DE602004008875T2 - Herstellung von milchsäure aus einem pentose-enthaltenden substrat - Google Patents
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Classifications
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Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Diese Erfindung betrifft die Produktion von Milchsäure aus Pentosehaltigem Substrat, insbesondere aus Xylose-haltigem Substrat.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Milchsäure und ihre Salze, welche als Lactat bekannt sind, sind kommerziell brauchbare Produkte, welche auf verschiedenen Gebieten, umfassend Medizin, bioabbaubare Polymere und Nahrungsmittelverarbeitung, nützlich sind. Gegenwärtig wird Milchsäure kommerziell hergestellt aus Glucose, Stärke, verflüssigter Stärke oder Saccharose. Derzeit stellen diese Substrate einen wichtigen Beitrag zum Herstellungskostenpreis von Milchsäure dar. Lignocellulose-Biomasse stellt eine kostenattraktive Alternative als Substrat für die biologische Erzeugung von Milchsäure bereit, da sie auf einfache Weise verfügbar ist, keinen in Konkurrenz stehenden Nahrungswert hat und weniger teuer ist als Stärke oder Saccharose. Theoretisch wäre ein Mikroorganismus in der Lage, die Zucker, welche in der Biomasse enthalten sind, zu Milchsäure zu fermentieren. Jedoch schließen mehrere Hindernisse eine effiziente Verwendung dieses Ausgangsstoffs durch einen Mikroorganismus zur Milchsäureproduktion aus. Lignocellulose-Substrate sind zum Großteil zusammengesetzt aus Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Obwohl mehrere Organismen die Glucose-Komponente in Cellulose effizient fermentieren können, hat sich die Umwandlung der Pentose-Zucker, welche in der Hemicellulosefraktion der Biomasse enthalten sind, als schwierig erwiesen. Die in Hemicellulose am häufigsten vorkommenden Pentose-Zucker umfassen D-Xylose und L-Arabinose. Die Fermentation von Xylose und Arabinose bleibt ein Haupthindernis für eine wirtschaftliche Umwandlung von aus Pflanzen stammender Biomasse.
- Viele heterolaktische und fakultativ heterolaktische Milchsäurebakterien können Pentosen fermentieren. Der Stoffwechselweg, welcher von diesen Organismen verwendet wird, um diese Zucker zu fermentieren, ist einfach: Eine Pentose, z.B. D-Xylose (Aldose) tritt in die Zelle ein, wo sie zu Xylulose (Ketose) isomerisiert wird und anschließend unter Verbrauch von 1 ATP phosphoryliert wird, um Xylulose-5-Phosphat zu ergeben, welches anschließend gespalten wird zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Acetyl-Phosphat durch Phosphoketolase (EC 4.1.2.9). Dieser Stoffwechselweg ist als der Phosphoketolase-Weg bekannt (Lengeler, J.W.; G. Drews; H.G. Schlegel, Biology of prokaryotes, 1999, Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland). Das Glycerinaldehyd-3-Phosphat, welches in der Phosphoketolase-Reaktion erzeugt wird, wird zu Brenztraubensäure wie im Emden-Meyerhof-Weg umgewandelt, wobei dies zu 2 ATP und 1 NADH2 führt (Lengeler, J.W.; G. Drews; H.G. Schlegel, Biology of prokaryotes, 1999, Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland). Brenztraubensäure wird abschließend mit NADH2 zu Milchsäure reduziert. Das Acetyl-Phosphat, welches in der Phosphoketolase-Reaktion erzeugt wird, wird durch Acetatkinase (EC 2.7.2.1) unter Bildung von 1 ATP zu Acetat umgewandelt. Im Verlauf der Fermentierung einer Pentose wird 1 NADH2 gebildet und verbraucht; die netto ATP-Ausbeute ist 2 pro Mol Pentose. Heteroenzymatische Milchsäurebakterien verwenden zur Fermentierung von Hexosen einen ähnlichen Weg. Eine Hexose, z.B. Glucose, wird zuerst zu Glucose-6-Phosphat phosphoryliert, oxidiert um 6-Phosphoglucanat zu