PT2275436E - Fermentação de bacilos moderadamente termofílicos na sacarose - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"FERMENTAÇÃO DE BACILOS MODERADAMENTE TERMOFÍLICOS NA SACAROSE" A presente invenção é destinada à modificação genética da estirpe de Bacillus moderadamente termofilica de forma a conferir a capacidade de utilização da sacarose na estirpe de Bacillus que originalmente não possuia essa capacidade.

As espécies de Bacillus moderadamente termofilicas, preferivelmente aquelas espécies que são facultativamente anaeróbicas e homolácticas, são organismos ideais para o fabrico industrial de ácido láctico.

No contexto desta invenção, as espécies de Bacillus moderadamente termofilicas são capazes de crescer entre 37 e 65°C e permitem a fermentação industrial a temperaturas superiores a 50°C. Esta elevada temperatura de fermentação tem várias vantagens quando se fermentando em escala industrial: menor risco de infecções e por isso, maior pureza do produto, reações mais rápidas etc. Além disso, as exigências nutritivas destas bactérias são menos exigentes do que as das bactérias de ácido láctico tais como da espécie Lactobacillus, que também permitem processos industriais relativamente baratos.

As espécies de Bacillus moderadamente termofilicas incluem espécies aeróbicas e espécies anaeróbicas facultativas. A utilização de espécies anaeróbicas facultativas é preferida, uma vez que estas espécies permitem a fermentação sob condições anaeróbicas, ou pelo menos abaixo de uma pressão parcial baixa de oxigénio, que é desejável à escala industrial. Tais condições previnem a exigência de aeração dispendiosa e permitem a utilização de meios de 2 baixo custo, enquanto minimizam os riscos de contaminação ou até mesmo permitindo procedimentos de produção não-estéreis .

Também é preferido a utilização de espécies de Bacillus moderadamente termofilicas que são homoláctica. A natureza homoláctica permite a produção de ácido láctico a partir de fontes de hidrocarboneto (incluindo açúcares de hexose e pentose; ver o documento WO 04/063382) sem a formação de mais de 15 % em peso de produtos laterais tais como ácido fórmico e ácido acético. A modificação qenética do fenótipo homoláctico pode ser aplicada de forma a converter estirpes homolácticas em estirpes de produção homofermentativa para outros produtos industriais deriváveis de piruvato. Os exemplos destes compostos são piruvato, acetolactato, diacetil, acetoina, 2,3-butanodiol, 1,2-propanodiol, acetato, formato, acetaldeido, etanol, L-alanina, oxaloacetato, S-malato, sucinato, fumarato, 2-oxoqlutarato, oxalosucinato, isocitrato, citrato, glioxilato.

De preferência estas estirpes de produção são deficientes na esporulação.

Os exemplos de espécies de Bacillus moderadamente termofilicas e facultativamente anaeróbicas são Bacillus coagulans, Bacillus smithii, Bacillus thermoamylovorans e Bacillus thermocloacae, sendo também, pelo menos as duas primeiras espécies, homolácticas. Uma espécie preferida é a Bacillus coagulans. É desejável em fermentações industriais utilizar matéria-prima barata nos meios de fermentação. Por exemplo, a sacarose ou os substratos que contêm sacarose são muitas vezes utilizados como fontes de carbono de baixo custo para 3 fermentações industriais. No entanto, foi considerado que nem todas as estirpes de Bacillus moderadamente termofilicas utilizadas para fermentações industriais possuem a capacidade de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono. Isto é uma desvantagem, especialmente se essas estirpes tiverem sofrido adaptações de modo a melhorar a sua capacidade de fermentação ou potencial de produção numa escala industrial. Por exemplo, a estripe de Bacillus coagulans DSM 1 pareceu ser um fermentador muito pobre. Apenas foram observados escasso crescimento e formação ácida utilizando a sacarose como única fonte de carbono, que é provavelmente devido à atividade não-especifica de sistemas para utilização de outros açúcares.

Na literatura, o B. coagulans é mencionado como sendo variável na capacidade de utilização da sacarose (De Clerck, E., M Rodriguez-Diaz, G. Forsyth, L. Lebbe, N. Logan, 2004: Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains. Syst. Appl. Microbiol. 27: 50 - 60). Contudo não há qualquer informação disponível dos genes envolvidos no catabolismo da sacarose e não há genes anotados para o catabolismo da sacarose na sequência do genoma do B. coagulans 36D1 (http://genome.jgi-psf.org/draftmicrobes/bacco/bacco.home.html).

Assim sendo, um objeto da presente invenção é modificar geneticamente uma estirpe de Bacillus moderadamente termofilica originalmente incapaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono de forma a fornecer a estirpe com a capacidade de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono. Outro objeto da invenção é auxiliar um método para produção de um composto de interesse compreendendo a cultura de uma estirpe de Bacillus moderadamente termofilica numa fonte de carbono contendo sacarose. 4 A presente invenção divulga agora novos genes e polipéptidos envolvidos no catabolismo da sacarose e obteníveis a partir de espécies de Bacillus moderadamente termofílicas, preferivelmente a partir de espécies de Bacillus moderadamente termofílicas e facultativamente anaeróbicas, sendo as mais preferidas, a partir das espécies de Bacillus moderadamente termofílicas e facultativamente anaeróbicas, as homolácticas.

Os novos polipéptidos surpreendentemente apresentam uma homologia bastante baixa para corresponderem a polipéptidos de outras espécies de Bacillus, enquanto se observa uma homologia mais elevada com polipéptidos correspondentes a partir de espécies de Lactobacillus. Os novos genes e polipéptidos permitem a introdução da capacidade utilizando sacarose em estirpes de Bacillus moderadamente termofílicas não utilizando sacarose das mesmas espécies (ou estreitamente relacionadas) como as espécies a partir das quais os novos genes e polipéptidos são obteníveis. Em particular, os novos genes permitem a introdução do material genético por meios de auto-clonagem, isto é, utilização de material genético específico para as espécies.

Desse modo, num aspecto desta invenção, é conferido um método para a composição de uma estirpe de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono originada a partir de um progenitor de estirpe de Bacillus moderadamente termofílica incapaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono.

