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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biologischen Herstellung von Xylit unter
Verwendung von Mikroorganismen, welche Xylose zu Xylit metabolisieren
können.
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Xylit ist ein natürlich vorkommender Zuckeralkohol und findet Verwendung vor
allem als Zuckeraustauschstoff bei diätetischen Lebensmitteln, da sein Abbau
im Stoffwechsel insulinunabhängig verläuft. Auch in der pharmazeutischen
Industrie, etwa für Zahncreme, findet Xylit Verwendung.
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Ein großes Einsatzgebiet erfährt Xylit bei Kaugummis, Kautabletten und
ähnlichen Produkten, weil Xylit in etwa die gleiche Süßkraft, aber keine
kariogene Wirkung im Vergleich zu Saccharose, aufweist.
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Nach dem Stand der Technik wird Xylit auf chemischem Wege durch die
Reduktion von Xylose an Nickelkatalysatoren unter hohem Druck und bei
hohen Temperaturen mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 50 bis 60%
der eingesetzten Xylose synthetisiert.
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Xylose ist ein Hauptbestandteil pflanzlicher Rohstoffe und wird durch saure
Hydrolyse oder Sulfitlaugung aus hemicellulosereichen Pflanzenresten
gewonnen.
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Um den Nachteil der geringen Ausbeute an Xylit bei chemischen Verfahren zu
überwinden, wurde beispielsweise in der EP 0 716 067 vorgeschlagen, Xylit,
ausgehend von Gluconsäure, chemisch über mehrere Verfahrensschritte zu
gewinnen, um Ausbeuten zwischen 60 und 70% zu erhalten.
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Den chemischen Verfahren ist gemeinsam, dass kostenintensive bzw.
umweltunverträgliche Katalysatoren zum Einsatz kommen müssen, um das
Xylit auf chemischem Wege zu erzeugen. Dabei werden überwiegend
Nickelkatalysatoren eingesetzt, deren Verwendung aus Erwägungen des
Umweltschutzes bedenklich ist.
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Weiterhin wird bei diesen chemischen Verfahren bei zum Teil hohen
Temperaturen zwischen 70 und 150° Celsius sowie hohen Drücken von bis zu
10 MPa gearbeitet. Es schließen sich weiterhin aufwändige Reinigungs- und
Konzentrierungsschritte an, um das Xylit letztlich in reiner Form zu gewinnen.
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Als eine Alternative zur chemischen Erzeugung von Xylit wurden im Stand der
Technik biotechnologische Verfahren beschrieben, welche einen sehr hohen
Ertrag beim Stoffumsatz von Xylose zu Xylit aufweisen.
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Als Mikroorganismen kommen einerseits Hefen der Gattungen Candida,
Debaryomyces und Pichia zum Einsatz, welche natürliche Xyloseverwerter
sind, die unter Sauerstofflimitation Xylose in Xylit umwandeln.
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Die Reaktion wird von dem Enzym Xylosereduktase (XR) unter Beteiligung des
Kofaktors NADH katalysiert.
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Alternativ zu den natürlichen Xylitbildnern werden nach der Lehre der
EP 0 672 161 Mikroorganismen dahingehend gentechnisch modifiziert, dass
diese nach der Manipulation Xylit auch unter Nutzung anderer
Kohlenstoffquellen bilden können.
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Eine andere Strategie zur Erhöhung der Xylitproduktion auf
biotechnologischem Wege beschreibt die EP 0 604 429. Dort werden Xylit
synthetisierende und metabolisierende Hefen derart gentechnisch modifiziert,
dass die Enzyme, welche das erwünschte Endprodukt umbauen, ausgeschaltet
werden.
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Nach der Lehre dieser Erfindung wird die Expression der Gene ausgeschaltet
oder verringert, welche zu einem Umbau bzw. zu einem Abbau des
gewünschten Endproduktes Xylit führen.
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Ebenso sind im Stand der Technik Verfahren bekannt, nach denen nicht auf
natürlichem Wege Xylose reduzierende Mikroorganismen durch gentechnische
Manipulation in die Lage versetzt werden, Xylosereduktaseenzyme zu bilden
und damit Xylose zur Produktion von Xylit verwerten zu können.
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Gleichfalls ist bekannt, zur Verbesserung der Ausbeute, dieses Enzym
Xylosereduktase stark zu überexprimieren.
