Leu Leu Met Gly Val Phe
325 330 335
Val Gln Met Phe Gln Gln Leu Thr Gly Asn Asn Tyr Phe Phe Tyr Tyr
340 345 350
Gly Thr Val Ile Phe Lys Ser Val Gly Leu Asp Asp Ser Phe Glu Thr
355 360 365
Ser Ile Val Ile Gly Val Val Asn Phe Ala Ser Thr Phe Phe Ser Leu
370 375 380
Trp Thr Val Glu Asn Leu Gly His Arg Lys Cys Leu Leu Leu Gly Ala
385 390 395 400
Ala Thr Met Met Ala Cys Met Val Ile Tyr Ala Ser Val Gly Val Thr
405 410 415
Arg Leu Tyr Pro His Gly Lys Ser Gln Pro Ser Ser Lys Gly Ala Gly
420 425 430
Asn Cys Met Ile Val Phe Thr Cys Phe Tyr Ile Phe Cys Tyr Ala Thr
435 440 445
Thr Trp Ala Pro Val Ala Trp Val Ile Thr Ala Glu Ser Phe Pro Leu
450 455 460
Arg Val Lys Ser Lys Cys Met Ala Leu Ala Ser Ala Ser Asn Trp Val
465 470 475 480
Trp Gly Phe Leu Ile Ala Phe Phe Thr Pro Phe Ile Thr Ser Ala Ile
485 490 495
Asn Phe Tyr Tyr Gly Tyr Val Phe Met Gly Cys Leu Val Ala Met Phe
500 505 510
Phe Tyr Val Phe Phe Phe Val Pro Glu Thr Lys Gly Leu Ser Leu Glu
515 520 525
Glu Ile Gln Glu Leu Trp Glu Glu Gly Val Leu Pro Trp Lys Ser Glu
530 535 540
Gly Trp Ile Pro Ser Ser Arg Arg Gly Asn Asn Tyr Asp Leu Glu Asp
545 550 555 560
Leu Gln His Asp Asp Lys Pro Trp Tyr Lys Ala Met Leu Glu
565 570
<210> 41
<211> 1632
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的XYT1
<400> 41
atgggttacg aggaaaagct tgtagcgccc gcgttgaaat tcaaaaactt tcttgacaaa 60
acccccaata ttcacaatgt ctatgtcatt gccgccatct cctgtacatc aggtatgatg 120
tttggatttg atatctcgtc gatgtctgtc tttgtcgacc agcagccata cttgaagatg 180
tttgacaacc ctagttccgt gattcaaggt ttcattaccg cgctgatgag tttgggctcg 240
tttttcggct cgctcacatc cacgttcatc tctgagcctt ttggtcgtcg tgcatcgttg 300
ttcatttgtg gtattctttg ggtaattgga gcagcggttc aaagttcgtc gcagaacagg 360
gcccaattga tttgtgggcg tatcattgca ggatggggca ttggctttgg gtcatcggtg 420
gctcctgttt acgggtccga gatggctccg agaaagatca gaggcacgat tggtggaatc 480
ttccagttct ccgtcaccgt gggtatcttt atcatgttct tgattgggta cggatgctct 540
ttcattcaag gaaaggcctc tttccggatc ccctggggtg tgcaaatggt tcccggcctt 600
atcctcttga ttggactttt ctttattcct gaatctcccc gttggttggc caaacagggc 660
tactgggaag acgccgaaat cattgtggcc aatgtgcagg ccaagggtaa ccgtaacgac 720
gccaacgtgc agattgaaat gtcggagatt aaggatcaat tgatgcttga cgagcacttg 780
aaggagttta cgtacgctga ccttttcacg aagaagtacc gccagcgcac gatcacggcg 840
atctttgccc agatctggca acagttgacc ggtatgaatg tgatgatgta ctacattgtg 900
tacattttcc agatggcagg ctacagcggc aacacgaact tggtgcccag tttgatccag 960
tacatcatca acatggcggt cacggtgccg gcgcttttct gcttggatct cttgggccgt 1020
cgtaccattt tgctcgcggg tgccgcgttc atgatggcgt ggcaattcgg cgtggcgggc 1080
attttggcca cttactcaga accggcatat atctctgaca ctgtgcgtat cacgatcccc 1140
gacgaccaca agtctgctgc aaaaggtgtg attgcatgct gctatttgtt tgtgtgctcg 1200
tttgcattct cgtggggtgt cggtatttgg gtgtactgtt ccgaggtttg gggtgactcc 1260
cagtcgagac aaagaggcgc cgctcttgcg acgtcggcca actggatctt caacttcgcc 1320
attgccatgt tcacgccgtc ctcattcaag aatatcacgt ggaagacgta tatcatctac 1380
gccacgttct gtgcgtgcat gttcatacac gtgtttttct ttttcccaga aacaaagggc 1440
aagcgtttgg aggagatagg ccagctttgg gacgaaggag tcccagcatg gaggtcagcc 1500
aagtggcagc caacagtgcc gctcgcgtcc gacgcagagc ttgcacacaa gatggatgtt 1560
gcgcacgcgg agcacgcgga cttattggcc acgcactcgc catcttcaga cgagaagacg 1620
ggcacggtct aa 1632
<210> 42
<211> 1635
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的GXF1
<400> 42
atgtctcaag acgaacttca tacaaagtct ggtgttgaaa caccaatcaa cgattcgctt 60
ctcgaggaga agcacgatgt caccccactc gcggcattgc ccgagaagtc cttcaaggac 120
tacatttcca tttccatttt ctgtttgttt gtggcatttg gtggttttgt tttcggtttc 180
gacaccggta cgatttccgg tttcgtcaac atgtccgact tcaagaccag atttggtgag 240
atgaatgccc agggcgaata ctacttgtcc aatgttagaa ctggtttgat ggtttctatt 300
ttcaacgtcg gttgcgccgt tggtggtatc ttcctttgta agattgccga tgtttatggc 360
agaagaattg gtcttatgtt ttccatggtg gtttatgtcg ttggtatcat tattcagatt 420
gcctccacca ccaaatggta ccaatacttc attggccgtc ttattgctgg cttggctgtg 480
ggtactgttt ccgtcatctc gccacttttc atttccgagg ttgctcctaa acagctcaga 540
ggtacgcttg tgtgctgctt ccagttgtgt atcaccttgg gtatcttttt gggttactgc 600
acgacctacg gtacaaagac ttacactgac tccagacagt ggagaatccc attgggtatc 660
tgtttcgcgt gggctttgtt tttggtggcc ggtatgttga acatgcccga gtctcctaga 720
tacttggttg agaaatcgag aatcgacgat gccagaaagt ccattgccag atccaacaag 780
gtttccgagg aagaccccgc cgtgtacacc gaggtgcagc ttatccaggc tggtattgac 840
agagaggccc ttgccggcag cgccacatgg atggagcttg tgactggtaa gcccaaaatc 900
ttcagaagag tcatcatggg tgtcatgctt cagtccttgc aacaattgac tggtgacaac 960
tactttttct actacggaac cacgattttc aaggctgttg gcttgcagga ctctttccag 1020
acgtcgatta tcttgggtat tgtcaacttt gcctcgactt ttgtcggtat ttacgccatt 1080
gagagaatgg gcagaagatt gtgtttgttg accggatctg cgtgcatgtt tgtgtgtttc 1140
atcatctact cgctcattgg tacgcagcac ttgtacaaga acggcttctc taacgaacct 1200
tccaacacat acaagccttc cggtaacgcc atgatcttca tcacgtgtct ttacattttc 1260
ttctttgcct cgacctgggc cggtggtgtt tactgtatcg tgtccgagtc ttacccattg 1320
agaatcagat ccaaggccat gtctgtcgcc accgccgcca actggatgtg gggtttcttg 1380
atctcgttct tcacgccttt catcacctcc gccatccact tttactacgg ttttgttttc 1440
actggctgct tggcgttctc cttcttctac gtctacttct ttgtcgtgga gaccaagggt 1500
ctttccttgg aggaggttga cattttgtac gcttccggta cgcttccatg gaagtcctct 1560
ggctgggtgc ctcctaccgc ggacgaaatg gcccacaacg ccttcgacaa caagccaact 1620
gacgaacaag tctaa 1635
<210> 43
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的Delta-GXF1 (具有短N-末端的GXF1的变体)
<400> 43
atgtccgact tcaagaccag atttggtgag atgaatgccc agggcgaata ctacttgtcc 60
aatgttagaa ctggtttgat ggtttctatt ttcaacgtcg gttgcgccgt tggtggtatc 120
ttcctttgta agattgccga tgtttatggc agaagaattg gtcttatgtt ttccatggtg 180
gtttatgtcg ttggtatcat tattcagatt gcctccacca ccaaatggta ccaatacttc 240
attggccgtc ttattgctgg cttggctgtg ggtactgttt ccgtcatctc gccacttttc 300
atttccgagg ttgctcctaa acagctcaga ggtacgcttg tgtgctgctt ccagttgtgt 360
atcaccttgg gtatcttttt gggttactgc acgacctacg gtacaaagac ttacactgac 420
tccagacagt ggagaatccc attgggtatc tgtttcgcgt gggctttgtt tttggtggcc 480
ggtatgttga acatgcccga gtctcctaga tacttggttg agaaatcgag aatcgacgat 540
gccagaaagt ccattgccag atccaacaag gtttccgagg aagaccccgc cgtgtacacc 600
gaggtgcagc ttatccaggc tggtattgac agagaggccc ttgccggcag cgccacatgg 660
atggagcttg tgactggtaa gcccaaaatc ttcagaagag tcatcatggg tgtcatgctt 720
cagtccttgc aacaattgac tggtgacaac tactttttct actacggaac cacgattttc 780
aaggctgttg gcttgcagga ctctttccag acgtcgatta tcttgggtat tgtcaacttt 840
gcctcgactt ttgtcggtat ttacgccatt gagagaatgg gcagaagatt gtgtttgttg 900
accggatctg cgtgcatgtt tgtgtgtttc atcatctact cgctcattgg tacgcagcac 960
ttgtacaaga acggcttctc taacgaacct tccaacacat acaagccttc cggtaacgcc 1020
atgatcttca tcacgtgtct ttacattttc ttctttgcct cgacctgggc cggtggtgtt 1080
tactgtatcg tgtccgagtc ttacccattg agaatcagat ccaaggccat gtctgtcgcc 1140
accgccgcca actggatgtg gggtttcttg atctcgttct tcacgccttt catcacctcc 1200
gccatccact tttactacgg ttttgttttc actggctgct tggcgttctc cttcttctac 1260
gtctacttct ttgtcgtgga gaccaagggt ctttccttgg aggaggttga cattttgtac 1320
gcttccggta cgcttccatg gaagtcctct ggctgggtgc ctcctaccgc ggacgaaatg 1380
gcccacaacg ccttcgacaa caagccaact gacgaacaag tctaa 1425
<210> 44
<211> 1647
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的 GXF2/GAL2
<400> 44
atgagtgccg aacaggaaca acaagtatcg ggcacatctg ccacgataga tgggctggcg 60
tccttgaagc aagaaaaaac cgccgaggag gaagacgcct tcaagcctaa gcccgccacg 120
gcgtactttt tcatttcgtt cctctgtggc ttggtcgcct ttggcggcta cgttttcggt 180
ttcgataccg gtacgatttc cgggtttgtt aacatggacg actatttgat gagattcggc 240
cagcagcacg ctgatggcac gtattacctt tccaacgtga gaaccggttt gatcgtgtcg 300
atcttcaaca ttggctgtgc cgttggtggt cttgcgcttt cgaaagtcgg tgacatttgg 360
ggcagaagaa ttggtattat ggttgctatg atcatctaca tggtgggaat catcatccag 420
atcgcttcac aggataaatg gtaccagtac ttcattggcc gtttgatcac cggattgggt 480
gtcggcacca cgtccgtgct tagtcctctt ttcatctccg agtcggctcc gaagcatttg 540
agaggcaccc ttgtgtgttg tttccagctc atggtcacct tgggtatctt tttgggctac 600
tgcacgacct acggtaccaa gaactacact gactcgcgcc agtggcggat tcccttgggt 660