ergeben und abschließend oxidativ decarboxyliert, um Ribulose-5-Phosphat und Kohlendioxid zu ergeben. Die Epimerisierung von Ribulose-5-Phosphat ergibt Xylulose-5-Phosphat, welches in den Phosphoketolase-Weg eintritt. Im Gegensatz zur Fermentierung von Pentosen erzeugt die Fermentierung von Hexosen durch heteroenzymatische Milchsäurebakterien einen Überschuss an Reduktionsleistung (3 NADH2), welcher verwendet wird, um Acetyl-Phosphat zu Ethanol und Brenztraubensäure zu Milchsäure zu reduzieren. In diesem Schema wird aus Acetyl-Phosphat keine Essigsäure erzeugt, da die ATP-Ausbeute der Fermentierung von Hexosen nur halb so groß ist wie die der Fermentierung von Pentosen; es wird 1 ATP pro Mol Hexose fermentiert. Im vorausgehend beschriebenen Stoffwechselweg der Pentose-Fermentierung spielt das Enzym Phosphoketolase eine schicksalsbestimmende Rolle, da es dieses Enzym ist, welches das C5-Kohlenstoffgerüst der Pentosen in einen C3-Rest aufbricht, welcher schließlich als Milchsäure gewonnen werden kann und einen C2-Rest, welcher schließlich als Essigsäure endet. Für die Herstellung von Milchsäure, welche verständlicherweise auf eine maximale Lactat-Ausbeute gerichtet ist, ist die Bildung von Essigsäure verschwenderisch. Eine kleine Zahl von Berichten zeigt aber, dass einige Lactobacillus-Spezies, z.B. Lactobacillus-Spezies MONT4, bestimmte Pentosen nahezu ausschließlich zu Milchsäure fermentieren (Barre, P., Identification of thermobacteria and homofermentative, thermophilic Pentose utilizing Lactobacilli from high temperature fermenting grape must, J. Appl. Bacteriol. 1978, 44, 125–129). In der Lactobacillus-Spezies MONT4 werden Pentosen dissimiliert durch einen Weg, welcher keine Phosphoketolase umfasst, sondern durch einen Stoffwechselweg, welcher eine Transaldolase (EC 2.2.1.2) und eine Transketolase (EC 2.2.1.1) umfasst (
US 5,798,237 ). Dieser Weg ist als der Transaldolase/Transketolase-Weg bekannt. - Die höhere Lactat-Ausbeute für Pentosen auf diesem Wegs kostet den Organismus einen Preis. Während die ATP-Ausbeute des Phosphoketolase-Wegs 2 ist pro Mol Pentose, ist die des Transaldolase/Transketolase-Wegs 5 ATP pro 3 Mol Pentose. Die niedrigere ATP-Ausbeute kann einer der Gründe sein, warum Milchsäurebakterien mit einem homolaktischen Muster von Pentose-Fermentierung relativ selten sind. Von einem industriellen Gesichtspunkt aus ist es hier relevant anzumerken, dass die Lactobacillus-Spezies MONT4 Xylose nicht fermentieren kann. Kürzlich wurde die Lactobacillus-Spezies MONT4 genetisch mit Xyloseisomerase- und Xylulokinase-Genen aus Lactobacillus pentosus manipuliert, um diesem Organismus die Fähigkeit zu verleihen, Xylose zu fermentieren. Dies wurde in
US 5,798,237 beschrieben. - Obwohl Mikroorganismen wie beispielsweise die Lactobacillus-Spezies Erzeuger von Milchsäure sind, machen bestimmte Eigenschaften diese Organismen für die industrielle Herstellung von Milchsäure weniger geeignet: Lactobacillus-Spezies erfordern sowohl eine beträchtliche Menge organischen Stickstoff im Fermentationsmedium als auch Wachstum unterstützende Substanzen, so dass die Nährlösung teurer wird und die Milchsäure schwieriger zu reinigen ist, wenn ein einfaches Fermentierungsmedium verwendet werden kann. Darüber hinaus erzeugen viele Lactobacillus-Spezies, einschließlich Lactobacillus sp MONT4-Milchsäure mit niedriger enantiomerer Reinheit (siehe: Barre, P. Identification of thermobacteria and homofermentative, thermophilic pentose utilizing Lactobacilli from high temperature fermenting grape must. J. Appl. Bacteriol. 1978, 44, 125–129). Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, welches diese Nachteile vermeidet.
- Wir haben nun herausgefunden, dass einige der natürlich vorkommenden moderat thermophilen Bacillus-Spezies in der Lage sind, Pentosen, insbesondere Xylose, anaerob zu fermentieren, hauptsächlich zu Enantiomeren-reiner Milchsäure und/oder Lactat. Die Umwandlung von Pentosen führt praktisch nur zu C3-Verbindungen, d.h. die Umwandlung läuft über einen homofermentativen Weg, wobei die C3-Verbindungen als Milchsäure und/oder Lactat gewonnen werden können. Moderat thermophile Bacillus-Spezies sind Bakterienstämme, welche bei Temperaturen zwischen 30–65°C wachsen können. Es ist ferner wichtig, dass die Fermentation anaerob durchgeführt wird. Im Fall anaerober Fermentation kann das Verfahren leicht im industriellen Maßstab durchgeführt werden, da es keiner Sauerstoffzuführung bedarf, wie beispielsweise durch teurere Rühraustattung. Beispiele hierfür sind Bacillus coagulans und Bacillus smithii und genetisch modifizierte Milchsäure-produzierende Spezies davon. Diese Mikroorganismus-Typen sind hinsichtlich der Nährstoffbedingungen weniger anspruchsvoll als Lactobacilli. Ein weiterer Vorteil dieser Mikroorganismen ist es, dass die höheren Wachstumsbedingungen (Lactobacillus-Spezies haben Wachstumstemperaturen von allenfalls 50°C) es einfacher machen, Infektionen in Fermentationssystemen im Industriemaßstab zu vermeiden. Deshalb ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure, wobei ein Pentose-haltiges Substrat homolaktisch durch eine moderat thermophile Bacilius-Spezies fermentiert wird, welche anaerob fermentiert.
- Die Wahl der Substrate hängt von den Kosten und der Zuführung des zu Milchsäure und/oder Lactat zu fermentierenden Substrats ab. Eine typische niedrig-preisige Lieferquelle für Pentosen ist Hemicellulose. Xylose, Arabinose und andere Pentosen werden aus Hemicellulose-Materialien freigesetzt durch Behandlung mit Dampf und/oder einer Säure oder Lauge. Kleinere Mengen anderer Zucker, wie beispielsweise Glucose werden während dieser Behandlung auch abgetrennt und werden durch die moderat thermophilen Bacillus-Spezies ebenfalls zu Milchsäure und/oder Lactat fermentiert.
- Lignocellulose-Substrate umfassen Cellulose, Hemicellulose als auch Lignin. Diese Substrattypen können durch Dampf und/oder milde saure oder alkalische Behandlung für eine Hydrolysierung zugänglich gemacht werden. Wenn das Substrat cellulosisches Material umfasst, kann die Cellulose gleichzeitig zu Zuckern oder getrennt hydrolysiert werden und kann auch zu Milchsäure fermentiert werden. Da Hemicellulose im Allgemeinen einfacher zu Zuckern zu hydrolysieren ist als Cellulose, ist es bevorzugt, das hemicellulosische Material zuerst zu dehydrolysieren, die gelösten Pentose-Zucker abzutrennen und anschließend die Cellulose zu hydrolysieren. Die Hydrolysierung kann enzymatisch durchgeführt werden (mit Cellulase für Cellulosen und Hemicellulase für Hemicellulosen) oder chemisch durch Säurebehandlung. Sowohl Pentose- als auch Hexose-Zucker können gleichzeitig oder getrennt zu Milchsäure und/oder Lactat fermentiert werden, wobei die moderat thermophilen Bacillus-Spezies verwendet werden. Wenn es gewünscht ist, können die Hexosen durch einen anderen Mikroorganismus zu Milchsäure und/oder Lactat fermentiert werden, d.h. in gemischter Kultur mit z.B. Hefen, Pilzen oder anderen bekannten Milchsäure produzierenden Bakterien, wie beispielsweise Lactobacillus-Spezies und Bacillus-Spezies, welche sich von denen unterscheiden, die zur Pentose-Fermentierung verwendet werden.
- Die Fermentierungsbedingungen zur Bildung von Milchsäure und/oder Lactat sind per se bekannt und werden beschrieben in
WO 01/27064 WO 99/19290 WO 98/15517 - Die Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung können als biologisch reine Kultur verwendet werden oder können mit anderen Milchsäure erzeugenden Organismen in gemischten Kulturen verwendet werden. Biologisch reine Kulturen sind im Allgemeinen leichter zu optimieren, aber gemischte Kulturen können in der Lage sein, zusätzliche Substrate zu verwenden. Man kann auch ein Enzym(e) zum Fermentierungreaktor zugeben, um den Abbau der Substrate zu unterstützen oder um die Milchsäureproduktion zu erhöhen. Beispielsweise kann Cellulase zugegeben werden, um Cellulose zu Glucose gleichzeitig mit der Fermentierung von Glucose zu Milchsäure durch Mikroorganismen abzubauen. Auf ähnliche Weise kann Hemicellulase zugegeben werden, um Hemicellulose abzubauen. Wie vorausstehend beschrieben, kann die Hydrolysierung (ggf. mittels Enzymen) ebenfalls vor der Fermentierung durchgeführt werden.
- Die Nährlösungsmedien, welche moderat thermophile Bacillus-Spezies enthalten, sind gegenüber Kontamination durch andere Organismen relativ resistent. Nichtsdestotrotz ist es bevorzugt, bereits vorliegende schädliche Organismen im Substrat, welches zu den moderat thermophilen Bacillus-Spezies zugegeben wird, zu eliminieren oder zu unterdrücken. Dies kann durch konventionelle Techniken wie beispielsweise Filtration, Pasteurisierung oder Sterilisierung getan werden.
- Die moderat thermophilen Bacillus-Spezies, welche im Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, können sowohl in sogenannten chemisch definierten Medien als auch in Kulturmedien, welche nicht definierte Verbindungen enthalten, wie beispielsweise Hefeextrakte, Pepton, Trypton und andere Fleischextrakte, oder in komplexen Stickstoffquellen aufgezogen werden. Die Verwendung eines chemisch definierten Mediums ist bevorzugt, da sie zu Milchsäure und/oder Lactat mit weniger Verunreinigung führt.
- Nach der Fermentierung wird die Milchsäure und/oder das Lactat aus der Fermentierungsnährlösung durch eine beliebige der vielen herkömmlichen Techniken abgetrennt, welche bekannt sind, um Milchsäure und/oder Lactat aus wässrigen Lösungen abzutrennen. Substrat-Partikel oder Mikroorganismen (die Biomasse) können vor der Abtrennung entfernt werden, um die Abtrennungseffizienz zu steigern. Die Abtrennung kann durchgeführt werden mittels Zentrifugieren, Filtrieren, Flockulation, Flotierung oder Membranfiltration. Dies ist beispielsweise bekannt aus
WO 01/38283 - Nach der Abtrennung der Milchsäure und/oder des Lactats aus der Fermentierungsnährlösung kann das Produkt einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen werden, wie beispielsweise Extraktion, Destillation, Kristallisierung, Filtration, Behandlung mit Aktivkohle etc. Die verschiedenen zurückbleibenden Ströme können ggf. nach Behandlung in den Fermentierungsreaktor zugeführt werden oder zu einem beliebigen der vorausgehend durchgeführten Reinigungsschritte.
- Die vorliegende Erfindung wird ferner beschrieben durch die nachstehenden Beispiele, welche nicht als beschränkend aufgefasst werden sollen.