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Den erwähnten, biotechnologischen Verfahren ist gemeinsam, dass selbst bei
starker Überexpression von Xylosereduktase und auch bei der Ausschaltung
der am natürlichen Metabolismus des Xylit beteiligten Enzyme die Produktivität
an Xylit nicht wirksam genug erhöht werden kann, um kosteneffizient Xylit auf
biotechnologischem Verfahrensweg zu produzieren.
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Es ist somit Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen,
welches eine höhere Xylitproduktivität bei der biotechnologischen Herstellung
von Xylit aus Xylose ermöglicht und damit eine wirtschaftlichere
Verfahrensführung durchführbar ist.
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Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren zur biotechnologischen
Herstellung von Xylit gelöst, wobei Mikroorganismen zum Einsatz kommen,
welche Xylose zu Xylit metabolisieren können und das Verfahren folgende
Verfahrensschritte umfasst:
- a) Modifizieren von Mikroorganismen, so dass die Oxidation von NADH
durch andere Enzyme als die Xylosereduktase verringert oder
ausgeschaltet ist,
- b) Kultivieren der Mikroorganismen in einem Xylose und 10-40 Gramm pro
Liter Sulfitsalz (z. B. Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Kaliumsulfit)
enthaltenden Substrat,
- c) Kultivieren der Mikroorganismen in einer aeroben Wachstumsphase und
einer sauerstofflimitierten Xylit-Produktionsphase und
- d) Anreichern und Gewinnen des Xylits aus dem Substrat.
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Die Umwandlung von Xylose in Xylit verläuft auf folgendem Weg:
Xylose + NADH
+|2 ≙ Xylit + NAD+.
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Diese Reaktion wird, wie bereits beschrieben, von dem Enzym
Xylosereduktase unter Beteiligung des Kofaktors NADH katalysiert. Wie bereits
bei der Erörterung des Standes der Technik auf diesem Gebiet beschrieben,
führt ein Überangebot des die Reaktion katalysierenden Enzyms
Xylosereduktase durch eine Überexpression des Enzyms bei modifizierten
Mikroorganismen nicht zu einer deutlichen Erhöhung und damit nicht zu einer
wirtschaftlichen Verbesserung der Xylitproduktion.
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Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Reaktion von Xylose zu Xylit
sehr stark von der Verfügbarkeit des Kofaktors NADH abhängt und von dieser
limitiert wird.
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Nach der Konzeption der Erfindung werden somit Mikroorganismen derart
modifiziert, dass andere NADH verbrauchende Enzymsysteme der
Mikroorganismen, wie beispielsweise die mitochondriale NADH-
Dehydrogenase, die Alkoholdehydrogenase und die
Glycerolphosphatdehydrogenase, ausgeschaltet werden.
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Die Wirkung der erfindungsgemäßen Modifizierung der Mikroorganismen
beruht darauf, dass die genannten Enzyme eine höhere Affinität zu diesem
Kofaktor aufweisen.
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Wird das NADH vorzugsweise durch die mit der Xylosereduktase
konkurrierenden Enzyme zu NAD(P) oxidiert, steht der benötigte Kofaktor nicht
in dem für eine hohe Produktivität an Xylit erforderlichen Maß zur Verfügung.
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Durch die erfindungsgemäße Verwendung genetisch modifizierter
Mikroorganismen können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren deutliche
Xylitertragssteigerungen erreicht werden. Damit ist dieses Verfahren eine
attraktive Alternative zu den bisherigen, chemischen Verfahren, in dem es die
beschriebenen Nachteile anderer biotechnologischer Verfahren
aufgabengemäß überwindet.
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Zudem können als besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens als
Rohstoffquellen nachwachsende Rohstoffe eingesetzt werden, und es
entstehen, im Gegensatz zu herkömmlichen, chemischen Verfahren, keine
umweltschädlichen Wirkungen durch die Verwendung von Nickelkatalysatoren.
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Ebenso ist den biotechnologischen Verfahren immanent, dass diese bei
vergleichsweise milden Reaktionsbedingungen arbeiten und somit generell
häufig umweltverträglicher sind als chemische Verfahren. Die Beschreibung
von Ausführungsbeispielen zeigt, wie einzelne Mikroorganismen, insbesondere
Hefen, zunächst modifiziert werden und anschließend zur Xylitproduktion
eingesetzt werden.
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Eine große Bedeutung für biotechnologische Verfahren besitzen Hefen der
Gattung Saccharomyces. Bei diesen Hefen wird das NADH auf verschiedenen
Stoffwechselwegen oxidiert. Hauptsächlich sind die Alkoholfermentation, die
Glycerolproduktion und die Oxidation durch die externen, mitochondrialen
NADH-Dehydrogenasen zu nennen. Diese Enzyme besitzen eine höhere
Affinität zu NADH im Vergleich zur Xylosereduktase, und der Kofaktor wird
somit bevorzugt durch diese Enzyme oxidiert.
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Als Ergebnis des NADH-Verbrauchs durch die skizzierten Abbauwege ist das
NADH-Angebot für die Xylosereduktion limitiert, und Xylit kann nicht in
erhöhtem Maß produziert werden.
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Erfindungsgemäß wird der Gehalt des im Zytoplasma und somit für die
Reaktion mit der Xylosereduktase zur Verfügung stehenden NADH erhöht,
indem bei den Mikroorganismen eines oder mehrere der Enzyme inaktiviert
bzw. deren Expression unterdrückt werden, welche zu einer Oxidation des
NADH führen.
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Die innere Mitochondrienmembran der Hefen ist für NADH undurchlässig;
deshalb richtet sich die Modifizierung des Enzymsystems auf die für die
Oxidation verantwortlichen, zytoplasmatischen NADH-Dehydrogenasen.
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In Saccharomyces cerevisiae kodieren die Gene NDE1 und NDE2 die externen
NADH-Dehydrogenasen, während GPD1 und GPD2 die
Glycerolphosphatdehydrogenasen kodieren. Die Repression einer oder mehrerer der genannten
Gene führt damit erfindungsgemäß zu einer Verminderung des NADH-
Verbrauchs durch die alternativen Stoffwechselrouten, und das NADH steht für
die Xylosereduktase in höherem Maß zur Verfügung.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird gleichfalls bei
Saccharomyces cerevisiae durch die Zugabe von Sulfitsalz (z. B.
Kalziumhydrogensulfit, Natriumsulfit, Kaliumsulfit) in einer Konzentration von 10
bis 40 Gramm pro Litern Substrat der Abbau von Glukose zu Ethanol inhibiert.
Folglich steigt die Produktion von Glycerol an.
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Erfindungsgemäß wird der Bildung von Glycerol entgegengewirkt, indem die
Expression des NADH verbrauchenden Enzyms
Glycerolphosphatdehydrogenase gentechnisch unterdrückt wird.
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Unter diesen Bedingungen steigt die Xylitproduktion, indem der durch die
Unterdrückung der Glycerolphosphatdehydrogenase zusätzlich zur Verfügung
stehende Kofaktor NADH von der Xylosereduktase zur Bildung von Xylit aus
Xylose genutzt werden kann.
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Die erfindungsgemäße Wirkung des Verfahrens mit modifizierten
Mikroorganismen wird insbesondere nach einer Ausführungsform dadurch
ermöglicht, dass die Gene der Mikroorganismen durch rekombinante DNA-
Technologie verändert werden. Alternativ ist die Modifizierung der
Mikroorganismen durch gerichtete oder zufällige Mutagenese möglich.
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Die Veränderung der Mikroorganismen erfolgt in der Weise, dass in einem
ersten Schritt die Sequenzen der Enzyme, welche den NADH-Kofaktor nutzen,
zerstört bzw. so manipuliert werden, dass diese nicht von dem
Mikroorganismus erzeugt werden können oder nur mit verringerter Aktivität
synthetisiert werden.
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Derartige Methoden zur gentechnischen Veränderung von Mikroorganismen
sind Stand der Technik. Die auf diese Weise genetisch manipulierten
Mikroorganismen produzieren vermehrt Xylit und akkumulieren es im
Wachstumsmedium, aus welchem das Xylit durch Kristallisation oder durch
chromatographische Methoden angereichert bzw. gewonnen werden kann. Die
folgende Beschreibung von Ausführungsbeispielen verdeutlicht die
Vorgehensweise der Modifikation der Mikroorganismen und der Gewinnung
von Xylit.
Beispiel 1
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Zunächst wird die Herstellung von Hefestämmen beschrieben, die die
heterologe Xylosereduktase exprimieren.
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Die Expression heterologer Xylosereduktase in Hefe ist Stand der Technik und
wurde beispielsweise im Patent WO 91/15588 beschrieben.
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Pichia stipitis wurde in 100 ml YPD (1 l Medium enthält 10 g Hefeextrakt, 20 g
Pepton und 20 g Glukose, pH = 6,5) über Nacht bei 30°C kultiviert. Zellen aus
10 ml Kultivierungsmedium wurden durch Zentrifugation pelletiert und die
chromosomale DNA nach dem Protokoll von Kaiser et al. (1994) isoliert. Diese
DNA diente als Template zur PCR-Amplifizierung des 956 bp großen
intronlosen, offenen Leserahmens (ORF) des XYL1-Gens (Amore et al. 1993).
Das resultierende Fragment wurde in einem 1% Agarosegel separiert und mit
dem "JETQUICK Gel Extraction Spin Kit" der Firma Genomed aufgereinigt. Das
Plasmid wurde mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen verdaut
und, wie oben beschrieben, aufgereinigt. Als Vektor für die Expression in S.
cerevisiae wurde p425GPD benutzt. Der Vektor ist ein Multicopy-Plasmid und
enthält das LEU2-Gen von S. cerevisiae als Selektionsmarker (Mumberg et al.
1995). Der Vektor wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wie
das Fragment und entsprechend aufgereinigt. Der ORF des XYL1-Gens wurde
in den Vektor ligiert, und rekombinante Plasmide wurden durch
Plasmidpräparation und Restriktionsanalysen identifiziert. In dem so
hergestellten Plasmid (p425GPD-PsXYL1) ist die Transkription von XYL1 unter
Kontrolle des starken GPD-Promotors und stellt eine hohe Expression
exogener XR in S. cerevisiae sicher. Der Stamm S. cerevisiae KOY50 (MATa;
his3Δ1; leu2Δ0; ura3Δ0) wurde mit p425GPD-PsXYL1 nach der Methode von
Schiestl und Gietz (1989) transformiert. Leucin-prototrophe Transformanden
wurden isoliert und analysiert.
Beispiel 2
Inaktivierung der NADH-Dehydrogenasen durch Gen-Replacement der Gene
NDE1 und NDE2
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Die mitochondrial lokalisierte, zytosolische NADH-Dehydrogenase konkurriert
mit der XR um den Kofaktor NADH. Um den Verbrauch an zytosolischem
NADH zu verringern, wurden die Gene NDE1 und NDE2 durch Gen-
Replacement mit geeigneten DNA-Fragmenten inaktiviert. Ein
Replacementfragment mit 40 bp Homologie direkt 5'-seitig des Startkodons von
NDE1 und 40 bp Homologie 3'-seitig des Stopkodons wurde durch PCR
amplifiziert. Das Fragment enthält das his5+-Gen von Schizosaccharomyces
pombe und komplementiert his3-Mutationen in S. cerevisiae (Wach et al.
1997). Nach der Amplifizierung wurde das Fragment, wie oben beschrieben,
isoliert und aufgereinigt. S. cerevisiae KOY50 wurde nach der Methode von
Schiestl und Gietz (1989) mit dem Replacementfragment transformiert.
Histidin-prototrophe Transformanden wurden isoliert. Die korrekte Integration
des Fragments und der Austausch von NDE1 wurde durch diagnostische PCR
nachgewiesen. Ein solcher Stamm (KOY50Δnde1) wurde mit p425GPD-
PsXYL1, wie in Beispiel 1 beschrieben, transformiert und zur Xylitproduktion
eingesetzt.
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Für die Herstellung der Doppelmutante nde1/nde2 wurde ein
Replacementfragment mit Homologien zu NDE2, wie oben beschrieben,
konstruiert. Als Selektionsmarker diente hierbei das kanMX Modul (Wach et al.
1994). Dieses Modul macht Transformanden resistent gegen G418 (Geneticin).