ctttgcttcg catgggctct tttgttgatc tcgggaatgg ttttcatgcc tgaatcccca 720
cgtttcttga ttgagcgcca gagattcgac gaggccaagg cttccgtggc caaatcgaac 780
caggtttcga ccgaggaccc cgccgtgtac actgaagtcg agttgatcca ggccggtatt 840
gaccgtgagg cattggccgg atccgctggc tggaaagagc ttatcacggg taagcccaag 900
atgttgcagc gtgtgatttt gggaatgatg ctccagtcga tccagcagct taccggtaac 960
aactactttt tctactatgg taccacgatc ttcaaggccg tgggcatgtc ggactcgttc 1020
cagacctcga ttgttttggg tattgtcaac ttcgcctcca cttttgtcgg aatctgggcc 1080
atcgaacgca tgggccgcag atcttgtttg cttgttggtt ccgcgtgcat gagtgtgtgt 1140
ttcttgatct actccatctt gggttccgtc aacctttaca tcgacggcta cgagaacacg 1200
ccttccaaca cgcgtaagcc taccggtaac gccatgattt tcatcacgtg tttgttcatc 1260
ttcttcttcg cctccacctg ggccggtggt gtgtacagta ttgtgtctga aacataccca 1320
ttgagaatcc gctctaaagg tatggccgtg gccaccgctg ccaactggat gtggggtttc 1380
ttgatttcgt tcttcacgcc tttcatcacc tcggccatcc acttctacta cgggtttgtg 1440
ttcacagggt gtcttatttt ctccttcttc tacgtgttct tctttgttag ggaaaccaag 1500
ggtctctcgt tggaagaggt ggatgagtta tatgccactg acctcccacc atggaagacc 1560
gcgggctgga cgcctccttc tgctgaggat atggcccaca ccaccgggtt tgccgaggcc 1620
gcaaagccta cgaacaaaca cgtttaa 1647
<210> 45
<211> 1509
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的GXS1
<400> 45
atgggcattt tcgttggcgt tttcgccgcg cttggcggtg ttctctttgg ctacgatacc 60
ggtaccatct ctggtgtgat ggccatgcct tgggtcaagg aacatttccc aaaagaccgt 120
gttgcattta gtgcttccga gtcgtcgttg attgtgtcta ttttatctgc aggaactttc 180
tttggagcca ttcttgctcc gctcttgacc gatacattgg gtagacgctg gtgtattatc 240
atctcttcgc tcgttgtgtt caatttgggt gctgctttgc agacggctgc cacggatatc 300
ccgctcttga ttgttggtcg tgtcattgcc ggtttagggg ttggtttgat ttcgctgacg 360
attccattgt accagtccga agcgcttccc aaatggatta gaggtgctgt tgtctcgtgc 420
taccaatggg ccattactat tggtatcttt ttggctgccg tgatcaacca gggcactcac 480
aagatcaaca gccctgcgtc gtacagaatt ccattgggta ttcagatggc atggggtctt 540
atcttgggtg tcggcatgtt cttcttgccc gagacgcctc gtttctacat ttccaagggc 600
cagaatgcga aggctgctgt ttcattggcg cgtttgagaa agcttccgca agatcacccg 660
gagttgttgg aggaattgga agatatccag gcggcatacg agtttgagac tgtccatggc 720
aagtcttcat ggctgcaggt tttcaccaac aagaacaaac aattgaagaa gttggccacg 780
ggcgtgtgct tgcaggcgtt ccaacaattg actggtgtga acttcatttt ctactttggc 840
acgactttct tcaacagtgt tgggcttgac ggattcacca cctccttggc caccaacatt 900
gtcaatgttg gctcgacgat ccctggtatt ttgggtgttg agattttcgg cagaagaaaa 960
gtgttgttga ccggcgctgc tggtatgtgt ctttcgcaat tcattgttgc cattgttggt 1020
gtagccaccg actccaaggc tgcgaaccaa gttcttattg ccttctgctg cattttcatt 1080
gcgttctttg cagccacctg gggccccacc gcatgggttg tttgtggcga gattttcccc 1140
ttgagaacca gagccaagtc gattgccatg tgcgctgctt cgaactggtt gttgaactgg 1200
gcaattgcat acgccacgcc atacttggtt gactccgata agggtaactt gggcaccaat 1260
gtgtttttca tttggggaag ctgtaacttc ttctgccttg tgtttgccta cttcatgatt 1320
tacgagacca agggtctttc cttggagcag gttgatgagc tttacgagaa ggttgccagc 1380
gccagaaagt cgcctggctt cgtgccaagc gagcacgctt tcagagagca cgccgatgtg 1440
gagaccgcca tgccagacaa cttcaacttg aaggcggagg cgatttctgt cgaggatgcc 1500
tctgtttaa 1509
<210> 46
<211> 1647
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的HGT12
<400> 46
atgagcatct ttgaaggcaa agacgggaag ggggtatcct ccaccgagtc gctttccaat 60
gacgtcagat atgacaacat ggagaaagtt gatcaggatg ttcttagaca caacttcaac 120
tttgacaaag aattcgagga gctcgaaatc gaggcggcgc aagtcaacga caaaccttct 180
tttgtcgaca ggattttatc cctcgaatac aagcttcatt tcgaaaacaa gaaccacatg 240
gtgtggctct tgggcgcttt cgcagccgcc gcaggcttat tgtctggctt ggatcagtcc 300
attatttctg gtgcatccat tggaatgaac aaagcattga acttgactga acgtgaagcc 360
tcattggtgt cttcgcttat gcctttaggc gccatggcag gctccatgat tatgacacct 420
cttaatgagt ggttcggaag aaaatcatcg ttgattattt cttgtatttg gtataccatc 480
ggatccgctt tgtgcgctgg cgccagagat caccacatga tgtacgctgg cagatttatt 540
cttggtgtcg gtgtgggtat agaaggtggg tgtgtgggca tttacatttc cgagtctgtc 600
ccagccaatg tgcgtggtag tatcgtgtcg atgtaccagt tcaatattgc tttgggtgaa 660
gttctagggt atgctgttgc tgccattttc tacactgttc atggtggatg gaggttcatg 720
gtggggtctt ctttagtatt ctctactata ttgtttgccg gattgttttt cttgcccgag 780
tcacctcgtt ggttggtgca caaaggcaga aacggaatgg catacgatgt gtggaagaga 840
ttgagagaca taaacgatga aagcgcaaag ttggaatttt tggagatgag acaggctgct 900
tatcaagaga gagaaagacg ctcgcaagag tctttgttct ccagctgggg cgaattattc 960
accatcgcta gaaacagaag agcacttact tactctgtca taatgatcac tttgggtcaa 1020
ttgactggtg tcaatgccgt catgtactac atgtcgactt tgatgggtgc aattggtttc 1080
aacgagaaag actctgtgtt catgtccctt gtgggaggcg gttctttgct tataggtacc 1140
attcctgcca ttttgtggat ggaccgtttc ggcagaagag tttggggtta taatcttgtt 1200
ggtttcttcg ttggtttggt gctcgttggt gttggctacc gtttcaatcc cgtcactcaa 1260
aaggcggctt cagaaggtgt gtacttgacg ggtctcattg tctatttctt gttctttggt 1320
tcctactcga ccttaacttg ggtcattcca tccgagtctt ttgatttgag aacaagatct 1380
ttgggtatga caatctgttc cactttcctt tacttgtggt ctttcaccgt cacctacaac 1440
ttcaccaaga tgtccgccgc cttcacatac actgggttga cacttggttt ctacggtggc 1500
attgcgttcc ttggtttgat ttaccaggtc tgcttcatgc ccgagacgaa ggacaagact 1560
ttggaagaaa ttgacgatat cttcaatcgt tctgcgttct ctatcgcgcg cgagaacatc 1620
tccaacttga agaagggtat ttggtaa 1647
<210> 47
<211> 1647
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的HXT5
<400> 47
atgagcatct ttgaaggcaa agacgggaag ggggtatcct ccaccgagtc gctttccaat 60
gacgtcagat atgacaacat ggagaaagtt gatcaggatg ttcttagaca caacttcaac 120
tttgacaaag aattcgagga gctcgaaatc gaggcggcgc aagtcaacga caaaccttct 180
tttgtcgaca ggattttatc cctcgaatac aagcttcatt tcgaaaacaa gaaccacatg 240
gtgtggctct tgggcgcttt cgcagccgcc gcaggcttat tgtctggctt ggatcagtcc 300
attatttctg gtgcatccat tggaatgaac aaagcattga acttgactga acgtgaagcc 360
tcattggtgt cttcgcttat gcctttaggc gccatggcag gctccatgat tatgacacct 420
cttaatgagt ggttcggaag aaaatcatcg ttgattattt cttgtatttg gtataccatc 480
ggatccgctt tgtgcgctgg cgccagagat caccacatga tgtacgctgg cagatttatt 540
cttggtgtcg gtgtgggtat agaaggtggg tgtgtgggca tttacatttc cgagtctgtc 600
ccagccaatg tgcgtggtag tatcgtgtcg atgtaccagt tcaatattgc tttgggtgaa 660
gttctagggt atgctgttgc tgccattttc tacactgttc atggtggatg gaggttcatg 720
gtggggtctt ctttagtatt ctctactata ttgtttgccg gattgttttt cttgcccgag 780
tcacctcgtt ggttggtgca caaaggcaga aacggaatgg catacgatgt gtggaagaga 840
ttgagagaca taaacgatga aagcgcaaag ttggaatttt tggagatgag acaggctgct 900
tatcaagaga gagaaagacg ctcgcaagag tctttgttct ccagctgggg cgaattattc 960
accatcgcta gaaacagaag agcacttact tactctgtca taatgatcac tttgggtcaa 1020
ttgactggtg tcaatgccgt catgtactac atgtcgactt tgatgggtgc aattggtttc 1080
aacgagaaag actctgtgtt catgtccctt gtgggaggcg gttctttgct tataggtacc 1140
attcctgcca ttttgtggat ggaccgtttc ggcagaagag tttggggtta taatcttgtt 1200
ggtttcttcg ttggtttggt gctcgttggt gttggctacc gtttcaatcc cgtcactcaa 1260
aaggcggctt cagaaggtgt gtacttgacg ggtctcattg tctatttctt gttctttggt 1320
tcctactcga ccttaacttg ggtcattcca tccgagtctt ttgatttgag aacaagatct 1380
ttgggtatga caatctgttc cactttcctt tacttgtggt ctttcaccgt cacctacaac 1440
ttcaccaaga tgtccgccgc cttcacatac actgggttga cacttggttt ctacggtggc 1500
attgcgttcc ttggtttgat ttaccaggtc tgcttcatgc ccgagacgaa ggacaagact 1560
ttggaagaaa ttgacgatat cttcaatcgt tctgcgttct ctatcgcgcg cgagaacatc 1620
tccaacttga agaagggtat ttggtaa 1647
<210> 48
<211> 1575
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的HXT2.6
<400> 48
atgctgagca ctaccgatac cctcgaaaaa agggacaccg agcctttcac ttcagatgct 60
cctgtcacag tccatgacta tatcgcagag gagcgtccgt ggtggaaagt gccgcatttg 120
cgtgtattga cttggtctgt tttcgtgatc accctcacct ccaccaacaa cgggtatgat 180
ggcctgatgt tgaatggatt gcaatccttg gacatttggc aggaggattt gggtcaccct 240
gcgggccaga aattgggtgc cttggccaac ggtgttttgt ttggtaacct tgctgctgtg 300
ccttttgctt cgtatttctg cgatcgtttt ggtagaaggc cggtcatttg tttcggacag 360
atcttgacaa ttgttggtgc tgtattacaa ggtttgtcca acagctatgg attttttttg 420
ggttcgagaa ttgtgttggg ttttggtgct atgatagcca ctattccgct gccaacattg 480
atttccgaaa tcgcctaccc tacgcataga gaaacttcca ctttcgccta caacgtgtgc 540
tggtatttgg gagccattat cgcctcctgg gtcacatacg gcaccagaga tttacagagc 600