Em particular, a estirpe de Bacillus moderadamente termofílica capaz de utilizar a sacarose como uma fonte de 5 carbono é derivada a partir de um progenitor de estirpe de Bacillus moderadamente termofilica incapaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono através da transformação da referida estirpe progenitora com um polinucleótido necessário (gene) de forma a obter a utilização de sacarose. Conforme divulgado neste documento, este polinucleótido necessário compreende uma sequência de ADN que codifica um polipéptido que tem atividade de fosfotransferase especifica para a sacarose e tendo i) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou ii) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, de preferência de pelo menos 75, 80, 85, 90, 95%, de SEQ ID NO: 1 e/ou compreendendo uma sequência de ADN que codifica um polipéptido tendo atividade de hidrolase de sacarose-6-fosfato e tendo iii) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou iv) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, de preferência de pelo menos 75, 80, 85, 90, 95%, da sequência de SEQ ID NO: 2. A introdução do polinucleótido para atingir a utilização da sacarose na estirpe de Bacillus moderadamente termofilica de interesse pode ser efetuada utilizando qualquer procedimento de transformação adequado que seja conhecido pelo entendido na técnica, incluindo a transformação do protoplasto ou a fusão do protoplasto, a electroporação, a transformação biolistica, a conjugação, ou a transformação de células competentes naturais. Por exemplo, pode ser utilizado um procedimento de transformação conforme divulgado no documento WO 2007/085443, que é incorporado neste documento por referência. O polinucleótido para obter a utilização da sacarose pode ser introduzido através da utilização de um plasmido autonomamente replicado ou através da integração 6 cromossómica. 0 último é preferido para a aplicação industrial, uma vez que a integração cromossómica é geralmente considerada como mais estável e irá assegurar uma distribuição estável do polinucleótido através das células da descendência. A fermentação da sacarose pode, ela própria, ser uma pressão de seleção para a manutenção do polinucleótido de forma a obter a utilização da sacarose. A introdução do polinucleótido no cromossoma pode ser efetuada através da recombinação não-homóloga bem como da homóloga. A recombinação homóloga é preferida, uma vez que abre a oportunidade para introduzir, remover ou simultaneamente introduzir e remover uma funcionalidade no/a partir do cromossoma bacteriano. Quando é pretendida a recombinação homóloga, a transformação do polinucleótido também contém uma sequência de ADN que é homóloga a uma sequência objetivo genómica do Bacillus especifico a ser projetado. Qualquer sequência objetivo genómica adequada pode ser selecionada para esta finalidade. As sequências objetivo genómicas adequadas estão, por exemplo, localizadas numa região de não-codificação do genoma. 0 entendido na matéria irá entender que não é necessária uma identidade de 100% de forma a obter a recombinação homóloga. Uma identidade de percentagem de cerca de 90% também será suficiente. Geralmente, a sequência de ADN de interesse a ser inserida no cromossoma pela recombinação homóloga está intervalada por sequências homólogas com um comprimento suficiente para permitir a recombinação homóloga. Tal comprimento pode ser de pelo menos cerca de 100 bp, por exemplo entre cerca de 200 e cerca de 1.500 bp, preferivelmente entre cerca de 200 e cerca de 1.000 bp.

Para atingir a expressão do polinucleótido para obter a utilização da sacarose, a sequência de codificação do 7 polinucleótido é conferida com as necessárias sequências reguladoras. Estas sequências reguladoras podem ser as sequências reguladoras nativas ou podem ser heterólogas à sequência de codificação em questão.

Num outro aspecto, são fornecidos novos polipéptidos, isto é, um polipéptido que tem a atividade de fosfotransferase especifica para a sacarose e um polipéptido que tem a atividade de hidrolase de sacarose-6-fosfato. 0 polipéptido que tem a atividade de fosfotransferase especifica para a sacarose tem i) uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou ii) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, preferivelmente de pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, até mais preferivelmente de pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente de pelo menos 90%, o mais preferível de pelo menos 95%, com a sequência de SEQ ID NO: 1. O polipéptido que tem a atividade de hidrolase de sacarose-6-fosfato tem i) uma sequência de aminoácidos de sequência de SEQ ID NO: 2 ou ii) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70%, preferivelmente de pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, até mais preferivelmente de pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente de pelo menos 90%, o mais preferível de pelo menos 95%, com a sequência de SEQ ID NO: 2. 0 polipéptido de fosfotransferase especifica para a sacarose que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 partilha homologia significante com os componentes EIIBCA do sistema PTS especifico para a sacarose do Pediococcus pentosaceus e do Lactobacillus plantarum (ambos com identidade de 62% ao nivel da proteina) e outras bactérias de ácido láctico. Surpreendentemente, a homologia com outras espécies de Bacillus é muito mais baixa, tendo a 8 mais elevada identidade com o Bacillus clausii homólogo (identidade de 44% ao nivel da proteína). 0 polipéptido da hidrolase de sacarose-6-fosfato tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 partilha significante homologia com a hidrolase de sacarose-6-fosfato a partir do Lactobacillus sakei (identidade de 50% ao nível da proteína) e outras bactérias de ácido láctico. Também para este polipéptido foi surpreendente ver que a homologia com outro Bacillus homólogo foi mais baixa do que a das bactérias de ácido láctico. O Bacillus homólogo mais próximo foi o Bacillus clausii (identidade de 41% ao nível da proteína).

Para as finalidades da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos refere-se à percentagem de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências. O grau de identidade é determinado utilizando o algoritmo de BLAST, que é descrito em Altschul, e outros., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). O software para executar as análises de BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTP utiliza como valores por defeito: Tamanho da palavra: 3; Valor esperado: 10; Tamanho da lista de ocorrências 100; Diferença de custos: 11,1; Matriz: BLOSUM62.

Em ainda um outro aspecto, são fornecidos polinucleótidos que codificam os polipéptidos do aspecto anterior, por exemplo um polinucleótido tendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 3 ou a SEQ ID NO: 4. 9

Os polipéptidos e polinucleótidos dos aspectos acima mencionados são utilizáveis de forma a construir estirpe de Bacillus moderadamente termofilica capaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono, conforme descrito neste documento.

Em ainda um outro aspecto, é conferido um método para a produção de um composto de interesse compreendendo a cultura da estirpe de Bacillus moderadamente termofilica numa fonte de carbono contendo sacarose. 0 método é caraterizado por a cultura da estirpe de Bacillus moderadamente termofilica ser derivada a partir de um progenitor de estirpe de Bacillus moderadamente termofilica incapaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono através do fornecimento da estirpe progenitora com a capacidade de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono. A estirpe de Bacillus moderadamente termofilica progenitora que não é capaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono é fornecida com a capacidade de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono que utiliza o método e o(s) polinucleótido (s) conforme descrito nos aspectos anteriores. Ao utilizar estes métodos e polinucleótido (s), a presente invenção permite vantajosamente a cultura numa fonte de carbono contendo sacarose de estirpes de Bacillus moderadamente termofilicas que são adaptadas a condições de cultura industrial e/ou selecionadas de forma a possuírem um elevado potencial de produção e que originalmente não possuem a capacidade de utilizar sacarose. A fonte de carbono que é utilizada para a cultura da estirpe de Bacillus moderadamente termofilica pode conter sacarose num nivel de pelo menos 0,5% (p/p) , com base no 10 peso total da fonte de carbono. Também é possível utilizar a sacarose como a única fonte de carbono. A cultura além disso pode ser efetuada sob condições convencionais comumente conhecidas pelos entendidos na técnica.

Depois da cultura, o composto de interesse formado é opcionalmente isolado a partir do meio de fermentação e purificado quando necessário. Os métodos de purificação/isolação convencionais, p. ex. para o ácido láctico, são a destilação, a extração, a electrodiálise, a adsorção, a troca iónica, a cristalização e semelhantes, e combinações dos métodos de purificação/isolação acima mencionados. O composto de interesse pode ser ácido láctico. O termo "ácido láctico" significa ácido 2-hidroxi propiónico tanto na sua forma de ácido livre como de sal. O ácido láctico contém um átomo de carbono quiral, e por essa razão pode existir como enantiómero (R) e (S). O termo "ácido láctico" conforme utilizado neste pedido inclui o puro (R) e os isómeros (S), e misturas desses incluindo a mistura racémica. Para a produção de R-lactato, pode ser utilizada uma estirpe de produção que é geneticamente modificada conforme descrito no documento WO 2007/085443, que é incorporado neste documento por referência. O composto de interesse também pode ser piruvato, utilizando uma estirpe em que a conversão de piruvato em lactato é bloqueada. O composto de interesse também pode ser um composto derivável a partir de piruvato, utilizando uma estirpe em que o piruvato é redirecionado em direção à produção desse composto, incluindo acetolactato, diacetil, acetoína, 2,3-butanodiol, 1,2-propanodiol, acetato, 11 formato, acetaldeído, etanol, L-alanina, oxaloacetato, S-malato, sucinato, fumarato, 2-oxoglutarato, oxalosucinato, isocitrato, citrato, glioxilato.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra o mapa genómico do operão de sacarose do Bacillus coagulans, representando o gene II da enzima PTS da sacarose (scrA) e o gene da hidrolase da sacarose-6-fosfato (scrB) . A Figura 2 mostra um mapa plasmídeo de pMH84. Os genes de replicaçao (repA e repB), o gene de resistência cloranfenicol (cat) , o gene II da enzima PTS da sacarose (scrA) e o gene da hidrolase da sacarose-6-fosfato (scrB) estão representados por setas. As regiões a montante (us) e a jusante (ds) de homologia de recombinação de passagem dupla (cinzento), a região do promotor de Bacillus coagulans (Bco; branco) , e os locais de lox (lox 71 e Ιοχββ; preto) estão dentro de caixas. Para BglII e Ncol só são incluídos os locais relevantes para a composição.

