DE10222373B4 - Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit - Google Patents

Abstract

Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit unter Verwendung von Mikroorganismen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst,
a) Modifizieren der Mikroorganismen, so dass die Oxidation von NADH durch andere Enzyme als die Xylosereduktase verringert oder ausgeschaltet ist;
b) Kultivieren der Mikroorganismen in einem Xylose und 10-40 Gramm pro Liter Sulfitsalz enthaltenden Substrat in einer aeroben Wachstumsphase und einer Sauerstoff limitierten Xylit-Produktionsphase,
c) Anreichern und Gewinnen des Xylit aus dem Substrat.

Description

• Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biologischen Herstellung von Xylit unter Verwendung von Mikroorganismen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können.
• Xylit ist ein natürlich vorkommender Zuckeralkohol und findet Verwendung vor allem als Zuckeraustauschstoff bei diätetischen Lebensmitteln, da sein Abbau im Stoffwechsel insulinunabhängig verläuft. Auch in der pharmazeutischen Industrie, etwa für Zahncreme, findet Xylit Verwendung.
• Ein großes Einsatzgebiet erfährt Xylit bei Kaugummis, Kautabletten und ähnlichen Produkten, weil Xylit in etwa die gleiche Süßkraft, aber keine kariogene Wirkung im Vergleich zu Saccharose, aufweist.
• Nach dem Stand der Technik wird Xylit auf chemischem Wege durch die Reduktion von Xylose an Nickelkatalysatoren unter hohem Druck und bei hohen Temperaturen mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 50 bis 60 % der eingesetzten Xylose synthetisiert.
• Xylose ist ein Hauptbestandteil pflanzlicher Rohstoffe und wird durch saure Hydrolyse oder Sulfitlaugung aus hemicellulosereichen Pflanzenresten gewonnen.
• Um den Nachteil der geringen Ausbeute an Xylit bei chemischen Verfahren zu überwinden, wurde beispielsweise in der EP 0 716 067 vorgeschlagen, Xylit, ausgehend von Gluconsäure, chemisch über mehrere Verfahrensschritte zu gewinnen, um Ausbeuten zwischen 60 und 70 % zu erhalten.
• Den chemischen Verfahren ist gemeinsam, dass kostenintensive bzw. umweltunverträgliche Katalysatoren zum Einsatz kommen müssen, um das Xylit auf chemischem Wege zu erzeugen. Dabei werden überwiegend Nickelkatalysatoren eingesetzt, deren Verwendung aus Erwägungen des Umweltschutzes bedenklich ist.
• Weiterhin wird bei diesen chemischen Verfahren bei zum Teil hohen Temperaturen zwischen 70 und 150°Celsius sowie hohen Drücken von bis zu 10 MPa gearbeitet. Es schließen sich weiterhin aufwändige Reinigungs- und Konzentrierungsschritte an, um das Xylit letztlich in reiner Form zu gewinnen.
• Als eine Alternative zur chemischen Erzeugung von Xylit wurden im Stand der Technik biotechnologische Verfahren beschrieben, welche einen sehr hohen Ertrag beim Stoffumsatz von Xylose zu Xylit aufweisen.
• In der DE44 10 028 A1 werden Hefen zur Erhöhung der Xylitausbeute unter speziellen Kulturbedingungen gehalten. Dabei wird insbesondere der pH-Wert des Kulturmediums in einem bestimmten Bereich gehalten, um die Hefen zu einer erhöhten Xylitproduktion anzuregen.
• Als Mikroorganismen kommen einerseits Hefen der Gattungen Candida, Debaryomyces und Pichia zum Einsatz, welche natürliche Xyloseverwerter sind, die unter Sauerstofflimitation Xylose in Xylit umwandeln.
• Die Reaktion wird von dem Enzym Xylosereduktase (XR) unter Beteiligung des Kofaktors NADH katalysiert.
• Alternativ zu den natürlichen Xylitbildnern werden nach der Lehre der EP 0 672 161 Mikroorganismen dahingehend gentechnisch modifiziert, dass diese nach der Manipulation Xylit auch unter Nutzung anderer Kohlenstoffquellen bilden können.
• Als Beispiele aus dem Stand der Technik sind die Veröffentlichungen in den Chemical Abstracts 129:25507; 131:4270; 133:236915 sowie 125:270220 zu nennen. Dabei werden Mikroorganismen genetisch manipuliert, wobei lediglich einzelne Aspekte des Stoffwechselsystems gezielt und erfolgreich verändert werden jedoch die Komplexität des Stoffwechselsystems der Mikroorganismen keine Beachtung findet. Derartige Vorgehensweisen führen regelmäßig dazu, dass zwar Einzelaspekte der Veränderung des Mikroorganismus erfolgreich realisiert werden aber der Mikroorganismus selbst durch diese Eingriffe Einschränkungen beispielsweise in der Vermehrungsfähigkeit erleidet.
• Eine andere Strategie zur Erhöhung der Xylitproduktion auf biotechnologischem Wege beschreibt die EP 0 604 429 . Dort werden Xylit synthetisierende und metabolisierende Hefen derart gentechnisch modifiziert, dass die Enzyme, welche das erwünschte Endprodukt umbauen, ausgeschaltet werden.
• Nach der Lehre dieser Erfindung wird die Expression der Gene ausgeschaltet oder verringert, welche zu einem Umbau bzw. zu einem Abbau des gewünschten Endproduktes Xylit führen.
• Ebenso sind im Stand der Technik Verfahren bekannt, nach denen nicht auf natürlichem Wege Xylose reduzierende Mikroorganismen durch gentechnische Manipulation in die Lage versetzt werden, Xylosereduktaseenzyme zu bilden und damit Xylose zur Produktion von Xylit verwerten zu können.
• Gleichfalls ist bekannt, zur Verbesserung der Ausbeute, dieses Enzym Xylosereduktase stark zu überexprimieren.
• Den erwähnten biotechnologischen Verfahren ist gemeinsam, dass selbst bei starker Überexpression von Xylosereduktase und auch bei der Ausschaltung der am natürlichen Metabolismus des Xylit beteiligten Enzyme die Produktivität an Xylit nicht wirksam genug erhöht werden kann, um kosteneffizient Xylit auf biotechnologischen Verfahrensweg zu produzieren.
• Es ist somit Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches eine höhere Xylitproduktivität bei der biotechnologischen Herstellung von Xylit aus Xylose ermöglicht und damit eine wirtschaftlichere Verfahrensführung durchführbar ist.
• Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit gelöst, wobei Mikroorganismen zum Einsatz kommen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können und das Verfahren folgende Verfahrensschritte umfasst:
• a) Modifizieren von Mikroorganismen, so dass die Oxidation von NADH durch andere Enzyme als die Xylosereduktase verringert oder ausgeschaltet ist,
• b) Kultivieren der Mikroorganismen in einem Xylose und 10-40 Gramm pro Liter Sulfitsalz enthaltenden Substrat in einer aeroben Wachstumsphase und einer Sauerstoff limitierten Xylit-Produktionsphase,
• c) Anreichern und Gewinnen des Xylit aus dem Substrat.
• Die Umwandlung von Xylose in Xylit verläuft auf folgendem Weg:

  
• Diese Reaktion wird, wie bereits beschrieben, von dem Enzym Xylosereduktase unter Beteiligung des Kofaktors NADH katalysiert. Wie bereits bei der Erörterung des Standes der Technik auf diesem Gebiet beschrieben, führt ein Überangebot des die Reaktion katalysierenden Enzyms Xylosereduktase durch eine Überexpression des Enzyms bei modifizierten Mikroorganismen nicht zu einer deutlichen Erhöhung und damit nicht zu einer wirtschaftlichen Verbesserung der Xylitproduktion.
• Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Reaktion von Xylose zu Xylit sehr stark von der Verfügbarkeit des Kofaktors NADH abhängt und von dieser limitiert wird.
• Nach der Konzeption der Erfindung werden somit Mikroorganismen derart modifiziert, dass andere NADH verbrauchende Enzymsysteme der Mikroorganismen, wie beispielsweise die zytoplasmatische NADH-Dehydrogenase, die Alkoholdehydrogenase und die Glycerolphosphatdehydrogenase, ausgeschaltet werden.
• Die Wirkung der erfindungsgemäßen Modifizierung der Mikroorganismen beruht darauf, dass die genannten Enzyme eine höhere Affinität zu diesem Kofaktor aufweisen.
• Wird das NADH vorzugsweise durch die mit der Xylosereduktase konkurrierenden Enzyme zu NAD(P) oxidiert, steht der benötigte Kofaktor nicht in dem für eine hohe Produktivität an Xylit erforderlichem Maße zur Verfügung.
• Durch die erfindungsgemäße Verwendung genetisch modifizierter Mikroorganismen können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren deutliche Xylitertragssteigerungen erreicht werden. Damit ist dieses Verfahren eine attraktive Alternative zu den bisherigen chemischen Verfahren, in dem es die beschriebenen Nachteile anderer biotechnologischer Verfahren aufgabengemäß überwindet.
• Zudem können als besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens als Rohstoffquellen nachwachsende Rohstoffe eingesetzt werden, und es entstehen, im Gegensatz zu herkömmlichen chemischen Verfahren, keine umweltschädlichen Wirkungen durch die Verwendung von Nickelkatalysatoren.
• Ebenso ist den biotechnologischen Verfahren immanent, dass diese bei vergleichsweise milden Reaktionsbedingungen arbeiten und somit generell häufig umweltverträglicher sind als chemische Verfahren. Die Beschreibung von Ausführungsbeispielen zeigt, wie einzelne Mikroorganismen, insbesondere Hefen, zunächst modifiziert werden und anschließend zur Xylitproduktion eingesetzt werden.
• Eine große Bedeutung für biotechnologische Verfahren besitzen Hefen der Gattung Saccharomyces. Bei diesen Hefen wird das NADH auf verschiedenen Stoffwechselwegen oxidiert. Hauptsächlich sind die Alkoholfermentation, die Glycerolproduktion und die Oxidation durch die externen mitochondrialen NADH-Dehydrogenasen zu nennen. Diese Enzyme besitzen eine höhere Affinität zu NADH im Vergleich zur Xylosereduktase und der Kofaktor wird somit bevorzugt durch diese Enzyme oxidiert.
• Als Ergebnis des NADH-Verbrauches durch die skizzierten Abbauwege ist das NADH-Angebot für die Xylosereduktion limitiert, und Xylit kann nicht in erhöhtem Maße produziert werden.
• Erfindungsgemäß wird der Gehalt des im Zytoplasma und somit für die Reaktion mit der Xylosereduktase zur Verfügung stehenden NADH erhöht, indem bei den Mikroorganismen eines oder mehrere der Enzyme inaktiviert bzw. deren Expression unterdrückt werden, welche zu einer Oxidation des NADH führen.
• Die innere Mitochondrienmembran der Hefen ist für NADH undurchlässig, deshalb richtet sich die Modifizierung des Enzymsystemes auf die für die Oxidation verantwortlichen zytoplasmatischen NADH-Dehydrogenasen.
• In Saccharomyces cerevisiae kodieren die Gene NDE1 und NDE2 die externen NADH-Deydrogenasen während GPD1 und GPD2 die Glycerolphosphatdehydrogenasen kodieren. Die Repression einer oder mehrerer der genannten Gene führt damit erfindungsgemäß zu einer Verminderung des NADH-Verbrauches durch die alternativen Stoffwechselrouten und das NADH steht für die Xylosereduktase in höherem Maße zur Verfügung.
• Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird gleichfalls bei Saccharomyces cerevisiae durch die Zugabe von Sulfitsalz (z.B. Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Kaliumsulfit) in einer Konzentration von 10 bis 40 Gramm pro Litern Substrat der Abbau von Glukose zu Ethanol inhibiert. Folglich steigt die Produktion von Glycerol an:
  Erfindungsgemäß wird der Bildung von Glycerol entgegengewirkt, indem die Expression des NADH verbrauchenden Enzyms Glycerolphosphatdehydrogenase gentechnisch unterdrückt wird.
• Unter diesen Bedingungen steigt die Xylitproduktion, indem der durch die Unterdrückung der Glycerolphosphatdehydrogenase zusätzlich zur Verfügung stehende Kofaktor NADH von der Xylosereduktase zur Bildung von Xylit aus Xylose genutzt werden kann.
• Die erfindungsgemäße Wirkung des Verfahrens mit modifizierten Mikroorganismen wird insbesondere nach einer Ausführungsform dadurch ermöglicht, dass die Gene der Mikroorganismen durch rekombinante DNA-Technologie verändert werden. Alternativ ist die Modifizierung der Mikroorganismen durch gerichtete oder zufällige Mutagenese möglich.
• Die Veränderung der Mikroorganismen erfolgt in der Weise, dass in einem ersten Schritt die Sequenzen der Enzyme, welche den NADH-Kofaktor nutzen, zerstört bzw. so manipuliert werden, dass diese nicht von dem Mikroorganismus erzeugt werden können oder nur mit verringerter Aktivität synthetisiert werden.
• Derartige Methoden zur gentechnischen Veränderung von Mikroorganismen sind Stand der Technik. Die auf diese Weise genetisch manipulierten Mikroorganismen produzieren vermehrt Xylit und akkumulieren es im Wachstumsmedium, aus welchem das Xylit durch Kristallisation oder durch chromatographische Methoden angereichert bzw. gewonnen werden kann. Die folgende Beschreibung von Ausführungsbeispielen verdeutlicht die Vorgehensweise der Modifikation der Mikroorganismen und der Gewinnung von Xylit.
• Beispiel 1
• Zunächst wird die Herstellung von Hefestämmen beschrieben, die die heterologe Xylosereduktase exprimieren.
• Die Expression heterologer Xylosereduktase in Hefe ist Stand der Technik und wurde beispielsweise im Patent WO 91/15588 beschrieben.
• Pichia stipitis wurde in 100 ml YPD (1 l Medium enthält 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Glukose, pH = 6,5) über Nacht bei 30 °C kultiviert. Zellen aus 10 ml Kultivierungsmedium wurden durch Zentrifugation pelletiert und die chromosomale DNA nach dem Protokoll von Kaiser et al. (1994) isoliert. Diese DNA diente als Template zur PCR Amplifizierung des 956 bp großen intronlosen offenen Leserahmens (ORF) des XYL1-Gens (Amore et al. 1993). Das resultierende Fragment wurde in einem 1 % Agarosegel separiert und mit dem „JETQUICK Gel Extraction Spin Kit" der Firma Genomed aufgereinigt. Das Plasmid wurde mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen verdaut und, wie oben beschrieben, aufgereinigt. Als Vektor für die Expression in S. cerevisiae wurde p425GPD benutzt. Der Vektor ist ein Multicopy-Plasmid und enthält das LEU2-Gen von S. cerevisiae als Selektionsmarker (Mumberg et al. 1995). Der Vektor wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wie das Fragment und entsprechend aufgereinigt. Der ORF des XYL1 Gens wurde in den Vektor ligiert und rekombinante Plasmide wurden durch Plasmidpräparation und Restriktionsanalysen identifiziert. In dem so hergestellten Plasmid (p425GPD-PsXYL1) ist die Transkription von XYL1 unter Kontrolle des starken GPD-Promotors und stellt eine hohe Expression exogener XR in S. cerevisiae sicher. Der Stamm S. cerevisiae KOY50 (MATa; his3Δ1; leu2Δ0; ura3Δ0) wurde mit p425GPD-PsXYL1 nach der Methode von Schiestl und Gietz (1989) transformiert. Leucin-prototrophe Transformanden wurden isoliert und analysiert.