aaggcttgct ggtcaattcc ttcttatctc caggccgcct tacctttctt tcaagtgtgc 660
atgatttggt ttgtgccaga gtctcccaga ttcctcgttg ccaagggcaa gatcgaccaa 720
gcaagggctg ttttgtctaa ataccataca ggagactcga ctgaccccag agacgttgcg 780
ttggttgact ttgagctcca tgagattgag agtgcattgg agcaggaaaa attgaacact 840
cgctcgtcat actttgactt tttcaagaag agaaacttta gaaagagagg cttcttgtgt 900
gtcatggtcg gtgttgcaat gcagctttct ggaaacggct tagtgtccta ttacttgtcg 960
aaagtgctag actcgattgg aatcactgaa accaagagac agctcgagat caatggctgc 1020
ttgatgatct ataactttgt catctgcgtc tcgttgatga gtgtttgccg tatgttcaaa 1080
agaagagtat tatttctcac gtgtttctca ggaatgacgg tttgctacac gatatggacg 1140
attttgtcag cgcttaatga acagagacac tttgaggata aaggcttggc caatggcgtg 1200
ttggcaatga tcttcttcta ctattttttc tacaacgttg gcatcaatgg attgccattc 1260
ctatacatca ccgagatctt gccttactca cacagagcaa aaggcttgaa tttattccaa 1320
ttctcgcaat ttctcacgca aatctacaat ggctatgtga acccaatcgc catggacgca 1380
atcagctgga agtattacat tgtgtactgc tgtattctct tcgtggagtt ggtgattgtg 1440
tttttcacgt tcccagaaac ttcgggatac actttggagg aggtcgccca ggtatttggt 1500
gatgaggctc ccgggctcca caacagacaa ttggatgttg cgaaagaatc actcgagcat 1560
gttgagcatg tttga 1575
<210> 49
<211> 1692
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的QUP2
<400> 49
atgggctttc gcaacttaaa gcgcaggctc tcaaatgttg gcgactccat gtcagtgcac 60
tctgtgaaag aggaggaaga cttctcccgc gtggaaatcc cggatgaaat ctacaactat 120
aagatcgtcc ttgtggcttt aacagcggcg tcggctgcca tcatcatcgg ctacgatgca 180
ggcttcattg gtggcacggt ttcgttgacg gcgttcaaac tggaatttgg cttggacaaa 240
atgtctgcga cggcggcttc tgctatcgaa gccaacgttg tttccgtgtt ccaggccggc 300
gcctactttg ggtgtctttt cttctatccg attggcgaga tttggggccg taaaatcggt 360
cttcttcttt ccggctttct tttgacgttt ggtgctgcta tttctttgat ttcgaactcg 420
tctcgtggcc ttggtgccat atatgctgga agagtactaa caggtttggg gattggcgga 480
tgtctgagtt tggccccaat ctacgtttct gaaatcgcgc ctgcagcaat cagaggcaag 540
cttgtgggct gctgggaagt gtcatggcag gtgggcggca ttgttggcta ctggatcaat 600
tacggagtct tgcagactct tccgattagc tcacaacaat ggatcatccc gtttgctgta 660
caattgatcc catcggggct tttctggggc ctttgtcttt tgattccaga gctgccacgt 720
tttcttgtat cgaagggaaa gatcgataag gcgcgcaaaa acttagcgta cttgcgtgga 780
cttagcgagg accaccccta ttctgttttt gagttggaga acattagtaa ggccattgaa 840
gagaacttcg agcaaacagg aaggggtttt ttcgacccat tgaaagcttt gtttttcagc 900
aaaaaaatgc tttaccgcct tctcttgtcc acgtcaatgt tcatgatgca gaatggctat 960
ggaatcaatg ctgtgacata ctactcgccc acgatcttca aatccttagg cgttcagggc 1020
tcaaacgccg gtttgctctc aacaggaatt ttcggtcttc ttaaaggtgc cgcttcggtg 1080
ttctgggtct ttttcttggt tgacacattc ggccgccggt tttgtctttg ctacctctct 1140
ctcccctgct cgatctgcat gtggtatatt ggcgcataca tcaagattgc caacccttca 1200
gcgaagcttg ctgcaggaga cacagccacc accccagcag gaactgcagc gaaagcgatg 1260
ctttacatat ggacgatttt ctacggcatt acgtggaatg gtacgacctg ggtgatctgc 1320
gcggagattt tcccccagtc ggtgagaaca gccgcgcagg ccgtcaacgc ttcttctaat 1380
tggttctggg ctttcatgat cggccacttc actggccagg cgctcgagaa tattgggtac 1440
ggatactact tcttgtttgc ggcgtgctct gcaatcttcc ctgtggtagt ctggtttgtg 1500
taccccgaaa caaagggtgt gcctttggag gccgtggagt atttgttcga ggtgcgtcct 1560
tggaaagcgc actcatatgc tttggagaag taccagattg agtacaacga gggtgaattc 1620
caccaacata agcccgaagt actcttacaa gggtctgaaa actcggacac gagcgagaaa 1680
agcctcgcct ga 1692
<210> 50
<211> 1887
<212> DNA
<213> 梅奇酵母（Metschnikowia）
<220>
<223> 来自H0梅奇酵母（Metschnikowia）种的APS1/HGT19
<400> 50
atgtcagaaa agcctgttgt gtcgcacagc atcgacacga cgctgtctac gtcatcgaaa 60
caagtctatg acggtaactc gcttcttaag accctgaatg agcgcgatgg cgaacgcggc 120
aatatcttgt cgcagtacac tgaggaacag gccatgcaaa tgggccgcaa ctatgcgttg 180
aagcacaatt tagatgcgac actctttgga aaggcggccg cggtcgcaag aaacccatac 240
gagttcaatt cgatgagttt tttgaccgaa gaggaaaaag tcgcgcttaa cacggagcag 300
accaagaaat ggcacatccc aagaaagttg gtggaggtga ttgcattggg gtccatggcc 360
gctgcggtgc agggtatgga tgagtcggtg gtgaatggtg caacgctttt ctaccccacg 420
gcaatgggta tcacagatat caagaatgcc gatttgattg aaggtttgat caacggtgcg 480
ccctatcttt gctgcgccat catgtgctgg acatctgatt actggaacag gaagttgggc 540
cgtaagtgga ccattttctg gacatgtgcc atttctgcaa tcacatgtat ctggcaaggt 600
ctcgtcaatt tgaaatggta ccatttgttc attgcgcgtt tctgcttggg tttcggtatc 660
ggtgtcaagt ctgccaccgt gcctgcgtat gctgccgaaa ccaccccggc caaaatcaga 720
ggctcgttgg tcatgctttg gcagttcttc accgctgtcg gaatcatgct tggttacgtg 780
gcgtctttgg cattctatta cattggtgac aatggcattt ctggcggctt gaactggaga 840
ttgatgctag gatctgcatg tcttccagct atcgttgtgt tagtccaagt tccgtttgtt 900
ccagaatccc ctcgttggct catgggtaag gaaagacacg ctgaagcata tgattcgctc 960
cggcaattgc ggttcagtga aatcgaggcg gcccgtgact gtttctacca gtacgtgttg 1020
ttgaaagagg agggctctta tggaacgcag ccattcttca gcagaatcaa ggagatgttc 1080
accgtgagaa gaaacagaaa tggtgcattg ggcgcgtgga tcgtcatgtt catgcagcag 1140
ttctgtggaa tcaacgtcat tgcttactac tcgtcgtcga tcttcgtgga gtcgaatctt 1200
tctgagatca aggccatgtt ggcgtcttgg gggttcggta tgatcaattt cttgtttgca 1260
attccagcgt tctacaccat tgacacgttt ggccgacgca acttgttgct cactactttc 1320
cctcttatgg cggtattctt actcatggcc ggattcgggt tctggatccc gttcgagaca 1380
aacccacacg gccgtttggc ggtgatcact attggtatct atttgtttgc atgtgtctac 1440
tctgcgggcg agggaccagt tcccttcaca tactctgccg aagcattccc gttgtatatc 1500
cgtgacttgg gtatgggctt tgccacggcc acgtgttggt tcttcaactt cattttggca 1560
ttttcctggc ctagaatgaa gaatgcattc aagcctcaag gtgcctttgg ctggtatgcc 1620
gcctggaaca ttgttggctt cttcttagtg ttatggttct tgcccgagac aaagggcttg 1680
acgttggagg aattggacga agtgtttgat gtgcctttga gaaaacacgc gcactaccgt 1740
accaaagaat tagtatacaa cttgcgcaaa tacttcttga ggcagaaccc taagccattg 1800
ccgccacttt atgcacacca aagaatggct gttaccaacc cagaatggtt ggaaaagacc 1860
gaggtcacgc acgaggagaa tatctag 1887
<210> 51
<211> 1620
<212> DNA
<213> 季也蒙毕赤酵母（Pichia gulliermondii）
<220>
<223> 来自季也蒙毕赤酵母（Pichia gulliermondii）的示例性木糖转运蛋白; AXT1
<400> 51
atggcttacg aggacaaact agtggctccg gccttgaagt ttagaaactt tcttgacaaa 60
actcccaata tctacaatcc atatatcatt tctataatct cgtgcattgc gggtatgatg 120
ttcggttttg atatttcttc aatgtcagcg tttgtcagtt taccagcata cgtgaattat 180
ttcgatacac cttcagcagt gattcaagga tttatcacat ctgccatggc tttgggttca 240
tttttcgggt caattgcttc tgcgtttgtg tctgagccat ttggaagacg agcttcctta 300
ctaacttgtt cgtggttttg gatgatagga gcagccatcc aagcgtcttc gcagaaccga 360
gctcaattga ttattggtcg gattatatct ggatttgggg ttggtttcgg gtcgtctgtg 420
gctcccgtat atggctccga gatggcacct agaaaaatta gaggaagaat tggtggaatt 480
tttcaattat ctgtcaccct cggtatcatg attatgttct tcataagtta cggaacttct 540
catattaaga ctgcggcagc tttcaggtta gcctgggcac tccagatcat tcctggactc 600
ctcatgtgta ttggtgtctt ctttattcca gaatctccta gatggttggc caaacaaggt 660
cactgggacg aagccgaaat cattgtagcc aaaattcaag ccaaaggaga tcgagaaaat 720
cccgatgttt tgattgaaat ttcggaaata aaagaccaat tgatggttga cgagaatgcc 780
aaagccttta cctatgctga cttgttttcg aaaaaatatc ttcccagaac catcacagcc 840
atgttcgctc aaatctggca acaattgaca ggaatgaatg tcatgatgta ctatatcgtt 900
tacattttcg aaatggctgg ctacggtgga aatggagtgt tggtatcatc gacaattcag 960
tacgttatct ttgtcgttgt tacatttgtc tcattattct ttttggacaa atttggaaga 1020
agaaaaattt tacttgtcgg agcagcttcc atgatgacct ggcagtttgc agtggcaggg 1080
atcttggcca ggtactcggt cccgtacgat ctcagcgata ctgtcaaaat taaaattcct 1140
gacaatcaca aatcggctgc aaaaggtgtc attgcatgct gctatctttt cgtagcatcg 1200
ttcggatttt cctggggagt tggtatctgg ttatactgct ctgaagtctg gggagactca 1260
caatcgagac agagaggagc cgctgtgtca actgcttcaa attggatttt caattttgcg 1320
ctcgccatgt tcacaccatc ttcgtttaaa aatatcacct ggaagacata ctgtatttat 1380
gccactttct gcgcatgtat gttcatccat gtgttcttct tcttcccaga aaccaagggg 1440
aagcgcttgg aagaaattgc tcaaatttgg gaagaaaaaa ttccagcttg gaaaaccacc 1500
aactggcaac ctcatgttcc tttgttgtcg gaccacgaac ttgcggaaaa gatcaatgcc 1560
gaacatgtgg agaacgtgaa ttctagggaa caatcggatg acgagaagtc gcaggtataa 1620
<210> 52
<211> 1644
<212> DNA
<213> 中间假丝酵母（Candida intermedia）
<220>
<223> 来自中间假丝酵母（Candida intermedia）PYCC 4715的示例性木糖转运蛋白;GXF1
<400> 52
atgtcacaag attcgcattc ttctggtgcc gctacaccag tcaatggttc catccttgaa 60
aaggaaaaag aagactctcc agttcttcaa gttgatgccc cacaaaaggg tttcaaggac 120