Nach der Transformation wurden die KOY50Δnde1-Zellen auf G418
enthaltendem Medium ausplattiert. Resistente Klone wurden durch
diagnostische PCR auf den korrekten Einbau des Replacementfragments und
Inaktivierung von NDE2 geprüft. Der resultierende Stamm
(KOY50Δnde1Δnde2) wurde mit p425GPD-PsXYL1, wie in Beispiel 1
beschrieben, transformiert und zur Xylitolproduktion eingesetzt.
Beispiel 3
Gen-Replacement der für Glycerolphosphatdehydrogenase kodierenden Gene
GPD1 und GPD2
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Die zytoplasmatischen Glycerolphosphatdehydrogenasen GPD1p und GPD2p
nutzen NADH als Kofaktor. Ihre Inaktivierung führt zu einer vorzugsweisen
Oxidation von zytosolischem NADH durch die Reduktion von Xylose zu Xylitol
mittels XR. Für das Gen-Replacement wurden die Stämme S. cerevisiae
KOY50Δnde1 beziehungsweise KOY50Δnde1Δnde2 genutzt.
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Beide Stämme tragen die ura3Δ0-Mutation. Für die Disruption wurden
Fragmente mit Homologien zu GPD1 und GPD2, wie unter Beispiel 2 für NDE1
beschrieben, genutzt. Die Fragmente enthielten das URA3-Gen von Candida
albicans als Selektionsmarker. Der Selektionsmarker wurde durch zueinander
identische DNA-Abschnitte flankiert (Goldstein et al. 1999). URA3 aus C.
albicans komplementiert ura3-Mutationen in S. cerevisiae. Zellen mit einem
intakten Uracil-Metabolismus sind im Gegensatz zu Zellen mit einer ura3-
Mutation sensitiv gegen 5-Fluor-Orod-Säure (5-FOA). Nach der Integration der
Disruptionskassette ins Genom kommt es an den sich wiederholenden DNA-
Abschnitten zu spontaner, homologer Rekombination und somit zum Verlust
des URA3-Markers. Klone, in denen eine solche Rekombination stattgefunden
hat, sind leicht durch ihre Resistenz gegen 5-FOA zu isolieren.
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Die oben beschriebenen DNA-Fragmente wurden durch PCR amplifiziert und
gereinigt. Das Fragment für das Gen-Replacement von GPD1 wurde nach der
Methode von Schiestl und Gietz (1989) in S. cerevisiae KOY50Δnde1 bzw.
KOY50Δnde1Δnde2 transformiert. Uracil-prototrophe Transformanden wurden
auf dem entsprechenden Selektionsmedium isoliert. Das Replacement von
GPD1 wurde durch diagnostische PCR bestätigt. Danach wurden die so
konstruierten Stämme auf eine 5-FOA-Resistenz selektiert. In 5-FOA-
resistenten Stämmen wurde der Verlust der URA3-Marker durch diagnostische
PCR nachgewiesen. In weiteren Arbeiten wurde schließlich GPD2, wie bereits
oben beschrieben, inaktiviert.
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Die so konstruierten Stämme wurden mit p425GPD-PsXYL1, wie in Beispiel 1
ausgeführt, transformiert und zur Xylitolproduktion eingesetzt.
Beispiel 4
Herstellung von Stämmen mit inaktivierten Dehydrogenasen durch
Tetradenanalyse
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Um Stämme mit mehreren inaktivierten Dehydrogenasen herzustellen, wurden
zunächst die betreffenden Gene einzeln, wie in Beispiel 2 beschrieben,
inaktiviert. Nach der Kreuzung der Einzelmutanten und Sporulation der
entstandenen, diploiden Stämme wurden Tetraden analysiert. Doppelmutanten
können einfach im nichtparentalen Dityp (NPD) identifiziert werden. Der Stamm
KOY50 wurde genutzt, um GPD1 und GPD2, wie für NDE1 in Beispiel 2
beschrieben, durch Gen-Replacement einzeln zu inaktivieren. Transformanden
entgegengesetzten Paarungstyps wurden gekreuzt und die resultierenden
Stämme auf dem entsprechenden Medium zur Sporulation gebracht. Die
Tetraden wurden auf Histidin-Prototrophie getestet. Die GPD1/GPD2-
Doppelnullmutanten wurden als histidin-prototrophe Einsporklone in NPD-
Tetraden isoliert, mit p425GPD-PsXYL1 transformiert und zur Xylitproduktion
eingesetzt.