DE102017101220A1

DE102017101220A1 - Minimalmedium zur fermentativen Umsetzung von Mono- und/oder Disacchariden zu Milchsäure mit Bacillus coagulans-Stämmen

Info

Publication number: DE102017101220A1
Application number: DE102017101220.6A
Authority: DE
Inventors: Michael Katzberg; Kirsten Kottmeier; Tim Rambowsky; Stefan Schönert; Kamila Rzeznicka; Philipp Himmel
Original assignee: ThyssenKrupp AG; ThyssenKrupp Industrial Solutions AG
Current assignee: ThyssenKrupp AG; ThyssenKrupp Industrial Solutions AG
Priority date: 2017-01-23
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2018-07-26
Anticipated expiration: 2037-01-24
Also published as: DE102017101220B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nährmediumzusammensetzung, umfassend Mono- und/oder Disaccharide, bis zu 5 g/L Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat, ein Mangansalz in einer Menge entsprechend 0,1 bis 3 g/L MnSOMonohydrat, 1 bis 15 g/L an Alkali- und Erdalkalimetallsalzen, 0,1 bis 5 g/L Aminosäuren, Wasser sowie gegebenenfalls Anteile von Spurenelementen und Vitaminen. Die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung zeichnet sich durch einen im Vergleich zu konventionell eingesetzten Nährmediumzusammensetzungen geringen Gehalt an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat aus, was sich aufgrund der günstigeren Verfügbarkeit der weiteren Inhaltsstoffe positiv auf die Kosten der Nährmediumzusammensetzung auswirkt. Darüber hinaus erlaubt der Mangangehalt der Nährmediumzusammensetzung eine deutliche Verkürzung der Fermentationszeit ohne signifikante Einbußen der Milchsäureausbeute und Reinheit. Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen Kombinationen der erwähnten Nährmediumzusammensetzung mit Mikroorganismen der Spezies Bacillus coagulans sowie Verfahren zur Herstellung von Milchsäure unter Verwendung der bezeichneten Nährmediumzusammensetzung und Mikroorganismen der Spezies Bacillus coagulans.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der fermentativen Umsetzung von Mono- und/oder Disacchariden, wie insbesondere Glucose und/oder Saccharose, zu Milchsäure z.B. als Ausgangsprodukt für die anschließende Herstellung von Milchsäurepolymeren. Die Erfindung betrifft dabei insbesondere Minimalmedien, die aus preisgünstigen Ausgangsstoffen bestehen und exakt auf den Bedarf der eingesetzten Mikroorganismen abgestimmt sind, um so die Herstellungskosten zu reduzieren.
Stand der Technik
Als wichtige organische Säure wird Milchsäure in der Lebensmittelindustrie, der Chemie und der pharmazeutischen Industrie in vielfältigen Anwendungen eingesetzt. Die inzwischen wichtigste und weitgehendste Applikation von Milchsäure besteht in deren Verwendung als Monomer für die Herstellung von Polymilchsäure, die eine gute Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit aufweist und als eines der vielversprechendsten erneuerbaren Materialien des 21. Jahrhunderts gehandelt wird.
Milchsäure ist ein optisch aktives Molekül, das ein chirales Zentrum besitzt. Gemäß der optischen Rotation kann Milchsäure in drei Klassen eingeteilt werden, nämlich L-Milchsäure, D-Milchsäure und razemische Milchsäure. Aufgrund der vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten von Poly(L-Milchsäure) hat die Herstellung von optisch reiner L-Milchsäure seit langem wissenschaftliches Interesse geweckt.
Grundsätzlich kann Milchsäure mit Hilfe von drei unterschiedlichen Methoden erzeugt werden, nämlich einer chemische Synthese, enzymatischen Methoden und biotechnologischen Prozessen. Im Vergleich zur chemischen und enzymatischen Herstellung ist die Herstellung über mikrobielle Fermentationen am weitesten verbreitet. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass Milchsäure aus Abbauprodukten von Stärke und Cellulose gewonnen werden kann, bei denen es sich um erneuerbare Ressourcen handelt. Darüber hinaus können optisch reine L-Milchsäure oder D-Milchsäure oder Mischungen der beiden Enantiomeren in unterschiedlichen Anteilen durch Fermentationsmethoden mit verschiedenen Bakterienstämmen erhalten werden. Wegen der geringen Kosten und der hohen Sicherheit ist die mikrobielle Fermentation daher heute die Hauptmethode zur Herstellung von Milchsäure in großen Mengen.
Damit dabei eine wirtschaftliche Aufarbeitung der wässrigen, Milchsäure enthaltenden Fermentationsbrühen möglich ist, ist es weiterhin zweckmäßig, wenn die Fermentationsbrühe am Ende der Fermentation einen Gehalt von >50 g/L Milchsäure und bevorzugt > 100 g/L aufweist.
Gemäß der chinesischen Patentanmeldung CN 1906290 weisen Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus und Rhizopus-Stämme die Fähigkeit zur Herstellung von optisch reiner L-Milchsäure auf. Darüber hinaus können thermophile Bacillus coagulans-Stämme für die Herstellung von L-Milchsäure genutzt werden. In den letzten Jahren haben die Studien zur Herstellung von Milchsäure mit Bacillus-Stämmen zugenommen, weil diese Stämme vielfältige Vorteile aufweisen. Dazu gehören Robustheit, Stabilität sowie die Möglichkeit bei hohen Temperaturen zu fermentieren, was das Risiko einer Kontamination signifikant vermindert. Dies wiederum hat signifikante Vorteile für die Produktionskosten und erlaubt eine kostengünstige Herstellung von optisch sehr reiner L-Milchsäure. Milchsäure, die mit Hilfe von Bacillus-stämmen produziert wird, wird beispielsweise in den japanischen Patenten JP 5840093 , JP 606200 und JP 327291 oder auch dem US-Patent 5,079,164 offenbart.
Trotz der erzielten Fortschritte im Bereich der Bakterienstämme, die für die Herstellung von Milchsäure und insbesondere von optisch reiner L-Milchsäure genutzt werden, besteht nach wie vor ein bedeutender Kostenfaktor bei der Herstellung von Milchsäure über fermentative Prozesse in den für die Prozesse erforderlichen Wachstumsmedien. So sind in für die Herstellung von Milchsäure verwendeten Medien regelmäßig Stickstoffquellen erforderlich, die die Mikroorganismen für ihr Wachstum benötigen. Eine häufig verwendete Stickstoffquelle ist Hefeextrakt, weil sich damit im Gegensatz zu Stickstoffquellen wie Maisquellwasser eine besonders hohe Zunahme der Biomasse erzielen lässt (vgl. z.B. Payot T. et al, Enzyme and Microbial Techology 1999, 24, S. 191-199). Bisher werden daher vor allem Medien genutzt, welche Hefeextrakt allein oder in Kombination mit anderen Proteinhydrolysaten in hohen Dosierungen (> 0,5 Massen-% und typischerweise etwa 1 bis 1,5 Massen-%) enthalten.
Die Verwendung solch hoher Anteile von nicht-definierten Proteinhydrolysaten im Medium ist allerdings mit dem Nachteil verbunden, dass nicht nur die tatsächlich für die Fermentation benötigten Nährstoffe in die Fermentation eingebracht werden, sondern auch prozessirrelevante Stoffe, wie beispielsweise Farbstoffe oder nicht benötigte/überschüssige Aminosäuren, die während der Aufarbeitung des Fermentationsprodukts aufwendig entfernt werden müssen. Bei Verwendung von Hefeextrakt-Substitutionsprodukten wie Sojapepton stellt sich das Problem, dass diese Produkte entweder noch teurer als Hefeextrakt, und somit kommerziell nicht interessant sind, oder dass sich die Fermentationsreaktion so stark verlangsamt, dass die Fermentation auf Grund der benötigten Zeit unwirtschaftlich wird. Die Verwendung von Maisquellwasser hat außerdem den Nachteil, dass dieses Verunreinigungen in Form von anderen organischen Säuren und Feststoffen enthält, die ebenfalls vor oder nach der Fermentation wieder von dem gewünschten Produkt abgetrennt werden müssen.
Vor diesem Hintergrund besteht ein Bedarf nach einem Fermentationsmedium und Fermentationsverfahren zur Herstellung von optisch reiner L-Milchsäure, bei dem die Menge an zugesetztem Hefeextrakt oder anderem Proteinhydrolysat durch eine möglichst definierte und kostengünstige Zusammenstellung von Inhaltsstoffen auf ein Mindestmaß reduziert bzw. ganz ersetzt werden kann, ohne dass dies ungünstige Auswirkungen auf die erforderliche Fermentationszeit hat. Trotz dieser Vorgabe sollten bei Verwendung des Fermentationsmediums wirtschaftlich relevante Endgehalte von >50 g/L und bevorzugt > 100 g/L Milchsäure realisiert werden können.
Aus dem Stand der Technik sind einige Medienzusammensetzungen bekannt, die nur sehr geringe Mengen oder sogar gar keinen Hefeextrakt enthalten. So wird beispielsweise in der WO 03/008601 eine Medienzusammensetzung offenbart, die als Stickstoffquelle ausschließlich Asparaginsäure, Glutaminsäure, Isoleucin, Methionin und Serin sowie zusätzliche Salze, Vitamine und Puffer enthält. In der WO 03/008601 ist dieses Medium jedoch alleine für Testzwecke beschrieben, um beispielsweise zu überprüfen, ob Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen grundsätzlich zur Bildung von Lactat genutzt werden können. Es liegen jedoch keine Angaben zu finalen Milchsäuregehalten und den damit verbundenen Fermentationszeiten vor, so dass nicht von einem wirtschaftlich relevanten Verfahren gesprochen werden kann.
In der DE 60 2004 008 875 T2 wird ein Anzuchtmedium für B. coagulans DSM 2314 beschrieben, das im Wesentlichen auf Diammoniumhydrogenphosphat (DAP), Diammoniumsulfat (DAS), dem Puffersystem BIS-IRIS (= Bis[2-Hydroxymethyl]iminotris[hydroxymethyl]methan), und Hefeextrakt beruht, wobei der Hefeextrakt in einer Menge von 1 g/L eingesetzt wird. Darüber hinaus wird in der DE 60 2004 008 875 T2 ein Minimalmedium beschrieben, dass DAP, DAS, das Puffersystem BIS-IRIS, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid sowie Aminosäure- und Spurenelementzusätze, und 0,05 g/l Hefeextrakt enthält. Im Rahmen der in der DE 60 2004 008 875 T2 durchgeführten Untersuchung konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Mikroorganismen Saccharose oder andere Zucker, die diesen Medien in einer Konzentration von 3 Gew.-% zugesetzt wurden, zu Milchsäure umsetzen können. Eine Umsetzung mit höheren Ausgangskonzentrationen an Kohlenhydraten, wie sie zum Erreichen von wirtschaftlich relevanten Milchsäuremengen am Ende der Fermentation benötigt werden, ist hingegen nicht beschrieben.
Die WO 2007/137809 beschreibt schließlich ein Hefeextrakt-freies flüssiges Medium zur Kultivierung von Mikroorganismen, das an Stelle des Hefeextrakts anorganische Ammoniumsalze und Glutamat als Stickstoffquelle enthält. Die WO 2007/137809 befasst sich jedoch im Wesentlichen mit der Kultivierung der Mikroorganismen und beschreibt keine weitergehende Fermentierung beispielsweise von Glucose zu Milchsäure.
Generell kann zum vorstehend angegebenen Stand der Technik festgehalten werden, dass dort keine Medien beschrieben sind, mit denen wirtschaftlich relevante Mengen von Milchsäure, d.h. Milchsäuregehalten von > 50 g/L oder sogar > 100 g/L, realisiert werden konnten. Nur wenn entsprechende Gehalte erzielt werden können, ist es wirtschaftlich möglich, das Medium für die Herstellung von 80%iger oder sogar 100%iger Milchsäure zu nutzen, wie sie für Lebensmittel- oder Polymerisationsanwendungen benötigt wird.
Ausgehend von dem geschilderten Stand der Technik, bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung demzufolge darin, ein Fermentationsmedium für die Umsetzung von Monosachariden und/oder Disacchariden und insbesondere Glucose und/oder Saccharose zu optisch reiner Milchsäure vorzuschlagen, das unter Minimierung bzw. Verzicht auf Hefeextrakt gegenüber Hefeextrakt-haltigen Medien vergleichbare Fermentationsgeschwindigkeiten, -produktivitäten und damit das Erreichen wirtschaftlich interessanter Endtiter erlaubt.
Beschreibung der Erfindung
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft eine Nährmediumzusammensetzung, die folgende Bestandteile enthält:

- 10 bis 250 g/L Monosaccharide und/oder Disaccharide,
- bis zu 5 g/L Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat,
- ein Mangansalz in einer Menge entsprechend 0,1 bis 3 g/L MnSO₄ Monohydrat,
- 1 bis 15 g/L Alkali- und Erdalkalimetallsalze,
- bis zu 5 g/L Aminosäuren,
- einen Phosphatpuffer in einer Menge entsprechend 0,2 bis 10 g/L (NH₄)₂HPO₄,
- bis zu 25 mg/L Spurenelementmischung umfassend Fe, Zn und Cu-Salze,
- bis zu 5 mg/L Vitamine und
- Wasser.

In Bezug auf die Mono-und/oder Disaccharide ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn diese zu mindestens 80 Gew.-%, bevorzugt zu mindestens 90 Gew.-% und insbesondere zu mindestens 95 Gew.-% in Form von Glucose und/oder Saccharose vorliegen. Für die Mono- und/oder Disaccharide kann weiterhin ein Gehalt von 20 bis 230 g/L, insbesondere 50 bis 200 g/L und noch spezifischer 100 bis 180 g/L als bevorzugt angegeben werden.
Für den Hefeextrakt bzw. das Proteinhydrolysat gilt, dass dieser bzw. dieses in einer möglichst geringen Menge in die Nährmediumzusammensetzung einbezogen werden sollte. Andererseits sollte die Menge so hoch sein, dass die durch das Nährmedium vermittelte Produktivität in Bezug auf die Umsetzung von Mono- und/oder Disacchariden zu Milchsäure nicht signifikant beeinträchtigt wird. Als bevorzugter Gehalt für Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat hat sich ein Gehalt von 0,05 g bis 2 g/l und insbesondere 0,1 bis 1,5 g/l erwiesen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Proteinhydrolysate umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Sojapepton, Caseinpepton oder Trypton. Generell sollen durch die Bezeichnung Proteinhydrolysat alle Voll- und Teilhydrolysate von Proteinquellen erfasst sein, die im Stand der Technik als Stickstoff- oder Aminosäurelieferanten bekannt sind. Diese Proteinhydrolysate enthalten regelmäßig alle natürlichen Aminosäuren in zumindest geringen Anteilen, was sie von einer Mischung dezidiert ausgewählter Aminosäuren unterscheidet. Für die Teilhydrolysate gilt dies umso mehr, als dass diese zusätzlich signifikante Anteile an peptidischen Verbindungen und/oder Proteinen enthalten.
In Einzelfällen kann es auch zweckmäßig sein, den Gehalt an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat in einem Bereich von etwa 2 bis 3 g/l einzustellen. In diesem Fall muss das Medium als Aminosäuren nur Threonin und gegebenenfalls Methionin enthalten, ohne dass die Fermentationsreaktion signifikant beeinträchtigt wird. Da Threonin und Methionin relativ kostengünstig sind und auf den Zusatz von teuren Aminosäurezusätzen verzichtet werden kann, können trotz der erforderlichen größeren Menge an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat durch entsprechende Medien erhebliche Kostenvorteile realisiert werden. Aus Kostenerwägungen ist es zudem zweckmäßig, dass in diesem Fall der überwiegende Anteil der Menge an Threonin und Methionin auf Threonin entfällt. So beträgt der Anteil an Threonin, bezogen auf die Gesamtmenge an Threonin und Methionin, vorzugsweise mindestens 60 Gew.-%, insbesondere mindestens 70 Gew.-% und besonders bevorzugt mindestens 80 Gew.-%. Andererseits wird die Fermentationsgeschwindigkeit bei sehr niedrigen Methioningehalten stärker beeinträchtigt, so dass der Methioningehalt, bezogen auf die Gesamtmenge an Threonin und Methionin, vorzugsweise bei mindestens 5 Gew.-% und bevorzugt bei mindestens 10 Gew.-% liegen sollte.
Darüber hinaus ist es möglich und kann bevorzugt sein, wenn dem Nährmedium nur Threonin, aber kein Methionin zugesetzt wird, da in diesem Fall eine nur unwesentlich beeinträchtige Fermentationsreaktion beobachtet wurde. Dieser Nachteil wir aber durch die geringeren Kosten der Nährmediumzusammensetzung mehr als kompensiert.
Im Zusammenhang mit dem angegebenen Mangangehalt von 0,1 bis 3 g/L wurde überraschend gefunden, dass sich der Zusatz von Mangan in entsprechender Menge positiv, d.h., verkürzend, auf die Fermentationsprozessdauer auswirkt, während gleichzeitig keine signifikanten Auswirkungen auf die Lactatausbeute beobachtet wurde. Als bevorzugter Anteil für das Mangansalz im Nährmedium kann ein Bereich von 0,2 bis 1,5 g/L (berechnet als MnSO₄ Monohydrat) und insbesondere 0,25 bis 1 g/L (berechnet als MnSO₄ Monohydrat) angegeben werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders geeignete Mangansalze sind beispielsweise MnSO₄, MnCl₂ oder Mn(NO₃)₂, von denen das MnSO₄ bevorzugt ist.
Wenn im vor- oder nachstehenden von spezifischen „Salzen“ die Rede ist, so umfassen diese regelmäßig auch die entsprechenden stabilen Hydrate dieser Salze. Von der Angabe „MnSO₄“ ist somit nicht nur das wasserfreie Mangansulfat, sondern z.B. auch das Monohydrat (MnSO₄ × H₂O) bzw. das Tetrahydrat (MnSO₄ × 4 H₂O) des Mangansulfats erfasst.
Unter „Alkalimetallsalzen“ sollen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch Ammoniumsalze verstanden werden. Ammonium ist zwar im eigentlichen Sinne kein Alkalimetall, weist aber als Ion mit Alkalimetallionen vergleichbare Eigenschaften auf und soll daher im Zusammenhang mit dieser Erfindung als Alkalimetall aufgefasst werden.
Bei den Alkalimetallsalzen handelt es ich bevorzugt um Salze von Ammonium, Natrium oder Kalium während als Erdalkalimetallsalze Magnesium- und Calciumsalze bevorzugt sind. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung zweckmäßig einzubeziehenden Alkalimetallsalze sind beispielsweise Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und Kaliumsulfat sowie die entsprechenden Carbonate und Hydrogencarbonate. Zweckmäßig einzubeziehende Erdalkalimetallsalze sind insbesondere Magnesiumsulfat, Calciumchlorid, Calciumsulfat sowie gelöschter Kalk (Ca(OH)₂).
Ein bevorzugter Gehalt an Alkali- und Erdalkalimetallsalzen in der erfindungsgemäßen Nährmediumzusammensetzung liegt im Bereich von 2 bis 6 g/L.
Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung bis zu 25 mg/L an Salzen von Spurenelementen, umfassend Eisen, Zink und Kupfer, enthalten. Der Zusatz solcher Spurenelemente ist im Rahmen der erfindungsgemäßen Nährmediumzusammensetzungen nicht zwingend erforderlich und kann in Einzelfällen auch unterbleiben. Sind in der erfindungsgemäßen Nährmediumzusammensetzung Salze von Spurenelementen, umfassend Eisen, Zink und Kupfer, enthalten, so kann als bevorzugter Gehalt eine Menge von 2 bis 10 mg/l angegeben werden.
Bevorzugt werden als Spurenelemente die Sulfatsalze von Eisen, Zink und Kupfer verwendet.
Die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung enthält, wie vorstehend angegeben, 0,1 bis 5 g/l an Aminosäuren. Bei dieser Angabe bleiben eventuell im Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat enthaltene Aminosäuren, sowie Aminosäuren, die im Hefeextrakt oder im Proteinhydrolysat in Peptide oder Proteine eingebunden sind, unberücksichtigt, d.h. die erwähnten Aminosäuren werden als solche neben dem Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat zur erfindungsgemäßen Nährmediumzusammensetzung zugesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbare Aminosäuren sind insbesondere Methionin, Isoleucin, Leucin, Valin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und deren Salze, Lysin sowie Salze davon und Threonin. Bevorzugt liegen diese Aminosäuren, unabhängig voneinander, als D,L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Valin, L-Asparaginsäure, L-Mono-natrium-glutamat sowie als HCI-Salz von L-Lysin und als L-Threonin vor.
Als bevorzugter Gehalt von Aminosäuren in der Nährmediumzusammensetzung kann ein Bereich von 0,4 bis 4 g/l und insbesondere 1 bis 3,7 g/l angegeben werden. Dabei ist zu beachten, dass bei einer größeren Menge an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat in den Nährmedienzusammensetzungen eine geringere Menge an zusätzlichen Aminosäuren erforderlich ist, während bei geringeren Mengen an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat größere Mengen an Aminosäuren zugesetzt werden müssen. Ist z.B. Hefeextrakt und/oder das Proteinhydrolysat in einer Menge von 2 bis 3 g/L in der Nährmediumzusammensetzung enthalten, so ist ein Gehalt von 0,1 bis 1 g/L an zusätzlichen Aminosäuren in der Regel ausreichend. Beträgt hingegen die Menge an Hefeextrakt und/oder an Proteinhydrolysat in der Nährmediumzusammensetzung 1 g/L oder weniger, so sollte die Menge an zusätzlichen Aminosäuren mindestens 1 g/L betragen, und bevorzugt im Bereich von 1,2 bis 2 g/L liegen. Für diesen Fall ist es weiterhin bevorzugt wenn von den zugesetzten Aminosäuren mindestens 50 Gew.-% und bevorzugt mindestens 65 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtmenge der zugesetzten Aminosäuren, auf Threonin, Glutaminsäure oder deren Salze entfallen.
Enthält die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung Asparginsäure, so ist es bevorzugt, wenn der Anteil dieser Aminosäure nicht mehr als 0,4 g/L, bevorzugt nicht mehr als 0,25 g/L und insbesondere bevorzugt nicht mehr als 0,1 g/L beträgt. Unabhängig davon, oder zusätzlich dazu ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung Glutaminsäure oder deren Salze in einer Menge von nicht mehr als 1 g/L, insbesondere nicht mehr als 0,7 g/L und am meisten bevorzugt nicht mehr als 0,5 g/L enthält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurde weiterhin überraschend gefunden, dass bei Einsatz einer größeren Menge an Threonin die Menge an verzweigtkettigen Aminosäuren, wie insbesondere Isoleucin, Leucin und Valin, reduziert werden kann, ohne dass sich dies negativ auf die Fermentationdauer oder die Fermentationsausbeute an Milchsäure auswirkt. Verzweigtkettige Aminosäuren weisen im Vergleich zu Threonin den Nachteil eines signifikant höheren Einkaufspreises auf, was sich ungünstig auf die Gesamtkosten eines Fermentationsverfahrens zur Herstellung von Milchsäure auswirkt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es daher bevorzugt, dass die Nährmediumzusamensetzung Threonin und insbesondere L-Threonin und ein oder mehrere verzweigtkettige Aminosäuren, bevorzugt ausgewählt aus Isoleucin, Leucin und Valin, enthält, wobei das Mengenverhältnis von Threonin zur Summe der Menge der verzweigt-kettigen Aminosäuren mindestens 2:1 und bevorzugt mindestens 3:1 beträgt.
In Einzelfällen, d.h. abhängig von der eingesetzten Hefeextrakt- und/oder Proteinhydrolysatmenge, ist es, wie vorstehend erwähnt, auch möglich, als zusätzliche Aminosäuren ausschließlich Threonin und Methionin oder ausschließlich Threonin in die Zusammensetzung einzubeziehen. In diesem Fall sollte jedoch eine größere Menge an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat, insbesondere im Bereich von 2 bis 3 g/L in der Nährmediumzusammensetzung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, bei der eine entsprechende Menge an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat verwendet wird, enthält die Nährmediumzusammensetzung als zugesetzte Aminosäuren, die nicht Bestandteil des Hefeextrakts und/oder des Proteinhydrolysats sind, ausschließlich Threonin und Methionin. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, bei der eine entsprechende Menge an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat verwendet wird, enthält die Nährmediumzusammensetzung als zugesetzte Aminosäuren, die nicht Bestandteil des Hefeextrakts und/oder des Proteinhydrolysat sind, ausschließlich Threonin.
Als Vitamine, die zweckmäßig in die Nährmediumszusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung einbezogen werden können, sind insbesondere Pyridoxin, Biotin, Thiamin, Riboflavin, Pantothensäure, Niacin, Nikotinsäure und Folsäure zu nennen. Diese Vitamine können auch in Form von Salzen, beispielsweise als Hydrochloridsalze, in die Nährmediumszusammensetzung einbezogen werden. Ein bevorzugter Gesamtgehalt an zugesetzten Vitaminen in der Nährmediumzusammensetzung beträgt 0,5 bis 3 mg/L und insbesondere 1 bis 2 mg/L. Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Nährmediumszusammensetzung Pyridoxin, Biotin, Thiamin, Riboflavin, Pantothensäure oder deren Salze, Niacin, Nikotinsäure und Folsäure enthält.
Darüber hinaus enthält die Nährmediumzusammensetzung einen Phosphatpuffer in einer Menge, die einer Menge von 0,2 bis 10 g/L (NH₄)₂HPO₄ entspricht. Mit der Vorgabe, dass die Menge einer Menge von 0,2 bis 10 g/L (NH₄)₂HPO₄ entspricht, ist gemeint, dass die Nährmediumzusammensetzung 1,51 bis 75,7 mmol Phosphat enthalten soll, wobei jedoch das konkrete Phosphatsalz, dass diese Phosphatmenge liefert, nicht festgelegt ist. Das (NH₄)₂HPO₄ bildet demzufolge eine Referenz für die Bestimmung der Phosphatmenge.
Der Phosphatpuffer kann Phosphate, Hydrogenphosphate und/oder Dihydrogenphosphate enthalten. Geeignete Hydrogenphosphate und Dihydrogenphosphate sind beispielsweise Ammoniumdihydrogenphosphat und Diammoniumhydrogenphosphat, aber auch die entsprechenden Natrium- oder Kaliumhydrogenphosphate und Dihydrogenphosphate. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung auch Phosphorsäure enthalten, dies jedoch zweckmäßig in Kombination mit einem Hydrogenphosphat oder Dihydrogenphosphatsalz, so dass sich aus der Kombination ein Puffersystem für die Nährmediumzusammensetzung ausbilden kann.
Im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen zu Nährmediumzusammensetzungen hat es sich gezeigt, dass sich eine geringe Pufferkapazität nicht nachteilig auf das Fermentationsverfahren auswirkt. Für die Nährmediumzusammensetzungen ist es daher bevorzugt, wenn diese einen Phosphatsalzgehalt im Bereich von 0,1 bis 1 g/L und insbesondere von 0,3 bis 1 g/L, jeweils bezogen auf (NH₄)₂HPO₄ als Referenz, aufweist.
Die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung kann neben den bisher erwähnten Bestandteilen auch noch zusätzliche Bestandteile, wie beispielsweise 4-Aminobenzoesäure oder Betain (N,N,N-Trimethylglycin) enthalten. Enthält die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung Betain, so beträgt dessen Gehalt in der Zusammensetzung bevorzugt bis zu 0,5 g/L und insbesondere 0,05 bis 0,025 g/L. Wenn die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung 4-Aminobenzoesäure enthält, ist diese in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung regelmäßig nur in Spuren enthalten, so dass hier eine Menge von bis zu 1 mg/L und insbesondere ein Gehalt von 0,1 bis 0,5 mg/L als geeigneter Gehalt angegeben werden kann.
Im Rahmen der dieser Anmeldung zugrunde liegenden Untersuchungen hat es sich weiterhin gezeigt, dass die im vorstehenden Nährmedium enthaltenen Mono- und/oder Disaccharide vom Mikroorganismus für das Wachstum der Mikroorganismen nicht zwangsläufig erforderlich sind, so dass die Monosaccharide im Wesentlichen fast vollständig zu Milchsäure umgesetzt werden. Besteht der Zweck der Nährmediumzusammensetzung daher nicht in der Herstellung von Milchsäure, sondern ausschließlich in der Vermehrung von Mikroorganismen, ist ein Zusatz von geringen Mengen an Monosacchariden zur Nährmediumzusammensetzung demzufolge ausreichend. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher eine Nährmediumzusammensetzung, enthaltend

- bis zu 10 g/L Monosaccharide und/oder Disaccharide
- bis zu 5 g/L Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat,
- ein Mangansalz in einer Menge entsprechend 0,1 bis 3 g/l MnSO₄ Monohydrat,
- 1 bis 15 g/l an Alkali- und Erdalkalimetallsalzen,
- 0,1 bis 5 g/l an Aminosäuren,
- bis zu 5 mg/l Vitamine und
- Wasser.

Für bevorzugte Ausführungsformen dieser Nährmediumzusammensetzung gelten die vorstehenden Ausführungen, mit Ausnahme der Angaben zu geeigneten Mono- und/oder Disaccharidgehalten, analog.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung folgende Bestandteile:

- 0 bis 2 g/L, bevorzugt 0,3 bis 1,6 g/L Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat,
- ein Mangansulfat in einer Menge entsprechend 0,2 bis 0,5 g/L MnSO₄ Monohydrat,
- 0,05 bis 2 g/L Magnesiumsulfat,
- ein Natriumsalz in einer Menge entsprechend 0 bis 1 g/L Na₂SO₄,
- ein Kaliumsalz in einer Menge entsprechend 0 bis 2,5 g/L K₂SO₄,
- ein Calciumsalz in einer Menge entsprechend 0 bis 0,5 g/L CaCl₂ x 2 H₂O,
- bis zu 0,01 g/L Eisensulfat,
- bis zu 0,01 g/L Zinksulfat,
- bis zu 0,001 g/L Kupfersulfat,
- 0,01 bis 1 g/L D,L-Methionin
- bis zu 0,5 g/L L-Isoleucin,
- bis zu 0,2 g/L L-Leucin,
- bis zu 0,1 g/L L-Valin,
- bis zu 0,2 g/L L-Asparginsäure oder ein entsprechendes Äquivalent eines ihrer Salze,
- bis zu 2 g/L L-Mono-Natriumglutamat x H₂O oder eine äquivalente Menge der freien Säure oder eines anderen Salzes der L-Glutaminsäure,
- bis zu 0,1 g/L L-Lysinhydrochlorid oder eine entsprechende Menge an L-Lysin,
- 0,05 bis 2 g/L L-Threonin oder eines L-Threoninsalzes,
- bis zu 0,5 g/L Betain,
- einen Phosphatpuffer in einer Menge entsprechend 0,2 bis 10 g/L (NH₄)₂HPO₄,
- Wasser.

In einer alternativen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung folgende Bestandteile:

- 0,5 bis 5 g/L Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat,
- ein Mangansulfat in einer Menge entsprechend 0,2 bis 0,5 g/L MnSO₄ Monohydrat,
- 0,05 bis 2 g/L Magnesiumsulfat,
- ein Calciumsalz in einer Menge entsprechend 0 bis 0,5 g/L CaCl₂ x 2 H₂O,
- bis zu 0,01 g/L Eisensulfat,
- bis zu 0,01 g/L Zinksulfat,
- bis zu 0,001 g/L Kupfersulfat,
- 0,01 bis 1 g/L D,L-Methionin
- 0,05 bis 2 g/L L-Threonin oder eines L-Threoninsalzes,
- 0,5 bis 5 mg/L Pyridoxinhydrochlorid,
- 0,001 bis 0,005 mg/L Biotin,
- bis zu 0,5 mg/L Thiaminhydrochlorid,
- bis zu 2 mg/L Riboflavin,
- bis zu 10 mg/L Calcium-D-Pantothenat
- bis zu 10 mg/L Nicotinsäure oder deren Salze oder Derivate,
- bis zu 1 mg/L 4-Aminobenzoesäure,
- bis zu 0,5 g/L Betain,
- einen Phosphatpuffer in einer Menge entsprechend 0,2 bis 10 g/L (NH₄)₂HPO₄,
- Wasser.