tacattgtca tttctatctt ctgttttatg gttgccttcg gtggtttcgt cttcggtttc 180
gacactggta ccatttccgg tttcgtgaac atgtctgact ttaaagacag attcggtcaa 240
caccacgctg atggtactcc ttacttgtcc gacgttagag ttggtttgat gatttctatt 300
ttcaacgttg gttgcgctgt cggtggtatt ttcctctgca aggtcgctga tgtctggggt 360
agaagaattg gtcttatgtt ctccatggct gtctacgttg ttggtattat tattcagatc 420
tcttcatcca ccaagtggta ccagttcttc attggtcgtc ttattgctgg tttggctgtt 480
ggtaccgttt ctgtcgtttc cccacttttc atctctgagg tttctccaaa gcaaattaga 540
ggtactttag tgtgctgctt ccagttgtgt atcaccttgg gtatcttctt gggttactgt 600
actacttacg gtactaagac ctacactgac tctagacagt ggagaattcc tttgggtttg 660
tgtttcgctt gggctatctt gttggttgtc ggtatgttga acatgccaga gtctccaaga 720
tacttggttg agaagcacag aattgatgag gccaagagat ccattgccag atccaacaag 780
atccctgagg aggacccatt cgtctacact gaggttcagc ttattcaggc cggtattgag 840
agagaagctt tggctggtca ggcatcttgg aaggagttga tcactggtaa gccaaagatc 900
ttcagaagag ttatcatggg tattatgctt cagtccttgc aacagttgac cggtgacaac 960
tacttcttct actacggtac taccattttc caggctgtcg gtttgaagga ttctttccag 1020
acttctatca ttttgggtat tgtcaacttt gcttccacct tcgttggtat ctatgtcatt 1080
gagagattgg gtagaagatt gtgtcttttg accggttccg ctgctatgtt catctgtttc 1140
atcatctact ctttgattgg tactcagcac ttgtacaagc aaggttactc caacgagacc 1200
tccaacactt acaaggcttc tggtaacgct atgatcttca tcacttgtct ttacattttc 1260
ttctttgctt ctacctgggc tggtggtgtt tactgtatca tttccgagtc ctacccattg 1320
agaattagat ccaaggccat gtctattgct accgctgcta actggttgtg gggtttcttg 1380
atttccttct tcactccatt catcaccagt gccatccact tctactacgg tttcgttttc 1440
actggttgtt tggctttctc tttcttctac gtctacttct tcgtctacga aaccaagggt 1500
ctttctttgg aggaggttga tgagatgtac gcttccggtg ttcttccact caagtctgcc 1560
agctgggttc caccaaatct tgagcacatg gctcactctg ccggttacgc tggtgctgac 1620
aaggccaccg acgaacaggt ttaa 1644
<210> 53
<211> 1644
<212> DNA
<213> 中间假丝酵母（Candida intermedia）
<220>
<223> 来自中间假丝酵母（Candida intermedia）的示例性葡萄糖/木糖同向转运蛋白; GXS1
<400> 53
atgtcacaag attcgcattc ttctggtgcc gctacaccag tcaatggttc catccttgaa 60
aaggaaaaag aagactctcc agttcttcaa gttgatgccc cacaaaaggg tttcaaggac 120
tacattgtca tttctatctt ctgttttatg gttgccttcg gtggtttcgt cttcggtttc 180
gacactggta ccatttccgg tttcgtgaac atgtctgact ttaaagacag attcggtcaa 240
caccacgctg atggtactcc ttacttgtcc gacgttagag ttggtttgat gatttctatt 300
ttcaacgttg gttgcgctgt cggtggtatt ttcctctgca aggtcgctga tgtctggggt 360
agaagaattg gtcttatgtt ctccatggct gtctacgttg ttggtattat tattcagatc 420
tcttcatcca ccaagtggta ccagttcttc attggtcgtc ttattgctgg tttggctgtt 480
ggtaccgttt ctgtcgtttc cccacttttc atctctgagg tttctccaaa gcaaattaga 540
ggtactttag tgtgctgctt ccagttgtgt atcaccttgg gtatcttctt gggttactgt 600
actacttacg gtactaagac ctacactgac tctagacagt ggagaattcc tttgggtttg 660
tgtttcgctt gggctatctt gttggttgtc ggtatgttga acatgccaga gtctccaaga 720
tacttggttg agaagcacag aattgatgag gccaagagat ccattgccag atccaacaag 780
atccctgagg aggacccatt cgtctacact gaggttcagc ttattcaggc cggtattgag 840
agagaagctt tggctggtca ggcatcttgg aaggagttga tcactggtaa gccaaagatc 900
ttcagaagag ttatcatggg tattatgctt cagtccttgc aacagttgac cggtgacaac 960
tacttcttct actacggtac taccattttc caggctgtcg gtttgaagga ttctttccag 1020
acttctatca ttttgggtat tgtcaacttt gcttccacct tcgttggtat ctatgtcatt 1080
gagagattgg gtagaagatt gtgtcttttg accggttccg ctgctatgtt catctgtttc 1140
atcatctact ctttgattgg tactcagcac ttgtacaagc aaggttactc caacgagacc 1200
tccaacactt acaaggcttc tggtaacgct atgatcttca tcacttgtct ttacattttc 1260
ttctttgctt ctacctgggc tggtggtgtt tactgtatca tttccgagtc ctacccattg 1320
agaattagat ccaaggccat gtctattgct accgctgcta actggttgtg gggtttcttg 1380
atttccttct tcactccatt catcaccagt gccatccact tctactacgg tttcgttttc 1440
actggttgtt tggctttctc tttcttctac gtctacttct tcgtctacga aaccaagggt 1500
ctttctttgg aggaggttga tgagatgtac gcttccggtg ttcttccact caagtctgcc 1560
agctgggttc caccaaatct tgagcacatg gctcactctg ccggttacgc tggtgctgac 1620
aaggccaccg acgaacaggt ttaa 1644
<210> 54
<211> 1725
<212> DNA
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
<220>
<223> 来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的示例性木糖转运蛋白; GAL2/GXF2
<400> 54
atggcagttg aggagaacaa tatgcctgtt gtttcacagc aaccccaagc tggtgaagac 60
gtgatctctt cactcagtaa agattcccat ttaagcgcac aatctcaaaa gtattctaat 120
gatgaattga aagccggtga gtcagggtct gaaggctccc aaagtgttcc tatagagata 180
cccaagaagc ccatgtctga atatgttacc gtttccttgc tttgtttgtg tgttgccttc 240
ggcggcttca tgtttggctg ggataccggt actatttctg ggtttgttgt ccaaacagac 300
tttttgagaa ggtttggtat gaaacataag gatggtaccc actatttgtc aaacgtcaga 360
acaggtttaa tcgtcgccat tttcaatatt ggctgtgcct ttggtggtat tatactttcc 420
aaaggtggag atatgtatgg ccgtaaaaag ggtctttcga ttgtcgtctc ggtttatata 480
gttggtatta tcattcaaat tgcctctatc aacaagtggt accaatattt cattggtaga 540
atcatatctg gtttgggtgt cggcggcatc gccgtcttat gtcctatgtt gatctctgaa 600
attgctccaa agcacttgag aggcacacta gtttcttgtt atcagctgat gattactgca 660
ggtatctttt tgggctactg tactaattac ggtacaaaga gctattcgaa ctcagttcaa 720
tggagagttc cattagggct atgtttcgct tggtcattat ttatgattgg cgctttgacg 780
ttagttcctg aatccccacg ttatttatgt gaggtgaata aggtagaaga cgccaagcgt 840
tccattgcta agtctaacaa ggtgtcacca gaggatcctg ccgtccaggc agagttagat 900
ctgatcatgg ccggtataga agctgaaaaa ctggctggca atgcgtcctg gggggaatta 960
ttttccacca agaccaaagt atttcaacgt ttgttgatgg gtgtgtttgt tcaaatgttc 1020
caacaattaa ccggtaacaa ttattttttc tactacggta ccgttatttt caagtcagtt 1080
ggcctggatg attcctttga aacatccatt gtcattggtg tagtcaactt tgcctccact 1140
ttctttagtt tgtggactgt cgaaaacttg ggacatcgta aatgtttact tttgggcgct 1200
gccactatga tggcttgtat ggtcatctac gcctctgttg gtgttactag attatatcct 1260
cacggtaaaa gccagccatc ttctaaaggt gccggtaact gtatgattgt ctttacctgt 1320
ttttatattt tctgttatgc cacaacctgg gcgccagttg cctgggtcat cacagcagaa 1380
tcattcccac tgagagtcaa gtcgaaatgt atggcgttgg cctctgcttc caattgggta 1440
tgggggttct tgattgcatt tttcacccca ttcatcacat ctgccattaa cttctactac 1500
ggttatgtct tcatgggctg tttggttgcc atgttttttt atgtcttttt ctttgttcca 1560
gaaactaaag gcctatcgtt agaagaaatt caagaattat gggaagaagg tgttttacct 1620
tggaaatctg aaggctggat tccttcatcc agaagaggta ataattacga tttagaggat 1680
ttacaacatg acgacaaacc gtggtacaag gccatgctag aataa 1725
<210> 55
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列：MeNAT
<400> 55
atgggtacca ccttggacga caccgcctac agatacagaa cctccgtccc aggtgacgcc 60
gaggccatcg aggccttgga cggttccttc accaccgaca ccgtcttcag agtcaccgcc 120
accggtgacg gtttcacctt gagagaggtc ccagtggacc caccattgac caaggtcttc 180
ccagacgacg agtccgacga cgagtccgac gacggtgagg acggtgaccc agactccaga 240
accttcgtcg cctacggtga cgacggtgac ttggccggtt tcgtggtcgt ctcctactcc 300
ggttggaaca gaagattgac cgtcgaggac atcgaggtcg ccccagagca cagaggtcac 360
ggtgtcggta gagccttgat gggtttggcc accgagttcg ccagagagag aggtgccggt 420
cacttgtggt tggaggtcac caacgtcaac gccccagcca tccacgccta cagaagaatg 480
ggtttcacct tgtgcggttt ggacactgcc ttgtacgacg gcaccgcctc tgacggtgag 540
caggctttgt acatgtccat gccatgtcca taa 573
<210> 56
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： MeHPH
<400> 56
atgggtacca agaagcctga gttgaccact acttctgttg agaagttctt gatcgaaaag 60
ttcgactctg tttctgactt gatgcagttg tccgagggtg aggagtccag agctttctcc 120
ttcgacgttg gtggtagagg ttacgtcttg agagtcaact cctgtgccga cggtttctac 180
aaggacagat acgtctacag acacttcgcc tccgctgctt tgccaatccc agaggtcttg 240
gacatcggtg agttctctga gtctttgacc tactgtatct ccagaagagc ccagggtgtc 300
accttgcagg acttgccaga gaccgagttg ccagccgtct tgcagccagt cgctgaggct 360
atggacgcta tcgctgctgc cgacttgtct cagacttctg gtttcggtca attcggtcca 420
cagggtatcg gtcagtacac cacttggaga gacttcatct gtgccatcgc cgacccacac 480
gtctaccact ggcagaccgt tatggacgac accgtttctg cctctgttgc ccaggctttg 540
gacgagttga tgttgtgggc tgaggactgt ccagaggtta gacacttggt tcacgctgac 600
ttcggttcca acaacgtctt gaccgacaac ggtagaatca ccgctgtcat cgactggtct 660
gaggctatgt tcggtgactc ccagtacgag gtcgccaaca tcttcttctg gagaccttgg 720
ttggcctgta tggagcagca gaccagatac ttcgagagaa gacacccaga gttggctggt 780
tctccaagat tgagagctta catgttgaga atcggtttgg accagttgta ccagtccttg 840