EXEMPLOS

Estirpes e condições de cultura 0 B. coagulans DSM 1 foi obtido a partir da DSMZ, Braunschweig, Alemanha. 0 B. coagulans foi rotineiramente cultivado a 50°C sob condições aeróbicas (120 rpm) no caldo de BC (documento WO 2007/085443) contendo 50 g/L de glucose. Se apropriado, o meio foi complementado com cloranfenicol a 7 mg/L. As placas de BC foram preparadas com Gelrite conforme descrito anteriormente (documento WO 2007/085443). Para a avaliação da utilização o B. coagulans foi colocado em cultura num meio quimicamente definido (CDM) contendo por litro 2,0 g de (NH4)2HP04, 3,5 g de (NH4) 2S04, 10 g de tampão Bis-Tris de iminotris (bis [2- 12 hidroximetil] [hidroximetil]-metano), 0,5 g de KC1, 0,234 g de L-arginina, 0,304 g de L-ácido aspártico, 0,026 g L-cistina, 0,470 g de ácido glutâmico, 0,093 g de L-histidina, 0,360 g de L-isoleucina, 0,581 g de L-leucina, 0,111 g de L-metionina, 0,197 g de L-prolina, 0,308 g de L-serina, 0,350 g de L-treonina, 0,345 g de L-valina, 0,2 g de MgCl2*6H20, 50 mg de CaCl2*2H20, 16 mg de MnCl2, 7 mg de FeS04»H20, 0,1 mg de tiamina, 0,5 mg de ácido nicotinico, 0,1 mg de ácido pantoténico, 0,5 mg de piridoxamina, 0,5 mg de piridoxal, 0,1 mg de D-biotina, 0,1 mg de ácido fólico, 0,1 mg de ácido p-aminobenzóico, 0,1 mg de cobalamina. Se apropriado o CDM foi suplementado com 5 g de glucose ou 5 g de sacarose por litro. O lactococcus lactis MG1363 foi descrito por Gasson (Gasson, M. J., 1983: Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO 712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing, J. Bacteriol. 154: 1 - 9) . O L. lactis foi rotineiramente cultivado a 30°C em caldo de M17 (Difco) contendo 5 g/L de glucose. As bactérias foram armazenadas em stocks de glicerol, utilizando glicerol a 15% (v/v), a -80°C.

Técnicas de manipulação de ADN

As técnicas de manipulação de ADN padrão foram efetuadas conforme descrito por Sambrook e Russell (J. Sambrook e D. W. Russell. 2001: Molecular Cloning, a laboratory manual. 3a edição. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). A isolação de ADN de plasmídeo de larga escala a partir da cultura de 100 mL foi efetuada utilizando um Jetstar 2,0 Plasmid Maxiprep Kit® (Genomed) seguindo as instruções do fabricante. A isolação de ADN de plasmideo de curta escala a partir da cultura de 1 mL foi efetuada utilizando um conjunto de Nucleospin Plasmid Quick Pure® (Macherey-Nagel) seguindo as instruções do fabricante. 13 0 L. lactis serviu como um hospedeiro intermediário durante a composição da integração do plasmido pMH84 (Figura 2) . A preparação das células competentes de L. lactis e a electroporação foram efetuadas conforme descrito por Holo e Nes (Holo, H. e I. F. Nes, 1989: High-f requency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media, Appl. Environ. Microbiol. 55: 3119 3123) . 0 B. coagulans foi transformado por electroporação conforme descrito no documento WO 2007/085443.

As reações PCR para propósitos de clonagem foram efetuadas com polimerase Pwo de alta-fidelidade (Roche) seguindo as instruções do fabricante. A análise de colónia-PCR foi utilizada de forma a demonstrar a presença de pNW33N nas colónias resistentes a cloranfenicol conforme descrito no documento WO 2007/085443.

Fermentações

Os lotes de fermentação de B. coagulans foram efetuados em tubos de tampa de rosca (13 mL) com 10 mL de caldo de BC ou CDM a 50°C.

Foram recolhidas amostras no final da fermentação de modo a medir a turvação a 600 nm, o pH e o conteúdo ácido orgânico no caldo de fermentação. Para o último, as amostras foram centrifugadas e os detritos restantes no sobrenadante foram retirados através de filtração utilizando um filtro Millex 14 GP 0,22 ym® (Millipore) . O filtrado foi congelado até análise posterior.

Os ácidos orgânicos (ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, etanol, ácido butírico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido 2-hidroxi butírico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido sórbico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido benzóico, ácido maleico, ácido málico, ácido cítrico) foram medidos utilizando uma derivação e GLC. Os lactatos R- e S- foram metilados para metilo-lactato e medidos através da análise do espaço livre numa coluna quiral. EXEMPLO 1. Composição de um plasmideo de integração de utilização de sacarose de B. coagulans A análise de sequência aleatória de uma estirpe de B. coagulans que fermenta sacarose selecionada revelou uma região de dois genes com homologia de sequência para a enzima PTS de sacarose II e genes de hidrolase de sacarose-6-fosfato (scrA e scrB respetivamente). Um mapa genético da região é mostrado na Figura 1. Um fragmento de ADN que contém um grupo genético scrAB e os seus promotores (representado em SEQ ID NO: 5) foi gerado com PCR de alta-fidelidade utilizando os primários 5'- AGTACTGCATGCTTAAAGAGTAGCTTTCGGTGTTAAAGTG-3' (introduzindo um local de Sphl, SEQ ID NO: 6) e 5'- AGTACTGAGCTCCTATTTATTAATAGAATGAAGACTCCAGTAGTTCCC-3' (introduzindo um local de SacII, SEQ ID NO: 7) em combinação com o ADN genómico originado a partir de uma estirpe de B. coagulans de fermentação de sacarose como ADN padrão. Alternativamente o grupo genético scrAB pode ser gerado como ADN sintético tendo a sequência representada na SEQ ID NO: 5. Um plasmido de integração de B. coagulans foi modificado de forma a permitir a integração do grupo genético scrAB no cromossoma B. coagulans DSM 1. Os 15 fragmentos de 1,0 kb a montante e a jusante do local de integração cromossómico foram utilizados para recombinação. O vetor de integração, pMH84 (Figura 2), é baseado na clonagem lactococal do vetor pMH3 (documento WO 2007/085443) e tem um replicão termo-sensivel em B. coagulans. Primeiro o promotor de cat foi substituído por um promotor de B. coagulans. Neste ponto o fragmento de BglIISall pMH3 que contém o gene de cat foi substituído por uma fusão de produto de PCR de um B. coagulans constitutivo promotor translacionalmente fundido para o gene de cat introduzindo simultaneamente um local de Ncol que fica sobreposto ao códon de início do cat (SEQ ID NO: 18) . A parte do promotor foi gerada utilizando combinação primária (para a frente) 5'-CGCGTCGACTGTGGATAAGACAACAGGATTCGTATG-3' (introdução de um local de Sall, SEQ ID NO: 8) e (inverso) 5'-CTAAATCAATTTTATTAAAGTCCATGGGTCCACCCCGTTCTTTTCTTTTTGTG -3' (introdução de um local de Ncol, SEQ ID NO: 9) com o ADN genómico de uma ala) 5'- CACAAAAAGAAAAGAAC GGGGT GGACCCATGGACT T TAATAAAATTGAT T TAG - 3' (introdução de um local de Ncol, SEQ ID NO: 10) e (inverso) 5'-CGCAGATCTCCTTCTTCAACTAACGGG-3' (introdução de um local de BglII, SEQ ID NO: 11) usando pMH3 como um padrão. Ambos os produtos foram utilizados como padrão numa nova reação PCR utilizando o promotor para a frente e os primários de cat inversos. Este fragmento também pode ser gerado como ADN sintético tendo a sequência representada na SEQ ID NO: 18. O plasmídeo resultante foi designado por pMH71. De forma a permitir a múltipla utilização do sistema Cre-lox, os locais lox66 e lox71 (Langer, S. J., A. P. Ghafoori, M. Byrd e L. Leinwand, 2002: A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites, Nucleic Acids Res. 30: 3067 - 3077., Lambert, J. M., R. S. Bongers, e M. Kleere-bezem, 2007: Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum, Appl. 16

Environ. Microbiol. 73: 1126 - 1135.) flanquearam a região do promotor do cat introduzida pelo PCR utilizando os primários 5'- CCCGTCGACGCTAGCTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTGGATAAGA CAACA GGATTCG-3' (introdução dos locais lox66, Sall e Nhel, SEQ ID NO: 12) e 5'- CGCAGATCTTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTTCTTCAACTAACG GGGCA GGTTAG-3' (introdução dos locais lox71 e BglII, SEQ ID NO: 13) e pMH71 como padrão. 0 produto PCR resultante foi digerido com BglII-Sall e utilizado para trocar com a região de BglII-Sall-promotor de cat de pMH71, resultando no plasmideo pMH77. 0 fragmento a montante do local de integração foi gerado por PCR utilizando os primários 5'-CGCCTCGAGAGATCTGGCCGGGCTTTATGGGAGG-3' (introdução de locais Xhol e BglII, SEQ ID NO: 14) e 5 GCCGAGCTCGCATGCCCCTGATCAACCGGGTCAGTGC (introdução de locais Saci e Sphl, SEQ ID NO: 15) e ADN cromossómico B. coagulans DSM 1 como padrão. 0 produto PCR foi clonado em pMH77 utilizando Saci e Xhol. Isto resultou em pMH82. 0 fragmento a jusante do local de integração foi gerado por PCR utilizando os primários 5'- CCCGCTAGCCGTTTCAATCACATAGTCGTATTG (introdução de um local de Nhel, SEQ ID NO: 16) e 5'CCGGTCGACGGCCTTCATGTGCTTTTGCCGCAAATTC (introdução de um local de Sall, SEQ ID NO: 17) e ADN cromossómico B. coagulans DSM 1 como padrão. O produto PCR foi clonado em pMH82 como fragmento de Sall-Nhel, resultando em pMH83. O fragmento de ADN que contém os genes scrAB foi clonado como fragmento de Sphl e de Saci em pMH83 digerido com as mesmas enzimas, o que resultou no vetor de integração pMH84 (Figura 2) . 0 plasmideo pMH84 foi isolado e a integridade do grupo genético scrAB, as regiões a montante e a jusante, e os locais de lox foram confirmados através da análise de sequência de ADN. 17 EXEMPLO 2. Integração genómica de scrAB em B. coagulans DSM1

Para a integração genómica dos genes scrAB no B. coagulans DSM 1, o plasmideo pMH84 foi transformado nesta estirpe através de eletroporação e colocado em placas de BC suplementadas com cloranfenicol. Os transformados foram protegidos para a presença do plasmideo através da colónia PCR. As colónias positivas foram cultivadas para isolação do plasmideo e a integridade do plasmideo foi confirmada através da análise de restrição. Um transformado foi selecionado para experiências posteriores. A integração dos genes de sacarose através da troca de cruzamento duplo foi estabelecida depois da cultura a 60°C e seleção para colónias resistentes ao cloranfenicol. Uma parte integrante foi selecionada para estudos posteriores e armazenado como stocks de glicerol. A integração correta foi confirmada através de análise PCR e análise de sequência dos locais de fusão. Esta estirpe foi designada por B. coagulans DSM 1:: scrAB. EXEMPLO 3. Fermentação da sacarose com B. coagulans

Nesta experiência os inventores demonstram como é que as estirpes de B. coagulans que não são capazes da eficiente fermentação da sacarose podem ser modificadas de forma a passarem a fermentar a sacarose. As estirpes de B. coagulans DSM 1 e DSM 1: : scrAB foram inoculadas a partir de stocks de glicerol em 10 ml de caldo de BC sem açúcar e incubadas a 50°C a 120 rpm. As culturas noturnas foram transferidas (2% v/v) para 10 ml de CDM suplementado com glucose. Depois da incubação noturna as culturas foram granuladas e os grânulos foram novamente suspensos em 10 ml de CDM sem açúcar. Para cada estirpe foram inoculadas três porções triplas de 10 ml de CDM suplementadas com 5 g de 18 glucose por litro, 5 g de sacarose por litro ou sem nenhum açúcar (2% v/v) a partir das culturas novamente suspensas. Depois de 50 h de incubação estática em tubos de tampa de rosca foram determinados a turvação a 600 nm, o pH e o conteúdo ácido orgânico do caldo sobrenadante (Tabela 1) . Os resultados demonstram que o açúcar é necessário para o crescimento anaeróbico adequado e que o B. coagulans DSM 1:: scrAB é capaz de fermentar a sacarose em ácido láctico, enquanto o B. coagulans DSM 1 não é. A ausência de açúcar resultou em ausência de crescimento e em nenhuma acidificação para ambas as estirpes de B. coagulans. Na presença de sacarose o DSM 1 não mostrou qualquer crescimento e nenhuma acidificação, enquanto o B. coagulans DSM 1:: scrAB tinha bom crescimento e acidificação. O ácido láctico foi o único ácido orgânico que foi detetado nos sobrenadantes da cultura. Isto demonstra que introduzir a sequência genética do B. coagulans scrAB é suficiente para a fermentação eficiente da sacarose com B. coagulans.

Tabela 1. Caracteristicas de fermentação depois de 50h de incubação3

Estirpe B. coagulans DSM 1::scrAB B. coagulans DSM 1 Carbono adicionado Glucose Sacarose Nenhum Glucose Sacarose Nenhum Turvação a 0,6 O 00 O o 0,7 0,1 O O 600 nm pH 4,4 4,5 6, 5 4,4 6, 5 6, 5 Ácido 0,41 0,36 N. D. 0,40 N. D. N. D. lático a Os dados são a média de 3 fermentações . As concentrações de ácidos orgânico são dadas em % (p/p) - N. D., não determinado. O ácido fórmico (<0,02 %) , 'ácido acético (<0,02%), o ácido propiómco «0,02%), o ácido butírico (<0,01%), o ácido pirúvico (<0,02%), o ácido 2-hidroxi butírico (<0,01%), o ácido glicólico «0,20%), o ácido oxálico «0,02%) , o ácido sórbico «0,01%), o ácido fumánco «0,02%), o ácido sucínico (<0,02%), o ácido benzoico (<0,03 o) e o ácido maleico «0,02%) estavam abaixo dos limites de deteção._ 19

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Purac Biochem B.V. <120> Fermentação de bacilos moderadamente termofílicos na sacarose <130> EP11371-He/vw <160> 18

<170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 656 <212> PRT <213> Bacillus coagulans <4 0 0> 1

Met Asn HIS Ala Lys Val Ala Lys Asp Val Leu Asn Ala Leu Asn Gly 1 5 10 15 Lys Asp Asn Ile 20 Lys Ala Ala Ala His 25 Cys Ala Thr Arg Leu 30 Arg Leu vai Ile Asn ASp Glu Ser Lys Ile ASp Gin Lys Ala Leu ASp Ala His 35 40 45 Pro Asp Val Lys Gly Thr Phe Lys Thr Asn Gly Gin Tyr Gin Ile Ile 50 55 60 ile Gly Pro Gly Asp val ASp Lys val Tyr Ala Glu Leu Ile Lys Leu 65 70 75 80 Thr Gly Leu Pro Asp Met Thr Thr Glu Asp Val Lys Lys Thr Ser Asn 85 90 95 Glu Lys Gin Gly Asn Val Leu Leu Arg Leu Ile Lys val Leu Ser Asp 100 105 110 20 ile Phe val Pro Ile Ile Pro Ala Leu val Ala Gly Gly Leu Leu Met 115 120 125 Ala Leu Asn Asn val Leu Thr Ala Glu His Leu Phe Thr Lys Lys Ala 130 135 140 Ile Val Glu Leu Tyr Pro Gly Leu Lys Asp Ile Ala Ser Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Met Ser Ala Ala Pro Phe Thr Phe Leu Pro val Leu Ile Gly Tyr 165 170 175 Ser Ala Thr Lys Arg Phe Gly Gly Asn Pro Tyr Leu Gly Ala Ala Met 180 185 190 Gly Met He Met val ser pro Ala Leu Thr Ser Gly Tyr Asp val val 195 200 205 Ser Ala Lys Ala ser Gly Glu Leu Ala Tyr Trp His Ile Phe Gly Leu 210 215 220 Lys val Ala Gl n Ala Gly Tyr Gin Gly Ser val teu Pro val Leu Val */ 225 230 235 240 val Ser Trp Ile Leu 245 Ala Lys Leu Glu Lys 250 Phe Phe His Lys Tyr 255 Ile Ser Asn Ala Phe 260 ASp phe Thr Phe Thr 265 Pro Met Leu Ala Ile 270 ile Ile Thr Gly Phe 275 Leu Thr phe Thr Phe 280 val Gly Pro val Met 285 Arg Asp Val ser ASp 290 Gly Leu Thr Asn Gly 295 Ile Met Trp Leu Tyr 300 Asn a! a Thr Gly Ala 305 val Gly Thr Ala Ile 310 Phe Gly Leu Phe Tyr 315 Ser Pro ile val Ile 320 21

Thr Gly teu His Gin 325 ser Phe Pro Ala Xle 330 Glu Thr Thr Leu Leu 335 Ala ASp ile Ala Lys 340 Thr Gly Gly ser Phe 345 val Leu pro xle Ala 350 ser Met Ala Asn ile Ala Gin Gly Ala Ala Cys Leu Ala val Phe Phe ile Thr 355 360 365 Lys ser 370 Lys Lys Gin Lys Ser 375 Leu ser Ser ser Ala 380 Ser ile ser Ala Leu 385 Leu Gly ile Thr Glu 390 Pro Ala xle Phe Gly 395 ile Asn Leu tys Leu 400 Arg Tyr pro phe Phe 405 Cys Ala Met val Ala 410 Ser Gly Ile Ala Ser 415 ile Phe ile Gly Met Phe His val Leu Ser val Ser Met Gly Pro Ala Ser 420 425 430 vai ile Gly phe ile Cys Xle Arg ser Gin ser xle Leu Pro Phe Val 435 440 445 Met ser Gly Ala lie Ser Phe val Ile Ala Phe Thr Thr Thr Tyr Ile 450 455 460 Tyr Gly Arg Arg Ala Ala Ala Lys Glu Gin Asn Thr Ile Thr Asn Glu 465 470 475 480 Arg vai ser Gly Lys Glu Gin Ile Gly Glu Thr Ala Ala Ser Ala Thr 485 490 495 Ala Pro Ala Gly Asn Xle ile Xle Phe Ala Pro val Glu Gly Glu Thr 500 505 510 Met ser Leu 515 Lys Asn val Lys ASP 520 Lys Leu Phe Ser Ser 525 Glu Leu Met Gly Lys 530 Gly Ala Ala Xle Met 535 pro Lys Asn Gly Asp 540 val Tyr Ala Pro Cys ASP Gly lie Leu Thr Thr val phe ASp Thr His His Ala Tyr Gly 545 550 555 560 22 ile Lvs Thr Glu asp Gly Ala Glu ile Leu He His ile Gly ile Asp 565 570 575

Thr vai Asn Leu Lys Gly Glu Tyr Phe Thr Ser Tyr Vai Glu Lys Gly 580 585 590 6ln Thr vai Asn Gin Gly Asp Lys Leu Cys Ser Phe Asp Leu Glu Lys 595 600 605

He Lys Glu Leu Gly Tyr Asp Pro Thr vai Ile Thr vai Vai Thr Asn 610 615 620

Thr Ala asp Tvr Ala Ala Vai Glu Gly Phe Asn His Asp His Asp Lys 625 630 635 640 val Lys Gin Gly ser Gin Phe lie Thr Leu Thr Pro Lys Ala Thr teu 645 650 655 <210> 2 <211> 493

<212> PRT <213> Bacillus coagulans <400> 2

Met Glu Trp Asn Arg Ala teu Arg Tyr Lys Asn Leu Asn Glu Trp ser 15 10 15

Glu Glu Glu Lys Lys His Leu Leu Leu Gin Ile Glu Asn Ser pro Trp 20 25 30

Arg Leu His Tyr His Ile Gin Pro Glu Ser Gly Leu Leu Asn asd Pro 35 40 45

Asn Gly Phe ser Phe Phe Asn asd Glu Trp His Leu Phe Tyr Gin Asn 50 55 60

Tyr Pro Met Gly pro vai His Gly Leu Lys Cys Trp Tyr His teu ser 65 70 75 só

Ser Lys Asp Leu Ile His Trp Lys Gly Lys Gly Leu Ala ile Leu Pro 85 90 95 23 ASp Thr Glu Tyr Asp Ser HÍS 100 vai Glu Asp 115 Arg Leu Phe Ile Asn Trp A$n Arg Phe ser Tyr 130 135 Gly Arg Ile Ser Lys Leu Lys 145 150 Asn Tyr Thr Asp His phe Arg 165 Ser Tyr Tyr Ala Leu Ile Gly 180 Ile Leu vai Tyr Gin Ser Lys 195 Pro Leu Glu Leu Pro Leu Lys 210 215 Asn ile val Trp Val Asp Gin 225 230 Gly Leu Asp Gin Asn Ile Leu 245 Tyr Leu Ile Gly ASp Thr Phe 260 Lys Tyr Leu Leu His Asn Leu 275 Gin Ala Phe Asn Ala Pro Asp 290 295 Gly Leu Pro Glu ile Asp Tyr 305 310 Cys Leu Ser Leu Ile Lys Glu 325