• Beispiel 2
• Inaktivierung der NADH-Dehydrogenasen durch Gen-Replacement der Gene NDE1 und NDE2
• Die mitochondrial lokalisierte zytosolische NADH-Dehydrogenase konkurriert mit der XR um den Kofaktor NADH. Um den Verbrauch an zytosolischem NADH zu verringern, wurden die Gene NDE1 und NDE2 durch Gen-Replacement mit geeigneten DNA-Fragmenten inaktiviert. Ein Replacementfragment mit 40 bp Homologie direkt 5'-seitig des Startkodons von NDE1 und 40 bp Homologie 3'-seitig des Stopkodons wurde durch PCR amplifiziert. Das Fragment enthält das his5⁺-Gen von Schizosaccharomyces pombe und komplementiert his3 Mutationen in S. cerevisiae (Wach et al. 1997). Nach der Amplifizierung wurde das Fragment, wie oben beschrieben, isoliert und aufgereinigt. S. cerevisiae KOY50 wurde nach der Methode von Schiestl und Gietz (1989) mit dem Replacementfragment transformiert. Histidin-prototrophe Transformanden wurden isoliert. Die korrekte Integration des Fragments und der Austausch von NDE1 wurde durch diagnostische PCR nachgewiesen. Ein solcher Stamm (KOY50Δnde1) wurde mit p425GPD-PsXYL1, wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert und zur Xylitproduktion eingesetzt.
• Für die Herstellung der Doppelmutante nde1/nde2 wurde ein Replacementfragment mit Homologien zu NDE2, wie oben beschrieben, konstruiert. Als Selektionsmarker diente hierbei das kanMX Modul (Wach et al. 1994). Dieses Modul macht Transformanden resistent gegen G418 (Geneticin). Nach der Transformation wurden die KOY50Δnde1 Zellen auf G418 enthaltendem Medium ausplattiert. Resistente Klone wurden durch diagnostische PCR auf den korrekten Einbau des Replacementfragments und Inaktivierung von NDE2 geprüft. Der resultierende Stamm (KOY50Δnde1Δnde2) wurde mit p425GPD-PsXYL1, wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert und zur Xylitolproduktion eingesetzt.
• Beispiel 3
• Gen-Replacement der für Glycerolphosphatdehydrogenase kodierenden Gene GPD1 und GPD2
• Die zytoplasmatischen Glycerolphosphatdehydrogenasen GPD1p und GPD2p nutzen NADH als Kofaktor. Ihre Inaktivierung führt zu einer vorzugsweisen Oxidation von zytosolischem NADH durch die Reduktion von Xylose zu Xylitol mittels XR. Für das Gen-Replacement wurden die Stämme S. cerevisiae KOY50Δnde1 beziehungsweise KOY50Δnde1Δnde2 genutzt.
• Beide Stämme tragen die ura3Δ0 Mutation. Für die Disruption wurden Fragmente mit Homologien zu GPD1 und GPD2, wie unter Beispiel 2 für NDE1 beschrieben, genutzt. Die Fragmente enthielten das URA3-Gen von Candida albicans als Selektionsmarker. Der Selektionsmarker wurde durch zueinander identische DNA Abschnitte flankiert (Goldstein et al. 1999). URA3 aus C. albicans komplementiert ura3 Mutationen in S. cerevisiae. Zellen mit einem intakten Uracil-Metabolismus sind im Gegensatz zu Zellen mit einer ura3 Mutation sensitiv gegen 5-Fluor-Orod-Säure (5-FOA). Nach der Integration der Disruptionskassette ins Genom kommt es an den sich wiederholenden DNA-Abschnitten zu spontaner homologer Rekombination und somit zum Verlust des URA3-Markers. Klone, in denen eine solche Rekombination stattgefunden hat, sind leicht durch ihre Resistenz gegen 5-FOA zu isolieren.