gttgacggta acttcgacga cgctgcctgg gctcagggta gatgtgacgc tatcgtcaga 900
tctggtgctg gcaccgttgg tagaacccag atcgctagaa gatccgctgc tgtctggacc 960
gacggttgtg tcgaggtttt ggctgactct ggtaacagaa gaccatccac cagaccaaga 1020
gccaaggagt aa 1032
<210> 57
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： MeKAN
<400> 57
atgggtacca aggaaaagac tcacgtttcg agaccaagat tgaactccaa catggatgct 60
gatttgtacg gttacaaatg ggctagagat aacgtcggtc aatctggtgc gactatctac 120
agactttacg gcaagcccga tgcgccagag ttgttcttga agcatggcaa aggttccgtt 180
gccaacgacg ttaccgatga gatggtcaga cttaactggt tgacggaatt tatgcctctt 240
cctaccatca agcacttcat ccgtactcct gatgacgcct ggttgctcac cactgcgatc 300
ccaggcaaaa ccgctttcca ggtcttggag gaataccctg attctggtga gaacattgtt 360
gacgcgttgg ccgtgttctt gcgtagattg cactcgattc ctgtttgtaa ctgtcctttc 420
aactccgacc gtgtgttcag actcgctcag gcccaatcca gaatgaacaa cggtttggtt 480
gacgcgtctg actttgatga cgagcgtaac ggctggcctg ttgagcaggt ctggaaagag 540
atgcacaagc tcttgccatt ctctccagat tccgtcgtta ctcacggtga tttctctctt 600
gacaacctta ttttcgacga gggtaagttg atcggttgta ttgatgttgg tagagtcggt 660
atcgctgaca gataccagga tcttgccatc ctctggaact gcctcggtga gttctctcct 720
tccttgcaga agagactttt ccagaagtac ggtattgata accctgatat gaacaagttg 780
cagttccact tgatgctcga cgagttcttt tga 813
<210> 58
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列：MeBLE
<400> 58
atgggtaccg ccgaccaagc gacgcccaac ttgccatcca gagatttcga ttccacggct 60
gccttctacg aaagattggg cttcggtatc gttttcagag acgccggttg gatgatcctc 120
cagagaggtg atctcaagtt ggagttcttc gcccacccag gtctcgatcc actcgcttcc 180
tggttcagct gctgtttgag attggacgac ctcgcggagt tctacagaca gtgcaaatcc 240
gtcggcatcc aggaaaccag cagcggttac ccaagaatcc acgctccaga gttgcaggag 300
tggggtggca cgatggccgc tttggttgac ccagacggta cgctcttgcg tttgatccag 360
aacgagttgc ttgctggcat ctcctga 387
<210> 59
<211> 1025
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： XYL2up
<400> 59
accggatgca cacgaaagga gtatgtgcca gcgaagcaac aacgccaagt gtcacggatg 60
acgagtatga cgatgaaaca gacgtggaga actgtaatgg aggggaacct gaatcaagag 120
tgagacaata cagaacatgt gcagatgata ttttaagtgt tcagagcctt gactaaagca 180
gttgattcaa gacgtatagt acctttgaag tacctatata aaagtaataa gaggtactcg 240
gcacacgttg accaatctta tgttttggca tgactacgat gtaccgtaga gtgttcaatt 300
tgatgtttag atcaatctat tagcgactgc ggaaagtaag ggagagccct aagaactgaa 360
tccccgcatt gccggcgtcg accgcagtga aaccaacgta agtctattat gtcgaatgtg 420
aacaacgagc caagtgcata gattgggtct ccccgcgacg cacaagcgga gactccggag 480
agtcacacat gtggctgaga cggcaaaaag tgggctgatt caagagcaac gcattccaaa 540
acatcagatt ttcacaagct ttgaataaat ttttattcgc ctgacaatta cgagcgtact 600
gcggcgatgt aagtgaatcg gatgcccccc atttgtttca tgcgcagccg caatataata 660
aaaaaaaagg ggccgatcta tgacgtaatg gctatttcag cgcttttatt cgagatctga 720
agctcgtcac ttgctgaagt tcgtaatata ttctaacaca aataaattcc gacgtggcgc 780
atgaaactga gtttatgagg gtcaagcagg ataagaattt acgaaaggct taacgcgtgc 840
gttatgaact gaataacctt cgtgtcaaca acaaactggg gtttccccgc gctgagtttt 900
cccgagaatc attgctgcgc gaagactccg acactctgca gtatgcgtgg gatgctataa 960
attatggacg acgacgtatt ccactttttt tccttttctt taatcagccg acaccatatc 1020
cgaaa 1025
<210> 60
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： XYL2N
<400> 60
atgcctgcta acccatcctt ggttttgaac aaagtgaacg acatcacgtt cgagaactac 60
gaggttccgt tactcacaga ccccaacgat gtattggttc aggtgaaaaa gactggaatc 120
tgtggatctg acatccacta ctacacccac ggcagaattg gcgacttcgt gttgacaaag 180
ccaatggttt tgggccacga 200
<210> 61
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： XYL2 C
<400> 61
agtggccact acaacttgtg cccacacatg tgttttgccg ccacgcccaa ctctaacccc 60
gacgagccaa acccgccagg gactttgtgc aaatattaca agtccccagc ggacttcttg 120
gtgaaattgc ctgagcacgt ctcccttgag ttgggcgcta tggtcgagcc tttgactgtc 180
ggtgtgcacg cctcgcgttt gggccgtgtc acttttggtg accacgttgt ggttttcggt 240
gctggcccag tcggtatcct tgcggctgcc gtggccagaa agtttggcgc tgccagcgtg 300
actatcgtcg acatcttcga cagcaaattg gaattggcca agtccattgg cgcggccact 360
cacacattca actcaatgac tgagggtgtt ctttcggagg ctttgcccgc gggcgtgaga 420
cctgacgttg tattggagtg cactggagca gagatctgtg tgcagcaagg tgtacttgcg 480
ttgaaggctg gtggccgcca cgtgcaagtt ggaaatgccg gctcctatct caaattcccc 540
atcaccgaat ttgttaccaa ggagttgact ctctttggat ccttccgtta cggttacaac 600
gactacaaga cgtcggtcgc catcttggac gagaattaca agaacgggaa ggagaatgcg 660
ttggtggact ttgaagcctt gattactcac cgtttcccct tcaagaatgc cattgaggct 720
tacgacgcgg tgcgcgctgg cgacggagct gtcaagtgta tcattgacgg cccagagtaa 780
<210> 62
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： XYL2C-prime
<400> 62
ccttccgtta cggttacaac gactacaaga cgtcggtcgc catcttggac gagaattaca 60
agaacgggaa ggagaatgcg ttggtggact ttgaagcctt gattactcac cgtttcccct 120
tcaagaatgc cattgaggct tacgacgcgg tgcgcgctgg cgacggagct gtcaagtgta 180
tcattgacgg cccagagtaa 200
<210> 63
<211> 553
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： XYL2 d
<400> 63
cgatgaaata aaaagataat acttgctctt actccattta tagactaatg tacgctgctt 60
cacgatagtt ttcctcacga tagtttattt aggctcgtcg agtctcgccg tctcgcatgc 120
tcatgagatc gttggcgagc tctctttctt gtctgctccg gccattcatg gtggaggcta 180
ttgaattttc aaactttgac agtgatgagt gcctaccgaa ggttgcatat tggtaaggca 240
catcgtgcgt gtatgagctt gccggatact gcatgagaaa tgatgctggg accgcagaat 300
tcagcaagtt tgccagcgat gtgcttgtca gtttcgcctc catcacgtca ttcgtagtgg 360
acgcaatagc gcttgaagac tgcgttggcc gaaccagtct gcttccatca gcgtgaatct 420
tgttcagcat acccgacaac atcttcgtct tgtatttgat gtacttcaaa attctgagat 480
acttcaagtc ctcgtctaga ttctcgtcat cccaatcgat atcggtactc tctgcatctt 540
cgacatcgga ctc 553
<210> 64
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： XYL1
<400> 64
atgccccaag tggggtttgg gtgctggaaa gtaactaaca gtacatgtgc tgatacgatc 60
tacaacgcga tcaaagttgg ctacagatta tttgatggcg ctgaagatta cgggaacgag 120
aaagaggtgg gcgaaggaat caacagggcc attgacgaag gcttggtggc acgtgacgag 180
ttgttcgtgg tgtccaagct ctggaacaac ttccatcatc cagacaacgt cgagaaggcg 240
ttggacaaga ctttgggcga cttgaatgtc gagtacttgg acttgttctt gatccatttc 300
ccaattgcgt tcaaattcgt gccctttgag gagaaatacc cgcccggctt ctactgtgga 360
gaaggcgata agtttatcta cgaggatgtg cctttgcttg acacgtggcg ggcattggag 420
aagtttgtga agaagggtaa gatcagatcc atcggaatct cgaacttttc cggcgcgttg 480
atccaggact tgctcagggg cgccgagatc ccccctgccg tgttgcagat tgagcaccac 540
ccatacttgc agcagcccag attgattgag tatgtgcagt ccaagggtat tgccatcaca 600
gcctactcct cttttggccc acagtcgttt gtggagttgg accaccccaa ggtcaaggag 660
tgtgtcacgc ttttcgagca cgaagacatt gtttccatcg ctaaagctca cgacaagtcc 720
gcgggccagg tattattgag gtgggccacg caaaggggtc ttgccgtgat tccaaagtca 780
aacaaaaccg agcgtttgtt gctgaatttg aatgtgaacg attttgatct ctctgaagca 840
gaattggagc aaatcgcaaa gttggacgtg ggcttgcgct tcaacaaccc ttgggactgg 900
gacaagattc caatcttcca ctaa 924
<210> 65
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： ADH1 启动子
<400> 65
ttgtcttgta aagagtcttc ggtcattttt acgccgaatc ggcctctggt gtacaggtgt 60
aatgtaagca gaaagatgta gataatacat agcgtcaacg gttctatcga gtcaggattg 120
actgcggggc caaatgtggg gtatcacgtg tcgatggaaa ctgtcaacaa aagatgaatt 180
tttttttgat cgtcaacgct gctctaagcg tgaatcaagg atatgcgctt atggggacgt 240
gcgatccgcg ccgcattcac ccgaagaacg tgctctcgat cgatcacccg gcgccgcgca 300
cggcccaatc gagaaagagg gacctcggag ataagcaccc cctttctcga agtatgtaca 360
tattatttac agcgaaatca caaaggccaa gtctactctc tatcacaatg attatttgca 420
cgctagaagt ttgccgcccc tctttcctca ttcaaagctg tttcagaaat gcactcgtaa 480
gcgcatgttc gtatcggcat cgcaggctca aatgcccagg agccgcccgc gcagccccat 540
aaacccattt caggcatatg cgcctagtgg cccgcagcgt gcgcgagcac cgaacatcac 600
cccacagcaa tgtataaaac ccgaacaata taaaagcgat ccacatcgct cggtaatgcg 660
tccgttcttt cgttcatcag tatcacttgc attcacttca cgaatccgag ctacaaacat 720
catcgcaatc agaaa 735
<210> 66
<211> 859
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： PGK1 启动子
<400> 66
atgttctggg tgtttctggt ttggagactg gctcagagat aaagcaaccg ggtgaataga 60
gatacagttt atttgaggcg gaaagagatc atcaggcata caaaatgcgt ttcgagaata 120
aagttttgtt ggaatgcctt tatgcgtgat gttgatgtgg ggatctgtaa agcaacttga 180