Gly cys Tyr ser Gly Ser Ala ile Pro 105 HO

Met Tyr Thr Gly Asn vai Arg Asp Lys 120 125

Gin Leu Gly Ala Trp Met ASp Lys Lys 140

Thr Pro Leu lie Ala Lys Gin Pro Glu 155 160

Asp Pro Gin ile Ile Arg Tyr His Asn 170 1?S

Ala Gin Thr Lys Gin Lys Glu Gly Asn 185 190

Asp Leu Lys Asn Trp Glu Phe Asn Gly 200 205

Asn Leu Gly Tyr Met lie Glu Cys Pro 220

Lys Pro vai Leu Ile Phe Cys Pro Gin 235 240

His Tyr Gin Asn ile Tyr Pro Asn Thr 250 255

Asp Pro Glu lys Asn Arg Phe Glu ser 265 270

Asp Glu Gly Phe Asp ile Tyr Ala Thr 280 285

Gly Arg Thr leu Ala vai ser Trp ile 300

Pro Thr Asp Gin Tyr Gly Trp Ala His 315 320

Leu Lys ile Gin Asp Gly His Leu Tyr 330 335 24

Gin Phe pro vai Lys Glu Thr Glu ser Leu Arg Gly Arg Lys ile Glu 340 345 350 Leu Asp Gly vai Leu Thr Glu Gin Thr Gin Leu ile Leu Asn Gin Asn 355 360 365 Glu Thr Ala Tyr Glu Leu Glu lie Ile Leu Lys Gly Asn Gly Glu Gly 370 375 380 Lys 385 Leu Gin Leu Ala Ser 390 ASP Gly His Gin Ala 395 Leu Asn Leu Ile Phe 400 Asn Phe Ala Asp Gly Thr Leu vai Leu Asp Arg Ser His Ala Gly Ile 405 410 415 ΡΓΟ Phe Ala Gin Gin Tyr Gly Thr Ser Arg Thr Vai Gin Ile Pro Lys 420 425 430 Asn Thr Pro Leu Asn Leu His Ile Phe Met Asp Ala Ser vai Vai Glu 435 440 445 ile Phe Leu Asn His Gly His Asp Vai Leu Thr Ser Arg Leu Phe Pro 450 455 460 Ser Lys Lys Gin Thr Lys lie Phe Leu Glu Thr Asn His His Leu Ala 465 470 475 480 Tyr Asn Gly Asn Tyr Trp Ser Leu Hi S ser ile Asn Lys 485 490

<210> 3 <211> 1971 <212> ADN <213> Bacillus coagulans <400> 3 25 atgaaccatg caaaggttgc aaaagacgtg ttaaacgctt taaatggcaa agataatata 60 aaagctgcag cccactgcgc gacaaggctg cgcttagtta tcaatgatga atcaaaaata 120 gaccaaaaag cattggatgc gcatccggat gtaaaaggta catttaaaac aaacggccag 180 taccaaatta ttataggacc gggggatgtc gataaagttt atgctgaatt gatcaaatta 240 accggccttc cggatatgac aacggaggat gtgaaaaaaa cttcgaatga aaagcaggga 300 aatgtattat taagattaat caaggtatta tctgatattt ttgttccaat tattcctgca 360 cttgttgccg gcggtttgct gatggcttta aacaatgtat tgacagcgga acacctattc 420 acaaagaagg caatagtgga attgtacccg ggactgaaag atatagcgtc atttatcaat 480 accatgtcgg ctgccccatt tactttcttg ccggttttaa tcggatattc cgcaaccaaa 540 cggtttggtg ggaatccgta tttaggagct gctatgggga tgatcatggt atctcctgca 600 ttgacaagcg ggtatgatgt tgttagcgca aaagcatcag gggagttggc ttattggcat 660 atttttggat taaaagtcgc gcaggccggt taccaaggct ctgtcttgcc ggtattggta 720 gtttcatgga ttttagctaa attagagaaa tttttccata aatatatttc aaatgcattt 780 gattttacgt tcacaccgat gcttgccatt atcattacag gatttctaac gtttacattt 840 gttgggcctg ttatgcgtga tgtgagtgat gggttaacca atggaattat gtggttatat 900 aatgcaacag gcgcggttgg aactgcaatc tttggactgt tttattcacc gattgtcatt 960 aceggtctgc atcaaagttt tcctgcaatt gaaaccacac ttttggctga tattgcaaaa 1020 accggcggat cgtttgtatt accaatcgcc tctatggcta atattgcgca aggtgctgct 1080 tgtcttgccg tattctttat tacaaaaagt aaaaaacaaa aaagcttatc ttcttcagca 1140 agtatttcag ctcttttggg gattacagaa ccggctattt tcgggattaa cttgaaatta 1200 aggtatccgt tcttttgtgc aatggttgct tccggtattg cttctatatt tattggcatg 1260 ttccatgtgt tatcagtttc aatgggacct gcaagtgtaa ttggttttat ttgcattcgc 1320 tcacaatcta tcttgccttt tgtcatgagt ggcgcaataa gttttgttat cgccttcaca 1380 acaacgtata tatatggaag acgggcggcg gcaaaggaac aaaatacgat tacgaatgaa 1440 cgggtatctg gaaaagaaca aataggagaa acggctgctt cggctacggc ccctgctggt 1500 aatatcatca tttttgcccc ggttgaaggt gaaacaatga gettaaaaaa tgtgaaggat 1560 aaattatttt catctgaatt aatgggtaaa ggggcagcca tcatgccgaa aaacggcgat 1620 gtctatgctc cttgtgacgg aattttgacc acggtatttg atacacatca tgeatacggc 1680 attaaaacgg aagatggagc agaaatttta attcacattg gtattgacac ggttaatctg 1740 aaaggcgaat attttacaag ttacgtagaa aaaggtcaga cggtaaacca aggcgacaaa 1800 ctatgcagtt ttgatctgga gaaaattaaa gaacttggtt atgatccaac cgtgatcacc 1860 gtcgtgacca acacagcaga ttatgcggct gttgaaggat ttaatcatga tcatgataag 1920 gtaaaacagg ggagccagtt catcacttta acaccgaaag ctactcttta a 1971 <210> 4 26

<211> 1482 <212> ADN <213> Bacillus coagulans <400> 4 atggaatgga atcgagcatt acgttataaa aatctaaatg agtggtctga ggaagaaaaa 60 aagcatttac ttcttcaaat agaaaattct ccgtggcggc tgcattacca tattcaacct 120 gaaagcggat tgttgaatga tccaaacgga ttttcttttt ttaatgatga atggcatcta 180 ttttatcaaa attatccgat ggggcctgtc catggtttaa aatgctggta tcatcttagt 240 tcaaaagatc ttatccattg gaaagggaag gggctggcca tattgccgga tacagagtat 300 gacagtcacg gctgctactc cggatctgca atcccggttg aagaccgttt atttatcatg 360 tatacaggaa acgtccgaga taaaaaetgg aacagattct cttaccagct tggagcgtgg 420 atggataaaa aaggtcggat ttccaaatta aaaactccat taattgcaaa acagccagaa 480 aattacacgg accatttcag ggatccgcaa attatccgtt atcataattc ttactatgct 540 ttgatcggtg cccagacgaa acaaaaagag gggaatatct tggtttacea atccaaagac 600 ctgaaaaaet gggaattcaa cggaccgctt gaattaccgt taaagaattt gggatatatg 660 attgaatgcc cgaatatcgt atgggtggat caaaagccgg tccttatatt ctgcccgcaa 720 ggcctcgacc aaaatatttt acactatcaa aatatttatc ccaacactta cttaattggg 780 gatacgttcg accctgagaa aaaccgtttt gaatctaaat atctcctgca taatttggat 840 gaaggattcg atatttacgc tacgcaggcc tttaacgcac cggacgggcg cacacttgca 900 gtcagctgga tcggccttcc tgaaatcgat tatccgacag atcagtacgg ttgggcgcat 960 tgcttgagtt taatcaaaga attgaaaata caggacggcc atctttatca atttcctgta 1020 aaagaaacag agagccttcg cggaaggaaa attgaattgg acggggtctt aacagaacag 1080 acccagctga tattgaatca aaatgagaca gcttatgaat tggaaatcat tctgaaaggg 1140 aacggggaag gtaaattaca attggcttcg gacgggcatc aagcgttaaa tcttattttc 1200 aactttgctg atggaacatt ggtcctggac cgcagccatg cgggtatccc ttttgcacag 1260 caatacggaa cttccagaac cgtccaaatt ccaaaaaata ccccgctgaa cctgcatatt 1320 tttatggatg cttctgtcgt tgaaattttt ttaaaccatg gacacgatgt gttaacatct 1380 cgtctctttc caagcaaaaa acaaacaaag atcttcttgg aaacaaacca tcatttagct 1440 tataatggga actactggag tcttcattct attaataaat ag 1482

<210> 5 <211> 3678 <212> ADN <213> Bacchus coagulans 27 <400> 5 gagctcctat ttattaatag aatgaagact ccagtagttc ccattataag ctaaatgatg 60 gtttgtttcc aagaagatct ttgtttgttt tttgcttgga aagagacgag atgttaacac 120 atcgtgtcca tggtttaaaa aaatttcaac gacagaagca tccataaaaa tatgcaggtt 180 cagcggggta ttttttggaa tttggacggt tctggaagtt ccgtattgct gtgcaaaagg 240 gatacccgca tggctgcggt ccaggaccaa tgttccatca gcaaagttga aaataagatt 300 taacgcttga tgcccgtccg aagccaattg taatttacct tccccgttcc ctttcagaat 360 gatttccaat tcataagctg tctcattttg attcaatatc agctgggtct gttctgttaa 420 gaccccgtcc aattcaattt tccttccgcg aaggctctct gtttctttta caggaaattg 480 ataaagatgg ccgtcctgta ttttcaattc tttgattaaa ctcaagcaat gcgcccaacc 540 gtactgatct gtcggataat cgatttcagg aaggccgatc cagctgactg caagtgtgcg 600 cccgtccggt gcgttaaagg cctgcgtagc gtaaatatcg aatccttcat ccaaattatg 660 caggagatat ttagattcaa aacggttttt ctcagggtcg aacgtatctc caattaagta 720 agtgttggga taaatatttt gatagtgtaa aatattttgg tcgaggcctt gcgggcagaa 780 tataaggacc ggcttttgat ccacccatac gatattcggg cattcaatca tatatcccaa 840 attctttaac ggtaattcaa gcggtccgtt gaattcccag tttttcaggt ctttggattg 900 gtaaaccaag atattcccct ctttttgttt cgtctgggca ccgatcaaag catagtaaga 960 attatgataa cggataattt gcggatccct gaaatggtcc gtgtaatttt ctggctgttt 1020 tgcaattaat ggagttttta atttggaaat ccgacctttt ttatccatcc acgctccaag 1080 ctggtaagag aatctgttcc agtttttatc tcggacgttt cctgtataca tgataaataa 1140 acggtcttca accgggattg cagatccgga gtagcagccg tgactgtcat actctgtatc 1200 cggcaatatg gccagcccct tccctttcca atggataaga tcttttgaac taagatgata 1260 ccagcatttt aaaccatgga caggccccat cggataattt tgataaaata gatgccattc 1320 atcattaaaa aaagaaaatc cgtttggatc attcaacaat ccgctttcag gttgaatatg 1380 gtaatgcagc cgccacggag aattttctat ttgaagaagt aaatgctttt tttcttcctc 1440 agaccactea tttagatttt tataacgtaa tgctcgattc cattccatat atataaaacc 1500 tccccaaatt caaggaaagc gttctcctgg atttaatgta ctgtaaacaa agtgatatgt 1560 caaccgtata acatacaaaa tatcttaaat gatggtaaaa cataaaaaaa taataaaaaa 1620 tatgataaac gcttgacata taataaaaag atagtatatt agtatgtgaa acgattacaa 1680 aaatatgaaa gggtgtacac gatgaaccat gcaaaggttg caaaagacgt gttaaacgct 1740 ttaaatggca aagataatat aaaagctgca gcccactgcg cgacaaggct gcgcttagtt 1800 28 ateaatgatg aatcaaaaat agaccaaaaa gcattggatg cgcatccgga tgtaaaaggt 1860 acatttaaaa caaacggcca gtaccaaatt attataggac cgggggatgt cgataaagtt 1920 tatgctgaat tgatcaaatt aaccggcctt ccggatatga caacggagga tgtgaaaaaa 1980 acttcgaatg aaaagcaggg aaatgtatta ttaagattaa tcaaggtatt atctgatatt 2040 tttgttccaa ttattcctgc acttgttgcc ggcggtttgc tgatggcttt aaacaatgta 2100 ttgacagcgg aacacctatt cacaaagaag gcaatagtgg aattgtaccc gggactgaaa 2160 gatatagcgt catttatcaa taccatgtcg gctgccccat ttactttctt gccggtttta 2220 atcggatatt ccgcaaccaa acggtttggt gggaatccgt atttaggagc tgctatgggg 2280 atgatcatgg tatctcctgc attgacaagc gggtatgatg ttgttagcgc aaaagcatca 2340 ggggagttgg cttattggca tatttttgga ttaaaagtcg cgcaggccgg ttaccaaggc 2400 tctgtcttgc cggtattggt agtttcatgg attttagcta aattagagaa atttttccat 2460 aaatatattt caaatgcatt tgattttacg ttcacaccga tgcttgccat tatcattaca 2520 ggatttctaa cgtttacatt tgttgggcct gttatgcgtg atgtgagtga tgggttaacc 2580 aatggaatta tgtggttata taatgcaaca ggcgcggttg gaactgcaat ctttggactg 2640 ttttattcac cgattgtcat taccggtctg catcaaagtt ttcctgcaat tgaaaccaca 2700 cttttggctg atattgcaaa aaccggcgga tcgtttgtat taccaatcgc ctctatggct 2760 aatattgcgc aaggtgctgc ttgtcttgcc gtattcttta ttacaaaaag taaaaaacaa 2820 aaaagcttat cttcttcagc aagtatttca gctcttttgg ggattacaga accggctatt 2880 ttcgggatta acttgaaatt aaggtatccg ttcttttgtg caatggttgc ttccggtatt 2940 gcttctatat ttattggcat gttccatgtg ttatcagttt caatgggacc tgcaagtgta 3000 attggtttta tttgcattcg ctcacaatct atcttgcctt ttgtcatgag tggcgcaata 3060 agttttgtta tcgccttcac aacaacgtat atatatggaa gacgggcggc ggcaaaggaa 3120 caaaatacga ttacgaatga acgggtatct ggaaaagaac aaataggaga aacggctgct 3180 tcggctacgg cccctgctgg taatatcatc atttttgccc cggttgaagg tgaaacaatg 3240 agcttaaaaa atgtgaagga taaattattt tcatctgaat taatgggtaa aggggcagcc 3300 atcatgccga aaaacggcga tgtctatgct ccttgtgacg gaattttgac cacggtattt 3360 gatacacatc atgcatacgg cattaaaacg gaagatggag cagaaatttt aattcacatt 3420 ggtattgaca cggttaatct gaaaggcgaa tattttacaa gttacgtaga aaaaggtcag 3480 acggtaaacc aaggcgacaa actatgcagt tttgatctgg agaaaattaa agaacttggt 3540 tatgatccaa ccgtgatcac cgtcgtgacc aacacagcag attatgcggc tgttgaagga 3600 tttaatcatg atcatgataa ggtaaaacag gggagccagt tcatcacttt aacaccgaaa 3660 gctactcttt aagcatgc 3678 <210> 6 <211> 40 29 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 6 agtactgcat gcttaaagag tagctttcgg tgttaaagtg 40 <210> 7 <211> 48 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 7 agtactgagc tcctatttat taatagaatg aagactccag tagttccc 48 <210> 8 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 8 cgcgtcgact gtggataaga caacaggatt cgtatg 36 <210> 9 <211> 53 <212> ADN <213> Artificial 30 <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 9 ctaaatcaat tttattaaag tccatgggtc caccccgttc ttttcttttt gtg 53 <210> 10 <211> 53 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 10 cacaaaaaga aaagaacggg gtggacccat ggactttaat aaaattgatt tag 53 <210> 11 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 11 cgcagatctc cttcttcaac taacggg 27 <210> 12 <211> 71 <212> ADN <213> Artificial 31 <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 12 cccgtcgacg ctagctaccg ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg tggataagac 60 aacaggattc g 71 <210> 13 <211> 70 <212> ADN <213> <22 0> Artificial <223> iniciador sintético <4 0 0> 13 cgcagatctt accgttcgta tagcatacat tatacgaagt tatccttctt caactaacgg 60 ggcaggttag 70 <210> 14 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 14 cgcctcgaga gatctggccg ggctttatgg gagg 34 <210> 15 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial 32 <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 15 gccgagctcg catgcccctg atcaaccggg tcagtgc 37 <210> 16 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 16 cccgctagcc gtttcaatca catagtcgta ttg 33 <210> 17 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador sintético <4 0 0> 17 ccggtcgacg gccttcatgt gcttttgccg caaattc 37 <210> 18 <211> 1146 <212> ADN <213> Artificial <22 0>