Die Menge an Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung jeweils auf das Trockengewicht des Hefeextrakts und/oder Proteinhydrolysats.
Für die beiden vorstehend beschriebenen Ausführungsformen ist es bevorzugt, wenn sie als zusätzlichen Bestandteil ein Mono- und/oder Disaccharid enthalten und besonders bevorzugt, wenn sie als zusätzlichen Bestandteil nur ein Mono- oder Disaccharid, bevorzugt in Form von Glucose oder Saccharose enthalten. Für bevorzugte Gehalte an Mono- und/oder Disacchariden wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen.
Bei Fermentationen, die in Stahlfermentern durchgeführt werden, ist eine hohe Chloridionenkonzentration mit dem Nachteil verbunden, dass die Stahlbehälter durch die Ionen angegriffen und korrodiert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es daher bevorzugt, wenn die Alkali- und Erdalkalimetallsalze keine Chloridsalze, wie insbesondere Kalium- oder Natriumchlorid, umfassen. Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäßen Nährmediumzusammensetzungen eine Chloridionenkonzentrationen von 100 ppm oder weniger, bevorzugt 50 ppm oder weniger, und besonders bevorzugt etwa 20 ppm oder weniger, aufweisen.
Die Nährmediumzusammensetzungen, wie sie vorstehend angegeben sind, können neben den genannten Bestandteilen weitere Bestandteile enthalten. Es ist jedoch zweckmäßig, wenn die erfindungsgemäßen Nährmediumzusammensetzungen keine weiteren organischen Bestandteile enthalten, da diese im weiteren Verfahrensverlauf aufwendig von dem eigentlich gewünschten Produkt Milchsäure abgetrennt werden müssten. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die erfindungsgemäße Nährmediumzusammensetzung ausschließlich aus den genannten Bestandteilen, wobei Verunreinigungen in den Ausgangsmaterialien unberücksichtigt bleiben.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Kombination aus i) einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus coagulans, und ii) einer Nährmediumzusammensetzung, wie sie vorstehend beschrieben wurde.
Bei der Nährmediumzusammensetzung kann es sich sowohl um eine Nährmediumzusammensetzung mit Mono- und/oder Disacchariden als auch um eine Nährmediumzusammensetzung ohne Mono- und/oder Disaccharide handeln. Für die genannte Kombination ist es bevorzugt, wenn es sich bei dem Mikroorganismus um einen Mikroorganismus, ausgewählt aus Bacillus coagulans SV1 (hinterlegt bei der DSMZ als DSM 32125), Bacillus coagulans PS5 (hinterlegt bei der DSMZ als DSM 21639), Bacillus coagulans RI 1-12 (hinterlegt bei der DSMZ als DSM 32126), Bacillus coagulans RI 1-14 (hinterlegt bei der DSMZ als DSM 32127), Bacillus coagulans LC 8-1 (hinterlegt bei der DSMZ als DSM 32128) und Bacillus coagulans U18 (hinterlegt bei der DSMZ als DSM 32124) handelt. Darüber hinaus kommen aber auch andere Bacillus coagulans Stämme, wie diejenigen, die bei der DSMZ unter den Hinterlegungsnummern DSM 32126, DSM 32127 oder DSM 32128 hinterlegt sind, als Mikroorganismen in Betracht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure aus Mono- und/oder Disacchariden, bei dem eine Nährmediumzusammensetzung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, mit einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus coagulans versetzt und fermentiert wird, bis die Mono- und/oder Disacharide vollständig umgesetzt wurden. Unter der Angabe „vollständige Umsetzung“ der Mono- und/oder Disaccharide ist in diesem Fall eine Umsetzung von mindestens 90 Gew.-%, insbesondere mindestens 95 Gew.-%, weiter bevorzugt mindestens 98 Gew.-% und noch weiter bevorzugt mindestens 99 Gew.-% der eingesetzten Mono- und/oder Disaccharide zu verstehen. Dem Fachmann ist bewusst, dass nicht das gesamte Mono- und/oder Disaccharid zu Milchsäure umgesetzt wird, sondern dass ein geringer Anteil der Mono- und/oder Disaccharide für die Generierung von Biomasse verbraucht wird.
Für ein solches Verfahren zur Herstellen von Milchsäure ist ersichtlich eine Nährmediumzusammensetzung zu verwenden, die Mono- und/oder Disaccharide enthält.
Das Verfahren lässt sich vorteilhaft ausgestalten, indem die Fermentierung unter anaeroben bis mikroaerophilen Bedingungen durchgeführt wird. Unter mikroaerophilen Bedingungen versteht man im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Zudosierung geringer Mengen an Luft oder Sauerstoff, insbesondere eine Begasung mit 0,0001 bis 0,1 vvm und bevorzugt 0,0001 bis 0,01 vvm Luft bzw. ausgedrückt als Produkt des Sauerstoffübergangskoeffizienten an der Phasengrenzfläche (Flüssigkeit-Gas) K_L und der spezifischen Austauschfläche a - dem Fachmann auch als K_La-Wert bekannt - ist die Begasung (zu verstehen als Kombination aus Begasungsrate und Begasungsgaszusammensetzung) in Verbindung mit Fermenter- und Rührergeometrie, Leistungseintrag und Behälterinnendruck so zu wählen, dass K_La Werte von 0,1-20 h^-1, bevorzugt K_La Werte von 2-8 h-¹ erreicht werden. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich gezeigt, dass sich mikroaerophile Bedingungen, insbesondere in der Wachstumsphase der Bakterien, positiv auf die Fermentierungszeit auswirken, da das Wachstum der Bakterien beschleunigt wird ohne dass es dabei zu einer erheblichen Reduktion des Ausbeutekoeffizienten (g(Milchsäure)/g(Kohlenhydrat) bzw. zu einem erheblichen Anstieg der Menge gebildeter, unerwünschter Nebenprodukte kommt. Dies führt zu einer Beschleunigung der Fermentation bis eine im Wesentlichen vollständige Umsetzung der Monosaccharide erreicht ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich weiterhin gezeigt, dass der pH-Wert während der Fermentation zweckmäßig in einem Bereich von 6 bis 8 und bevorzugt 6,2 bis 6,7 gehalten werden sollte. Fällt der pH-Wert im Rahmen der Fermentation signifikant unter 6 bzw. steigt dieser über einen pH Wert von 8 über längere Zeit (>10 min), so hat dies negative Auswirkungen auf die Produktions- und die Fermentationsgeschwindigkeit der Mikroorganismen.