cctgcaattg cattgcatgg gcccggtcgt gctcatttgt tggtatgcgc ttatccgggc 240
aaccacgttg ttgaaaagcg cggatgggcc ggagtactca cagcaagggc aatcgaccac 300
atttattctt agcgcccata gttcaggcgt ccggagtcat cagcggatgg tatctgttga 360
aaataaagtc tcctagagtt tttaatgtaa ttacttgcgt tttcgatttt tgtagaaagt 420
tttggagttt gtgggactga actcaggccc aatgcgattt ccgaatctgg agaaacgtag 480
tcgatatgcg attaggggta acaaaaagat ttcatagtca cacaaagatc aattcgacag 540
tattttgcag tgattgcatt gaaggccata atatcattgc aaatagtgtc tatttgggcc 600
cattggtgaa ttctgtctgt gttgagtcat tcaagacaca gcaatcaatt cgattgcagt 660
ctcgcaggtg gtgtggttgt ggtgcgactt gaaaaacccg gaggatggta atccgccgag 720
aatgaactcc gagcgaaaac ccgtcagaca tatataaacc ctcacagtgc gcactactcg 780
cctggaaaaa ttagaattcg tttctatcaa ttcatctcca tttgatatca attgattcgc 840
atactaaaat ctataacta 859
<210> 67
<211> 283
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的抗生素基因序列： PGK1 终止子
<400> 67
gtagttcgat aagtttgaca cttaccgatt gaatacacat tttaatctat gactttcatg 60
tttattatgt atattgaggt ccaaagcgtg taaaagggcg gagacatgtt cacaacttag 120
cggctccact catgattttg gtccacgact cttcagtcaa ttcttcatac ctgttcttgt 180
tcaaccagta gatcaactct ttgccgtcat cgccctttgg taacttttga ttcttgaact 240
gattttttgg caccttgtga ttgtgagatg cttgtatgta ttg 283

Claims (31)

1.分离的梅奇酵母(Metschnikowia)种，其包括：(a)至少一种编码木糖还原酶或者导致所述分离的梅奇酵母种的木糖还原酶过表达的外源核酸；和(b)使所述分离的梅奇酵母种的木糖醇脱氢酶的活性减弱或失活的遗传修饰。
2.根据权利要求1所述的分离的梅奇酵母种，其中当培养时，所述分离的梅奇酵母种从木糖产生至少0.50g/L/h、至少0.60g/L/h、至少0.70g/L/h、至少0.80g/L/h、至少0.90g/L/h、至少1.00g/L/h、至少1.50g/L/h、至少2.00g/L/h、至少2.50g/L/h、至少3.00g/L/h、至少3.50g/L/h、至少4.00g/L/h、至少5.00g/L/h、至少6.00g/L/h、至少7.00g/L/h、至少8.00g/L/h、至少9.00g/L/h或至少10.00g/L/h的木糖醇。
3.根据权利要求1所述的分离的梅奇酵母种，其中当培养时，所述分离的梅奇酵母种从木糖产生至少75g/L，至少80g/L，至少85g/L，至少90g/L，至少95g/L，至少100g/L，至少110g/L，至少120g/L，至少130g/L，至少140g/L，至少150g/L，至少160g/L，至少170g/L，至少180g/L，至少190g/L，至少200g/L，至少250g/L，至少300g/L的木糖醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述分离的梅奇酵母种选自：美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、核果梅奇酵母(Metschnikowiafructicola)、金佩梅奇酵母(Metschnikowia chrysoperlae)、瑞氏梅奇酵母(Metschnikowia reukaufii)、Metschnikowia andauensis、山西梅奇酵母(Metschnikowiashanxiensis)、中国梅奇酵母(Metschnikowia sinensis)、Metschnikowia zizyphicola、二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)、Metschnikowia lunata、佐贝尔梅奇酵母(Metschnikowia zobellii)、澳洲梅奇酵母(Metschnikowia australis)、Metschnikowiaagaveae、Metschnikowia gruessii、夏威夷梅奇酵母(Metschnikowia hawaiiensis)、克里斯梅奇酵母(Metschnikowia krissii)、梅奇酵母种NS-O-85株和梅奇酵母种NS-O-89株。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述分离的梅奇酵母种是于2016年11月8日，根据布达佩斯条约的条款，在作为国际保藏中心的加拿大国际保藏中心以指定登记号No.081116-01保藏的梅奇酵母种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述至少一种编码木糖还原酶的外源核酸是异源核酸。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述木糖还原酶包含选自SEQ ID NO：11-18的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述木糖还原酶包含SEQID NO：11所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：11具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述遗传修饰包括编码所述分离的梅奇酵母种的木糖醇脱氢酶或其部分的至少一个等位基因的缺失。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述遗传修饰包括编码所述分离的梅奇酵母种的木糖醇脱氢酶或其部分的两个等位基因的缺失。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的梅奇酵母种，其中所述分离的梅奇酵母种还包括至少一个编码木糖转运蛋白或者导致所述分离的梅奇酵母种的木糖转运蛋白过表达的外源核酸。
12.根据权利要求11所述的分离的梅奇酵母种，其中所述木糖转运蛋白包括选自SEQID NO：27-40的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的分离的梅奇酵母种，其中所述木糖转运蛋白包括SEQ IDNO：27-36中任一项所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：27-36中任一项具有至少30％的序列同一性的氨基酸序列。
14.用于生产木糖醇的方法，其包括将根据权利要求1-13中任一项所述的分离的梅奇酵母种在一定条件下培养足够的一段时间以从木糖产生木糖醇。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述条件包括在包含木糖和C3碳源、C4碳源、C5碳源、C6碳源或它们的组合的培养基中培养所述分离的梅奇酵母种。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述条件包括在包含木糖和选自纤维二糖、半乳糖、葡萄糖、乙醇、乙酸酯、阿糖醇、山梨糖醇和甘油或它们的组合的共基质的培养基中培养所述分离的梅奇酵母种。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述共基质为葡萄糖。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养基包含木糖和纤维二糖的组合。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养基包含木糖和半乳糖的组合。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述培养基包含木糖和甘油的组合。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中所述培养包括好氧培养条件。
22.根据权利要求14-21中任一项所述的方法，其中所述培养包括分批培养、补料-分批培养或连续培养。
23.根据权利要求14-22中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将木糖醇与培养物中的其它组分分离。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述分离包括提取、连续液-液萃取、渗透气化、膜滤法、膜分离、反渗透、电渗析、蒸馏、结晶、离心、提取过滤、离子交换色谱、吸附色谱或超滤。
25.通过根据权利要求14-24中任一项所述的方法所生产的生物衍生木糖醇。
26.组合物，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的分离的梅奇酵母种或者根据权利要求25所述的生物衍生木糖醇。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物是包含木糖的培养基。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物是从中已除去根据权利要求1至13中任一项所述的分离的梅奇酵母种的培养基。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的组合物，其包含作为来自根据权利要求14-24中任一项所述的方法的杂质的甘油、阿糖醇、C7糖醇或它们的组合。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述C7糖醇是庚七醇或其异构体。
31.根据权利要求29所述的组合物，其中所述甘油或阿糖醇或两者的量比通过根据权利要求1-13中任一项所述的分离的梅奇酵母种以外的微生物所产生的相应的甘油或阿糖醇或两者的量大至少10％、20％、30％或40％。
CN201780087068.XA 2016-12-21 2017-12-20 产生木糖醇的梅奇酵母种 Pending CN110382684A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662437606P 2016-12-21 2016-12-21
US62/437,606 2016-12-21
PCT/CA2017/051562 WO2018112639A1 (en) 2016-12-21 2017-12-20 Xylitol producing metschnikowia species

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110382684A true CN110382684A (zh) 2019-10-25

Family

ID=62556824

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780087068.XA Pending CN110382684A (zh) 2016-12-21 2017-12-20 产生木糖醇的梅奇酵母种

Country Status (9)

Country Link
US (3) US10435721B2 (zh)
EP (1) EP3559207A4 (zh)
JP (2) JP2020501595A (zh)
CN (1) CN110382684A (zh)
AU (1) AU2017383557A1 (zh)
BR (1) BR112019013005A2 (zh)
CA (1) CA3047841A1 (zh)
MX (2) MX2019007406A (zh)
WO (1) WO2018112639A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501039A (zh) * 2020-11-11 2021-03-16 大连海洋大学 二尖梅奇酵母菌及处理高盐废水的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018112636A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Creatus Biosciences Inc. Method and organism expressing metschnikowia xylose transporters for increased xylose uptake
US20180195093A1 (en) * 2016-12-21 2018-07-12 Creatus Biosciences Inc. Metschnikowia species for biosynthesis of compounds
GB201713622D0 (en) * 2017-08-24 2017-10-11 Aberystwyth Univ Microbial strains and uses thereof
WO2021253115A1 (en) 2020-06-15 2021-12-23 Melio Peptide Systems Inc. Microorganisms and methods for reducing bacterial contamination

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3619369A (en) 1968-10-31 1971-11-09 Noda Inst For Scientific Res Process for producing xylitol by fermentation
US3627636A (en) 1969-10-02 1971-12-14 Hoffmann La Roche Manufacture of xylitol
US3854995A (en) 1973-03-19 1974-12-17 Sanyo Kokusaku Pulp Co Process for the recovery of sugars from spent sulfite liquor
IT1025347B (it) 1973-11-23 1978-08-10 Sued Chemie Ag Processo per la disgregazione di gusci di avena
US4008285A (en) 1974-04-22 1977-02-15 Melaja Asko J Process for making xylitol
US4075406A (en) 1974-04-22 1978-02-21 Suomen Sokeri Osakeyhtio Process for making xylose
US4072628A (en) 1974-11-05 1978-02-07 Ici Americas Inc. Regeneration of supported ruthenium catalyst
US4087316A (en) 1975-09-02 1978-05-02 Cotton Incorporated Process for obtaining seed hull commodities including cellulosic fibers and xylitol
DE2545111C3 (de) 1975-10-08 1980-07-17 Sued-Chemie Ag, 8000 Muenchen Verfahren zum zweistufigen Aufschließen von xylanhaltigen Naturprodukten zwecks Gewinnung von Xylose
US3990904A (en) 1976-05-11 1976-11-09 Sud-Chemie Ag Method for the preparation of xylose solutions
US4350766A (en) 1980-08-01 1982-09-21 Purdue Research Foundation Pentose syrup production from hemicellulose
US4429140A (en) 1981-12-29 1984-01-31 New Japan Chemical Co., Ltd. Process for preparing dibenzylidene sorbitols and dibenzylidene xylitols
US5340403A (en) 1986-10-20 1994-08-23 Zeneca Limited Process for the production of xylose
FI76377C (fi) 1987-01-15 1989-05-10 Farmos Oy Mikrobiologisk framstaellningsmetod.