- BEISPIEL 1 Milchsäurebildung aus Pentose-Zuckern durch moderat thermophile Bacillus-Spezies
- MATERIALIEN UND VERFAHREN
- Medien
- Das Hefeextraktmedium zur Anzucht von Bacillus smithii DSM 459 und 460 (DSM-Stränge erhalten von der Deutschen Kultursammlung) enthielten pro Liter: 3,5 g DAS (Diammoniumsulfat), 2 g DAP (Diammoniumphosphat), 10 g Hefeextrakt und war gepuffert durch 10 g BIS-IRIS (Bis[2- Hydroxymethyl]iminotris[hydroxymethyl]methan). Vor der Verwendung wurde das Medium autoklaviert. D-Ribose, D-Xylose, D-Arabinose oder Glucose wurde als Kohlenstoffquelle in einer Endkonzentration von 3% verwendet. Die Kohlenstoffquellen wurden Filter-sterilisiert und getrennt zugegeben. Der pH des Mediums wurde angepasst auf 6,6–6,7 mit HCL. Das Hefeextraktmedium für die Anzucht von Bacillus coagulans DSM 2314 war wie für B. smithii beschrieben, enthielt jedoch 1 g/l Hefeextrakt anstelle von 10 g/l.
- Das Minimalmedium für die Anzucht von B. smithii DSM 2319 und B. coagulans DSM 2314 enthielt pro Liter: 2 g DAP, 3,5 g DAS, 10 g BIS-IRIS, 0,5 g KCl und 15 mg MgCl2. Der pH-Wert des Mediums wurde mit HCl auf den pH-Wert 6,8 angepasst. Das Medium wurde vor der Verwendung autoklaviert. D-Ribose, D-Xylose, D-Arabinose oder Glucose wurde als Kohlenstoffquelle in einer Endkonzentration von 3% verwendet. Die Kohlenstoffquellen, Wachstumsfaktoren und Spurenelemente wurden Filter-sterilisiert und getrennt zugegeben. Die Endkonzentrationen betrugen: 0,024 mg/l Biotin, 0,012 mg/l Thiamin, 0,02 g/l Methionin, 0,05 g/l Hefeextrakt, 100 Konzentrationen waren: 0,024 mg/l Biotin, 0,012 mg/l Thiamin, 0,02 g/l Methionin, 0,05 g/l Hefeextrakt, 100 μl Spurenelemente, 1 g/l CaCl2. Die Spurenelemente enthielten pro 100 ml: 0,36 g FeCl3, 0,3 g MnCl2, 0,24 g CoCl2, 0,12 ZnCl2.
- Wachstumsbedingungen zur Milchsäureproduktion
- Alle Bakterien wurden aus –80 Glycerinstammlösungen auf Hefeextraktmedium ausplattiert, wobei Glucose (5% w/w) als Kohlenstoffquelle enthaltend 10 g/l Gelrit (Gellan gum, Sigma) verwendet wurde. Die Platten wurden bei 46°C für 24–48 Stunden in anaeroben Gefäßen inkubiert. Danach wurden anaerobe Kulturen auf Hefeextraktmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle (3% w/w) in sterilen 10 ml-Röhrchen hergestellt. Die Kulturen wurden bei 54°C für 24 Stunden inkubiert. Danach wurden 2% der Kultur auf Röhrchen überführt, welche Minimalmedium mit Glucose, Xylose, Ribose oder Arabinose als Kohlenstoffquelle enthielten. Die Röhrchen wurden bei 54°C für 48 Stunden inkubiert. Nach einer zweiten Überführung (2%) auf frisches Medium und Inkubation bei 54°C für 48 Stunden wurden Proben zur Bestimmung der Biomasse, des pH-Werts und der Produktion von organischer Säure entnommen.
- Zur Bestimmung der Biomasseproduktion wurde die optische Dichte bei 610 nm in einem Spektrophotometer gegenüber demineralisiertem Wasser gemessen. Als Indikation für die (Milch)Säureproduktion wurde der pH-Wert in Zellnährmedium gemessen. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation (10 Min, 8000 Upm) geerntet, der Überstand wurde durch 0,45 μm Filter gefiltert und bei 4°C zur weiteren Analyse gehalten.
- Analyse von organischen Säuren, Ethanol und Zuckern
- Die organische Säuren (Milchsäure, Essigsäure, Ameisensäure und Bernsteinsäure) und Ethanol wurden unter Verwendung von Derivatisierung und GLC gemessen.
- Die optische Reinheit von Milchsäure wurde mittels GLC gemessen. D- und L-Lactate wurden methyliert zu Methyl-Lactat und vermessen durch Headspace-Analyse auf einer chiralen Säule.
- Pentose-Zucker wurden analysiert mit einem Dionex-Typ DX 500 enthaltend eine Carbopac PA-1-Säule und einen PAD (Pulsed Amperometric Detection Type ED 40)-Detektor unter Verwendung einer Strömung von 1,0 ml/min.
- ERGEBNISSE
- B. smithii und B. coagulans wurden anaerob aufgezogen bei 54°C auf Hefeextrakt und Minimalmedium enthaltend 3% (w/w) Arabinose, Ribose oder Xylose (Tabelle 1, Tabelle 2). Alle Stämme führten eine homolaktische Fermentierung von Pentose-Zuckern durch, wobei hauptsächlich L-Milchsäure erzeugt wurde. Es wurden keine detektierbaren Mengen an Essigsäure gefunden. Die optische Reinheit der erzeugten L-Milchsäure betrug 96,7–99,7%. Andere organische Säuren (Ameisensäure, Bernsteinsäure) und Ethanol lagen in allen Fällen unterhalb der Detektierungsmenge von 0,05% w/w. Eine Analyse der verbleibenden Zucker zeigte eine Abnahme hinsichtlich der Xylose-, Ribose- und Arabinose-Konzentrationen in Abhängigkeit von der verwendeten Kohlenstoffquelle (Daten nicht gezeigt). Tabelle 1: Säureproduktion durch thermophile Bacillus-Spezies aus Pentose-Zuckern in Hefeextraktmedium bei 54°C nach zwei Überführungen.
Organismus C-Quelle (3% w/w) Milchsäure (% w/w) 48 h Essigsäure1 (% w/w) 48 h Chirale Reinheit L (+)-Lactat (S/R+S) *100% 48 h PH 48 h OD 610 48 h B. coagulans DSM 2314 Xylose 0,24 n. d.2 99,7 5,4 - Arabinose 0,23 n. d.2 99,7 5,3 - B. smithii DSM 459 Xylose 0,39 n. d.2 98,9 4,1 0,9 Arabinose 0,24 n. d.2 99,1 5,3 0,5 Ribose 0,26 n. d.2 99,2 4,6 0,7 B. smithii DSM 460 Xylose 0,38 n. d.2 99,3 4,3 1,0 Arabinose 0,24 n. d.2 99,2 5,3 0,6 Ribose 0,26 n. d.2 99,1 4,6 0,7 1. Die Detektionsmenge beträgt 0,05%. 2. Nicht detektierbar. Organismus C-Quelle (3% w/w) Milchsäure (% w/w) 48 h Essigsäure1 (% w/w) 48 h Chirale Reinheit L (+)-Lactat (S/R+S) *100% 48 h PH 48 h OD 610 48 h B. coagulans DSM 2314 Xylose 0,26 n. d.2 99,7 4,3 0,5 Arabinose 0,25 n. d.2 99,3 4,3 0,5 Glucose 0,23 n. d.2 99,4 5,1 0,4 B. smithii DSM 2319 Xylose 0,21 n. d.2 98,1 6,0 0,2 Arabinose 0,20 n. d.2 99,5 6,0 0,3 Glucose 0,18 n. d.2 98,8 6,0 0,2 1. Die Detektionsmenge beträgt 0,05%. 2. Nicht detektierbar. - BEISPIEL 2 Homolaktische Fermentierung von Xylose durch B. coagulans DSM 2314
- MATERIALIEN UND VERFAHREN
- Stamm, Medium und Fermentierungsbedingungen
- Der verwendete Mikroorganismus war Bacillus coagulans DSM 2314. Der Stamm wurde in Glycerinstammlösungen bei –80°C gehalten. Der Bioreaktor (3L Applikon) enthielt 1,5 l Medium mit der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l DAP, 3,5 g/l DAS, 10 g/l BIS-IRIS und 0,5 g/l KCl.
- Der Bioreaktor mit Medium wurde autoklaviert bei 121°C (1,2 Bar) für 20–30 Min. Vitamin- und Spurenelement-Lösungen wurden Filter-sterilisiert und nach der Sterilisierung getrennt dem Bioreaktor zugegeben. Die Endkonzentrationen der Wachstumsfaktoren waren: 20 mg/l DL-Methionin, 24 mg/l Biotin, 12 mg/l Thiamin, 15 mg/l MgCl2-2H2O, 0,1 g/l CaCl2 und 1,5 ml Spurenelemente. Die Spurenelemente enthielten pro 100 ml: 0,36 g FeCl3, 0,3 g MnCl2, 0,24 g CoCl2 und 0,12 ZnCl2. D-Xylose wurde nach der Sterilisierung getrennt bis zu einer Endkonzentration von 50 g/l zugegeben. Der pH-Wert des Mediums wurde mit einer konzentrierten HCl-Lösung auf 6,5 eingestellt. Während der Fermentierung und aufgrund der niedrigen Biomassekonzentration, welche nach 50 Stunden Fermentierung erhalten wurde, wurde Hefeextrakt bis zu einer Endkonzentration von 10 g/l zugegeben.
- Das Inokulum (~110 ml) wurde über Nacht bei 50°C in Fermentierungsmedium, welches 1% D-Xylose enthielt, aufgezogen. Das Inokulum wurde nach zwei Überführungen auf Xylose-Medien verwendet.
- Die pH-Aufrechterhaltung wurde erreicht mit der automatischen Zugabe von KOH-Lösung mit 20% (w/v). Die Fermentierung wurde durchgeführt bei 54°C, pH 6,4 und einer Rührgeschwindigkeit von 250–300 Upm. Die Temperaturkontrolle wurde durchgeführt mit dem Wasserbad Lauda E100, während das pH-Wert-Auslesen/die Kontrolle von Daten durch einen ADI 1020 Bio-Prozessor durchgeführt wurde. Alle Daten (pH-Wert und Basenverbrauch) wurden durch die Online-Datenerfassung FM V5.0 verarbeitet.
- Es wurden Proben vor und nach Inokulation entnommen. Während der Fermentierung wurden periodisch 5 bis 30 ml Proben zur OD-Messung, zur Zelltrockengewicht (CDW)-Messung und zur Analyse von L(+)- und D(–)-Milchsäure, Xylose und möglicher Nebenprodukte (Acetat) entnommen. Die Proben wurden zentrifugiert (4–6°C, 6000–12000 Upm für 5–10 Min) und es wurde der Überstand gewonnen/gelagert bei –21°C bis zur weiteren Analyse.
- Bestimmung der Biomasseproduktion
- Trockenmasse wurde erhalten durch einen zuvor gewogenen 0,45 μm Millipore-Filter. Es wurde eine 15–20 ml Probe filtriert, gewaschen mit 10 ml demineralisiertem Wasser und getrocknet bei 105°C für 1–2 Tage. Das Endgewicht erlaubte die Messung der getrockneten Zellen (CDW) in g/l. Analyse von Zuckern, organischen Säuren und Ethanol Die restliche Xylolosekonzentration in den Proben wurde bestimmt durch den kolorimetrischen Assay unter Verwendung des Eisen(II)-Orcinol-Verfahrens wie beschrieben von Chaplin, M. F., Kennedy, J. F. (1987). Carbohydrate analysis: a practical approach. IRL Press Limited (ISBN 0-947946-68-3).
- (1). Die Xylose-Konzentration, wie in Tabelle 3 gezeigt, wurde analysiert mit einem Dionex-Typ DX 500 enthaltend eine Carbopac PA-1-Säule und einen PAD (Pulsed Amperometric Detection Type ED 40)-Detektor unter Verwendung einer Strömung von 1,0 ml/Min.
- Die L(+)-Lactatanalyse von Proben wurde durchgeführt mittels eines enzymatischen Verfahrens, wobei es sich um eine angepasste Version des Boehringer GOD-PAP-Verfahrens zur Quantifizierung von Glucose mit Glucoseoxidase handelt. L(+)-Milchsäureoxidase wandelt L(+)-Milchsäure in Pyruvat und Wasserstoffperoxid um. Wasserstoffperoxid reagiert in Gegenwart von Peroxidase mit 4-Aminophenazon und Phenol unter Bildung eines wasserlöslichen rot-gefärbten Produkts, welches in einem Spektrometer bei 540 nm gemessen werden kann.
- Die organische Säuren (Milchsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure) und Ethanol, wie in Tabelle 3 gezeigt, wurden gemessen unter Verwendung einer Derivatisierung und GLC. Die optische Reinheit der Milchsäure wurde mittels GLC gemessen. D- und L-Lactate wurden methyliert durch Methyl-Lactat und gemessen durch Headspace-Analyse auf einer chiralen Säure.
- ERGEBNISSE
- Der Stamm Bacillus coagulans DSM 2314 wurde auf 50 g/l Xylose in Minimalmedium bei 54°C in einem 3-Liter-Fermentor aufgezogen (
1 ). Während der Fermentierung wurde aufgrund der niedrigen Biomassekonzentration, welche nach 50 Stunden Fermentierung erreicht wurde, Hefeextrakt bis zu einer Endkonzentration von 10 g/l zugegeben. Nach etwa 105 Stunden war die Xylose aus dem Medium aufgebracht und hauptsächlich umgewandelt zu Milchsäure (35 g/l) mit nur einer niedrigen Konzentration an Essigsäure (1 g/l) (Tabelle 3). Die optische Reinheit der erzeugten Milchsäure betrug 99%. Die Produktion anderer organischer Säuren war unterhalb der Detektionsmenge. - Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von B. coagulans zur Durchführung einer homofermentativen Milchsäurefermentierung von Pentose-Zuckern. Die maximale Milchsäureproduktionsrate von B. coagulans in der nicht-optimierten Fermentierung von Xylose betrug 1,7 g/l/h, wie es durch die Online-Datenerfassungs-Software beobachtet wurde. Tabelle 3: Organische Säureproduktion von 50 g/l Xylose durch B. coagulans DSM 2314
Zeit Xylose g/l Milchsäure g/l Chirale Reinheit (S/R+S) *100% Essigsäure g/l Ameisensäure g/l Ethanol1 g/l Bernsteinsäure1 100 h 0,2 35 99 1 <0,5 <0,5 <0,5 1. Detektionsmenge beträgt 0,5 g/l.
Claims (10)
- Verfahren zur Herstellung von Milchsäure und/oder Lactat, wobei ein Pentose-haltiges Substrat durch eine moderat thermophile Bacillus-Spezies, welche anaerob fermentiert homolaktisch fermentiert wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Pentose-haltige Substrat Xylose umfasst.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die moderat thermophile Bacillus-Spezies aus gewählt ist aus Bacillus coagulans und/oder Bacillus smithii.
- Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das Pentose-haltige Substrat Arabinose umfasst.
- Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei das Substrat Glucose umfasst.
- Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die Fermentation mittels eines Gemischs von moderat thermophilen Bacillus-Spezies und anderen Milchsäure-produzierenden Mikroorganismen durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die gebildete Milchsäure und/oder das gebildete Lactat vom Fermentationsnährmedium abgetrennt wird/werden.
- Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, wobei die moderat thermophile Bacillus-Spezies in einem chemisch definierten Medium aufgezogen wird.
- Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Biomasse vor der Abtrennung der Milchsäure und/oder des Lactats aus dem Fermentationsnährmedium aus dem Fermentationsnährmedium entfernt wird.
- Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche 8–9, wobei die erzeugte Milchsäure und/oder das Lactat nach der Abtrennung aus dem Fermentationsnährmedium einem oder mehreren Reinigungsschritten unterzogen wird.
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