Da bei der Fermentation als Fermentationsprodukt aus den nicht-sauren Monosacchariden Milchsäure erzeugt wird, ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung weiterhin sinnvoll, den pH-Wert im Laufe des Verfahrens durch Zugabe einer Base anzupassen. Geeignete Basen sind beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumoxid, Calciumhydroxid (auch in Form von Kalkmilch oder gelöschtem Kalk), Calciumcarbonat, Ammoniumhydroxid und Ammoniak. Von diesen sind Ammoniumhydroxid und Ammoniak besonders geeignet, weil die Milchsäure durch die Zugabe von Mineralsäuren, wie beispielsweise Schwefelsäure, aus dem Ammoniumlactatsalz freigesetzt wird und das entstehende Ammoniumsalz der Mineralsäure, beispielsweise über eine Simulated-Moving-Bed Chromatographie, leicht von der ebenfalls erhaltenen Milchsäure abgetrennt werden kann. Ammoniumsalze lassen sich im Gegensatz zu den entsprechenden Natrium- oder Kaliumsalzen, kommerziell in einfacher Weise weiterverwerten, beispielsweise als Zusatz für Düngemittel. Ein geeignetes Verfahren zur Aufbereitung der Milchsäure für die Weiterverarbeitung zu Polymilchsäure ist beispielsweise in der WO 2009/040095 A2 offenbart, deren Inhalt hiermit durch Bezugnahme in die Anmeldung aufgenommen werden soll.
Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich weiterhin dadurch vorteilhaft ausgestalten, indem die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 45°C bis 65°C und bevorzugt im Bereich von 50°C bis 55°C durchgeführt wird. Der Einsatz erhöhter Temperaturen hat zum einen, wie vorstehend erwähnt, den Vorteil, dass die Fermentation nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden muss, da das Kontaminationsrisiko durch Fremdbakterien durch die erhöhte Temperatur von über 45°C entscheidend verringert wird. Um eine solche Fermentation zu gewährleisten, ist demzufolge die Einhaltung einer Mindesttemperatur von 45°C erforderlich. Andererseits nimmt die Produktivität der Bakterien jenseits von 65°C infolge der Denaturierung der Bakterien stark ab, so dass die Fermentation nicht bei Temperaturen von mehr als 65°C durchgeführt werden sollte.
Zum anderen wird bei erhöhten Temperaturen auch eine erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit erhalten, so dass verminderte Fermentationszeiten realisiert werden können.
Für das vorstehend beschrieben Verfahren ist es nicht entscheidend, dass die Kohlehydratkonzentration in der Nährmediumzusammensetzung von Anfang an so hoch ist, dass wirtschaftlich relevante Endtiter an Milchsäure erhalten werden (d.h. von > 50 und bevorzugt > 100 g/l). So ist es z.B. möglich im Laufe des Verfahrens, beispielsweise im Rahmen eines Fed-Batch Prozesses, weitere Mono- und/oder Disaccharide zuzusetzen, so dass am Ende des Verfahrens wirtschaftlich relevante Endtiter an Milchsäure erhalten werden. Die Menge der zugesetzten weiteren Mono- und/oder Disaccharide sollte in diesem Fall so bemessen sein, dass sich eine effektive Menge der für die Fermentation zur Verfügung stehenden Mono- und/oder Disaccharide in der Fermentationsmischung ergibt, die den Vorgaben aus Anspruch 1 entspricht (d.h. 10 bis 250 g/L). Die effektive Menge bezeichnet die Gesamtmenge an Mono- und/oder Disaccharide (in g), die dem Mikroorganismus über den gesamten Verlauf der Fermentierung für die Umsetzung zu Milchsäure und für das Wachstum zur Verfügung steht.
Alternativ dazu ist es möglich anstelle der Mono- und/oder Disaccharide Vorläufer davon in die Fermentation einzubeziehen, wobei der Fermentationsmischung, soweit erforderlich, Enzyme oder Mikroorganismen zugesetzt werden können, die die Vorläufer in Mono- oder Disaccharide umwandeln. Beispiele für solche Vorläufer sind z.B. Polysaccharide wie Stärke oder Cellulose, sowie Oligosaccharide mit mehr als zwei Monosaccharideinheiten. Bevorzugte Oligosacharide enthalten 3 bis 8 Monosaccharideinheiten. Geeignete Enzyme sind beispielsweise Amylasen wie insbesondere α-, β- oder y-Amylasen, sowie Cellulasen wie insbesondere Endoglucanasen, Exoglucanasen, Cellobiasen oder β-Glucosidasen. Auch in diesem Fall sollte die Menge der zugesetzten weiteren Mono- und/oder Disaccharidvorläufer so bemessen sein, dass sich eine effektive Menge der für die Fermentation zur Verfügung stehenden Mono- und/oder Disaccharide in der Fermentationsmischung ergibt, die den Vorgaben aus Anspruch 1 entspricht (d.h. 10 bis 250 g/L). Für den Fachmann ersichtlich liegt diese Menge zu keinem Zeitpunkt der Fermentation effektiv in der Fermentationsmischung vor, da die Mono- und/oder Disaccharide im Laufe der Zeit aus dem Vorläufer generiert und dann direkt zu Milchsäure umgesetzt werden.
Nach dem Vorstehenden betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure aus Kohlehydraten, bei dem eine Nähmediumzusammensetzung gemäß den vorstehenden Erläuterungen verwendet wird, die einen Gehalt von Mono- und/oder Disacchariden von weniger als 10 g/L aufweist, und bei dem diese Nähmediumzusammensetzung mit einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus coagulans versetzt und fermentiert wird, bis die Kohlehydrate vollständig umgesetzt wurden. Im Rahmen dieser Fermentation werden dabei weitere Mono- und/oder Disaccharide zugesetzt oder aus Vorläufern generiert, so dass die effektive Menge der für die Fermentation zur Verfügung stehenden Mono- und/oder Disaccharide im Bereich von 10 bis 250 g/L liegt.
Im Folgenden wird die Anmeldung anhand einiger Beispiele näher illustriert, die jedoch in keiner Weise als maßgeblich für den Schutzumfang der vorliegenden Anmeldung angesehen werden sollen.
Beispiel 1
Der Stamm Bacillus coagulans SV1 wurde in einem Medium mit einem Gehalt an 120 g/L Glucose, 1,5% w/v Hefeextrakt, 0,2 w/v (NH₄)₂HPO₄, 0,02 w/v MgSO₄ und 0,02 w/v MnSO₄ kultiviert. In einem Vergleichsversuch wurde eine entsprechende Mediumzusammensetzung ohne MnSO₄-Zusatz verwendet. Die entsprechenden Mischungen wurden bei einer Temperatur von 45°C unter Einstellung eines pH-Werts von 6,2 durch Zugabe von Ammoniakwasser als Korrekturmittel solange fermentiert, bis die Glucose vollständig (d.h. zu mehr als 99%) abgebaut war. Für die Fermentierungen wurde die Zeit bis zum Erreichen der vollständigen Umsetzung bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle 1 wiedergegeben: Tabelle 1

Mn²⁺ Dauer [h] Glucose, Anfang [g/L] Glucose, Ende [g/L] Laktat, Ende [g/L] Ausbeute [%]

ja 46 120 0,7 93,1 72,5

nein 68 120,9 1,3 100,9 77,4
Es zeigte sich, dass die Batchzeit allein durch den Zusatz von Mangansulfat um etwa 20 h reduziert werden konnte.
Beispiel 2

Der Stamm Bacillus coagulans SV1 wurde in einem Medium mit einem Gehalt an 119,2 g/L Glucose, 1,5% w/v Hefeextrakt, 0,2 w/v KH₂PO₄ und 0,02 w/v MgSO₄ kultiviert, das zusätzlich unterschiedliche Mengen an MnSO₄ enthielt. Die entsprechenden Mischungen wurden bei einer Temperatur von 52°C unter Einstellung eines pH-Werts von 6,2 durch Zugabe von Ammoniakwasser als Korrekturmittel solange fermentiert, bis die Glucose vollständig (d.h. zu mehr als 99%) abgebaut war. Für die Fermentierungen wurde die Zeit bis zum Erreichen der vollständigen Umsetzung bestimmt. Die Ergebnisse der Bestimmungen sind in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben: Tabelle 2

Mn²⁺	Dauer [h]	Glucose, Anfang [g/L]	Glucose, Ende [g/L]	Laktat, Ende [g/L]	Ausbeute [%]
0,01	28	119,2	0,7	98,0	78,1
0,015	28	119,2	0,6	98,0	78,5
0,02	27	119,2	0,7	98,2	78,9
0,03	25	119,2	0,7	98,0	78,6
0,04	25	119,2	0,7	97,8	79,0
0,05	25	119,2	0,7	97,7	78,7

Es zeigte sich, dass bei einer Mangankonzentration von etwa 0,02 bis 0,03 % die schnellste Umsetzung der Glucose zu Milchsäure realisiert werden kann. Bei einer Erhöhung der Manganmenge über 0,03 % hinaus ist hingegen keine weitere Beschleunigung der Fermentationsreaktion zu beobachten.
Beispiel 3

Der Stamm Bacillus coagulans U18 wurde in den Medien nach Tabelle 3 bei 48°C und pH 6,6, 425 rpm im 1 L-Maßstab unter pH-Statisierung mit Ammoniakwasser solange fermentiert, bis die Glucose vollständig (d.h. zu mehr als 99%) abgebaut war. Die erzielten Batchzeiten sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 3