CS271428B1 (en) 1987-12-03 1990-09-12 Vladimir Ing Csc Jiricny Method of d-arabinose production
US5536526A (en) 1988-01-11 1996-07-16 Cultor Ltd. Xylitol-based binding and diluting agent and a process for the production thereof
ATE136588T1 (de) 1989-01-17 1996-04-15 Xyrofin Oy Verfahren zur herstellung von xylitol aus xylose enthaltenden gemischen
FR2648474B1 (fr) 1989-06-16 1995-01-06 Roquette Freres Nouveau procede de fabrication du xylose
US5162517A (en) 1989-10-14 1992-11-10 Bayer Aktiengesellschaft Process for the preparation of epimer-free sugar alcohols from the group consisting of xylitol, sorbitol (D-glucitol), 4-O-β-D-galactopyranosyl-D-glucitol and 4-O-α-D-glucopyranosyl-D-sorbitol
US5084104A (en) 1989-12-05 1992-01-28 Cultor, Ltd. Method for recovering xylose
FI86440C (fi) 1990-01-15 1992-08-25 Cultor Oy Foerfarande foer samtidig framstaellning av xylitol och etanol.
US7109005B2 (en) 1990-01-15 2006-09-19 Danisco Sweeteners Oy Process for the simultaneous production of xylitol and ethanol
DE4009676A1 (de) * 1990-03-26 1991-10-02 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Dna-sequenz, umfassend ein fuer xylosereduktase und/oder xylitoldehydrogenase codierendes strukturgen
US5866382A (en) 1990-04-06 1999-02-02 Xyrofin Oy Xylose utilization by recombinant yeasts
FI901771A (fi) 1990-04-06 1991-10-07 Valtion Teknillinen Anvaendning av xylos hos hybridjaest.
US5144024A (en) 1990-10-11 1992-09-01 Tammy Pepper Shelf stable liquid xylitol compositions
FI913197A0 (fi) 1991-07-01 1991-07-01 Xyrofin Oy Nya jaeststammar med reducerad foermaoga att metabolisera xylitol, foerfarande foer bildande av dessa och deras anvaendning vid framstaellning av xylitol.
US5158789A (en) 1991-08-09 1992-10-27 Ici Americas Inc. Melt cocrystallized sorbitol/xylitol compositions
FI92051C (fi) 1992-03-17 1994-09-26 Amylum Nv Menetelmä ksylitolin valmistamiseksi D-glukoosista ja D-glukoosin ja D-fruktoosin sekä D-glukoosin ja D-galaktoosin seoksista
US6723540B1 (en) 1992-11-05 2004-04-20 Xyrofin Oy Manufacture of xylitol using recombinant microbial hosts
US7226761B2 (en) 1992-11-05 2007-06-05 Danisco Sweeteners Oy Manufacture of five-carbon sugars and sugar alcohols
EP0672161B1 (en) 1992-11-05 1999-09-22 Xyrofin Oy Recombinant method and host for manufacture of xylitol
FI96225C (fi) 1993-01-26 1996-05-27 Cultor Oy Menetelmä melassin fraktioimiseksi
US6663780B2 (en) 1993-01-26 2003-12-16 Danisco Finland Oy Method for the fractionation of molasses
FI932108A (fi) 1993-05-10 1994-11-11 Xyrofin Oy Menetelmä sulfiittikeittoliemen fraktioimiseksi
US5728225A (en) 1993-07-26 1998-03-17 Roquette Freres Viscous liquid compositions of xylitol and a process for preparing them
US5789210A (en) 1993-11-08 1998-08-04 Purdue Research Foundation Recombinant yeasts for effective fermentation of glucose and xylose
FI98791C (fi) 1994-04-21 1997-08-25 Xyrofin Oy Menetelmä liuoksen fraktioimiseksi
FR2720406B1 (fr) 1994-05-27 1996-08-14 Agronomique Inst Nat Rech Composition de microorganismes et procédé pour la production de xylitol.
US5795398A (en) 1994-09-30 1998-08-18 Cultor Ltd. Fractionation method of sucrose-containing solutions
GB9424567D0 (en) 1994-12-06 1995-01-25 Cerestar Holding Bv Process for the production of xylitol
FI952065A0 (fi) 1995-03-01 1995-04-28 Xyrofin Oy Foerfarande foer tillvaratagande av en kristalliserbar organisk foerening
GB9514538D0 (en) 1995-07-15 1995-09-13 Cerestar Holding Bv Process for the production of xylitol
KR0153091B1 (ko) 1995-10-27 1998-10-15 담철곤 산소분압의 조절을 이용한 자일리톨의 생물공학적 제조방법
US5965408A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Diversa Corporation Method of DNA reassembly by interrupting synthesis
US6224776B1 (en) 1996-05-24 2001-05-01 Cultor Corporation Method for fractionating a solution
FI102962B1 (fi) 1996-06-24 1999-03-31 Xyrofin Oy Menetelmä ksylitolin valmistamiseksi
GB9615635D0 (en) 1996-07-25 1996-09-04 Cerestar Holding Bv Process for the production of arabinitol
US6057438A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Eastman Chemical Company Process for the co-production of dissolving-grade pulp and xylan
KR100199819B1 (ko) 1997-03-21 1999-06-15 정기련 천연으로부터 분리한 신균주 캔디다 트롭피칼리스에 의한 자일리톨의 제조방법
FR2769314B1 (fr) 1997-10-07 2000-02-11 Roquette Freres Procede de fabrication d'un aldose ou d'un derive d'aldose
JP3855486B2 (ja) 1997-10-17 2006-12-13 味の素株式会社 キシリトールの製造法
JPH11266888A (ja) 1997-10-17 1999-10-05 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
WO1999031241A1 (en) 1997-12-17 1999-06-24 Immunex Corporation Cell surface glycoproteins associated with human b cell lymphomas - ulbp, dna and polypeptides
FI974625A0 (fi) 1997-12-23 1997-12-23 Xyrofin Oy Foerfarande foer framstaellning av xylos
US6335177B1 (en) 1998-07-08 2002-01-01 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms and method for producing xylitol or d-xylulose
PE20001023A1 (es) 1998-07-30 2000-10-10 Ajinomoto Kk Deshidrogenasa de xilitol de bacterias de acido acetico y su gen
FI106853B (fi) 1998-11-18 2001-04-30 Xyrofin Oy Menetelmä polyolien valmistamiseksi arabinoksylaania sisältävästä materiaalista
FR2786772B1 (fr) 1998-12-04 2002-09-06 Roquette Freres Procede de preparation d'un aldose ou derive d'aldose par decarboxylation
JP2000210095A (ja) 1999-01-20 2000-08-02 Ajinomoto Co Inc キシリト―ル又はｄ―キシルロ―スの製造法
WO2000046405A2 (en) 1999-02-02 2000-08-10 Bernhard Palsson Methods for identifying drug targets based on genomic sequence data
JP2000295994A (ja) 1999-02-09 2000-10-24 Ajinomoto Co Inc キシリトールの製造法
JP2001008682A (ja) 1999-06-24 2001-01-16 Ajinomoto Co Inc Ｄ−アラビトール、ｄ−キシルロース及びキシリトールの製造法
FI113060B (fi) 1999-07-14 2004-02-27 Xyrofin Oy Menetelmä orgaanisten yhdisteiden valmistamiseksi
DE60002020T2 (de) 1999-08-10 2004-02-12 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellen von hochreinem Xylitol
JP2003520583A (ja) 2000-01-21 2003-07-08 ダニスコ スイートナーズ オイ 五炭糖及び糖アルコールの製造
US7005561B2 (en) 2000-03-08 2006-02-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Arabitol or ribitol as positive selectable markers
AU2001282174A1 (en) 2000-07-13 2002-01-30 Danisco Sweeteners Oy Method for the production of xylitol
GB0022713D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Xyrofin Oy Method for fractionating liquid mixtures
FI20002148A (fi) 2000-09-29 2002-03-30 Xyrofin Oy Menetelmä tuotteiden talteenottamiseksi
WO2002053781A1 (en) 2000-12-28 2002-07-11 Danisco Sweeteners Oy Separation process
JP4776146B2 (ja) 2001-01-10 2011-09-21 ザ・ペン・ステート・リサーチ・ファンデーション 細胞代謝をモデル化する方法及びシステム
US7127379B2 (en) 2001-01-31 2006-10-24 The Regents Of The University Of California Method for the evolutionary design of biochemical reaction networks
DK1364072T3 (da) 2001-02-28 2007-05-14 Iogen Energy Corp Fremgangsmåde til behandling af lignin- og celluloseholdigt råmateriale til foröget produktion af xylose og ethanol
JP2004533037A (ja) 2001-03-01 2004-10-28 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 調節された反応ネットワークの全体的特性を決定するためのモデルおよび方法
WO2002072777A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 State Of Israel-Ministry Of Agriculture Agricultural Research Organization A novel antagonistic yeast useful in controlling spoilage of agricultural produce, methods of use thereof and compositions containing same
CN1133746C (zh) 2001-04-20 2004-01-07 中国科学院微生物研究所 游离细胞重复利用多次转化制备木糖醇的方法
US6894199B2 (en) 2001-04-27 2005-05-17 Danisco Sweeteners Oy Process for the production of xylitol
FI20010977A (fi) 2001-05-09 2002-11-10 Danisco Sweeteners Oy Kromatografinen erotusmenetelmä
FI20011889A (fi) 2001-09-26 2003-03-27 Xyrofin Oy Menetelmä ksylitolin valmistamiseksi
US6773512B2 (en) 2001-12-31 2004-08-10 Danisco Sweeteners Oy Method for the recovery of sugars
US20030224363A1 (en) 2002-03-19 2003-12-04 Park Sung M. Compositions and methods for modeling bacillus subtilis metabolism
US8229673B2 (en) 2002-03-29 2012-07-24 Genomatica, Inc. Human metabolic models and methods
DE10222373B4 (de) 2002-05-15 2004-08-12 Technische Universität Dresden Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit
FI20021312A (fi) 2002-07-03 2004-01-04 Danisco Sweeteners Oy Polyolikoostumusten kiteyttäminen, kiteinen polyolikoostumustuote ja sen käyttö
AU2003256480B2 (en) 2002-07-10 2008-03-06 The Penn State Research Foundation Method for determining gene knockout strategies
AU2003222214B2 (en) 2002-10-15 2010-08-12 The Regents Of The University Of California Methods and systems to identify operational reaction pathways
WO2004044210A2 (en) 2002-11-06 2004-05-27 University Of Florida Materials and methods for the efficient production of acetate and other products
BR0316829A (pt) 2002-12-11 2005-10-18 Basf Ag Processo contìnuo para a preparação de álcoois de açúcar
DE10258089A1 (de) 2002-12-11 2004-06-24 Basf Ag Kontinuierliches Verfahren zur Herstellung von Sorbit
US7226735B2 (en) 2003-01-21 2007-06-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Xylose-fermenting recombinant yeast strains
WO2004085627A1 (en) 2003-03-26 2004-10-07 Forskarpatent I Syd Ab New saccharomyces cerevisiae strains utilizing xylose
US6893849B2 (en) 2003-03-31 2005-05-17 Council Of Scientific And Industrial Research Fermentation process for production of xylitol from Pichia sp
BR0301678A (pt) 2003-06-10 2005-03-22 Getec Guanabara Quimica Ind S Processo para a produção de xilose cristalina a partir de bagaço de cana-de-açucar, xilose cristalina de elevada pureza produzida através do referido processo, processo para a produção de xilitol cristalino a partir da xilose e xilitol cristalino de elevada pureza assim obtido
KR20050025059A (ko) 2003-07-25 2005-03-11 씨제이 주식회사 신규한 칸디다 트로피칼리스 씨제이-에프아이디 균주와이를 이용한 자일리톨의 생산방법
KR100528804B1 (ko) 2003-12-08 2005-11-15 씨제이 주식회사 균체 재사용에 의한 고수율 자일리톨의 제조방법
US20060110805A1 (en) 2004-05-19 2006-05-25 Biotechnology Research And Development Corporation Microbial production of xylitol via hexose phosphate and pentose phosphate intermediate
EP2386625A2 (en) 2004-05-19 2011-11-16 Biotech Research And Development Corporation Methods for production of xylitol in microorganisms
CN1320122C (zh) 2005-06-02 2007-06-06 江南大学 一种从木糖母液或木糖水解液提取木糖和木糖醇的方法
FI120590B (fi) 2005-10-28 2009-12-15 Danisco Sweeteners Oy Erotusmenetelmä
US7977083B1 (en) 2006-12-28 2011-07-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method for microbial production of xylitol from arabinose
US8247200B2 (en) 2007-01-25 2012-08-21 Iogen Energy Corporation Method of obtaining inorganic salt and acetate salt from cellulosic biomass
KR101108789B1 (ko) 2007-02-09 2012-03-13 씨제이제일제당 (주) 열대과일 바이오매스 부산물로부터 제조된 자일로스와아라비노스를 포함하는 가수분해 당화액을 이용한자일리톨의 제조방법
US7820414B2 (en) 2007-06-29 2010-10-26 Lpbio Co., Ltd. Xylitol dehydrogenase-inactivated and arabinose reductase-inhibited mutant of Candida tropicalis, method of producing high-yield of xylitol using the same, and xylitol produced thereby
US7947483B2 (en) 2007-08-10 2011-05-24 Genomatica, Inc. Methods and organisms for the growth-coupled production of 1,4-butanediol
ITTO20070655A1 (it) 2007-09-19 2009-03-20 Univ Degli Studi Torino Nuovo ceppo di metschnikowia pulcherrima e suoi usi
US20110003356A1 (en) 2008-03-10 2011-01-06 Tata Chemicals Limited Process for production of xylitol
WO2009155982A1 (en) 2008-06-26 2009-12-30 Danisco A/S Process for separation of ca- or mg-sulfite spent liquor to yield crystalline xylose
EP2326749A4 (en) 2008-08-08 2012-06-27 Dynamic Food Ingredients Corp METHOD OF ELECTROLYTICALLY PREPARING XYLO-PENT-1,5-DIOSE
CN101914591B (zh) 2009-01-16 2013-05-01 唐传生物科技（厦门）有限公司 一种热带假丝酵母制备木糖醇的用途与高纯度木糖醇产物的制药、保健用途
CN101857886B (zh) 2009-04-09 2012-12-26 华北制药康欣有限公司 一种木糖醇联产l-阿拉伯糖的制备方法
TWI439547B (zh) 2009-10-23 2014-06-01 Iner Aec Executive Yuan 一種未去毒性纖維原料水解液生產木糖醇的方法
US20110207190A1 (en) 2010-02-04 2011-08-25 University Of Iowa Research Foundation Methods of xylitol preparation
US20120021467A1 (en) 2010-07-22 2012-01-26 Thomson Biotech (Xiamen) PTE. LTD. Method of producing xylitol and arabinose at same time from hemicellulose hydrolysates
US20130295631A1 (en) * 2010-10-01 2013-11-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Combinatorial design of highly efficient heterologous pathways
KR101246780B1 (ko) 2010-10-06 2013-03-26 한국과학기술원 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
EP3101137A1 (en) 2010-10-11 2016-12-07 The Board of Trustees of the University of Illionis Production of xylitol from a mixture of hemicellulosic sugars
US20140342418A1 (en) * 2011-10-17 2014-11-20 The Board Of Trustees Ofthe University Of Illinois Xylitol production from cellulosic biomass
US20150017696A1 (en) * 2012-03-02 2015-01-15 Codexis, Inc. a corporation Recombinant host cells and processes for producing 1,3-butadiene through a crotonol intermediate
CN102936576B (zh) 2012-06-25 2015-08-05 江苏大学 一种木糖醇基因工程菌及其混合转化生产木糖醇的方法
WO2014013506A1 (en) 2012-07-16 2014-01-23 Council Of Scientific & Industrial Research Process for production of crystalline xylitol using pichia caribbica and its application for quorum sensing inhibition
US10006059B2 (en) 2012-08-28 2018-06-26 Privi Biotechnologies Private Limited Selective microbial production of xylitol from biomass based sugar stream with enriched pentose component
CN103184243A (zh) 2013-03-26 2013-07-03 合肥工业大学 一种木糖醇的发酵生产方法
US10385309B2 (en) * 2014-04-23 2019-08-20 Scandinavian Technology Group Ab Saccharomyces cerevisiae strains
GB201713622D0 (en) 2017-08-24 2017-10-11 Aberystwyth Univ Microbial strains and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKINORI MATSUSHIKA等: "Ethanol production from xylose in engineered Saccharomyces cerevisiae strains: current state and perspectives", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
SANTAMAURO F等: "Low-cost lipid production by an oleaginous yeast cultured in non-sterile conditions using model waste resources", 《BIOTECHNOL BIOFUELS》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112501039A (zh) * 2020-11-11 2021-03-16 大连海洋大学 二尖梅奇酵母菌及处理高盐废水的方法
CN112501039B (zh) * 2020-11-11 2024-02-02 大连海洋大学 二尖梅奇酵母菌及处理高盐废水的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10435721B2 (en) 2019-10-08
US20180171366A1 (en) 2018-06-21
MX2019007406A (es) 2019-12-16
EP3559207A4 (en) 2020-08-12
MX2023001943A (es) 2023-03-16
BR112019013005A2 (pt) 2019-10-08
AU2017383557A1 (en) 2019-08-08
US11473110B2 (en) 2022-10-18
US20230357804A1 (en) 2023-11-09
JP2020501595A (ja) 2020-01-23
CA3047841A1 (en) 2018-06-28
EP3559207A1 (en) 2019-10-30
WO2018112639A1 (en) 2018-06-28
JP2023156360A (ja) 2023-10-24
US20200239915A1 (en) 2020-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110382684A (zh) 产生木糖醇的梅奇酵母种
CN110325640A (zh) 用于化合物生物合成的梅奇酵母种
CN111363759B (zh) 合成赤藓糖醇的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法及其菌株
PT2970934T (pt) Polipèptidos de valenceno sintase, moléculas de ácido nucleico que os codificam e suas utilizações
CN110312796A (zh) 角鲨烯何帕烯环化酶及其用于生产降龙涎香醚的用途
KR102645531B1 (ko) 알데하이드 데하이드로게나제 변이체 및 사용 방법
US20210222210A1 (en) Methods and organism with increased xylose uptake
Domik et al. A terpene synthase is involved in the synthesis of the volatile organic compound sodorifen of Serratia plymuthica 4Rx13
CN106715679A (zh) 用于生产乙偶姻的方法
Wolff et al. Acurin A, a novel hybrid compound, biosynthesized by individually translated PKS-and NRPS-encoding genes in Aspergillus aculeatus
US20180195051A1 (en) Methods and organism with increased ethanol production
CN113179645A (zh) 醛脱氢酶变体及其使用方法
CN104560917B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用
Tawong Diversity of the potential 2-methylisoborneol-producing genotypes in Thai strains of Planktothricoides (Cyanobacteria)
CN107903227B (zh) 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
US20180094281A1 (en) Production of fragrant compounds
KR20200023450A (ko) 기능적 dna 서열의 안정화된 카피 수를 갖는 미생물 및 관련 방법
KR101827822B1 (ko) 자일리톨 생산능이 향상된 클루이베로마이세스 마르시아누스 36907-fmel1 (kctc18459p) 및 이를 이용한 자일리톨의 생산방법
Li et al. Inactivation of MrPigH in Monascus ruber M7 results in its Monascus pigments increase and citrinin decrease with mrpyrG selection marker

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination