DE4410028A1

DE4410028A1 - Verfahren zur Herstellung von Xylit aus D-Xylose

Info

Publication number: DE4410028A1
Application number: DE19944410028
Authority: DE
Inventors: Abbas Scharif Dr Afschar; Da Silva Silvio Silvera
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 38124 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date: 1994-03-23
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 1995-11-02

Description

D-Xylose wird durch chemische Hydrolyse von Hemizellulose aus Birkenholz oder anderen hemizellulosereichen Pflanzen gewonnen [1]. Ein beachtlicher Anteil (15 bis 35%) der getrockneten Pflanzenkultur besteht aus Hemizellulose. Der in den USA fermen tierbare Hemizellulose-Zucker aus Pflanzenabfällen wird jährlich auf etwa 175 Millionen Tonnen geschätzt [2]. In Brasilien können 5 bis 12 Millionen Tonnen pro Jahr D-Xylose aus Zuckerrohrba gasse gewonnen werden [3].

Xylit ist ein in der Natur vorkommender fünfwertiger Polyalko hol. Er findet zunehmend Verwendung als Zuckerersatz in der Le bensmittelindustrie. Xylit hat eine starke Süßkraft. Im Ver gleich zu anderen Süßstoffen hat Xylit eine größere negative Lösungswärme. Der Alkohol ist außerdem weniger kariesfördernd [4, 5]. Xylit wird medizinisch als Zuckerersatz bei Diabetikern oder bei Personen mit verminderter Glucose-6-phosphat-dehydro genase eingesetzt [6].

Im industriellen Maßstab wird Xylit durch chemische Reduktion von D-Xylose gewonnen. Da die Hemizellulose andere Zuckerarten und Polymere enthält, ist die Aufarbeitung von D-Xylose oder Xy lit sehr kostspielig. Auch ist die Ausbeute verhältnismäßig ge ring [7]. In Gemüsen oder Früchten kommt Xylit nur in geringer Konzentration vor, so daß die extraktive Gewinnung aus diesem natürlichen Vorkommen unwirtschaftlich ist.

Sehr viele Hefen (yeast species) besitzen NADP⁺-abhängige Xy lose-reduktasen, so daß sie D-Xylose zu Xylit in einem ersten Schritt katalytisch reduzieren können.

D-Xylose kann auch durch Candida boidinii direkt zu D-Xylulose isomerisiert werden [8, 9]. Xylit wird extrazellulär als Neben produkt bei der Ethanolproduktion [10] oder als Hauptprodukt [11] produziert. Bei der Produktion von Xylit spielt die Belüf tungsrate eine wesentliche Rolle [12, 13].

Es existieren einige Veröffentlichungen über die Produktion von Xylit aus D-Xylose. Die meisten Autoren haben diese biologische Umsetzung im Schüttelkolben [11] oder in sehr kleinen Glasrohr reaktoren [14] untersucht und optimiert. Aus diesen Gründen und auch wegen des unterschiedlichen Verhaltens der Hefestämme bei der Vergärung von D-Xylose findet man in der Literatur unter schiedliche und meist widersprechende Angaben. Im folgenden wird eine tabellarische Übersicht über den Stand der Technik gegeben.

Gegenüber diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Xylit unter Verwendung von D- Xylose vorzusehen, das sich unter nicht-sterilen Bedingungen durchführen läßt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Her stellung von Xylit gelöst, bei dem man D-Xylose mit Hilfe eines Stammes der Gattung Candida fermentativ in Xylit überführt, wo bei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man bei einem pH-Wert 4,0 nicht-steril fermentiert.

Man kann das erfindungsgemäße Verfahren bei einem pH-Wert im Be reich von 3,5 bis 2,0, insbesondere 3,0 bis 2,3 und vorzugsweise 2,6 bis 2,4 durchführen.

Candida-Stämme, mit denen sich das erfindungsgemäße Verfahren bei den angegebenen pH-Werten durchführen läßt, sind dadurch er hältlich, daß man Stämme der Gattung Candida in an sich bekann ter Weise in einem Medium mit einem Gehalt an D-Xylose kulti viert und einem Screening auf einen Stamm unterwirft, der bei einem pH-Wert von etwa 2,5 eine Xylitkonzentration liefert, die der Xylitkonzentration, die sich mit anderen dem Screening unterworfenen Stämmen erzielen läßt, um den Faktor 10 bis 1000 überlegen ist, und den ermittelten Stamm isoliert.

Erfindungsgemäß kann man Stämme von Candida tropicalis, Candida guilliermondii oder Candida parapsilosis verwenden, beispiels weise Candida tropicalis DSM 7524 oder einen Abkömmling dieses Stammes.

Erfindungsgemäß kann man im mikroaeroben Zustand fermentieren, insbesondere bei einer Belüftungsrate im Bereich von 0,6 bis 1,3 und vorzugsweise 0,8 bis 1,0 ml Sauerstoff/l Kulturmedium.

Erfindungsgemäß kann man bei einer D-Xylose-Konzentration im Be reich von 80 bis 130 und insbesondere 90 bis 120 g D-Xylose/l Kulturmedium fermentieren.

Erfindungsgemäß kann man die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 45°C, insbesondere 27 bis 42°C und ins besondere 30 bis 40°C durchführen.

D-Xylose kann man in das erfindungsgemäße Verfahren in Form von hydrolysierter Bagasse oder hydrolysierter Hemizellulose als Substrat einsetzen.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform läßt sich erfindungsgemäß D-Xylose als einzige Kohlenstoffquelle verwenden.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich gemäß einer wichtigen Ausführungsform batch-weise bzw. als Satzfermentation durchfüh ren.

Dabei hat sich gezeigt, daß es vorteilhaft ist, mit Substrat shift zu arbeiten, da hohe Substratkonzentrationen wachtumslimi tierend wirken können.

Für die batch-weise Ausführungsform kann man die Zellen des ein gesetzten Candida-Stammes immobilisiert verwenden, insbesondere auf einem porösen keramischen Trägermaterial.

Bei der batch-weisen Ausführungsform kann man beispielsweise mit einem Substratshift von etwa 100 g D-Xylose/l, einem pH-Wert von etwa 2,5, einer Belüftungsrate von etwa 0,8 bis 1,0 ml Sauer stoff/l Kulturmedium und bei einer Temperatur von 30 bis 40°C und insbesondere etwa 37°C arbeiten.

Unter den angegebenen Bedingungen wurde beispielsweise Candida tropicalis DSM 7524 verwendet und mit dessen Hilfe D-Xylose im microaeroben Zustand zu Xylit verarbeitet. Bei geringer Belüf tung kommt es zu einer Ansammlung von NADH, wobei D-Xylose hauptsächlich zu Xylit reduziert wird. Der verwendete Stamm zeigt keine starke Temperatur- und auch keine starke pH-Abhän gigkeit. Er verarbeitet D-Xylose bei einem pH-Wert von etwa 2,5 mit optimaler Ausbeute zu Xylit. Derart niedrige pH-Werte ermög lichen eine unsterile Kultivierung, was von großer wirtschaft licher Bedeutung ist. Bei einem Sauerstoffeintrag von 0,8 bis 1 ml Sauerstoff/l Kulturmedium produziert DSM 7524 beispielsweise Xylit mit einer Ausbeute von 77 bis 80% der Theorie. D-Xylose kann in höheren Konzentrationen auf Candida tropicalis wachs tumslimitierend wirken. Für DSM 7524 wurde bei einer D-Xylose- Konzentration von etwa 100 g D-Xylose/l die höchste Xylitaus beute erreicht.

Man arbeitet daher gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Substratshift. Beispielsweise werden in einer Batch-Kultur von DSM 7524 mit Substratshift aus 300 g D-Xylose/l etwa 220 g Xylit/l mit einer Xylitproduktivität von 0,37 g Xylit/l h produziert. Auch in diesem Fall kann die Fermentation unsteril durchgeführt werden, etwa bei einem pH- Wert von 2,5.

Das Arbeiten mit Substratshift berücksichtigt, daß die biolo gische Reaktion sehr langsam verläuft und stark belüftungsabhän gig ist. Die Bedingungen für eine optimale Xylitausbeute einer seits und optimales Zellwachstum bzw. optimale Xylitproduktivi tät andererseits sind unterschiedlich. Während bei DSM 7524 ein niedriger pH-Wert von etwa 2,5, eine niedrige Belüftungsrate von etwa 0,8 bis 1 ml Sauerstoff/l Kulturmedium und eine hohe Sub stratkonzentration von etwa 100 g D-Xylose/l die Xylitbildung begünstigen, sind für die Zellproduktion ein wesentlich höherer pH-Wert, eine höhere Belüftungsrate und eine niedrigere Sub stratkonzentration empfehlenswert. Einer niedrigeren Substrat konzentration kommt Substratshift entgegen.

Gemäß einer weiteren wesentlichen Ausführungsform der Erfindung wird das Verfahren kontinuierlich durchgeführt. Dabei verwendet man den eingesetzten Candida-Stamm vorzugsweise immobilisiert, insbesondere auf einem porösen keramischen Trägermaterial, oder man arbeitet vorzugsweise unter Zellrückhaltung. Durch dieses Vorgehen lassen sich höhere Zellkonzentrationen und damit höhere Produktivitäten erreichen.

Da DSM 7524 bei batch-weiser Fermentation mit Substratshift (ohne Immobilisierung oder Zellrückhaltung) bereits Produktkon zentrationen von etwa 220 g Xylit/l liefert, ist ein kontinuier liches Verfahren, bei dem batch-weise unter Zellimmobilisierung oder Zellrückhaltung bei kontinuierlicher Zufuhr und kontinuier lichem Abzug von Medium gearbeitet wird, besonders bevorzugt. Auch hier ist Substratshift vorteilhaft.

Beispielsweise lassen sich, wenn man DSM 7524 auf porösem Sin terglas immobilisiert und den Stamm batch-weise fermentiert, beispielsweise in einem Wirbelschichtreaktor (fluidized bed reactor), in kontinuierlicher und unsteriler Kultur aus 155 g D- Xylose/l 90 bis 95 g Xylit/l mit einer Produktivität von 1,35 g Xylit/l h produzieren.

Bei Zellimmobilisation eignet sich ein Wirbelschichtreaktor.

Allgemein wird anerkannt, daß sich biologische Prozesse durch Reinheit der Produkte und schonende Herstellungsweise auszeich nen. Derartige Prozesse können aber durch einen höheren Energie verbrauch und eine geringere Produktkonzentration oft unwirt schaftlich sein. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird nun eine Lehre gegeben, nach der sich zusätzlich zur befriedigenden Reinheit des Produkts auch ein niedriger Energieverbrauch (nicht-steriles Arbeitsverfahren) und höhere Produktkonzen trationen erreichen lassen. Die Aufarbeitungskosten des erfin dungsgemäßen Verfahrens sind unzweifelhaft beträchtlich kosten günstiger als die eines rein chemischen Verfahrens. Auch ist das aufgearbeitete Produkt für die Lebensmittelindustrie besser ge eignet als das nach einem rein chemischen Verfahren hergestellte Produkt.

Nachstehend wird die Erfindung durch Abbildungen und experimen telle Daten näher erläutert.

Abb. 1 schematische Anordnung einer Wirbelschicht Reaktor.

Abb. 2 Abhängigkeit der Xylitausbeute von der Belüftung bei einer C. tropicalis Batchkultur.

Abb. 3 Einfluß der D-Xylose-Konzentration auf die Xylitproduktivität und spez. Xylitproduktivität bei einer C. tropicalis Kultur.

Abb. 4 Einfluß der D-Xylose-Konzentration auf die Xylitausbeute bei einer C. tropicalis Kultur.

Abb. 5 Abhängigkeit der Xylitkonzentration, Restzucker, und Biotrockenmasse von der Zeit in einer Batchkultur.

Abb. 6 Abhängigkeit der Xylitkonzentration, Restzucker, und Biotrockenmasse von der Zeit in einer Batchkultur mit Substrat shift.

Abb. 7 Abhängigkeit der Xylitkonzentration, Restzucker, und Biotrockenmasse von der Zeit in einer Batchkultur mit Substrat shift.

Abb. 8 Elektronenmikroskopische Aufnahmen der immobilisierten C. tropicalis DSM 7524 an der Oberfläche von Siran-Carrier.

Abb. 9 Abhängigkeit der Xylitkonzentration und Restzucker von der Zeit in einer kontinuierlicher Kultur von C. tropicalis mit einer Verdünnungsrate von 0.015 h⁻¹.

Experimentelles Mikroorganism

Candida tropicalis DSM 7524 wurde für die Untersuchungen eingesetzt. Dieser Stamm wurde von der "Faculty of Chemical Engineering of Lorena, University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brasilien" unter dem Namen Candida guilliermondii FTI 20037 zur Verfügung gestellt. Die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, Braunschweig, Germany) identifizierte den Stamm als C. tropicalis mit der Sammlungsnummer 7524.

Konservierungsmedium

Die Kultur wurde in Schrägagar bei 30°C incubeted und bei 4°C aufbewahrt. Das Aufbewahrungsmedium enthielt pro Liter deionisiertem Wasser: 6.7 g Yeast Nitrogen base (W/o) Amino Acid (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA), 20 g D-Xylose und 20 g Agar. Die Lösung der Yeast Nitrogen base wurde steril filtriert und mit steril autoklaviertem Zucker- und Agarlösung anschließend gemischt. Die Kultur wurde nach etwa zwei Wochen auf neues Agar übertragen.

Vorkulturmedium

Das Vorkulturmedium enthielt pro Liter deionisiertem Wasser: 5 g (NH4)₂SO₄, 0.5 g MgSO₄ · 7 H₂O, 1 g KH₂PO₄, 0.1 g CaCl₂ · 2 H₂O, 1 g yeast extract und 30 g D-Xylose. Die Zuckerlösung wurde steril filtriert und anschließend mit autoklavierter Salz- und Hefeextraktlösung gemischt. Die Kultur wurde von Schrägagar in einen Erlenmeyerkolben (ohne Schikanen) mit 200 ml Medium übertragen und bei einer Temperatur von 30°C und einer Schüttelge schwindigkeit von 150 rpm geschüttelt. Nach etwa 40 Stunden wurde mit der vorbereiteten Vorkultur der Fermenter beimpft.

Produktionsmedium

Das Fermentationsmedium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das Vorkulturmedium mit dem Unterschied, daß das Fermentationsmedium keine D-Xylose enthielt. Bei den Batch- bzw. kontinuierlichen Fermentationen wurde je nach Art der Untersuchungen die entsprechende Menge Zucker dem Medium beigemischt. Bei den Batchfermentationen mit Substrat shift wurde die gesamte Salz- und Hefeextraktlösung zu Beginn der Fermentation zugegeben und anschließend eine hochkonzentrierte Zuckerlösung in shiften zudosiert.

Batchkulturen

Alle Fermentationen erfolgten in batch-Form mit Substratshift in 2.5 l Fermentern (Applikon B. V., Schiedam, Netherlands) bei 30°C. Der pH-Wert wurde bei 2.5 mit 2 molarer KOH geregelt. Die Begasung erfolgte bei 20 ml min^-1 Luft und wurde bei einer Rührergeschwindigkeit von 300 rpm (einem k_la-Wert von 2 h^-1) geregelt.

Ein Prozeßleitsystem (UBICON, ESD, Hannover, Germany) kontrollierte den pH- Wert, die Temperatur sowie die Substratzugabe. Die Änderung der optischen Dichte wurde durch eine Durchflußzelle on-line gemessen und vom Prozeßleitsystem aufgenommen.

Kontinuierlichenkulturen

Die Kultur wurde in einer kontinuierlichen Kultur optimiert. Weitere kontinuier liche Kultivierungen wurden in einem Wirbelschichtreaktor (Fa. Bioengineering, Wald, Schweiz) durchgeführt (Abb. 1).

Der Reaktorteil dieses Fermenters hatte einen Durchmesser von 50 mm, eine Höhe von 360 mm und war gefüllt mit 273 g mikroporösem Glas (Siran, Schott, Germany: SIKUG 012102/300/A). Die Glaspartikel hatten einen Durchmesser von 0.2 bis 2 mm und eine Porengröße von < 300 µm. Die Flüssigkeit in dem Fermenter wurde mit einer Geschwindigkeit von 210 l h^-1 umgepumpt. Dadurch entstand einer Festbettexpansion von etwa 80%, diese Expansion verringerte sich mit der Zunahme der Zellablagerung. Der Wirbelschichtreaktor war mit einer pH-Elektrode, einem ??? pT100 sensor und einer P_O2-Elektrode ausgerüstet.

Ein Prozeßleitsystem (UBICON, ESD, Hannover, Germany) kontrollierte den pH- Wert, die Temperatur sowie die Substratzugabe. Die Temperatur wurde mit Hilfe eines Thermostaten durch den Außenmantel des Fermenters bei einer Temperatur von 30°C konstant gehalten. Der pH-Wert wurde auf einen Wert von 2.5 durch 2M KOH geregelt. Die Kultur wurde durch 15 ml min^-1 Luft begast. Das Arbeitsvolumen des Wirbelschichtreaktors wurde bei einem Volumen von 1.4 l konstant gehalten. Die Fermentationen wurden erst als Batchkultur betrieben und anschließend (nach etwa 60 bis 70 Stunden) auf kontinuierlich umgestellt.

Analytische Methoden

Die Zellkonzentration würde durch Messung der optischen Dichte bei 578 nm und der Zelltrockenmasse (zentrifugiert bei 10000 Upm und 24 Stunden bei 80°C getrocknet) bestimmt. Die D-Xylose- und Xylitkonzentration wurde durch HPLC mit Sugar-Pak-Säule und Refraktometer (Waters, Division of Millipore, USA) gemessen. Die Messungen von Ethanol und Methanol erfolgten mit einem Gaschromatographen (Shimadzu, Kyoto, Japan) mit Flammenionisations detektor und einer mit Chromosorb 101 gefüllten, 2 m langen Glassäule. Die Sauerstoffeintragsrate (oxygen transfer rate) wurde nach der von Pirt entwickelten Methode (gasing-out Methode) gemessen [15]. Bei dieser Methode wurde zuerst der vorhandene Sauerstoff durch Begasung mit Stickstoff ausgetrieben. Das sauerstofffreie Medium wurde anschließend gerührt und belüftet und die Änderung der Sauerstoffkonzentration registriert. Aus der Änderung der Konzentration des gelösten Sauerstoffs in Abhängigkeit von der Zeit wurde der volumetrische Sauerstoffeintragskoeffizient (k_La) berechnet.

Ergebnisse Einfluß der Temperatur

In den kontinuierlichen sowie in den Batchfermentationen sind C. tropicalis Kulturen in dem Bereich von 30 bis 37°C weitgehend temperaturunabhängig. Bei Temperaturen höher als 37 °C verringert sich die Xylitausbeute sehr stark.

Einfluß des pH-Wertes

Die C. tropicalis Kultur ist nicht sehr pH-Wert abhängig. Sie ist imstande, bei einem pH-Wert von 2.5 mit optimaler Ausbeute D-Xylose in Xylit umzuwandeln. Mit der Erhöhung des pH-Wertes von 2.5 auf 4.0 erhöht sich die Xylitproduk tivität, erniedrigt sich aber die Xylitausbeute. Mit weiterer Erhöhung des pH- Wertes verringern sich sowohl die Xylitproduktivität als auch die Xylitausbeute. Eine Kultivierung bei einem niedrigen pH-Wert von 2.5 hat zusätzlich den Vorteil, daß die Kultivierung nicht im sterilen Zustand durchgeführt werden muß, was wirtschaftlich vorteilhaft ist.

Einfluß der Belüftung

D-Xylose als Substrat induziert bei den Hefestämmen die Produktion von zwei spezifischen Enzymen in zwei nacheinander folgenden Schritten. Der erste Schritt ist die Produktion von Xylose Reductase Enzym für die Reduzierung (reduction) von D-Xylose zu Xylit in Abhängigkeit von dem vorhandenen NADPH. Der zweite Schritt ist die Produktion von Xylit Dehydrogenase Enzym zur Oxidation von Xylit zu D-Xylulose mit Verbrauch von NAD. In einem mikro- oder semiaeroben Zustand verringert sich die oxidative Umwandlung von Xylit zu D-Xylulose und es kommt zu einer Ansammlung von NADH. Das Gleichgewicht liegt hier auf der Seite der Reduktion, somit kann eine katalytische Oxidation nicht begünstigt ablaufen [16, 10].

Die Wachstumsrate der C. tropicalis erhöht sich mit der Erhöhung der Belüftungsrate. Da sie eine Carbtree-negative Hefe ist, produziert sie bei vollständig aerober Kultivierung weder Ethanol noch Xylit und die Kohlehydrate werden vollständig veratmet. Bei einer Verringerung der Belüftung, im mikroaeroben Bereich, wird D-Xylose zu Ethanol als Haupt- und zu Xylit als Nebenprodukt verarbeitet. Der gelöste Sauerstoff im Fermentationsmedium beeinflußt direkt die NADH-Konzentration in der Zelle, die Belüftungsrate ist daher der wichtigste Parameter für die Produktion von Xylit. Unter dem anaeroben Zustand kommt es zu einer Ansammlung von NADH in der Zelle, wobei das Redoxgleichgewicht gestört wird, aus diesem Grund wird die biologische Umwandlung langsamer oder es kommt das biologische System vollständig zum Stillstand [17].

Unsere Untersuchungen zeigen, daß mit Verringerung des Sauerstoffeintrags eine höhere Xylit-Ausbeute erreicht wird (Abb. 2).

Bei einem Sauerstoffeintrag von 0.8 bis 1 ml Sauerstoff pro Liter Kulturmedium wird eine Ausbeute von 77 bis 80% des theoretischen Wertes von 0.9 mol Xylit pro mol D-Xylose erreicht. Mit Verringerung des Sauerstoffeintrags kann auf Kosten der Xylit-Produktivität eine höhere Xylit-Ausbeute erreicht werden.

Mit Erhöhung des Sauerstoffeintrags erniedrigt sich die Xylit-Ausbeute und die damit verbundene Xylit-Endkonzentration, es steigt jedoch die Zellwachstums rate und die damit verbundene Xylit-Produktivität.

Einfluß des Hefeextrakts

C. tropicalis DSM 7524 kann auch andere Zucker wie Glucose, Maltose, Mannose und Galactose aufnehmen. Die spezifische Aufnahmefähigkeitsraten der oben genannten Zucker sind in der Reihenfolge 2.2, 2.0, 1.8 und 1.5 mal höher als die der D-Xylose.

Bei Anwesenheit von Maltose oder Glucose in höheren Konzentrationen im Nährmedium ist C. tropicalis oft nicht imstande, D-Xylose mit guter Ausbeute zu Xylit zu verarbeiten. Unsere Untersuchungen zeigen, daß bei Zusatz von 10 g l^-1 Glucose oder Maltose in ein xylosehaltiges Medium die Weiterverarbeitung von D-Xylose zu Xylit dem Zufall überlassen ist. Das heißt, daß nach einer Verarbeitung von Glucose oder Maltose mit der damit verbundenen höheren Wachstumsrate C. tropicalis DSM 7524 sich häufig nicht auf die Umwandlung von D-Xylose zu Xylit umstellen kann. Für solche Degenerierungserscheinungen fanden wir keine wissenschaftliche Erklärung. Bei Zugabe von Hefeextrakt in Konzentrationen über 15 g l^-1 in das xylosehaltige Nährmedium beobachteten wir die gleichen Degenerierungserscheinungen. Dies ist wahrscheinlich auf die Anwesenheit von Maltose im Hefeextrakt zurückzuführen.

Um den Bedarf an wichtigen Spurenelementen zu decken, empfehlen wir bei der biologischen Umsetzung von D-Xylose zu Xylit eine Zugabe von maximal 1 g l^-1 Hefeextrakt.

Einfluß der Substratkonzentration

D-Xylose in hohen Konzentrationen limitiert das Wachstum von C. tropicalis DSM 7524. Durch die Erhöhung der D-Xylose-Konzentration von 20 auf 200 g l^-1 durchläuft die spez. Xylitproduktivität bzw. die Xylitproduktivität ein Maximum bei einer Xylosekonzentration von 50 g l^-1 (Abb. 3).

Das bedeutet, daß bei einer D-Xylose-Konzentration von 50 g l^-1 die geringste Substratlimitierung vorliegt und die Umsetzung der D-Xylose zu Xylit mit höchster Geschwindigkeit verläuft. Bei Konzentrationen geringer als 50 g l^-1 wird die Produktion von Xylit weniger angeregt und es wird ein beachtlicher Anteil der Kohlehydrate veratmet.

C. tropicalis produzieren Xylit nicht mit maximaler Ausbeute, wenn sie die höchste Wachstumsrate haben, sondern wenn sie durch höhere D-Xylose- Konzentrationen limitiert sind. Die höchste Xylitausbeute wird bei einer D-Xylose-Konzentration von etwa 100 g l^-1 erreicht (Abb. 4).

Verschiedene Batch Kultivierungen bestätigen der limitierenden Einfluß von D-Xylose auf C. tropicalis DSM 7524. Eine nicht steril durchgeführte einfache Batchfermentation mit 300 g l^-1 D-Xylose in der Anfangskonzentration, einem pH-Wert von 2.5 und einem Sauerstoffeintrag von 0.8 bis 1 ml O₂ pro Liter Kulturflüssigkeit produziert nach 800 Std. etwa 220 g l^-1 Xylit (Abb. 5).

Diese Kultivierung verläuft mit einer Xylitausbeute von 0.74 g Xylit pro g D-Xylose und einer Xylitproduktivität von 0.28 g l^-1 h-¹.

Bei der Wiederholung der oben beschriebenen Batchfermentation, wobei aber die Dosierung des Substrats in shifts erfolgt, kann die Fermentationszeit wesentlich verkürzt werden (Abb. 6).

Bei dieser Batchfermentation mit Substrat shift erhöht sich die Xylitproduktivität auf 0.37 g l^-1 h-¹.

Bei einer Produktkonzentration von etwa 200 g l^-1 ist die Produktinhibierung sehr hoch und deshalb die Produktivität sehr gering. Bei der Umwandlung von geringeren Mengen D-Xylose und einer Produktion von nur 100 g l^-1 Xylit in einer Batchfermentation mit Substrat shift ist es möglich, die Xylitproduktivität auf 0.56 g l^-1 h-¹ zu erhöhen (Abb. 7).

C. tropicalis produziert in einer Batchkultur maximal 3 bis 5 g l^-1 Biotrocken masse (Abb. 5 bis 7). Üblicherweise läßt sich durch die Erhöhung der Zellkonzentration bei Immobilisierung oder Zellrückführung die Produktivität und die Produktkonzentration erhöhen.

C. tropicalis DSM 7524 läßt sich sehr gut auf porösem Sinterglas immobilisieren.

Abb. 8a zeigt, daß die Poren schnell und ausreichend mit Hefezellen gefüllt werden. Die immobilisierten Zellen sind deutlich in einem intakten Zustand (Abb. 8c) und tendieren zur Myzelbildung (Abb. 8b).

Die kontinuierlichen und immobilisierten Kulturen von C. tropicalis verarbeiten in Wirbelschichtreaktoren D-Xylose mit höheren Ausbeuten zu Xylit. Da diese kontinuierliche Kultivierung bei einem pH-Wert von 2.5 durchgeführt wird, ist eine sterile Verarbeitung nicht notwendig. Hierbei wird aus 155 g l^-1 D-Xylose 90 bis 95 g l^-1 Xylit mit einer Produktivität von 1.35 g l^-1 h-¹ produziert (Abb. 9).

References

1. Hyvönen, L. and Koivistoinen, P.: Food Technological evaluation of Xylitol. Adv. in Food Research. 28 (1983) 373-403.
2. Slininger, P. J.; Bolen, P. L.; and Kurtzman, C. P.: Pachysolen tannophilus: Properties and process considerations for ethanol production from D-xylose. Enzyme Microb. Technol. 9 (1) (1987) 5.
3. Burg, R.: Este bagaco nâo ´ de jogar fora. A grania 44 (484) (1988) 16-26.
4. Havenaar, R.; Huis in T; Veld, J.H.J.; Stoppelaar, J.D.; Backer Dir Ks, O.: Anti-cariogenic and remineralizing properties of xylitol in Combination with sucrose in rats inoculated with Streptococcus mutans. Caries Research, 18 (1984) 269-277.
5. Wäler, S. M.; Assev, S.; Rölla, G.: Xylitol 5-P formation by dental plaque after 12 weeks′ exposure to a xylitol/sorbitol containing chewing gum. Scand. J. Dent. Res. 100 (1992) 319-321.
6. Van Eys, J.; Wang, Y. M.; Chan, S.; Tanphaichitr, V. S.; and King, S. M.: Xylitol as a Therapeutic Agent on Glucose-6-Phosphate Dehyrogenase Deficiency. In: Sugars in Nutrition, H. L. Sippie, and K. W. McNutt, eds. New York: Academic Press (1974) p. 613.
7. Melaja, A. and Hämälainen, L. 1977 Process for making xylitol. US patent 373-403.
8. Dahiya, J. S.: Xylitol production by Petromyces albertensis grown on medium containing D-xylose. Can. J. Microbiol. 37 (1991) 14-18.
9. Vongsuvanlert, V.; and Tani, Y.: Xylitol production by a methanol yeast, Candida boidinii (Kloeckera sp.) No. 2201. J. Ferment. Technol. 1 (1989) 35-39.
10. Prior, B. A.; Kilian, S. G.; Du Preez, J. C.: Fermentation of D-xylose by the Yeasts Candida shehatae and Pichia Stipitis, prospects and problems. Process Biochmistry 2 (1989) 21-32.
11. Barbosa, M. F. S.; De Meideiros, M. B.; De Mancilha, I. M.; Schneider, H.,; and Lee, H: Screening of yeasts for production of xylitol from D-xylose and some factors wich affect xylitol yield in Candida guilliermondii. J. of Indust. Microbiol 3 (1988) 241-251.
12. Furlan, S. A.; Dupuy, M. L.; and Strehaiano, P. Bioconversion of D-xylose: Aeration and Kinetics. International Conference Biotechnology and Food February (1989) 20-24, Stuttgart, Germany.
13. Rizzi, M.; Klein, C:; Schulze, C.; Bui-Thanh, N.-A.; and Dellweg, H.: Xylose Fermentation by Yeasts 5. Use of ATP balances for Modeling oxygen- Limited Growth and Fermentation of Yeast Pichia stiptis with Xylose as Carbon source. Biotech. Bioeng. 34 (1989) 509-514.
14. Horitsu, H.; Yahashi, Y.; Takamizawa, K.; Kawai, K.; Suzuki, T.; and Watanabe, N.: Production of Xylitol from D-Xylose by Candida tropicalis. Biotechnol. Bioeng. 40 (1992) 1085-1091.
15. Pirt, J. S. Principles of Microbe and Cell Cultivation, pp. 65, New York, Blackwell Scientific Publications 1975.
16. Roseiro, J. C., Peito, A., Girio, F. M., and Amaral-Collaco, M. T.: The effects of the oxygen transfer coefficient and substrate concentration on the xylose fermentation by Debaryomyces hansenii. Arch. Microbiol. 156 (1991) 484-490.
17. Bruinenberg, P. M.; De Bot, P. H. M.; Van Dilken, J. P.; and Scheffers, W. A.: NADH-linked aldose reductase: the key to anaerobic alcohol fermentation of xylose by yeast. Appl. Microbiol. Biotechnol. 19 (1984) 256-260.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Xylit, bei dem man D-Xylose mit Hilfe eines Stammes der Gattung Candida fermentativ in Xylit überführt, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert 4,0 nicht-steril fermentiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 2,0, insbesondere 3,0 bis 2,3 und vorzugsweise 2,6 bis 2,4 fermentiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm verwendet, der dadurch erhältlich ist, daß man Stämme der Gattung Candida in an sich bekannter Weise in einem Medium mit einem Gehalt an D-Xylose kultiviert und einem Scree ning auf einen Stamm unterwirft, der bei einem pH-Wert von etwa 2,5 Xylitkonzentrationen liefert, die der Xylitkonzentration, die sich mit anderen dem Screening unterworfenen Stämmen erzielen läßt, um den Faktor 10 bis 1000 überlegen ist, und den ermittelten Stamm isoliert.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Candida tropicalis, Can dida guilliermondii oder Candida parapsilosis verwendet.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Candida tropicalis DSM 7524 oder einen Abkömmling dieses Stammes verwendet.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man im mikroaeroben Zustand fermentiert, insbesondere bei einer Belüftungsrate im Bereich von 0,6 bis 1,3 und vorzugsweise 0,8 bis 1,0 ml O₂/l Kulturmedium.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer D-Xylose-Konzentration im Be reich von 80 bis 130 und insbesondere 90 bis 120 g D-Xylose/l Kulturmedium fermentiert.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 45°C, insbesondere 27 bis 42°C und insbesondere 30 bis 40°C fermentiert.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man D-Xylose dadurch in das Verfahren ein setzt, daß man hydrolysierte Bagasse oder hydrolysierte Hemizel lulose als Substrat verwendet.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man D-Xylose als einzige Kohlen stoffquelle verwendet.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren batch-weise (Satzfermen tation) durchführt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit Substratshift durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen des eingesetzten Candida-Stammes immobili siert verwendet, insbesondere auf einem porösen Glas oder keramischen Trägermaterial.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Substratshift von etwa 100 g D-Xylose/l, einem pH-Wert von etwa 2,5, einer Belüftungsrate von etwa 0,8 bis 1,0 ml Sauerstoff/l Kulturmedium und bei einer Temperatur von 30 bis 40°C und insbesondere etwa 37°C arbeitet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß man das Verfahren kontinuierlich durchführt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen des eingesetzten Candida-Stammes immobilisiert ver wendet, insbesondere auf einem porösen Glas als Trägermaterial.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren unter Zellrückhaltung durchführt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch ge kennzeichnet, daß man kontinuierlich Medium zuführt und kontinuierlich Medium abzieht.

19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei oder mehr Satzfermentationen hintereinander durchführt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Satzfermentationen mit Substratshift durchführt.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren in einem Wirbelschichtre aktor durchführt.