Bestandteil	Einheit	MM 1	MM 2
Glucose Monohydrat	g/L	154	154
MnSO4	g/L	1	1
(NH4)2HPO4	g/L	1	1
MgSO4 x 7 H2O	g/L	1,04	1,04
NaCl	g/L	0,5	0,5
KCl	g/L	1,72	1,72
CaCl2 x 2 H2O	g/L	0,06	0,06
D,L-Methionin	g/L	0,144	0,1224
L-Isoleucin	g/L	0,4	0,3
L-Leucin	g/L	0,64	0,2688
L-Valin	g/L	0,48	0,192
L-Aspartat	g/L	0,288	0,288
L-Glutamat	g/L	0,848	0,848
L-Lysin	g/L	0,62	0,10075
L-Threonin	mg/L	0,24	0,72
L-Pyridoxin	mg/L	0,0004	0,0004
Biotin	mg/L	0,000002	0,000002
Thiamin	mg/L	0,0004	0,0004
Riboflavin	mg/L	0,0002	0,0002
Calcium Pantothenat	mg/L	0,0004	0,0004
Niacin	mg/L	0,0004	0,0004
Folsäure	mg/L	0,000002	0,000002
Beta i n	mg/L	0,1536	0,1536
FeS04 x 7 H2O	mg/L	0,00255	0,00255
ZnS04 x 7 H2O	mg/L	0,00106	0,00106
CuS04 x 5 H2O	mg/L	0,00035	0,00035
Hefeextrakt	g/L	1,5	1,5

Tabelle 4

Medium	Batchzeit	Milchsäureausbeute bezogen auf Glucose
MM1	68 h	96 %
MM2	66 h	96 %

Im Vergleich zu MM1 weist MM2 geringere Gehalte an höherpreisigen verzweigtkettigen Aminosäuren (Isoleucin, Valin, Leucin) und einen höheren Anteil an L-Threonin (preiswerter) auf. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass L-Threonin verzweigtkettige Aminosäuren im Medium ohne Performanceeinbußen ersetzen kann. Dies wird anhand der vergleichbaren Batchzeiten in Tabelle 4 ersichtlich.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

CN 1906290 [0006]
JP 5840093 [0006]
JP 606200 [0006]
JP 327291 [0006]
US 5079164 [0006]
WO 03/008601 [0010]
DE 602004008875 T2 [0011]
WO 2007/137809 [0012]
WO 2009/040095 A2 [0052]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Payot T. et al, Enzyme and Microbial Techology 1999, 24, S. 191-199 [0007]

Claims

Nährmediumzusammensetzung enthaltend - 10 bis 250 g/L Mono- und/oder Disaccharide, - Bis zu 5 g/L Hefeextrakt und/oder Proteinhydrolysat, - ein Mangansalz in einer Menge entsprechend 0,1 bis 3 g/L MnSO₄ Monohydrat, - 1 bis 15 g/L Alkali- und Erdalkalimetallsalze, - 0,1 bis 5 g/L Aminosäuren, - einen Phosphatpuffer in einer Menge entsprechend 0,2 bis 10 g/L (NH₄)₂HPO₄, - bis zu 25 mg/L Spurenelementmischung umfassend Eisen-, Zink- und Kupfersalze, - bis zu 5 mg/L Vitamine und - Wasser.
Nährmediumzusammensetzung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Mangansalz in einer Menge entsprechend 0,15 bis 1,5 g/L und bevorzugt 0,2 bis 1,2 g/L MnSO₄ Monohydrat aufweist.
Nährmediumzusammensetzung nach Anspruch 1 oder2, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Aminosäuren Threonin, und ein oder mehrere ausgewählt aus Isoleucin, Leucin und Valin enthält, wobei das Mengenverhältnis von Threonin zur Summe der Mengen von Isoleucin, Leucin und Valin mindestens 2:1 und bevorzugt mindestens 3:1 beträgt.
Nährmediumzusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Aminosäuren, die nicht Bestandteil des Hefeextrakts und/oder des Proteinhydrolysats sind, ausschließlich Threonin und gegebenenfalls Methionin in die Zusammensetzung einbezogen werden.
Nährmediumzusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 80 Gew.-%, bevorzugt mindestens 90 Gew.-% der Mono- und oder Disaccharide in Form von Glucose und/oder Saccharose vorliegen.
Nährmediumzusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkalimetallsalze Salze von Ammonium, Natrium und Kalium und die Erdalkalimetallsalze Salze von Magnesium und Calcium umfassen.
Nährmediumzusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Phosphat-, Hydrogenphosphat oder Dihydrogenphosphat enthält.
Nährmediumzusammensetzung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus Pyridoxin, Biotin, Thiamin, Riboflavin, Pantothensäure oder deren Salze, Niacin, Nicotinsäure und Folsäure, bevorzugt alle vorgenannten Substanzen, als Vitamine umfasst.
Kombination aus i) einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus coagulans, und ii) einer Nährmediumzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8.
Kombination gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus ausgewählt ist aus Bacillus coagulans SV1, Bacillus coagulans PS5, Bacillus coagulans RI 1-12, Bacillus coagulans RI 1-14, Bacillus coagulans LC 8-1 und Bacillus coagulans U18.
Verfahren zur Herstellung von Milchsäure aus Kohlehydraten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nährmediumzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus coagulans versetzt und fermentiert wird, bis die Kohlehydrate vollständig umgesetzt wurden.
Verfahren zur Herstellung von Milchsäure aus Kohlehydraten, dadurch gekennzeichnet, dass eine wie in den Ansprüchen 1 bis 8 angegebene Nährmediumzusammensetzung, die einen Gehalt von Mono- und/oder Disacchariden von weniger als 10 g/L aufweist, mit einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus coagulans versetzt und fermentiert wird, bis die Kohlehydrate vollständig umgesetzt wurden, wobei im Rahmen der Fermentation weitere Mono- und/oder Disaccharide zugesetzt oder aus Vorläufern generiert werden, so dass die effektive Menge der für die Fermentation zur Verfügung stehenden Mono- und/oder Disaccharide im Bereich von 10 bis 250 g/L liegt.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentierung unter anaeroben bis mikroaerophilen Bedingungen durchgeführt wird, wobei bevorzugt ein K_La Wert im Bereich von 0,1 bis 20 h^-1, und besonders bevorzugt im Bereich von 2 bis 8 h-¹ erreicht wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert während der Fermentation im Bereich von 6 bis 7, bevorzugt 6,2 bis 6,5 gehalten wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur Anpassung des pH-Werts eine Base, bevorzugt ausgewählt aus Ca(OH)₂, CaO, CaCO₃, NaOH, KOH, NH₄OH und NH₃, zugegeben wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentation bei einer Temperatur im Bereich von 45 bis 65°C, bevorzugt im Bereich von 50 bis 55°C durchgeführt wird.