• Die oben beschriebenen DNA Fragmente wurden durch PCR amplifiziert und gereinigt. Das Fragment für das Gen-Replacement von GPD1 wurde nach der Methode von Schiestl und Gietz (1989) in S. cerevisiae KOY50Δnde1 bzw. KOY50Δnde1Δnde2 transformiert. Uracil-prototrophe Transformanden wurden auf dem entsprechenden Selektionsmedium isoliert. Das Replacement von GPD1 wurde durch diagnostische PCR bestätigt. Danach wurden die so konstruierten Stämme auf eine 5-FOA Resistenz selektiert. In 5-FOA-resistenten Stämmen wurde der Verlust der URA3 Marker durch diagnostische PCR nachgewiesen. In weiteren Arbeiten wurde schließlich GPD2, wie bereits oben beschrieben, inaktiviert.
• Die so konstruierten Stämme wurden mit p425GPD-PsXYL1, wie in Beispiel 1 ausgeführt, transformiert und zur Xylitolproduktion eingesetzt.
• Beispiel 4
• Herstellung von Stämmen mit inaktivierten Dehydrogenasen durch Tetradenanalyse
• Um Stämme mit mehreren inaktivierten Dehydrogenasen herzustellen, wurden zunächst die betreffenden Gene einzeln, wie in Beispiel 2 beschrieben, inaktiviert. Nach der Kreuzung der Einzelmutanten und Sporulation der entstandenen diploiden Stämme wurden Tetraden analysiert. Doppelmutanten können einfach im nichtparentalen Dityp (NPD) identifiziert werden. Der Stamm KOY50 wurde genutzt, um GPD1 und GPD2, wie für NDE1 in Beispiel 2 beschrieben, durch Gen-Replacement einzeln zu inaktivieren. Transformanden entgegengesetzten Paarungstyps wurden gekreuzt und die resultierenden Stämme auf dem entsprechenden Medium zur Sporulation gebracht. Die Tetraden wurden auf Histidin-Prototrophie getestet. Die GPD1/GPD2 Doppelnullmutanten wurden als histidin-prototrophe Einsporklone in NPD-Tetraden isoliert, mit p425GPD-PsXYL1 transformiert und zur Xylitproduktion eingesetzt.

Claims (7)

1. Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Xylit unter Verwendung von Mikroorganismen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren können, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst, a) Modifizieren der Mikroorganismen, so dass die Oxidation von NADH durch andere Enzyme als die Xylosereduktase verringert oder ausgeschaltet ist; b) Kultivieren der Mikroorganismen in einem Xylose und 10-40 Gramm pro Liter Sulfitsalz enthaltenden Substrat in einer aeroben Wachstumsphase und einer Sauerstoff limitierten Xylit-Produktionsphase, c) Anreichern und Gewinnen des Xylit aus dem Substrat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierten Mikroorganismen eine verringerte oder keine Aktivität mindestens eines der Enzyme Glycerolphosphatdehydrogenase, externe mitochondriale NADH-Dehydrogenase oder Alkoholdehydrogenase aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei den Mikroorganismen die Expression der Gene, die die Glycerolphosphatdehydrogenase, externe mitochondriale NADH-Dehydrogenase oder Alkoholdehydrogenase kodieren, ausgeschaltet oder verringert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Mikroorganismen Hefen der Gattungen Candida, Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces und Debaryomyces eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass bei Saccharomyces cerevisiae mindestens eines der Gene NDE1, NDE2, GPD1 und GPD2 entfernt oder inaktiviert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass im Substrat als eine weitere Kohlenstoffquelle Galaktose, Mannose, Glukose oder Arabinose eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Sulfitsalz Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit oder Kaliumsulfit eingesetzt wird.