<223> construção CAT 33 <4 Ο 0> 18 gtcgactgtg gataagacaa caggattcgt atgccctttt ttgtataaag caggcaaaac 60 agagcattaa atgcaggaaa atcgcagaag atcataccta aaaatgaaaa tgtggtaaat 120 ttttagagta aattttttta atctaatcta gaaaatcagt acatcgcaaa aagctcgggt 180 tttaagtatg ttttgcttca ggcggtaaaa cttcgtataa taagggagag gcctatccta 240 ttataaaagc cgctttcggc attttgcctt gggagccggc cccggtttag acgggacgta 300 cagccgtttc accggctaac caggcccctt tttggaagcg aagatccgga aatcaagatc 360 agctgtatag atatcaattt ttggaacaca aaaagaaaag aacggggtgg acccatggac 420 tttaataaaa ttgatttaga eaattggaag agaaaagaga tatttaatca ttatttgaac 480 caacaaacga cttttagtat aaccacagaa attgatatta gtgttttata ccgaaacata 540 aaacaagaag gatataaatt ttaccctgca tttattttct tagtgacaag ggtgataaac 600 tcaaatacag cttttagaac tggttacaat agcgacggag agttaggtta ttgggataag 660 ttagagccac tttatacaat ttttgatggt gtatctaaaa cattctctgg tatttggact 720 cctgtaaaga atgacttcaa agagttttat gatttatacc tttctgatgt agagaaatat 780 aatggttcgg ggaaattgtt tcccaaaaca cctatacctg aaaatgcttt ttctctttct 840 attattccgt ggacttcatt tactgggttt aacttaaata tcaataataa tagtaattac 900 cttctaccca ttattacagc aggaaaattc attaataaag gtaattcaat atatttaccg 960 ctatctttac aggtacatca ttctgtttgt gatggttatc atgcaggatt gtttatgaac 1020 tctattcagg aattgtcaga taggcctaat gactggcttt tataatatga gataatgccg 1080 actgtacttt ttacagtcgg ttttctaatg tcactaacct gccccgttag ttgaagaagg 1140 agatct 1146

Lisboa, 21 de Novembro de 2012

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para a produção de um composto de interesse compreendendo a cultura de uma estirpe de Bacillus moderadamente termofilica numa fonte de carbono que contém sacarose, caracterizado por a estirpe de Bacillus moderadamente termofilica ser obtida a partir de um progenitor de estirpe de Bacillus moderadamente termofilica que não é capaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono através da transformação da referida estirpe progenitora com um polinucleótido compreendendo uma sequência de ADN que codifica um polipéptido tendo uma atividade de fosfotransferase específica para a sacarose e tendo i) uma sequência de aminoácidos de sequência de SEQ ID NO: 1 ou ii) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 7 0% da sequência de SEQ ID NO: 1 e/ou compreendendo uma sequência de ADN que codifica um polipéptido que tem atividade de hidrolase de sacarose-6-fosfato e tendo iii) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou iv) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70% da sequência de SEQ ID NO: 2.

2. O método de acordo com a reivindicação 1, em que o composto de interesse é o ácido láctico.

3. Um método para a composição de uma estirpe de Bacillus moderadamente termofilica capaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono compreendendo a transformação de uma estirpe progenitora moderadamente termofilica incapaz de utilizar a sacarose como uma fonte de carbono com um polinucleótido compreendendo uma sequência de ADN que codifica um polipéptido tendo uma atividade de fosfotransferase especifica para a sacarose e tendo i) uma sequência de aminoácidos de sequência de SEQ ID NO: 1 ou ii) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo 2 menos 70% da sequência de SEQ ID NO: 1 e/ou compreendendo uma sequência de ADN que codifica um polipéptido que tem atividade de hidrolase de sacarose-6-fosfato e tendo iii) uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou iv) uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70% da sequência de SEQ ID NO: 2.

4. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a estirpe de Bacillus moderadamente termofilica é facultativamente anaeróbica.

5. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a estirpe de Bacillus moderadamente termofilica é homoláctica.

6. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a estirpe de Bacillus moderadamente termofilica é Bacillus coagulans.

7. Um polipéptido tendo atividade de fosfotransferase especifica para a sacarose e tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 7 0% com sequência de SEQ ID NO: 1.

8. Um polipéptido tendo atividade de hidrolase de sacarose-6-fosfato e tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com uma identidade de pelo menos 70% da sequência de SEQ ID NO: 2.

9. Um polinucleótido que codifica o polipéptido das reivindicações 7 ou 8.

10. O polinucleótido da reivindicação 9 tendo uma sequência de SEQ ID NO: 3 ou uma SEQ ID NO: 4. Lisboa, 21 de Novembro de 2012